Αφηρημένο

Η νοσηρότητα και η θνησιμότητα του καρκίνου του προστάτη (PCA) έχουν αυξηθεί τα τελευταία χρόνια σε όλο τον κόσμο. Επί του παρόντος, οι υπάρχουσες μέθοδοι για τη διάγνωση και τη θεραπεία δεν κάνουν η κατάσταση βελτιωθεί, ειδικά για ορμονοάντοχο καρκίνο του προστάτη (HRPC). Η έλλειψη των μοριακών ανιχνευτών για την PCA εμπόδισε την έγκαιρη διάγνωση των μεταστάσεων και ακριβής σταδιοποίηση για την PCA. Σε αυτό το έργο, έχουμε αναπτύξει ένα νέο αισθητήρα απταμερούς Wy-5α ενάντια προστάτη κυτταρική σειρά PC-3 με την τεχνική των κυττάρων-SELEX. Wy-5α δείχνει υψηλή ειδικότητα στα κύτταρα-στόχους με σταθερές διάστασης στο εύρος nanomolar, και δεν αναγνωρίζει άλλα δοκιμάστηκαν κυτταρικές γραμμές προστάτη και άλλων δοκιμάστηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η χρώση των τμημάτων κλινικής ιστού με φθορίζουσα χρωστική επισημανθεί Wy-5α δείχνει ότι τμήματα από ομάδα υψηλού κινδύνου με μετάσταση παρουσίασαν ισχυρότερη φθορισμού και τμήματα από Καλοήθη Υπερπλασία του Προστάτη (ΚΥΠ) δεν παρουσιάζουν αξιοσημείωτες φθορισμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι απταμερούς Wy-5α μπορεί να συνδεθεί με πρωτεΐνης που σχετίζονται με την εξέλιξη της ΣΕΣΣ. Η υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση των Wy-5α κάνει αυτό το δυναμικό κράτημα απταμερούς για εφαρμογή στη διάγνωση και τη θεραπεία του προστάτη στοχεύουν

Παράθεση:. Wang Υ, Luo Υ, Bing Τ, Chen Ζ, Lu Μ, Ζανγκ Ν, et al. (2014) DNA απταμερές Evolved από το Cell-SELEX για αναγνώριση του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (6): e100243. doi: 10.1371 /journal.pone.0100243

Επιμέλεια: Sabato D’Auria, CNR, Ιταλία

Ελήφθη: 18 του Γενάρη του 2014? Αποδεκτές: 23, Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν την οικονομική υποστήριξη από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172430, 81372728, 21205124 και 81201694) και Grant 973 Πρόγραμμα (2011CB935800) και Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (20120171120059). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μη-δερματικό νεόπλασμα στον ανδρικό πληθυσμό παγκοσμίως [1]. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι το συμβάν του PCA είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι πριν από είκοσι χρόνια [2]. Τα στατιστικά ενημέρωση δείχνει ότι η νοσηρότητα του προστάτη έχει ξεπεράσει τον καρκίνο του πνεύμονα και να γίνει η πιο συχνή κακοήθης όγκος στους άνδρες. Περισσότεροι από 238.590 άνδρες θα διαγνωστεί με προστάτη και 29.720 θα πεθάνουν από τη μεταστατική προστάτη στις Ηνωμένες Πολιτείες (ΗΠΑ) το 2013, καθιστώντας την δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις αμερικανικές άνδρες, πίσω από τον καρκίνο του πνεύμονα [3]. Δυστυχώς, οι περισσότεροι ασθενείς προστάτη στην Ασία είχε προχωρήσει τοπική ασθένεια ή μεταστάσεις από τη στιγμή που είχαν διαγνωστεί, και τα ποσοστά θνησιμότητας του προστάτη μπορεί να συνεχίσει να αυξάνεται στις περισσότερες χώρες της Ασίας. Αυτό μπορεί να προκληθεί από τις αλλαγές της ζωής ή διαιτητικών ύφος και το περιβάλλον [4].

Η απόδοση του προστάτη σε πρώιμο στάδιο παρουσιάζει μια σχετικά νωχελικός θεραπεία στην πλειονότητα των ασθενών [5]. Αυτό το χαρακτηριστικό κάνει προστάτη δύσκολο να παρατηρήσει και να διαγνωστεί σε αρχικό στάδιο. Όταν οι ασθενείς είναι στον πόνο, τα περισσότερα από αυτά έχουν συμβεί στην μετάσταση στα οστά. Αρχικά, οι περισσότεροι ασθενείς PCa είναι ευαίσθητα στη θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT), αλλά η διάρκεια είναι ετερογενής, θα μπορούσε να διαρκέσει από μερικούς μήνες έως περισσότερο από 3 χρόνια [6]. Τελικά, η PCA μπορεί να εξελιχθεί σε ορμονοάντοχο καρκίνο του προστάτη (HRPC), το οποίο είναι ανθεκτικό στη συμβατική θεραπεία. Η επιτυχής θεραπεία του καρκίνου βασίζεται στην έγκαιρη διάγνωση και ακριβή σταδιοποίηση, και τα δύο εκ των οποίων απαιτούν κατάλληλου μοριακού καθετήρες και βιοδείκτες [7]. Επιπλέον, οι διαφορές μοριακό επίπεδο αποφασίσει φαινότυπο? εξατομικευμένη θεραπεία βασίζεται σε αυτές τις διαφορετικές βιοδείκτες για τη διάγνωση και διάκριση ακριβώς. Όμως, η έλλειψη των μοριακών ανιχνευτών για τα κύτταρα του προστάτη εμπόδισε την έγκαιρη διάγνωση των μεταστάσεων και ακριβής σταδιοποίηση για την PCA. Ορός ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) είναι ένας βιοδείκτης για την PCA, και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανίχνευση του προστάτη. Η συγκέντρωση του PSA είναι επίσης σχετίζεται με κακοήθη βαθμό και υποτροπή του όγκου. Ωστόσο, το PSA δεν είναι ένας ειδικός δείκτης του προστάτη από το επίπεδο αυξάνεται στον ορό του με Καλοήθη Υπερπλασία του Προστάτη (ΚΥΠ) και επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως φάρμακα (Finasteride), ουρολογικές χειρισμούς, φλεγμονή, ή ακόμα και εκσπερμάτιση [8], [9] . Παρά το γεγονός ότι, μαζί με τη γενίκευση των προσυμπτωματικού ελέγχου με ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), η διαγνωστική ρυθμός και η έγκαιρη θεραπεία βελτιώθηκε γρήγορα, αλλά η κλινική δοκιμή στην Αμερική και την Ευρώπη δείχνουν ο έλεγχος δεν έχει καμία αποτελεσματική στη μείωση της θνησιμότητας από προστάτη [ ,,,0],10], [11]. Έτσι, για να βελτιωθεί η κλινική ταξινόμηση και εξατομικευμένη χημειοθεραπεία, εξακολουθεί να πρέπει να βρει νέους βιοδείκτες ή ανιχνευτές με μεγαλύτερη εξειδίκευση.

