Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου οφείλεται σε μετάσταση της σε απομακρυσμένα όργανα. Εξετάσαμε την επίδραση της Honokiol, ένα βιοενεργό συστατικό από το

Magnolia

φυτό, στην ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) μετανάστευση των κυττάρων και των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται αυτό το αποτέλεσμα. Χρησιμοποιώντας μια

in vitro

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία του Α549, Η1299, Η460 και H226 NSCLC κυττάρων με Honokiol είχε σαν αποτέλεσμα αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων αυτών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο συνδέεται με ένα μείωση των επιπέδων της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) και προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE

2). Celecoxib, ένας αναστολέας COX-2, ανέστειλε επίσης την κυτταρική μετανάστευση. Honokiol ανέστειλε PGE

2-ενισχυμένη μετανάστευση κυττάρων NSCLC, ανέστειλε την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ /p65, ανάντη ρυθμιστή της COX-2, σε Α549 και Η1299 κυττάρων και επεξεργασία των κυττάρων με φαιναιθυλ εστέρα καφεϊκό οξύ, ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ, ανέστειλαν επίσης τη μετανάστευση των κυττάρων NSCLC. PGE

2 έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν σηματοδότηση β-κατενίνης, η οποία συμβάλλει στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την επίδραση της Honokiol επί σηματοδότησης β-κατενίνης. Παρατηρήθηκε ότι η επεξεργασία των κυττάρων με NSCLC Honokiol αποικοδομούνται κυτοσολικό β-κατενίνης, μειωμένη πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και ρυθμισμένα προς τα κάτω μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -2 και ΜΜΡ-9, που είναι οι στόχοι κατάντη του β-κατενίνης και παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην καρκινικών κυττάρων της μετάστασης. Honokiol ενισχυμένη: (i) τα επίπεδα της κινάσης της καζεΐνης-1α, γλυκογόνο συνθάσης κινάσης-3β, και (ii) φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε κρίσιμα υπολείμματα Ser

45, Ser

33/37 και Thr

41. Αυτά τα γεγονότα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποδόμηση ή αδρανοποίηση της β-κατενίνης. Θεραπεία της celecoxib μείωσε επίσης πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης σε κύτταρα NSCLC. FH535, ένας αναστολέας της Wnt οδού /β-κατενίνης, ανέστειλε PGE

2-ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση του Α549 και Η1299 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Honokiol αναστέλλει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα μετανάστευσης με τη στόχευση PGE

2-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της σηματοδότησης β-κατενίνης

Παράθεση:. Singh Τ, Katiyar SK (2013) Honokiol Αναστέλλει Μη μικρές κυττάρων καρκίνο του πνεύμονα μετανάστευση από Στόχευση PGE

2-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της β-κατενίνης σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (4): e60749. doi: 10.1371 /journal.pone.0060749

Επιμέλεια: Xianglin Shi, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιανουαρίου 2013? Δεκτές: 2, Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 του Απρίλη, 2013

Copyright: © 2013 Singh, Katiyar. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε οικονομικά από το βραβείο Veterans Administration Merit Βαθμολογία (1I01BX001410-01, SKK). Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα ευθύνεται για περισσότερους θανάτους στις ΗΠΑ κάθε χρόνο από ό, τι του μαστού, του παχέος εντέρου και του προστάτη σε συνδυασμό, και ως εκ τούτου έχει μια τεράστια επίδραση στην ανθρώπινη δαπανών για την υγεία και την υγειονομική περίθαλψη [1]. Ένας από κάθε τρία θανάτων από καρκίνο σχετίζονται αποδίδεται σε καρκίνο του πνεύμονα, και δεν έχει καμία βελτίωση κατά τα τελευταία 30 περίπου έτη [2], [3]. καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των τύπων καρκίνου του πνεύμονα και περιλαμβάνει αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου και μεγάλου κυττάρου καρκινώματα [4], [5]. Κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) είναι συχνά ιδιοσυστατικά πάνω ρυθμισμένα σε διαφορετικές ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου καρκίνου του πνεύμονα [6] – [10]. Παρά το γεγονός ότι πολλαπλές γενετικές αλλαγές είναι απαραίτητες για τον κίνδυνο καρκίνου των πνευμόνων και την ανάπτυξή του, COX-2 θεωρείται ως κεντρικό στοιχείο στην ενορχήστρωση του καρκινογένεση του πνεύμονα. COX-2 είναι ένα επαγώγιμο ένζυμο και παράγει προσταγλανδίνες (PG) κατά τη δράση της επί του αραχιδονικού οξέος. Μεταξύ των PGs, PGE

