Αφηρημένο

Σκοπός

τοπικής υποτροπής είναι η κύρια εκδήλωση της αποτυχίας της θεραπείας σε ασθενείς με λειτουργική καρκίνωμα του λάρυγγα. Ιδρύθηκε κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες δεν μπορεί να προβλέψει επαρκώς τους ασθενείς που είναι πιθανό να επαναληφθεί μετά τη θεραπεία. Ως εκ τούτου, τα πρόσθετα εργαλεία που απαιτούνται για τον ακριβή προσδιορισμό των ασθενών που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο για υποτροπή. Η παρούσα μελέτη επιχειρεί να εντοπίσει και ανεξάρτητα επικύρωση μοντέλα γονιδιακής έκφρασης, προγνωστική της ελεύθερης νόσου επιβίωση (DFS) σε λειτουργική καρκίνο του λάρυγγα.

Υλικά και Μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας Affymetrix U133A GeneChips, εμείς προφίλ γλυκού κατεψυγμένων ιστών όγκου από 66 ασθενείς με καρκίνο του λάρυγγα αγωγή τοπικά με χειρουργική επέμβαση. Εφαρμόσαμε Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων μοντέλων για τον εντοπισμό πολυγονιδιακής πρόβλεψης της υποτροπής. μοντέλα γονίδιο στη συνέχεια επικυρώνονται σε δύο ανεξάρτητες ομάδες των 54 και 187 ασθενείς (νωπά-κατεψυγμένα και φορμόλη σταθερά σύνολα επικύρωσης ιστού, αντίστοιχα).

Αποτελέσματα

Είμαστε επικεντρώθηκε στην γονίδια univariately που σχετίζονται με DFS (

σ

acc=GSE27020

RNA απομόνωση από FFPE δείγματα καρκινικού ιστού και qRT-PCR

Όλες οι έρευνες που αφορούν τα δείγματα ιστού FFPE πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας, Ελληνικό Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Ιατρική Σχολή. Για την επικύρωση της προγνωστικής αξίας των γονιδίων που προέρχονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών μας, χρησιμοποιήσαμε μια ξεχωριστή σειρά ασθενών με διαθέσιμο υλικό ιστού όγκου. Αυτή η ομάδα δείγμα περιλάμβανε 187 δείγματα ιστού FFPE που macrodissected κατά την προηγούμενη ιστολογική αξιολόγηση περιέχουν & gt? 50% των κυττάρων του όγκου. RNA απομονώθηκε μετά από πλήρη λύση για όλη τη νύχτα ιστού χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ-LS (Life Technologies, Paisley, UK), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] και μεταγράφηκε αντίστροφα με Superscript III (Life Technologies), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNAs ομαλοποιήθηκαν στα 25 ng /ul και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. mRNA έκφραση διερευνήθηκε με FAM σημασμένο TaqMan® Gene δοκιμασίες έκφρασης σε duplex αντιδράσεις που περιλαμβάνουν ένα VIC-επισημασμένο δοκιμασία αναφοράς εκκινητή-περιορισμένη για γλυκουρονιδάση βήτα (GUSB, δοκιμασία # Hs00939627_m1), όπως ένα ενδογενές ελέγχου χωρίς πρότυπο. GUSB προτιμήθηκε επί εφαρμόζεται συνήθως ενδογενές έλεγχοι επειδή δεν ψευδογονίδια έχουν, μέχρι στιγμής, έχουν αναφερθεί για το γονίδιο αυτό. Επιπλέον, έχει αναγνωριστεί ως ένα από τα καλύτερα διατηρημένα στόχους mRNA σε ιστούς FFPE [21]. qPCR mRNA επιλογή στόχου περιλαμβάνονται αξιολόγησης των 30 ανιχνευτών της υπογραφής U133A για διπλότυπα γονίδιο, τα χαρακτηριστικά γονίδιο (ισχύει γονίδιο ταυτότητες, τον τύπο του γονιδίου, που καταγράφονται παραλλαγές ματίσματος που δεν θα διακρίνεται από τον ανιχνευτή επάνω στην διάταξη ή με τη δοκιμασία qPCR), καθώς και μια παραμετρική