Πρόσφατα, μια νέα κατηγορία των μοριακών ανιχνευτών που ονομάζεται απταμερές έχει προσελκύσει πολλή προσοχή ως μοριακοί ανιχνευτές για τη διάγνωση της νόσου και θεραπεία. Απταμερή είναι μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που θα μπορούσε να πάει πάσο σε μοναδική τριτοβάθμια δομές μέσα από διάφορες ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις [12]. Παρόμοια με τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην κλινική άγρια, απταμερή μπορούν να προσδένουν ειδικά διάφορους στόχους που κυμαίνονται από μικρά οργανικά μόρια με τις πρωτεΐνες του [13], [14]. Συγκρίνοντας με τα αντισώματα, απταμερή έχουν χαμηλού μοριακού βάρους, μεγαλύτερη σταθερότητα, η διείσδυση ταχεία ιστών, έλλειψη ανοσογονικότητας [15] – [18], και ιδιαίτερα, απταμερή μπορούν να συντεθούν χημικά και να τροποποιηθούν [19]. Αυτά τα πλεονεκτήματα κάνουν απταμερών ευέλικτα εργαλεία για τη διάγνωση [20], Εικόνα κυτταρομετρίας [21] και στοχευμένη θεραπευτική [22].

Τα απταμερή δημιουργούνται από την τεχνολογία SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) [20], [23]. Κυττάρου-SELEX είναι μία διαδικασία επιλογής απταμερές χρησιμοποιώντας ολόκληρα κύτταρα ως στόχους, η οποία παράγει κυττάρου-ειδική απταμερή χρησιμοποιώντας τις διαφορές στο μοριακό επίπεδο μεταξύ οποιωνδήποτε δύο κυτταρικές σειρές [19], [24] – [27]. Με κυττάρων-SELEX, ένα πάνελ απταμερών που specically συνδέονται προς στόχευση κυτταρική γραμμή μπορούν να ταυτοποιηθούν χωρίς την προηγούμενη γνώση των ακριβών πρωτεΐνες μεμβράνης. Κατά τη διαδικασία του εμπλουτισμού, τα ζωντανά κύτταρα διασφάλιση των στόχων που υφίστανται κατά την μεμβράνη διατηρούν το σχηματισμό τους φύση, έτσι τα λαμβανόμενα απταμερή θα διατηρήσει την ίδια συγγένεια και ειδικότητα στην κυτταρική εφαρμογές τους [28]. Σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε την επιλογή απταμερούς έναντι PC-3 κύτταρα (μια κυτταρική γραμμή PCA). Μέσω κύτταρο-SELEX, ταυτοποιήσαμε ένα απταμερές DNA, το οποίο δεσμεύεται ειδικά σε PC-3 κύτταρα και μπορούν να διακρίνουν τα δείγματα ΒΡΗ και δείγματα προστάτη υψηλού κινδύνου από κλινική.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

επιλογή απταμερές έναντι PC-3 κύτταρα

Η διαδικασία της επιλογής απταμερούς φαίνεται στο Σχήμα 1. Η κυτταρική γραμμή στόχος PC-3 είναι ένα τυπικό κυτταρική γραμμή από ανδρογόνα ανεξάρτητο ασθενή με καρκίνο με οστικές μετάσταση. ασθενείς ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο με οστικές μετάσταση είναι η πιο δύσκολη να αντιμετωπιστεί. Για να δημιουργηθούν απταμερή με υψηλή εξειδίκευση, θα χρησιμοποιείται περισσότερο από ένα είδος κυτταρικής γραμμής ως αρνητικός έλεγχος για την επιλογή μετρητή, συμπεριλαμβανομένων των μη όγκου-αθανατοποιημένα προστάτη επιθηλιακά κύτταρα γραμμή RWPE-1, ανθρώπινα ηπατικά κυτταρική γραμμή καρκινώματος SMMC-7721 και ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών τραχήλου γραμμή Hela.