2 θεωρείται η πιο αποτελεσματική μεταβολίτης ή φλεγμονώδους μεσολαβητή που θεωρείται ότι παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, την εξέλιξη, εισβολή και μετάσταση. Μελέτες σε καρκίνο του παχέος εντέρου, όπου η COX-2 αυθόρμητα υπερεκφράζεται, έχουν αποκαλύψει μια σύνδεση μεταξύ της COX-2 /PGE

2 και β-κατενίνης σηματοδοτήσεως η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [11]. Smith et al [12] έχουν δείξει ότι η υπεριώδης ακτινοβολία που προκαλείται από COX-2 έκφρασης και PGE

Αποτελέσματα 2 παραγωγή σε αυξημένη ενεργοποίηση σηματοδότησης β-κατενίνης. Υπάρχουν αναφορές που δείχνουν ότι η COX-2 /PGE

2 άξονας /β-κατενίνης ή της σύνδεσης συνδέεται με την μετάσταση καρκίνου του πνεύμονα [13]. β-κατενίνης είναι ένα 90 kD πρωτεΐνη του κυτταροπλάσματος και λειτουργεί ως ένα κρίσιμο συστατικό του μονοπατιού Wnt. Εν απουσία συνδετήρων Wnt, β-κατενίνης στρατολογείται στο /συμπλόκου φωσφορυλίωσης καταστροφής, το οποίο περιέχει το ογκοκατασταλτικό, αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) και Axin. Το συγκρότημα καταστροφή διευκολύνει τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης με συνθάσης γλυκογόνου 3β κινάση και κινάση καζεΐνης (CK1) που οδηγεί στην υποβάθμιση του πρωτεασώματος του β-κατενίνης. Αν β-κατενίνης δεν είναι φωσφορυλιωμένη μετά Ν-τερματικά un-φωσφορυλιωμένη β-κατενίνη συσσωρεύεται στο κυτοσόλιο, εισέρχεται στον πυρήνα και αλληλεπιδρά με τους παράγοντες μεταγραφής, όπως ο παράγοντας Τ-κυττάρων, την ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση , πολλαπλασιασμός και η μετάσταση [14] – [16]. Δεδομένου ότι, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μια ιδιαίτερα κακοήθη καρκίνο με έναν ισχυρό ικανότητα μετάστασης μακρινή και μια σημαντική αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με, μια προσέγγιση που μειώνει μεταστατική ικανότητα του μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής στρατηγικής για τη θεραπεία ή /και πρόληψη της.

φυτοχημικά θεραπευτικών τιμών προσφέρουν πολλά υποσχόμενες επιλογές για την ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών για την πρόληψη της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, την εισβολή και τη μετάσταση. Honokiol (C

18Η

18Ο

2, Σχήμα 1Α) είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοενεργό συστατικό του φλοιού του

Magnolia

φυτά που έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιαπωνική ιατρική για τη θεραπεία ορισμένων παθήσεων λόγω αντιθρομβωτική, αντικαταθλιπτική και αντι-βακτηριακή ιδιότητες [17]. Οι αντι-καρκινογόνες επιδράσεις της Honokiol έχουν διερευνηθεί σε μία ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών, καθώς και σε ορισμένα μοντέλα όγκου και παρουσιάζουν καμία εμφανή τοξικότητα

in vivo

[18] – [25]. Οι μελέτες μας επίσης έχουν δείξει ότι Honokiol εξασκεί χημειοπροληπτική επιδράσεις στην υπεριώδη ακτινοβολία που προκαλείται από τον καρκίνο του δέρματος και ότι αυτή η επίδραση σχετίζεται με τη στόχευση φλεγμονωδών μεσολαβητών της, όπως COX-2 και PGE