σ

-τιμή του & lt? 0,05 για πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση γονιδίου. Από τις 30 ανιχνευτές U133A, 23 εξακολουθούσε να ισχύει για την εφαρμογή qRT-PCR (Πίνακας 2). Γι ‘αυτούς τους 23 στόχους, ψάξαμε για προ-made δοκιμασίες έκφρασης TaqMan® Gene (Applied Biosystems) τα οποία θα ταιριάζουν με τις αλληλουχίες στόχοι ανιχνεύονται με τις αντίστοιχες ανιχνευτές στη συστοιχία U133A. Ήταν δυνατό να ανακτήσει 16 τέτοιες δοκιμασίες (Πίνακας 2). Duplex 10 υΐ αντιδράσεις διεξήχθησαν εις διπλούν, που το καθένα περιέχει 50 ng εκμαγείου, σε ένα σύστημα ΑΒΙ PRISM 7900HT (Applied Biosystems /Life Technologies) σε ένα μπλοκ 384 φρεατίων υπό προεπιλεγμένες συνθήκες που περιλαμβάνουν 45 κύκλους ενίσχυσης, μαζί με ένα δείγμα RNA αναφοράς ( TaqMan® Ελέγχου Ολικό RNA, αρ. 4307281, Applied Biosystems) και ελέγχους χωρίς πρόπλασμα. Το RNA αναφοράς χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος πλάκα και για την αξιολόγηση της απόδοσης του προσδιορισμού μεταξύ τρεξίματα (επικύρωση μεταξύ τρέξιμο). Δύο από τα 16 επιλεγμένα δοκιμασίες απέδωσε τιμές deltaRQ της & gt? 1.5 μεταξύ διαφορετικών τρεξίματα και, ως εκ τούτου, απέτυχε η επικύρωση μεταξύ τρέξιμο και δεν αξιολογήθηκαν περαιτέρω (Πίνακας 2)

Η

κατώτατα όρια κύκλου (CT, το οποίο αντιστοιχεί. να Cq στις κατευθυντήριες γραμμές MIQE) για κάθε στόχο και για την ενδογενή αναφοράς ελήφθησαν αυτόματα σε περίπτωση αθέτησης όρων και σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) υπολογίστηκε σε γραμμική λειτουργία [22] αφαιρώντας (45-avg deltaCT), σύμφωνα με την οποία 45 ήταν η συνολική ενίσχυση αριθμός κύκλου και avg DCT = μέσος [(στόχος CT) – (CT GUSB)] για διπλότυπα. Τα κριτήρια επιλεξιμότητας για την περαιτέρω αξιολόγηση δείγμα περιλάμβανε GUSB CT τιμές των & lt? 38 για κάθε αντίδραση και deltaRQ για κάθε διπλούν (ενδο-τρέχει παραλλαγή) της & lt? 0,8. Για 3 δοκιμασίες δεν ελήφθησαν καμπύλες ενίσχυσης για την FFPE και των δειγμάτων αναφοράς mRNA, ενώ για μια επιπλέον δοκιμασία παρατηρήθηκαν υψηλές διαφορές ενδο-τρέξει RQ αξία στο 87% των δειγμάτων (Πίνακας 2). Με βάση τα παραπάνω βήματα φιλτραρίσματος για προσδιορισμό και την επιλεξιμότητα του δείγματος, ήταν τελικά δυνατό να αξιολογεί τα αποτελέσματα RQ μόνο 10 γονίδια.

Με την εφαρμογή των παραπάνω κριτηρίων επιλεξιμότητας του δείγματος, ο ακόλουθος αριθμός ενημερωτικών δειγμάτων που λαμβάνονται ανά mRNA στόχου (ενημερωτικό αναλύσεις μόνο): ACE2, 159? DHTKD1 171? FLOT1, 178? MAP4K1, 169? ΝΕΚ2, 156? SFRS8, 184? PRKD1, 162? TBC1D4, 165? TGOLN2, 183 και YTHDC2, 176.

Η στατιστική ανάλυση

μοντέλα έκφρασης Πρόγνωσης γονιδίου αναπτύχθηκαν αποκλειστικά στο σετ εκπαίδευσης. DFS μετρήθηκε από τη στιγμή της διάγνωσης μέχρι τις επαληθευμένες την εξέλιξη της νόσου ή το θάνατο. Alive ασθενείς χωρίς επαλήθευση εξέλιξη της νόσου περικόπηκαν κατά την ημερομηνία της τελευταίας επαφής. Γονίδια που επιλέγονται έπρεπε να συνδέονται univariately με DFS (

σ

& lt? 0.01, Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνου). Ο αλγόριθμος ταιριάζει αναλογικών κινδύνων μοντέλα να σχετίζονται DFS σε κάθε γονίδιο, ένα γονίδιο σε έναν χρόνο, και παρέχει ένα