η

Για τον πρώτο γύρο επιλογής, τα κύτταρα-στόχοι επωάστηκαν με πισίνα βιβλιοθήκη τυχαίων DNA. Μετά την πλύση, οι παραμένοντες αλληλουχίες σε κύτταρα ενισχύθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), και διαχωρίζεται σε αλληλουχίες μονής έλικας για το δεύτερο γύρο επιλογής. Από το δεύτερο γύρο επιλογής, τα αρνητικά κύτταρα επωάστηκαν με το εμπλουτισμένο συνένωμα πριν από το κύτταρο στόχο δέσμευσης με σκοπό την εξάλειψη των αλληλουχιών που δεσμεύονται στα κοινά μόρια παρόντα στην επιφάνεια των κυττάρων στόχων και κυττάρων ελέγχου. Για κάθε δύο ή τρεις γύρους επιλογής, ο εμπλουτισμός απταμερές παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή απεικόνιση. Αν εμπλουτίστηκαν αλληλουχίες απταμερούς, η ένταση φθορισμού επί της επιφανείας του PC-3 κύτταρα έγινε εντονότερη μετά από επώαση των κυττάρων με τα επιλεγμένα πισίνες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η ένταση του φθορισμού στην επιφάνεια των PC-3 κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά κατά τους πρώτους δέκα γύρους επιλογής, και την ενίσχυση του φθορισμού στα κύτταρα ελέγχου (SMMC-7721, Σχήμα 2Β) ήταν πολύ μικρότερο, υποδεικνύοντας ότι απταμερή για το στόχο κύτταρα σε μεγάλο βαθμό εμπλουτίζεται. Ωστόσο, μετά εκτελέστηκε περαιτέρω πέντε γύρους επιλογής, αν και ο φθορισμός στο PC-3 κύτταρα ήταν ακόμη ισχυρότερη από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου, η ενίσχυση φθορισμού σε κύτταρα PC-3 έγινε πιο αργή και ότι σε κύτταρα ελέγχου έγινε γρηγορότερα, γεγονός που υποδηλώνει ότι περισσότερο μη ειδικά αλληλουχίες ότι δεσμευμένο και στις δύο κυτταρικές σειρές εμπλουτίζεται. Ομοεστιακή απεικόνισης (Σχήμα 2C) έδειξαν ότι απταμερή δεσμεύονται επί της μεμβράνης των κυττάρων-στόχων. Μετά από άλλες δύο γύρους επιλογής με ισχυρότερα επιλογή μετρητή, ο 17ος γύρος πισίνα κλωνοποιήθηκε και 50 κλώνοι αλληλουχήθηκαν.

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας των επιλεγμένων δεξαμενών συνδέεται με τις στοχευόμενες κυτταρική γραμμή PC-3 (Α) και αρνητική κυτταρική έλεγχος γραμμή SMMC-7721 (Β), Blank είναι ο φθορισμός υποβάθρου των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Lib είναι επισημασμένο με FITC βιβλιοθήκη DNA ως αρνητικός έλεγχος. (Γ) Ομοεστιακή απεικόνιση PC-3 κύτταρα χρωματίστηκαν με το 15ο γύρο επιλέγονται πισίνα σημασμένο με FITC (χ 100 φακός εμβύθισης έλαιο).

Η

Προσδιορισμός των απταμερών κατά κυττάρων στόχων

Μετά την ευθυγράμμιση, τα ληφθέντα αλληλουχίες των 50 κλώνοι βρέθηκαν να διανείμει σε 5 οικογένειες, σύμφωνα με τις ομοιότητες των αλληλουχιών Thier. Μέσω αναλύοντας την προβλεπόμενη δευτερεύουσα δομή των αλληλουχιών σε κάθε οικογένεια [29] – [31], έξι αλληλουχίες περικοπεί και συντέθηκαν για δοκιμασία σύνδεσης (αλληλουχίες δεν φαίνονται). Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας έδειξαν ότι μία αλληλουχία, Wy-5α επέδειξε τα ισχυρότερα πρόσδεσης σε κύτταρα PC-3 και τον ασθενέστερο πρόσδεση σε άλλους τύπους κυττάρων (Εικόνα S1)? Ως εκ τούτου, αυτή η αλληλουχία χαρακτηρίστηκε περαιτέρω. Η πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής [32] έδειξε ότι Wy-5a υιοθέτησε μια δομή στελέχους βρόχου με μια one-βάσης εξόγκωμα στο στέλεχος (Σχήμα 3). Αφαίρεση της μίας βάσης διόγκωση, μια τέλεια ακολουθία δομή στελέχους-βρόχου Wy-5β (Πίνακας 1) συντέθηκε επίσης για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Δοκιμασία σύνδεσης έδειξαν ότι Wy-5a και Wy-5β δεσμεύεται ειδικά σε PC-3 κύτταρα (Σχήμα 3). Οι σταθερές διάστασης ισορροπίας (

K

δ) του Wy-5a και Wy-5β υπολογίστηκαν να είναι 73.59 ± 11.01 και 173.1 ± 44.67, υποδεικνύοντας ότι απταμερούς Wy-5α έχει υψηλότερη συγγένεια με το PC-3 κύτταρα από Wy-5β. Η υψηλότερη συγγένεια του Wy-5a δείχνει ότι η διόγκωση ενός βάσης επί του στελέχους του Wy-5a μπορεί να περιλαμβάνει τη σύνδεση με το στόχο του. Λόγω της υψηλότερης συγγένειας Wy-5a, αυτό χαρακτηρίστηκε περαιτέρω ως νέο ανιχνευτή για ανίχνευση PCa.

Οι συγκεντρώσεις του DNA είναι 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16, 32, 64, 128 και 256-σημασμένο DNA βιβλιοθήκη (Lib). Η προβλεπόμενη δευτερεύουσα δομή του Wy-5a και WY-5β (δεξιά), ήταν ανοικοδόμηση από το εργαλείο που παρέχεται από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies (IDT). [Www.IDTdna.com/page/scitools].