2 [25]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το εάν οι στόχοι Honokiol εισβολή ή μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. Καθώς ο καρκίνος του πνεύμονα είναι πολύ μεταστατικός, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση του χημειοθεραπευτικού Honokiol στην κυτταρική μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα ή εισβολή χρησιμοποιώντας διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα ως

in vitro

μοντέλο. Στην παρούσα ανακοίνωση, διερευνήσαμε το χημειοθεραπευτικό επιδράσεις της Honokiol στην μετανάστευση /επεμβατική δυναμικό των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC και εξετάζεται αν ανασταλτική επίδραση της Honokiol σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων που σχετίζονται με την αδρανοποίηση της σηματοδότησης β-κατενίνης και αν PGE

2 έχει οποιοδήποτε ρόλο σε αυτή τη διαδικασία. Για το σκοπό αυτό, επιλέγονται τέσσερις διαφορετικές NSCLC κυτταρικές γραμμές: Α549, Η1299, Η460 και Η226. Φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή (BEAS-2Β) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Εδώ, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι Honokiol αναστέλλει την επιθετική πιθανότητα των κυτταρικών γραμμών NSCLC με τη στόχευση PGE

2-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της σηματοδότησης β-κατενίνης.

(Α) Μοριακή δομή Honokiol, ένα βιοδραστικό φυτοχημικό από το

Magnolia

φυτών. (Β) Η πιθανή κυτταρική μετανάστευση των διαφόρων κυτταρικών γραμμών NSCLC προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου Boyden. Ίσοι αριθμοί των καρκινικών κυττάρων φορτώθηκαν στον ανώτερο θάλαμο των θαλάμων Boyden, επωάστηκαν για 24 ώρες, και μεταναστευτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν πάνω στη μεμβράνη μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες. (Γ) Τα μεταναστευτικά κύτταρα μετρήθηκαν και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ± SD /επιλέγονται μικροσκοπικό πεδίο, η = 3, μεγέθυνση:. × 10

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Καθαρίστηκε Honokiol αγοράστηκε από την ποιότητα φυτοχημικά, LLC (Edison, NJ). Boyden Chambers και μεμβράνες πολυανθρακικού (μέγεθος πόρων 8 μm) για δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης ελήφθησαν από Neuroprobe (Gaithersburg, MD). Τα αντισώματα που είναι ειδικά για β-κατενίνης αγοράστηκαν από την R Santa Cruz, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως και 70% συρροή. Η COX-2 mix siRNA με αντιδραστήρια διαμόλυνσης επικαλύφθηκε επί των κυττάρων για περίπου 6 ώρες σε ένα θάλαμο επώασης και μεταφέρονται σε 2 μεσαίου × ανάπτυξης για περίπου 20 ώρες. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες, όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων. Η knockdown του COX-2 έκφρασης σε Α549 και Η1299 κύτταρα μετά την επιμόλυνση επαληθεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29].

Ανάλυση Western Blot

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς Honokiol ή άλλους παράγοντες του ενδιαφέρον για την επιθυμητή χρονική περίοδο, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [30]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση 8-10% πηκτές Τπδ-Γλυκίνης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης, η μεμβράνη επωάστηκε με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και κατόπιν επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και οι ειδικές πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών επί των πηκτωμάτων, η μεμβράνη απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται είτε με αντι-β ακτίνης ή αντι-ιστόνης Η3 αντίσωμα.

Στατιστική Ανάλυση

Για δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης, τα δεδομένα στην ομάδα ελέγχου συγκρίθηκαν με honokiol-, PGE

2- ή ομάδες celecoxib-θεραπεία χωριστά χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με τη χρήση GraphPad Prism version 4.00 για Windows λογισμικό (GraphPad Software, San Diego, California. www. graphpad.com.). Όλα τα ποσοτικά στοιχεία παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Σε κάθε περίπτωση

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Συγκριτική Ανάλυση της Επεμβατική δυνατότητα των ανθρώπινων NSCLC κύτταρα