σ

τιμή για κάθε γονίδιο, τον έλεγχο της υπόθεσης ότι DFS είναι ανεξάρτητο από το επίπεδο έκφρασης του συγκεκριμένου γονιδίου. Γονίδια βρέθηκε να σχετίζεται με το DFS στο σύνολο εκπαίδευσης στη συνέχεια κατετάγη βάση την απόλυτη αξία αναλογία κινδύνου τους, που παρέχεται από τον αλγόριθμο. Προγνωστικών μοντέλων γονίδιο, το οποίο περιλαμβάνει διαφορετικούς αριθμούς από τα κορυφαία κατάταξη γονιδίων, αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας τον εποπτευόμενο κύριο αλγόριθμο επιβίωση συνιστώσα [23]. Ο αλγόριθμος υπολογίζει κύριες συνιστώσες και εκτελεί Cox ανάλυση ανάλογη παλινδρόμησης κινδύνου για τον υπολογισμό του συντελεστή παλινδρόμησης (βάρος) για κάθε κύριο συστατικό. Ένα εποπτεύεται κύριο μοντέλο συνιστώσα έχει σχεδιαστεί για να παρέχει ένα προγνωστικό δείκτη για κάθε ασθενή της μελέτης. Μια υψηλή προγνωστική δείκτη αντιστοιχεί σε υψηλή τιμή του κινδύνου υποτροπής. Για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία της μεθόδου αυτής, χρησιμοποιήσαμε Αφήστε-One-Out-Cross-Validation, όπου κάθε περίπτωση παραλείπεται και η όλη ανάλυση εκτελείται χρησιμοποιώντας το υπόλοιπο των δειγμάτων. Για να εφαρμοστεί άμεσα αυτά τα μοντέλα στην 1

σύνολο επικύρωσης st, θα ομαλοποιηθεί η εκπαίδευση και τα σύνολα επικύρωσης 1

ου, με τη μέθοδο της εμπειρικής Bayes (EB) [24]. Η μέθοδος χρησιμοποιεί έναν αλγόριθμο σχεδιασμένο για να προσαρμόζεται για τη μη βιολογική πειραματική παραλλαγή ( «φαινόμενο της παρτίδας») μεταξύ των διαφόρων συνόλων δεδομένων. Μειώνει διεργαστηριακή διακύμανση, καθώς και τεχνικές διαφορές, λόγω της αξιοποίησης των διαφόρων πλατφορμών και μεθοδολογικές προσεγγίσεις. Μετά την κανονικοποίηση, εφαρμόσαμε άμεσα τα μοντέλα γονίδιο στο 1

ου σετ επικύρωση χωρίς τροποποιήσεις.

Kaplan-Meier καμπύλες και log-rank τεστ χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί και να συγκρίνουν τις κατανομές επιβίωσης σε ασθενείς με υψηλό – και χαμηλού κινδύνου υποτροπής. Όλες οι αναφερόμενες

σ

τιμές είναι δύο όψεων. Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκε για την μονοπαραγοντική ανάλυση και προσαρμογή πολλών μεταβλητών για γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση των BRB-ArrayTools αναπτύχθηκε από τον Δρ Richard Simon και της ομάδας ανάπτυξης του BRB-ArrayTools και το στατιστικό πακέτο SPSS, έκδοση 18.0, (IBM Corporation, Armonk, NY).

Χρησιμοποιήσαμε το ανεξέλεγκτους «Υποκατηγορία Mapping» (Submap) μέθοδος [25] για την αξιολόγηση της μοριακής αλληλογραφία των ασθενών με θετικά και αρνητικά πρόγνωση μεταξύ του συνόλου εκπαίδευσης και το 1

ου σύνολο επικύρωσης. Αυτή η μέθοδος αμφίδρομα αξιολογεί τη σύνδεση των προκαθορισμένων υποτύπους σε πολλαπλά ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων, παρά τις τεχνικές διαφορές τους. Ο αλγόριθμος παρέχει τον υπολογισμό του

σ

αξία να αποδείξει την πιθανότητα μοριακής ομοιότητας μεταξύ των διαφόρων υποκατηγοριών, που υλοποιείται στο GenePattern λογισμικού (έκδοση 3.0, Broad Institute, Cambridge, ΜΑ) και μπορεί να έχει πρόσβαση σε https://www.broad.mit.edu/genepattern/