Η

Εξειδίκευση Επιλεγμένων απταμερή

Η ιδιαιτερότητα της Wy-5α και σε άλλες κυτταρικές σειρές όγκων διερευνήθηκε με κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή απεικόνιση (Σχήμα 4). Ανάμεσα σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές, Wy-5A συνδέεται μόνο προς PC-3 κυτταρική γραμμή, δεν συνδέονται με άλλες κυτταρικές σειρές προστάτη (όπως DU145, από PCa μετάσταση εγκεφάλου με μέτρια μεταστατικό δυναμικό? 22RV-1, από την τοπική PCa χωρίς μεταστατική δυναμικό), και άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα καρκίνος κυτταρική γραμμή (Α549), ανθρώπινα μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή (MCF-7), ανθρώπινου εγκεφαλικού καρκινικής κυτταρικής γραμμής (HeLa), κυτταρική γραμμή ηπατώματος (SMMC-7721), ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρο γραμμές (LoVo και HCT-8), κυτταρική σειρά λευχαιμίας (Jurkat) και της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας κυτταρική γραμμή (Κ562) (πίνακας S1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι απταμερούς Wy-5α έχει εξαιρετική εξειδίκευση στο κύτταρο στόχο γραμμή. Η υψηλή εξειδίκευση καθιστά Wy-5α έχει τη δυνατότητα για την εφαρμογή στην ανίχνευση των μεταστάσεων προστάτη ή ένα εργαλείο για τη θεραπεία του στόχου

Σειρά Α, στοχεύουν κυτταρική σειρά PC-3.? Σειρά Β, SMMC-7721? Σειρά C, HeLa? Σειρά D, 22RV-1. Colum 1, εικόνες φθορισμού? Colum 2, επικάλυψη των εικόνων φθορισμού και εικόνες φωτεινό πεδίο, Colum 3, Ιστόγραμμα Οικόπεδο ροής. Blank είναι ο φθορισμός υποβάθρου των μη επεξεργασμένων κυττάρων, αντίστοιχα? Lib είναι επισημασμένο με FITC βιβλιοθήκη DNA ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Οι θέσεις σύνδεσης του απταμερούς επί των κυττάρων στόχων

Η συνεστιακή απεικόνιση έχει δείξει ότι οι λαμβανόμενες απταμερή δεσμεύονται στην επιφάνεια των κυττάρων ( Εικόνα 2C και το σχήμα 4 Row α), έτσι ένα πείραμα πέψη πρωτεϊνάσης διεξήχθη για να εξακριβώσει αν το μόριο στόχος είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, μετά την κατεργασία με θρυψίνη ή πρωτεϊνάση Κ για 2 λεπτά, PC-3 κύτταρα σχεδόν δεν δεσμεύει Wy-5a, υποδεικνύοντας ότι το μόριο στόχος του απταμερούς Wy-5 είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης.

Μετά την επεξεργασία με θρυψίνη ή πρωτεϊνάση Κ, PC-3 κύτταρα σχεδόν δεν δεσμεύει Wy-5α. Blank είναι ο φθορισμός υποβάθρου των μη επεξεργασμένων κυττάρων, αντίστοιχα.

Η

Η εσωτερικοποίηση του Wy-5α

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ολιγονουκλεοτίδια περισσότερο από 25 βάσεις δεν μπορούν να διαπεράσουν τη μεμβράνη ελεύθερα [33] , [34]. WY-5α είναι ένα 52-βάσεων ολιγονουκλεοτίδιο, στοχεύει μια πρωτεΐνη της μεμβράνης. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσο Wy-5a μπορεί να εσωτερικεύουν σε κύτταρα μέσω ενδοκύτωσης με υποδοχέα, PC-3 κύτταρα επωάστηκαν με Wy-5α στους 37 ° C για 2 ώρες. Η αύξηση του tempreture από 4 ° C έως 37 ° C δεν επηρεάζει πολύ τη δέσμευση του Wy-5α έως PC-3 κύτταρα (Σχήμα S2). Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας (Σχήμα 6) έδειξαν ότι η προ-επεξεργασία των κυττάρων με θρυψίνη προκαλείται σχεδόν πλήρης απώλεια του απταμερούς πρόσδεσης (σε σύγκριση με μη δεσμευμένο labrary DNA). Ωστόσο, η θεραπεία του κυττάρου με θρυψίνη μετά την πρόσδεση απταμερούς προκαλείται μόνο μερική απώλεια του απταμερούς δέσμευσης, υποδηλώνοντας ότι μερικοί Wy-5α μπορούσε εσωτερικεύουν σε κύτταρα. Στο συνεστιακό εικόνα του PC-3 κυττάρων μετά από επώαση με Wy-5α στους 37 ° C για 2 ώρες (Εικόνα 6), ισχυρό σήμα φθορισμού παρατηρήθηκε στην κυτταρική μεμβράνη και ασθενές σήμα φθορισμού βρέθηκε σε ολόκληρα κύτταρα. Αλλά η η ομοεστιακή εικόνα των κυττάρων icubated βιβλιοθήκη DNA δεν έδειξε σημαντική σήματος φθορισμού με εξαίρεση ορισμένες μη ειδική φωτεινά σημεία dispersedly προσροφώνται στα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Wy-5α μπορεί να εμπλέκεται σε ενδοκύτωσης με υποδοχέα