Κατ ‘αρχάς, προσδιορίζεται το συγκριτικό επεμβατική δυναμικό των διαφορετικών NSCLC κυτταρικές γραμμές, όπως Α549, Η1299, Η460 και Η226, χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου Boyden. Η επώαση των κυττάρων NSCLC για 24 ώρες σε θάλαμο Boyden οδήγησε σε μεγαλύτερο αριθμό μετανάστευση των κυττάρων που αντανακλά διεισδυτικότητα τους. Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες από κρυσταλλικό ιώδες-χρωματισμένα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Μεταναστευτικών ή επεμβατική κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο, και τα προκύπτοντα δεδομένα παρουσιάζονται από την άποψη του μέσου αριθμού των μεταστατικών κυττάρων ± SD μικροσκοπικό πεδίο /(μεγέθυνση, χ 10) (Σχήμα 1 C). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, η ικανότητα εισβολής των κυττάρων ήταν σχεδόν ταυτόσημη εκτός του ότι η επεμβατική δυναμικό των κυττάρων Η226 ήταν συγκριτικά χαμηλότερο από ό, τι άλλες κυτταρικές σειρές. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες, το δυναμικό μετανάστευσης των κανονικών ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι τα κύτταρα NSCLS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Honokiol αναστέλλει τον κυτταρικό μετανάστευση των Ανθρωπίνων NSCLC Cells

Η επίδραση του Honokiol ήταν καθορίζεται με τη μετανάστευση των κυττάρων ή επεμβατικές δυνατότητες του Α549, Η1299, Η460 και H226 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης Boyden θάλαμο. Αρχικά, ένα πείραμα διαλογής διεξήχθη για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις των χαμηλότερων συγκεντρώσεων Honokiol (μΜ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, σε σχέση με μη-Honokiol επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, η θεραπεία των κυττάρων με Honokiol σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10 και 20 μΜ για 24 ώρες μείωσε την επεμβατική δυναμικό αυτών των καρκινικών κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Η πυκνότητα των κυττάρων που μεταναστεύουν επί της μεμβράνης μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες δείχνεται στο Σχήμα 2Α, και οι αριθμοί των μεταναστευτικών κυττάρων /μικροσκοπικού πεδίου συνοψίζονται στο Σχήμα 2Β. Η κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται από 38 σε 66% (

P

& lt? 0,01 έως 0,001) σε κύτταρα Α549, κατά 37-62% (

P

& lt? 0,01 έως 0,001) σε Η1299 κύτταρα , 12-58% (

P

& lt? 0,05 έως 0,001) σε κύτταρα Η460 και 32-69% (

P

& lt? 0,05 έως 0,001) σε κύτταρα Η226 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο μετά τη θεραπεία με Honokiol (Σχήμα 2Β). Συγκριτικά υψηλότερο ανασταλτικό αποτέλεσμα του Honokiol στην κυτταρική μετανάστευση παρατηρήθηκε στο χρονικό σημείο 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Θεραπεία των κυττάρων NSCLC με Honokiol (0, 5, 10 και 20 μΜ) για 24 h αναστέλλει μετανάστευση κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (Β) Τα μεταναστευτικά κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε ομάδα αγωγής και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ± SD /πεδίο, η = 3. Σημαντική αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων

έναντι

μη-επεξεργασμένο Honokiol ομάδα ελέγχου, *

P

& lt? 0.001,

†

P & lt?

0,01?

¶

P

& lt? 0,05. (Γ) επούλωση πληγών ή δοκιμασία γρατσουνιά διεξήχθη για να εκτιμηθεί η επίδραση της Honokiol στην ικανότητα μετανάστευση των κυττάρων NSCLC. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς Honokiol για 36 ώρες. Honokiol αναστέλλει μετανάστευση κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τον έλεγχο (μη-επεξεργασμένα Honokiol) κύτταρα. Ελέγχου (0 h) πίνακα υποδεικνύει το αρχικό διάστημα μεταξύ των στρωμάτων των κυττάρων άμεσα μετά κάνει μία γρατσουνιά ή πληγή. Ο χώρος μεταξύ των διακεκομμένων λευκές γραμμές υποδεικνύει το χώρο σε μεγάλο βαθμό μη κατειλημμένο από τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες φαίνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Η μη κατειλημμένο κενός χώρος από τα κύτταρα μεταξύ των στρωμάτων των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κλίμακα μικρο-πλέγμα κάτω από μικροσκόπιο, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ένα κενό χώρο από την άποψη της μm ± SD για κάθε κυτταρική γραμμή. Σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των κυττάρων έναντι μη-Honokiol-θεραπεία ελέγχους, *