σετ Gene ανάλυση (GSA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση απορρύθμισης χαρακτηριστικό δίκτυο γονιδίων των ομάδων των ασθενών με καλή ή κακή πρόγνωση [26]. Χρησιμοποιώντας δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα, μπορούμε στη συνέχεια προβλέψει την κατάσταση ενεργοποίησης της οδού ογκογόνο σε κάθε ασθενή της εκπαίδευσης και 1

ου σετ επικύρωσης. Εφαρμόσαμε τα μοντέλα γονιδιακής έκφρασης, που προηγουμένως αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν in vitro, για να εκτιμηθεί η πιθανότητα ενεργοποίησης της οδού σε κάθε δείγμα [27]. Τέλος, με τη χρήση Bayesian μοντέλα probit παλινδρόμησης που αποδίδεται σε κάθε ασθενή μια πιθανότητα ενεργοποίησης της οδού.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση και επικύρωση των προγνωστικών ταξινομητών χρησιμοποιώντας την έκφραση του γονιδίου προφίλ

Το διάγραμμα ροής της μελέτη μας φαίνεται στο Σχήμα 1 (διάγραμμα σύζυγος). Αναλύσαμε πρωτοπαθείς όγκους του λάρυγγα από 66 ασθενείς (σύνολο εκπαίδευσης) και 54 ασθενείς (1

ου σετ επικύρωση) χρησιμοποιώντας την παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Μετά την αξιολόγηση της ποιότητας των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, αποκλείσαμε 7 και 4 τεχνικές ακραίες τιμές από τις δύο σειρές, αντίστοιχα. Για ορισμένα από τα γονίδια, η έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα ανιχνευτή. Προγνωστική μοντέλα σύνολο ανιχνευτών εντοπίστηκαν αποκλειστικά στο σετ εκπαίδευσης. Αφού απέκλεισε το ένα τέταρτο από τα λιγότερο παραλλαγή γονίδια, επικεντρωθήκαμε σε γονίδια που σχετίζονται με το DFS (Wald είναι

σ

& lt? 0,01). Στη συνέχεια κατέλαβε τις 253 σειρές ανιχνευτών βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με DFS, με βάση τον συντελεστή παλινδρόμησης Cox. Εντοπίσαμε πολλά μοντέλα προγνωστική σύνολο ανιχνευτών που αποτελείται από όσο 250 έως τόσο λίγα όπως 20 σύνολα ελέγχων, που εκτελούνται εξίσου καλά στο σετ εκπαίδευσης.

Η

Στη συνέχεια, εφαρμόσαμε αυτά πολυγονιδιακής προγνωστικών απευθείας στο 1

ου σύνολο επικύρωσης. Το σύνολο μοντέλο 30-καθετήρα πραγματοποιείται το καλύτερο στο σύνολο επικύρωσης (το μοντέλο με τα λιγότερα γονίδια που αποδεικνύουν την υψηλότερη στατιστική διαφορά στην DFS μεταξύ των ασθενών υψηλού και χαμηλού κινδύνου). Διάμεση DFS για τις ομάδες των ασθενών με δυσμενή και ευνοϊκή πρόγνωση, όπως προβλέπεται από το σύνολο μοντέλο 30-ανιχνευτή, ήταν 34 και 80 μήνες αντίστοιχα (log-rank,

σ

= 0,010). Η αναλογία κινδύνου (HR) για υποτροπή στην ομάδα υψηλού κινδύνου σε σχέση με την ομάδα χαμηλού κινδύνου ήταν 3,87 (95% CI 1,28 έως 11,73, Wald είναι

σ

= 0,017). Kaplan-Meier για όλα τα σετ καθετήρα μοντέλα της εκπαίδευσης και 1 σετ επικύρωσης

ου μπορεί να βρεθεί σε S1 αρχείου. Συμφωνία μεταξύ των αναθέσεις κινδύνου, τόσο στην εκπαίδευση και 1

ου σετ επικύρωσης με βάση τις διαφορετικές ταξινομητές ήταν υψηλό, 81-87% (Cramer V δοκιμή = 0,62 – 0,75).