W /O αγωγή:. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Wy-5α? Προεπεξεργασία: κύτταρα προκατεργάστηκαν με θρυψίνη και στη συνέχεια επωάζονται Wy-5α? Μετεπεξεργασία: τα κύτταρα επωάστηκαν Wy-5α και στη συνέχεια κατεργάζεται με θρυψίνη? Lib: negtive έλεγχος, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο βιβλιοθήκη DNA? κενό:. είναι ο φθορισμός υποβάθρου των μη επεξεργασμένων κυττάρων

Η

Η χρώση των κλινικών προστάτη διαφάνειες

Πάνω αποτελέσματα hav δείξει ότι απταμερούς Wy-5α έχει εξαιρετική εξειδίκευση στο PC 3-κυττάρων πάνω DU145 και 22RV-1 κύτταρα. PC-3 κυτταρική σειρά ξεκίνησε από μια μετάσταση στα οστά ενός βαθμού IV ανδρογόνα ανεξάρτητο ασθενή ΣΕΣΣ. Επιπλέον, η σκελετική εμπλοκή είναι η πιο κοινή μεταστατική θέση σε προχωρημένο στάδιο PCa, παρατηρήθηκε σε έως και 80% των ασθενών [35]. DU145 προήλθε από PCa μετάσταση εγκεφάλου με μέτρια μεταστατικό δυναμικό, και δεν είναι ορμονο-ευαίσθητος [36]? 22RV-1 είναι μία ανθρώπινη κυτταρική γραμμή προστάτη αλλά χωρίς μεταστατικό δυναμικό που προέρχεται από ένα ξενομόσχευμα σε ποντικούς [37]. Ως εκ τούτου, η πρωτεΐνη-στόχος του Wy-5a μπορεί να έχει συσχέτιση με επιθετικότητα ή μετάσταση. Έτσι απταμερούς Wy-5α μπορεί να έχουν τη δυνατότητα ταξινόμηση των όγκων και στάσης. Προκειμένου να ελεγχθεί η σκοπιμότητα της Wy-5α για την ταξινόμηση των όγκων και στάσης, χρησιμοποιήσαμε αυτό το απταμερές για τη χρώση τμημάτων ιστού του προστάτη από την κλινική τους ασθενείς. Ο αρνητικός μάρτυρας είναι ιστούς καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, μια διαδεδομένη noncancerous αλλαγή στην ηλικίας άνθρωπο. ιστούς όγκων είχαν πάρει από τους ασθενείς με προστάτη (που προσδιορίζονται από τα ανώτερα παθολόγο, ο τρίτος συνδεδεμένες νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Sun Yat-Sen). Οι τομές κόπηκαν από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς, και τα αντιγόνα μεμβράνης επισκευάστηκαν με βρασμό EDTA Antigen Ανάκτηση λύση πριν τη χρώση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, μετά χρωματίστηκαν με FITC (ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη) σημασμένο απταμερούς Wy-5α, τους ιστούς του καρκίνου εμφάνισαν ισχυρό σήμα φθορισμού. Ωστόσο, το σήμα φθορισμού ήταν σχεδόν παρατηρήθηκε στη διαφάνεια της ΚΥΠ ιστού

Σπάνια φθορισμού σήμα. (-) Παρατηρήθηκε σε διαφάνειες BPH. Σε καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη, Gleason σκορ: 2 + 3, καμία απόδειξη των άλλων μετάσταση οργάνου, παρατηρήθηκε πολύ ασθενές σήμα φθορισμού (+). Στον ασθενή χαμηλού διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη, Gleason σκορ: 5 + 5, με μετάσταση στα οστά, παρατηρήθηκε ισχυρό σήμα φθορισμού (+++). (Colum 1) HE χρώση τμήμα παραφίνης από κλινικό δείγμα, (Colum 2) Φωτεινό τομέα της συνεστιακής, (Colum 3) το σήμα φθορισμού της συνεστιακής.

Η

Η χρώση όλων των διαφανειών ήταν συνοψίζονται στον Πίνακα 2 . Συνολικά, όλοι οι 10 διαφάνειες BPH από διαφορετικούς ασθενείς εμφάνισαν αρνητικά αποτελέσματα και διαφάνειες 20 καρκίνο από τις 28 περιπτώσεις του καρκινικού ιστού έδειξε θετικά αποτελέσματα. Μόνο 8 περιπτώσεις διαφάνειες καρκίνου δεν θα μπορούσε να χρωματίζονται από το απταμερές. Συγκρίνοντας το σκορ Gleason των ιστών του καρκίνου και το ιατρικό ιστορικό των ασθενών, βρήκαμε ένα ενδιαφέρον φαινόμενο: οι διαφάνειες από ασθενείς με υψηλή βαθμολογία Gleason (& gt? 6) με οστικές μεταστάσεις έδειξε ισχυρότερη φθορισμού στην κυτταρική μεμβράνη από χαμηλή βαθμολογία (≤6 ) χωρίς μετάσταση (σχήμα 7). Αυτό έδειξε ότι η πρωτεΐνη-στόχος του Wy-5α εντόνως εκφρασμένο σε αυτούς τους ασθενείς με υψηλή βαθμολογία μετάσταση. Το σύστημα ταξινόμησης Gleason είναι ένα ισχυρό εργαλείο για να προβλέψουν και τις ενισχύσεις για τη θεραπεία ανδρών με προστάτη. Με βάση την παθολογική δομή των επιθηλιακών αδένων, η εικόνα ιστός ταξινομείται σε πέντε τύπους. Από την πρώτη μέχρι την πέμπτη τύπο, ο βαθμός διαφοροποίησης μειώνεται σταδιακά [38]. Από σκορ Gleason αντανακλά το βαθμό κακοήθειας του προστάτη, αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να συνεπάγεται ότι η πρωτεΐνη-στόχος του Wy-5α ίσως έχουν κάποια σχέση με την κακοήθη βαθμό ή επιθετικότητα ή την πρόοδο του όγκου. Περαιτέρω προσδιορισμός και η αξιολόγηση της πρωτεΐνης θα διεξάγεται για να φωτίσει αυτό το ζήτημα. Αυτό το σύνολο των αποτελεσμάτων δείχνει απταμερούς Wy-5α έχει τη δυνατότητα να λειτουργήσει ως ανιχνευτής για τη διάγνωση του προστάτη.