P

& lt?. 0.001

Η

Η ανασταλτική επίδραση των Honokiol για τη μετανάστευση των κυττάρων NSCLC επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας την επούλωση των πληγών δοκιμασίας, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Για την δοκιμασία επούλωσης πληγών, η επίδραση της Honokiol στην κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε σε 36 ώρες μετά την επεξεργασία της, ενώ στην δοκιμασία θαλάμου Boyden η επίδραση της Honokiol προσδιορίστηκε μετά από 24 ώρες. Ήταν οφείλεται στο γεγονός ότι στην επούλωση τραύματος πρώτα κύτταρα δοκιμασίας που συνδέονται με τις πλάκες, στη συνέχεια, ξεκινήστε πολλαπλασιαζόμενα και μετά να αρχίσει μεταναστεύουν ή να ξεκινήσει επούλωση των πληγών. Έτσι, χρειάζεται μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου μη-Honokiol επεξεργασμένο, επεξεργασία των κυττάρων με Honokiol (0, 10 και 20 μΜ) για 36 ώρες μείωσε την ικανότητα μετανάστευσης όλων των κυτταρικών σειρών (Α549, Η1299, Η460 και Η226) που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το μεγάλο κενό ή τραυματίζοντας χώρος μεταξύ των κυττάρων στρώματα μετά την πραγματοποίηση μιας πληγής καλύφθηκε από τα κύτταρα που μεταναστεύουν NSCLC που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Honokiol. Ωστόσο, ο κενός χώρος μεταξύ των κυττάρων στρώματα ήταν λιγότερο καλύπτεται από τις μεταναστεύουν κύτταρα επεξεργασμένα με Honokiol και αυτό το αποτέλεσμα ήταν δοσοεξαρτώμενη. Ο τραυματισμός ή κενός χώρος μεταξύ των στρωμάτων των κυττάρων υπογραμμίζεται από διακεκομμένες γραμμές (Σχήμα 2C). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι Honokiol ανέστειλε τη μεταναστευτική αποτελεσματικότητα των κυττάρων NSCLC. Ο χώρος μεταξύ των διακεκομμένων λευκών γραμμών μετρήθηκε με μικροσκόπιο σε κάθε ομάδα θεραπείας. Όπως συνοψίζεται στην Εικόνα 2D, ο κενός χώρος μεταξύ των κυττάρων στρωμάτων ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα κύτταρα Honokiol φάρμακο (

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με μη-Honokiol επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Αυτό δείχνει ότι Honokiol ανέστειλε την διαδικασία της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων. Για να βεβαιωθείτε ότι η αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων με Honokiol ήταν μια άμεση επίδραση στην ικανότητα της μετανάστευσης, και ότι δεν οφειλόταν σε μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων, ένας προσδιορισμός ΜΤΤ διεξήχθη χρησιμοποιώντας κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον ίδιο τρόπο με αυτά που χρησιμοποιούνται στις δοκιμασίες μετανάστευσης. Θεραπεία κανονικών ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων κυττάρων (BEAS-2Β) και NSCLC με Honokiol στις συγκεντρώσεις 0, 5, 10 και 20 μΜ δεν είχαν σημαντική ανασταλτική επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α.

(Α) Μια συγκριτική δοσοεξαρτώμενη επίδραση του Honokiol στο δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων BEAS-2Β και κυτταρικές σειρές NSCLC, όπως αναλύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Honokiol για 24 ώρες, και κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western για να μετρηθούν τα επίπεδα της COX-2. (Γ) Κατεργασία του Α549 και Η1299 κυττάρων με celecoxib, ένας αναστολέας της COX-2, για 24 ώρες αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση δυναμικού με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (D) Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν μετρήθηκε επί της μεμβράνης και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ± SD /πεδίου από τρία ξεχωριστά πειράματα. Σημαντική αναστολή από Honokiol έναντι μη-Honokiol επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, *