Οι σχολιασμοί του συνόλου των 30 καθετήρα τα σύνολα που περιλαμβάνονται στο μοντέλο μας φαίνεται στον πίνακα 3, ενώ μια γραφική αναπαράσταση των προτύπων γονιδιακής έκφρασης του συνόλου μοντέλο 30-ανιχνευτή σε ασθενείς υψηλού και χαμηλού κινδύνου φαίνεται στο Σχήμα 2α. Παρατηρήσαμε ότι σε αυτό το μοντέλο, δύο γονίδια (ACE2 και MAP4K1) εκπροσωπήθηκε από δύο ομάδες ανιχνευτών. Προκειμένου να αποφευχθεί η επίδραση των στάθμιση αυτών των δύο γονιδίων διπλάσια σε σύγκριση με καθένα από τα άλλα επιμέρους σύνολα ανιχνευτή, που αντιπροσωπεύουν ένα μόνο γονίδιο, έχουμε εκ νέου δοκιμασία μοντέλο μας στην εκπαίδευση και 1

σετ επικύρωσης st τη χρήση ενός μόνο ανιχνευτή οριστεί για κάθε γονίδιο. Στο σύνολο εκπαίδευσης, στατιστική σημαντικότητα στο μοντέλο 28-γονιδίου παρέμεινε ίδια (δοκιμασία log-rank,

σ

& lt? 0.001, Σχήμα 3α) με το ένα με βάση το σύνολο μοντέλο 30-ανιχνευτή. Διάμεση DFS στο σύνολο επικύρωσης 1

ου, όπως προβλέπεται από το μοντέλο 28-γονιδίου, ήταν 34 και 80 μήνες αντίστοιχα (log-rank,

σ

= 0,029, σχήμα 3β). Η αναλογία κινδύνου (HR) για υποτροπή στην ομάδα υψηλού κινδύνου σε σχέση με την ομάδα χαμηλού κινδύνου ήταν 4,38 (95% CI 1.6 έως 7.1,

σ

= 0.036 Wald του).

Γραφική αναπαράσταση από τα σχέδια 30-ανιχνευτή σετ μοντέλο έκφρασης σε ασθενείς με θετική όσο και αρνητική πρόγνωση φαίνεται στον πίνακα Α. Κόκκινο χρώμα σημαίνει υπερέκφραση και πράσινο χρώμα υποέκφραση των αντίστοιχων γονιδίων. Μοριακή ομοιότητα των ασθενών με θετικά και αρνητικά πρόγνωση στην εκπαίδευση και 1

ου σετ επικύρωσης, χρησιμοποιώντας Submap, παρουσιάζεται στον πίνακα β. κάτω από τη γραμμή δείχνει τη σχέση ανάμεσα στο χρώμα και Bonferonni διορθωθεί

σ

τιμές. Κόκκινο χρώμα αντιπροσωπεύει υψηλή εμπιστοσύνη για τη μοριακή ομοιογένεια μεταξύ των αντίστοιχων ομάδων, ενώ το μπλε χρώμα αντιπροσωπεύει την έλλειψη εμπιστοσύνης τους.

Η

Οι εκτιμήσεις επιβίωσης κατά Kaplan-Meier για τους ασθενείς υψηλού και χαμηλού κινδύνου με βάση το 28-γονιδίου προβλέψεις μοντέλο κινδύνου στο σύνολο εκπαίδευσης (α) και 1

σετ st επικύρωσης (β).

η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω την προγνωστική σημασία αυτών των προφίλ, εφαρμόσαμε 28-γονιδίων μας μοντέλο των διαθέσιμων στο κοινό σειρά ασθενών με πρώιμο στάδιο καρκίνου του λάρυγγα [28]. Λόγω τεχνικών διαφορά μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων, 23 από τα 28 γονίδια του μοντέλου μας ήταν χρησιμοποιούνται για τη διαστρωμάτωση των ασθενών με βάση τον κίνδυνο για υποτροπή. Παρά τα τεχνικά και βιολογικά περιορισμούς (διαφορετικές πλατφόρμες, διαφορετικά τον αριθμό των γονιδίων, νωρίς εναντίον όλων των σταδίων της νόσου) το μοντέλο μας διατήρησε προγνωστική σημασία της. Διάμεση DFS για τις ομάδες των ασθενών με δυσμενή και ευνοϊκή πρόγνωση, όπως προβλέπεται από το μοντέλο 23-γονιδίου, ήταν 118 και 161 μήνες αντίστοιχα (log-rank,

σ

= 0,011, σχήμα S1). Το HR για υποτροπή στην ομάδα υψηλού κινδύνου σε σχέση με την ομάδα χαμηλού κινδύνου ήταν 4,37 (95% CI 1,24 έως 15,34, Wald είναι

σ

= 0,022).