Η

Οι ασθενείς προστάτη με υποτροπή ή σε προχωρημένο στάδιο θα γίνει τελικά HRPC και δεν παρουσιάζουν κανένα ανταποκρίνεται σε ADT [6]. Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα φάρμακα της εκτός από την ορμόνη ανθεκτικότητα, κάνουν την επίδραση της θεραπείας απογοητευτικό [39]. Ωστόσο, ετερογενή διάρκεια έδειξαν ότι οι τύποι και οι εκδηλώσεις των ασθενών είναι διάφορες. Ακριβής ταξινόμηση του τύπου ή βαθμού είναι χρήσιμο για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Ως εκ τούτου, τα περισσότερα διαγνωστικά αντιδραστήρια που απαιτούνται, προκειμένου να επιλέξουν τη βέλτιστη εξατομικευμένη θεραπεία. Μερικά χημειοθεραπευτικά είναι αποτελεσματικές in vitro, αλλά η έλλειψη κυτταρικής επιλεκτικότητας, σοβαρή τοξικότητα και παρενέργειες περιορίζονται χρήση τους in vivo. Απταμερούς μεσολάβηση στοχευμένες φάρμακο μπορεί να είναι μια καλή λύση. Μέχρι τώρα ημέρες, μόνο ένα RNA απταμερές με στόχο PCa έχει δημιουργηθεί με την παραδοσιακή μέθοδο SELEX, δηλ απταμερές έναντι PSMA (ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης, εκφράζεται μόνο στην κυτταρική σειρά LNCaP) [40]. Για την τυπικά κυτταρική σειρά PC-3, δεν υπάρχει ακόμα κανένα ολιγονουκλεοτίδιο απταμερές εξελιχθεί. Πρόσφατα απταμερές βάση παροχής φαρμάκου έχει δείξει καλά αποτελέσματα [41]. Η υψηλή συγγένεια και ειδικότητα για PC-3 κυτταρική γραμμή και να καρκινικούς ιστούς με υψηλό κίνδυνο και μετάσταση υποδηλώνουν ότι το δυναμικό DNA απταμερούς Wy-5α αναμονή στον τομέα της ταξινόμησης, ανίχνευση και θεραπεία των ασθενών στόχος προστάτη.

Πειραματικό τμήμα

κυτταρική καλλιέργεια

Δώδεκα καθιερωμένες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν: RWPE-1 είναι μια αθανατοποιημένη φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. PC-3, DU-145 και 22RV-1 είναι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του προστάτη. SMMC-7721 είναι ένα ανθρώπινο ηπατικό κυτταρική γραμμή καρκινώματος. LoVo και Hct-8 κύτταρα είναι κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος. HeLa είναι ένα ανθρώπινο αυχενικό καρκινικές κυτταρικές σειρές. Α549 είναι μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα. MCF-7 είναι μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου του μαστού, Jurkat είναι μια οξεία λευχαιμία Τ κυττάρων κυτταρική γραμμή, Κ562 είναι μια χρόνια μυελογενή λευχαιμία κυτταρική γραμμή. RWPE-1, PC-3, DU-145, 22RV-1, κυτταρικές σειρές LoVo SMMC-7721 και αγοράστηκαν από Τυπική τράπεζα κυττάρων διατήρηση Επιτροπή πολιτισμό, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). HeLa, Α549, MCF-7, Jurkat και Κ562 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο των Βασικών Ιατρικών Επιστημών της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). RWPE-1 καλλιεργήθηκε σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Κ-SFM) με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (ΒΡΕ) και ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF), οι άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (FBS, GIBCO) και 100 μονάδες /mL πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (Sigma). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Σε όλη τη διαδικασία, κάθε σημαντικό δείκτη της αυξανόμενης στα κύτταρα πρέπει να κρατήσει σταθερή και κύτταρα διατηρούνται σε καλή κατάσταση, τα οποία δημιουργούν μια σταθερή βάση για περαιτέρω πειράματα.

Ρυθμιστικό

ρυθμιστικό ρούχων παρασκευάστηκε με την προσθήκη 5 mmol MgCl

2 και 4,5 g γλυκόζης σε 1 L 0,01 Μ PBS (περιέχει 8 g NaCl, 0,2 g ΚΟΙ, 3.58 g Na

2HPO

4 · 12Η

2O, 0.272 g ΚΗ

2 ΡΟ

4 ανά 1 L DDH

2O. ρΗ = 7,4) χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο. Το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης παρασκευάστηκε με προσθήκη 1 mg /mL αλβουμίνης βόειου ορού (BSA, Sigma) και 0,1 mg /mL DNA σπέρματος ρέγγας (Invitrogen) για να ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης.