P

& lt? 0.001,

†

P

& lt? 0,01,

¶

P

& lt? 0,05. (Ε) Επίδραση της celecoxib σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης της COX-2 σε Α549 και κύτταρα Η1299. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις celecoxib για 24 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και τα προϊόντα λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για την μέτρηση των επιπέδων COX-2. Η σχετική πυκνότητα των ζωνών πρωτεϊνών σε κηλίδες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα ImageJ αναπτύχθηκε στα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (https://rsb.info.nih.gov/ij) και ομαλοποιήθηκε με τις β-ακτίνης λωρίδων. Σε κάθε περίπτωση, ομάδα ελέγχου ανατέθηκε μία αυθαίρετη μονάδα 1.0. (F) Επιμόλυνση των Α549 και Η1299 κυττάρων με COX-2 siRNA μειώνει σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση. Σημαντική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης σε σχέση με τον έλεγχο των κυττάρων siRNA-θεραπεία, *

P

& lt?. 0.001

Η

Η ανασταλτική δράση της Honokiol στην κυτταρική μετανάστευση του NSCLC κύτταρα συνδέεται με τη μείωση της του ενδογενής COX-2 Εκφραση

Για να εξεταστεί αν Honokiol αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων NSCLC με τη στόχευση της ενδογενούς έκφρασης του COX-2, προσδιορίσαμε τα επίπεδα COX-2 σε κυτταρολύματα κυττάρων σε επεξεργασία με και χωρίς τη χρήση Honokiol κηλίδος western ανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η αγωγή των Α549, Η1299, Η460 και H226 κυττάρων με Honokiol μείωσε τα επίπεδα έκφρασης της COX-2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε σύγκριση με την έκφραση της COX-2 σε μη κατεργασμένους ελέγχους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων με Honokiol μπορεί να σχετίζεται με την αναστολή της έκφρασης COX-2 σε καρκινικά κύτταρα.

Celecoxib, ένας εκλεκτικός COX-2 αναστολέας, αναστέλλει NSCLC Κυττάρων Η μετανάστευση

για να καθοριστεί εάν η ανασταλτική δράση του Honokiol στην κυτταρική μετανάστευση NSCLC προκαλείται μέσω ανασταλτική επίδραση του στην έκφραση της COX-2, ίσοι αριθμοί Α549 και κύτταρα Η1299 υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων μετά από θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις celecoxib (0, 5 , 10, 20 μΜ) για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, κατεργασία των κυττάρων με celecoxib οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της ικανότητας κυτταρική μετανάστευση αυτών των κυττάρων σε σύγκριση με μάρτυρες μη celecoxib αγωγή. Τα δεδομένα για τη μετανάστευση των κυττάρων συνοψίζεται στην Εικόνα 3D, το οποίο πρότεινε ότι η θεραπεία των κυττάρων με celecoxib ανέστειλε σημαντικά (

P

& lt? 0,01 έως 0,001) η μετανάστευση των Α549 και Η1299 κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η αναστολή της ενδογενούς συστατική επίπεδα έκφρασης COX-2 συνδέεται με την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης NSCLC. Περαιτέρω, τα επίπεδα της COX-2 ελέγχθηκαν στα προϊόντα λύσης των κυττάρων κατεργασμένα ή μη κατεργασμένα με celecoxib χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. δεδομένα κηλίδος Western αποκάλυψαν ότι η θεραπεία του Α549 και Η1299 κυττάρων με το celecoxib για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της έκφρασης COX-2 σε αυτά τα κύτταρα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε.

εκλεκτικών αναστολέων COX-2 Knockdown Χρησιμοποιώντας siRNA οδηγεί στη μείωση του Cancer Cell Migration

Ο ρόλος της COX-2 σε κυτταρική μετανάστευση περαιτέρω πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας siRNA knock-down της COX-2 στα κύτταρα NSCLC και εξεταστεί κατά πόσον θα οδηγήσει στην αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης στον καρκίνο κύτταρα. Η επιμόλυνση των Α549 και Η1299 κυττάρων με COX-2 siRNA οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης Α549 (79%,

P

& lt? 0.001) και Η1299 (75%,

P

& lt ?. 0.001) κυττάρων μετά από 24 ώρες σε σύγκριση με την μετανάστευση του ελέγχου siRNA επιμολυσμένα Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 3F)