Μοριακή ομολογία των ασθενών με ευνοϊκή και δυσμενή πρόγνωση στην εκπαίδευση και 1

ου σετ επικύρωση

το προφίλ των 28 γονιδίων μας φαίνεται όχι μόνο να είναι μια συλλογή των προγνωστικών γονιδίων, αλλά να συλλάβει πραγματικά την υποκείμενη βιολογία των όγκων. Για να αποδειχθεί η μοριακή ομοιογένεια των όγκων υψηλού κινδύνου, χρησιμοποιήσαμε χαρτογράφηση υποκατηγορία (Submap), μια μέθοδος που αξιολογεί μοριακή ομοιότητα των προκαθορισμένων ομάδων που ανήκουν σε διαφορετικά σύνολα δεδομένων. Μπορούμε πράγματι φαίνεται ότι οι ομάδες των ασθενών με κακή και καλή πρόγνωση στο σύνολο εκπαίδευσης έχουν τα ίδια βιολογικά πρότυπα με τις αντίστοιχες ομάδες στο σύνολο επικύρωσης, πάνω και πέρα ​​από την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Τα διαγράμματα εμφανίζουν καλή «μοριακής αντιστοιχίας» των ασθενών υψηλού και χαμηλού κινδύνου που φαίνεται στο Σχήμα 2β.

Ανεξάρτητα προγνωστική σημασία του μοντέλου 28-γονιδίου

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για την απόδειξη της ανεξάρτητης προγνωστική σημασία της πολυγονιδιακής predictor μας. Εμείς που περιλαμβάνονται στο στάδιο της ανάλυσης και ποιότητας, οι μόνοι γνωστοί προγνωστικούς παράγοντες, για τους οποίους υπήρχαν διαθέσιμα για τους ασθενείς της μελέτης μας δεδομένων. Έχουμε επίσης συμπεριλάβει ακτινοθεραπεία, αφού είναι γνωστό ότι μειώνει σημαντικά την τοπική υποτροπή. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, το μοντέλο των 28 γονιδίων μας διατηρείται οριακά προγνωστική σημασία στο σύνολο επικύρωσης 1

st. ΥΕ για υποτροπή στην ομάδα υψηλού κινδύνου ήταν 2,67 (95% CI 0,99 έως 7,22, Wald είναι

σ

= 0,05) (λεπτομέρειες φαίνονται στον Πίνακα 4).

Η

ανάλυση Pathway στις ομάδες υψηλού και χαμηλού κινδύνου

για να αποκτήσουν κάποια πρόσθετη διορατικότητα στις βιολογικές διεργασίες σε ασθενείς με θετικά και αρνητικά πρόγνωση, πραγματοποιήσαμε Gene Set Ανάλυσης (GSA). Ερευνήσαμε δίκτυα γονιδίων και των βιολογικών θεμάτων, όπως περιγράφεται από την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) Διαδρομή βάσης δεδομένων. Έχουμε πράγματι προσδιορίσει ένα ευρύ φάσμα των οδών, διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών (παγκόσμια δοκιμή GSA Goeman του

σ

τιμές & lt? 0,01). Εστιάσαμε τις οδούς απελευθερωθεί τόσο στην εκπαίδευση και στα σύνολα επικύρωσης 1

st. Πίνακας 5 παρουσιάζει επιλεγμένα μονοπάτια του ενδιαφέροντος, ενώ ο πλήρης κατάλογος των μονοπατιών μπορεί να βρεθεί ως στον Πίνακα S2. Αρκετά από αυτά τα μονοπάτια έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι τα γονίδια του εστιακού προσκόλλησης (FA) μονοπατιού [29], που φαίνεται να είναι προγνωστική στη δέσμη στοιχείων μας, καθώς και σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, στρωματοποιημένη επιτυχώς ασθενείς μας με βάση τον κίνδυνο τους επανάληψης (λεπτομέρειες στο Σχήμα 4 )

Kaplan-Meier ελεύθερη νόσου εκτιμήσεις επιβίωσης για τους ασθενείς υψηλού και χαμηλού κινδύνου, όπως ορίζεται από τα κεντρικά γονίδια μονοπάτι πρόσφυσης (log-rank,

σ

& lt?. 0.005).