SELEX ssDNA βιβλιοθήκη και εκκινητές PCR

Το HPLC καθαρισμένο βιβλιοθήκη περιείχε ένα κεντρικό τυχαιοποιημένη αλληλουχία 45 νουκλεοτιδίων (nt) περιστοιχίζεται από θέσεις υβριδισμού εκκινητή 20-nt (5′-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45nt-CTCATGGACGTGCTGGTGAC -3 ‘). Ένα ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου 5′-εκκινητή (5’-FITC-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3 ‘) και ένα βιοτινυλιωμένο (Bio) 3′-εκκινητή (5′-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’) χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις PCR για τη σύνθεση του διπλά επισημασμένου, δίκλωνα μόρια DNA. Μετά τη μετουσίωση σε αλκαλικές συνθήκες (0,2 Μ ΝαΟΗ), το FITC- συζευγμένο αίσθηση ssDNA απταμερές διαχωρίζεται από το βιοτινυλιωμένο αντινόημα ssDNA κλώνο από στρεπταβιδίνη-επικαλυμμένων σφαιρίδια sepharose (Streptavidin Sepharose υψηλής απόδοσης) (GE Healthcare, Sweden) και χρησιμοποιήθηκε για το επόμενο γύρο επιλογής ή δοκιμασία πρόσδεσης. Η διαδικασία επιλογής παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας και συνεστιακή απεικόνιση.

Διαδικασία της SELEX

Η διαδικασία της κυτταρικής SELEX είναι παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Σε συντομία, η μέθοδος πραγματοποιήθηκε όπως ακολουθεί τα βήματα (Σχήμα 1). Πριν από κάθε γύρο SELEX, τα κύτταρα-στόχους PC-3 καλλιεργήθηκαν σε 80~90% συρροή και τα αρνητικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν για να ολοκληρωθεί συρροή σε 60 mm τρυβλία Petri και πλένονται τρεις φορές με PBS προψυχθέν. 10 nmol αρχική βιβλιοθήκη ssDNA διαλύθηκε σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης μετουσιώθηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά και διατηρήθηκε σε λουτρό πάγου για 15 λεπτά, στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου περίπου μισή ώρα πριν χρησιμοποιηθεί. Μετά την επώαση του πισίνα βιβλιοθήκη με τα κύτταρα-στόχους σε 4 ° C για 1 ώρα, το αρχικό διάλυμα βιβλιοθήκη απομακρύνθηκε. Μετά πλύση με πλύση ρυθμιστικού οι συγκολλητικές κύτταρα αποξέστηκαν και συλλέγεται σε ένα σωλήνα 2 mL, πλένεται και πάλι. Οι οριοθετούνται DNAs εκλούστηκαν με την προσθήκη 500 μΙ DDH

2O μέσα στο σωλήνα, και θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε ως το πρότυπο και που ενισχύεται με την PCR με τους εκκινητές σημάνθηκαν με FITC ή βιοτίνη (10-15 κύκλους των 30 δευτερολέπτων μετουσίωση στους 95 ° C, ανασύνδεση 30 sec στους 59 ° C, και 30 sec στους επέκταση 72 ° C, ο τελευταίος γύρος που ακολουθείται από 5 λεπτά στους 72 ° C?. κρατήσει την παραγωγή σε 4 ° C η Taq πολυμεράση και dNTPs αποκτήθηκαν από την Takara). Η FITC-επισημασμένο αίσθηση ssDNA πισίνα διαχωρίστηκε από το προϊόν PCR με σφαιρίδια sepharose επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη για τον επόμενο γύρο επιλογής. Από το δεύτερο κύκλο επιλογής, τα αρνητικά κύτταρα επωάστηκαν με την πισίνα ssDNA πρώτα για επιλογή μετρητή, τότε τα αρνητικά κύτταρα δεσμεύονται με μη ειδική αλληλουχίες απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο επωάστηκε με κύτταρα-στόχους για να εμπλουτίσουν τις συγκεκριμένες αλληλουχίες. Η διαδικασία επιλογής παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή απεικόνιση. Από το 2ο έως 5ο γύρο, RWPE-1 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή μετρητή? από τον 6ο έως τον 8ο γύρο, SMMC-7721 χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή πάγκο? από τον 9ο έως 10ο γύρο επιλογής, τα κύτταρα Hela χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή πάγκο. Μετά 10ο γύρο, HeLa και SMMC-7721 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή μετρητή χωριστά σε κάθε γύρο. Για να αποκτήσετε απταμερή με υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση, η πίεση επιλογής ενισχύθηκε σταδιακά από 1 έως 15 επιλογή μειώνοντας την ποσότητα της πισίνας ssDNA (από 100 pmol έως 50 pmol), ο χρόνος επώασης για τα κύτταρα-στόχους (από 60 λεπτά έως 30 λεπτά), και ο αριθμός των κυττάρων-στόχων (από cm τρυβλίου 7,5 εκατομμύρια /10 να 1 εκατομμύριο /3,5 cm δίσκο) και με την αύξηση του αριθμού πλύσεων (από δύο έως τρία). Στους δύο τελευταίους γύρους της ενισχυμένης επιλογής (16ος-17ος), μειώσαμε την πισίνα σε 30 pmol, χρόνος επώασης για 15 λεπτά και να αυξήσει το πλύσιμο τέσσερις φορές με ισχυρή ανακίνηση. Εντελώς 17 γύροι επιλογής εκτελείται πριν από αλληλούχιση. Ο κλώνος και αλληλούχιση πραγματοποιήθηκαν από Sangon Βιοτεχνολογία Co, Ltd,