Honokiol αναστέλλει την παραγωγή της PGE

2 και PGE

2-ενισχυμένη η μετανάστευση των κυττάρων σε NSCLC κύτταρα

Καθώς η επίδραση χημειοπροληπτικές της Honokiol στην ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης από 4 διαφορετικές NSCLC κυτταρικές σειρές ήταν σχεδόν πανομοιότυπες, έχουμε επιλέξει 2 κυτταρικές σειρές (Α549 και Η1299) για περαιτέρω λεπτομερή και μηχανιστικές μελέτες. Όπως PGE

2 είναι ένας κύριος μεταβολίτης της COX-2 και έχει εμπλακεί σε COX-2 με τη μεσολάβηση δυσμενείς επιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένης της εισβολής και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων? προσδιορίσαμε τα επίπεδα της PGE

2 στα κύτταρα Honokiol κατεργασία χρησιμοποιώντας PGE

2 κιτ ανοσοδοκιμασίας. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η θεραπεία των κυττάρων με Honokiol για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην παραγωγή της PGE

2 και στα δύο Α549 (20-64%,

P

& lt? 0,01 έως 0,001) και Η1299 ( 13-65%,

P

& lt? 0,01 έως 0,001) κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι Honokiol επαγόμενη μείωση σε PGE

2 παραγωγή μπορεί να σχετίζεται με μία ανασταλτική επίδραση της Honokiol για την κυτταρική μετανάστευση σε αυτά τα κύτταρα.

(Α) Θεραπεία του Α549 και Η1299 κυττάρων με Honokiol μείωσε τα επίπεδα της PGE

2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα επίπεδα της PGE

2 μετρήθηκαν σε κυτταρολύματα χρησιμοποιώντας PGE

2 κιτ ανοσοδοκιμασίας και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε όρους pg /mg πρωτεΐνης ± SD, η = 3. Σημαντική μείωση σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, *

P

& lt? 0.001,

†

P

& lt? 0,01. (Β) Θεραπεία των Α549 και των κυττάρων Η1299 με Honokiol αναστέλλει PGE

2-αυξημένη ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης. Τα δεδομένα σχετικά με την ικανότητα κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων που συνοψίζονται ως μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ± SD /μικροσκοπικό πεδίο, n = 2. Σημαντική αναστολή έναντι PGE

2 μόνο θεραπεία? *

P

& lt? 0.001,

†

P

& lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον PGE

2 ενίσχυσε τη μετανάστευση NSCLC κύτταρα και αν Honokiol αναστέλλει PGE

2-επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC. Για το σκοπό αυτό, Α549 και κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με PGE

2 (10 μΜ) με και χωρίς Honokiol για 24 ώρες και κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε. Η

in vitro

θεραπευτική δόση της PGE

2 επελέγη με βάση προηγούμενες μελέτες [29], [31]. Διαπιστώθηκε ότι η επεξεργασία των κυττάρων με NSCLC PGE

2 οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα τα οποία δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PGE

2 ( Σχήμα 4Β). Θεραπεία της Α549 και Η1299 κυττάρων με Honokiol (10 και 20 μΜ) οδήγησε σε σημαντική αναστολή (

P

& lt? 0,01 έως 0,001) της PGE

2 (10 μΜ) επαγόμενη μετανάστευση κυττάρων (Σχήμα 4Β) .

Honokiol Αναστέλλει NF-κΒ /p65 Δραστηριότητα στο NSCLC κύτταρα: NF-κΒ είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της Cancer Cell εισβολή /μετανάστευση

NF-κΒ είναι ένας ρυθμιστής ανάντη της COX- 2? Ως εκ τούτου, θα καθοριστεί αν Honokiol επηρεάζει τη δραστηριότητα καθώς και τα επίπεδα των πρωτεϊνών της οικογένειας NF-κΒ στα κύτταρα NSCLC. Για το σκοπό αυτό, και πάλι Α549 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (0, 5, 10 και 20 μΜ) για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα πυρηνικά προϊόντα λύσης και λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν για ανάλυση στυπώματος western. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η θεραπεία των κυττάρων με Honokiol μειώνει την πυρηνική συσσώρευση του ΝΡ-κΒ /p65 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Α). Η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ /p65 επίσης ήταν σημαντικά μειωμένη (