Η

Ογκογόνες μοτίβα ενεργοποίησης της οδού σε μεμονωμένους ασθενείς

Εκτός από τα προαναφερθέντα αποτελέσματα της ανάλυσης μονοπάτι που προκύπτουν από την αξιολόγηση των ομάδων των ασθενών, επιδιώξαμε να εξερευνήσετε την ενεργοποίηση της οδού σε μεμονωμένους ασθενείς . Έχουμε χρησιμοποιήσει προηγουμένως αναπτυχθεί και επικυρωθεί «in vitro» γονιδιακή έκφραση «διαβάστε-άουτ» για τον προσδιορισμό της ενεργοποίησης των γνωστών ογκογόνων οδών σε κάθε ασθενή της εκπαίδευσης και 1

ου σετ επικύρωσης. Ερευνήσαμε την Src, Ras, β-κατενίνης και E2F3 οδούς, τα οποία έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι σχετίζονται με την επιβίωση σε άλλους τύπους καρκίνου [27]. Είναι ενδιαφέρον, αποδείξαμε ότι οι ασθενείς με κακή πρόγνωση πιο συχνά είχαν όγκους που χαρακτηρίζονται από την ενεργοποίηση της οδού Ras, αναλογία πιθανοτήτων (OR) = 2.92 (95% CI 1,33 έως 6,39, Wald είναι

σ

& lt? 0,01), ενώ οι ασθενείς με καλή πρόγνωση πιο συχνά είχαν όγκους που παρουσιάζουν Src και ενεργοποίηση μονοπατιού β-κατενίνης, OR = 4,54 (95% CI 1,64 έως 12,50,

σ

= 0,003) και 2,63 (95% CI 1,16 έως 5,88,

p

= 0.03), αντίστοιχα. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε Cox αναλογικό παλινδρόμησης κινδύνους επιβίωσης και παρατήρησε ότι η ενεργοποίηση της οδού Ras βρέθηκε να σχετίζεται με κακή πρόγνωση, HR = 2,55 (95% CI 1,19 έως 5,45,

σ

= 0,020). Οι οδοί Src, β-κατενίνης και E2F3 δεν φάνηκε να σχετίζεται με DFS σε ασθενείς με καρκίνο του λάρυγγα. Οι αντίστοιχες καμπύλες Kaplan-Meier παρουσιάζονται στην Εικόνα 5. Τέλος, εκτελέσαμε ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένου του μοντέλου 28-γονίδιο και την οδό Ras και διαπίστωσε ότι η ικανότητα πρόβλεψης διατηρείται ανεξάρτητη προγνωστική σημασία του (Wald του

σ

= 0,001) , όπως έκανε την ογκογόνο οδό (Πίνακας 6).

τιμές RQ έχουν συνδυαστεί ως δυαδικές μεταβλητές για να ληφθεί προφίλ 3-κλίμακα σύμφωνα με τα στοιχεία του πίνακα. Δείκτες όπως υποδεικνύεται. Μπλε και κόκκινο καμπύλες ταιριάζουν με τα αναμενόμενα προγνωστικών μοτίβα που λαμβάνονται στο μοντέλο 28-γονίδιο για τα συγκεκριμένα γονίδια. Γκρι καμπύλες: αταξινόμητη ασθενείς (ενδιάμεση κλίμακα)