P

& lt? 0,05 και

P

& lt? 0.001) μετά την επεξεργασία των κυττάρων με Honokiol (Σχήμα 5Β). Τα δεδομένα μας αποκάλυψε επίσης ότι η αγωγή των Honokiol είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της ΙΚΚα, ένα ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, και εμπόδισε την υποβάθμιση του ΙκΒα (Σχήμα 5Α). Για την περαιτέρω επαλήθευση εάν ΝΡ-κΒ έχει ένα ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση NSCLC, Α549 και κύτταρα Η1299 υπέστησαν κατεργασία με έναν ισχυρό αναστολέα του ΝΡ-κΒ, προσδιορίστηκε φαιναιθυλ εστέρα καφεϊκό οξύ (CAPE), και την κυτταρική μετανάστευση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C και 5D, η θεραπεία των κυττάρων με κάπα για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης των Α549 (42-78%,

P

& lt? 0,05 έως 0,001) και Η1299 ( 41-76%,

P

& lt? 0,05 έως 0,001) κυττάρων σε σχέση με μη-Honokiol επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, και αυτό το αποτέλεσμα του Πράσινου ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε για την επεξεργασία των κυττάρων με Honokiol (Σχήματα 2Α, 2Β). Περαιτέρω, ελέγξαμε επίσης την επίδραση του Πράσινου επί των πρωτεϊνών της οικογένειας ΝΡ-κΒ σε Α549 και κύτταρα Η1299 χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, κατεργασία των κυττάρων με CAPE είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή των επιπέδων του ΝΡ-κΒ /p65 και ΙΚΚα στις δύο κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

(Α) και Α549 κύτταρα Η1299 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του Honokiol για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Β) Η δραστηριότητα του ΝΡ-κΒ /p65 στα πυρηνικά κλάσματα των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας δραστικότητας του ΝΡ-κΒ /p65-ειδική, n = δραστικότητα /p65 3. ΝΡ-κΒ εκφράζεται σε όρους επί τοις εκατό των μη κύτταρα ελέγχου Honokiol-θεραπεία. Σημαντική αναστολή

σε σχέση με τον έλεγχο

, *

P

& lt? 0.001,

¶

P

& lt? 0,05. (Γ) Η επεξεργασία των κυττάρων με κάπα, ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ, για 24 ώρες αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (D) Τα στοιχεία σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων συνοψίζονται ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν ± SD ανά μικροσκοπικό πεδίο /ομάδα. Σημαντική αναστολή

έναντι

ομάδα ελέγχου, *

P

& lt? 0.001,

¶

P

& lt? 0,05. (Ε) Θεραπεία των κυττάρων με κάπα για 24 ώρες αναστέλλει τα επίπεδα της NF-κΒ και ΙΚΚα όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδας western.

Η

Honokiol Αναστέλλει πυρηνική συσσώρευση της β-κατενίνης

PGE

2 έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν οδό σηματοδότησης β-κατενίνης η οποία έχει εμπλακεί στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση [12], [13]. Όπως έχουμε βρει ότι η θεραπεία των κυττάρων NSCLC με Honokiol αναστέλλει τα επίπεδα της PGE

2 και αναστέλλει PGE-ενισχυμένη 2

μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, έχουμε περαιτέρω αποφασιστική αν η αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης NSCLC από Honokiol συνδέεται επίσης με την καταστολή της σηματοδότησης β-κατενίνης. Για το σκοπό αυτό, Α549 και κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με Honokiol για 24 ώρες, και τα πυρηνικά και κυτοσολικά κλάσματα κυτταρολυμάτων υποβλήθηκαν σε ανάλυση πρωτεϊνών σηματοδότησης β-κατενίνης. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η θεραπεία των Α549 και Η1299 κυττάρων με Honokiol είχε ως αποτέλεσμα μείωση των επιπέδων των πυρηνικών β-κατενίνης (Σχήματα 6Α και 6Β) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Δεδομένου ότι, πυρηνική συσσώρευση της β-κατενίνης συσχετίζεται αντίστροφα με φωσφορυλίωση σε ορισμένα βασικά κατάλοιπα της β-κατενίνης (Ser

45, Ser

33, Ser

37 και Thr

41), ελέγξαμε το επίδραση των Honokiol στα επίπεδα φωσφορυλίωσης β-κατενίνης σε αυτές τις θέσεις.