Η

qPCR επικύρωση ενός υποσυνόλου των γονιδίων από το 28-γονιδίου προγνωστικός

Οι προαναφερθείσες αναλύσεις έγιναν με φρέσκα-κατεψυγμένα. δείγματα ιστών. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση έχει ορισμένους μεθοδολογικών περιορισμών, όταν πρόκειται για την καθημερινή κλινική πρακτική. Έτσι, προσπαθήσαμε να επικυρώσει πολυγονιδιακής προγνωστικό μας χρησιμοποιώντας qPCR σε δείγματα καρκινικού ιστού FFPE, πιο εύκολα εφαρμόσιμο μεθοδολογία. Όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι, ωστόσο, ήταν δυνατό να διερευνηθεί αξιόπιστα σε σειρά δείγμα FFPE μας την έκφραση μόνο 10 από τα 28 γονίδια στο πρωτότυπο πρόβλεψης. Τα περιγραφικά χαρακτηριστικά των αξιών RQ λαμβάνονται από τα ενημερωτικά δείγματα ανά δοκιμασία που περιγράφεται στον Πίνακα 7 (μέσα, διαμέσους, SD, min, max). Κατά την πρώτη, προσπαθήσαμε να συγκεντρωθούν συνεχή τιμές RQ για όλα αυτά τα γονίδια. Ωστόσο, ιεραρχική συσταδοποίηση δεν απέδωσε αποτελέσματα συγκρίσιμα με το 28-γονίδιο προγνωστικός με ουσιαστικό τρόπο, με την πλειονότητα των υψηλών και χαμηλών τιμών RQ συγκεντρωμένα προς την αντίθετη κατεύθυνση (Σχήματα 6α και β). Αυτό ήταν καμία έκπληξη, διότι μόνο εξετάστηκαν 1/3 των γονιδίων ανιχνεύθηκαν στην υπογραφή συστοιχίας, ενώ πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν πολύ στενό και θα μπορούσε εύκολα να αναστραφεί με μία διαφορετική μέθοδο (qPCR vs. υβριδισμό συστοιχίας ) ή ένα διαφορετικό είδος του υλικού (FFPE εναντίον φρέσκο-κατεψυγμένα ιστούς). Λεπτομερή αναλυτική και στατιστικές προσεγγίσεις για τη συμπεριφορά της κάθε δοκιμασίας qPCR εναντίον του ανιχνευτή συστοιχίας σε συμφωνημένα FFPE εναντίον φρέσκο-κατεψυγμένα δείγματα θα χρειαστούν για την αποσαφήνιση αυτής της διαφοράς, ωστόσο, μια τέτοια ανάλυση σε βάθος ήταν πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτη. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη εφαρμόστηκε προκαθορισμένο προφίλ για τη διερεύνηση των πιθανών επιπτώσεων των γονιδίων δοκιμαστεί με qPCR στο DFS ασθενή. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε μετασχηματισμένα συνεχείς τιμές RQ σε δυαδικά παραμέτρους (υψηλή /χαμηλή έκφραση). Με βάση την στενή πολλαπλή μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των καλών και κακών ομάδων πρόγνωση στην 28-γονίδιο προγνωστικό, χρησιμοποιήσαμε διάμεσες τιμές RQ να κατατάξει υψηλή και χαμηλή έκφραση για τα 10 αξιολογήσιμους γονίδια. Log-rank δοκιμών για αυτά τα γονίδια ως ενιαίο δεικτών απέδωσε τις ενώσεις με αποτέλεσμα παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν για τις αντίστοιχα γονίδια στην υπογραφή U133A (υψηλή /χαμηλή μοτίβα συγκρίσιμα με πάνω και κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, αντίστοιχα, για 6 από τα 10 γονίδια), μερικές από τις οποίες ήταν σημαντικές (PRKD1) ή έδειξαν μία τάση για σημαντικότητα (ACE2, FLOT1) (Πίνακας 8). Ιεραρχική ομαδοποίηση των συνεχών τιμές RQ για τις τρεις τελευταίες γονίδια απέδωσε δύο ομάδες ασθενών με σημαντικά διαφορετική DFS (Εικόνες 6c και δ). Το αναμενόμενο πρότυπο έκφρασης του γονιδίου ήταν παρούσα στο σωστό πλαίσιο με αποτέλεσμα, αλλά ήταν απούσα στην πλειονότητα των περιπτώσεων.

Ιεραρχική ομαδοποίηση των τιμών RQ από τα γονίδια δοκιμάστηκαν στο

ου σετ επικύρωσης 2 (δείγματα FFPE ). Στο πάνελ Α και Β, αξιολογήθηκαν οι τιμές RQ από τις 10 που εφαρμόζονται γονίδια. Εντοπίστηκαν δύο μεγάλες συστάδες (α) που έδειξαν να έχουν σημαντική επίδραση επί DFS ασθενή (b). Cluster 1 σχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση σε σχέση με τον Cluster 2. Ωστόσο, η πλειονότητα αυτών των γονιδίων ήταν συγκεντρωμένα στην αντίθετη κατεύθυνση από αυτή που αναμένεται από το 28-γονίδιο ταξινομητή. Στο πάνελ c και d, η ομαδοποίηση των 3 γονιδίων με μεμονωμένα σημαντικές συσχετίσεις απέδωσε 2 ομάδες ασθενών με διαφορετικά αποτελέσματα? σε σύγκριση με την αρχική 28-γονίδιο ταξινομητής, σωστή πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ήταν παρόντες στα αντίστοιχα καλά και κακά ομάδες πρόγνωση. Κόκκινα και πράσινα χρώματα σε πίνακες Α και C υποδηλώνουν υψηλή και χαμηλή έκφραση, αντίστοιχα.

Η

Η

Εφαρμογή των υψηλών προτύπων καλής πρόγνωσης /χαμηλή έκφραση του γονιδίου στις δυαδικές μετατραπεί τιμές RQ αποκάλυψε