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την παρακολούθηση του εμπλουτισμού του απταμερούς μαζί με την πρόοδο της SELEX, τα κύτταρα-στόχους και τα αρνητικά κύτταρα ήταν καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδες με 80~90% συρροή, στη συνέχεια διασπώνται τα κύτταρα με 0,02% ΕϋΤΑ μετά πλύθηκαν με PBS μία φορά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά πλύση με ψυχρό ρυθμιστικό πλύσης δύο φορές, τα κύτταρα (2 χ 10

5) επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο πισίνες ssDNA ή επιλεγμένες αλληλουχίες DNA (0.25 μΜ) σε 200 μL ρυθμιστικού σύνδεσης στους 4 ° C για 30 λεπτά. Πριν κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης και διηθείται με κόσκινο 400 mesh κύτταρο. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε με FACScan κυτταρόμετρο (Becton Dickinson) με μέτρηση 1 × 10

4 γεγονότα. Το σημασμένο με FITC βιβλιοθήκη πισίνα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

χρώση τομών ιστού ανθρώπινου όγκου με τη χρήση επιλεγμένων απταμερούς

μπλοκ ιστού παραφίνης δόθηκαν από το τμήμα παθολογίας του 3ου συνδεδεμένες νοσοκομείο, Sun Yat- sen πανεπιστήμιο (Guangzhou της Κίνας). Η προεπεξεργασία των τμημάτων (5 μm πάχους) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43], [44]. Η διαδικασία ανάκτησης αντιγόνο είναι παρόμοια με Immunohisto-χημεία. Οι τομές ιστού deparaffinated σε ξυλόλιο δύο φορές (10 λεπτά κάθε φορά) μετά διατηρούνται σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας στους 60 ° C για 20 λεπτά. Χρησιμοποιήστε το βαθμίδωση αιθανόλης (100%, 95% και 70%) για να ενυδατωθεί το τμήμα και ξεπλύντε τα πλακίδια σε απιονισμένο νερό. Μετά πλύση σε PBS για 5 λεπτά, όλα τα τμήματα τέθηκαν σε ρυθμιστικό ΤΕ (περιέχει 10 mmol Tris, 1 mmol EDTA ανά 1 L DDH

2O, ρΗ = 8.0) και γρήγορα θερμαίνεται μέχρι βρασμού με φούρνο μικροκυμάτων, στη συνέχεια να κρατήσει το θερμοκρασία στους 95 ° C για 15 λεπτά για να ανακτήσετε αντιγόνα και φυσική ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου, μετά πλύθηκαν τρεις φορές με φρέσκο ​​PBS. Μετά την ιστολογική διαδικασία, οι τομές ιστών επωάστηκαν με ρυθμιστικό σύνδεσης που περιέχει 20% FBS και 0,1 mg /DNA mL σπέρματος ρέγγας σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 250 ηΜ FITC-επισημασμένο απταμερή σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 60 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, αυτά τα τμήματα του ιστού πλύθηκαν τρεις φορές με φρέσκο ​​PBS, αφυδατώθηκαν και σφραγίζονται από αντιξεθωριάσματος Πολυβινυλοπυρρολιδόνη Τοποθέτηση Medium. Τέλος, οι τομές απεικονίστηκαν με περιστρεφόμενου δίσκου συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (Olympus IX71, Ιαπωνία). FITC ήταν ενθουσιασμένος με ένα λέιζερ 488 nm ιόντων αργού (Mells Griot, CA) .Τα σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν με στόχο 40 × (NA 0.90, UPLSAPO, τον Όλυμπο, Ιαπωνία). Οι εικόνες αναλύθηκαν με FV10-ASW Έκδοση 3.1.

συγγένεια και εξειδίκευση του απταμερούς

14 κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η εξειδίκευση των απταμερών με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, όπως περιγράφεται παραπάνω. Προκειμένου να δοκιμαστεί η συγγένεια των διαφόρων απταμερών σε PC-3cell, διαφορετική συγκέντρωση απταμερών επωάστηκαν με 2 × 10

5 κύτταρα στους 4 ° C, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η μέση ένταση φθορισμού κάθε δείγματος αφαιρέθηκε η μέση ένταση φθορισμού του υποβάθρου. Οι σταθερές διάστασης ισορροπίας (

K

δ) της αλληλεπίδρασης απταμερούς-κυττάρου ελήφθησαν με την τοποθέτηση του εξάρτηση της έντασης φθορισμού δεσμευτικό για την συγκέντρωση των απταμερών στην εξίσωση ειδικό

Y

=

Β

max

X

/(

K

δ +

X

), χρησιμοποιώντας SigmaPlot (Jandel, San Rafael, CA) [ ,,,0],25].

θεραπεία πρωτεϊνάση για κύτταρα

κύτταρα PC-3 πλύθηκαν δύο φορές σε πιάτο με PBS σε θερμοκρασία δωματίου, διαχωρίζονται με 0,02% EDTA. Μετά πλύση, 2 × 10

5cells επωάζονται με 200 μΐ 0,05% θρυψίνη ή 0,1 mg /ml πρωτεϊνάση Κ στους 37 ° C για 2, 5 και 10 λεπτά αντίστοιχα. Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη πλήρους μέσου. Μετά πλύση, τα επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με απταμερούς και εφαρμόζεται για κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, όπως περιγράφεται προηγουμένως.

Ομοεστιακή εικόνα των κυττάρων

Η συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να τηρήσει την δέσμευση του απταμερών να διαβίωσης κύτταρα. 2 × 10

4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 35 χιλιοστά γυαλί Κάτω πιάτων για περισσότερο από 1 ημέρα για να πάρετε μια επέκταση καλά. Μετά πλύση με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης, τα κύτταρα επωάστηκαν με απταμερή (0,25 μΜ) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Μετά πλύση δύο φορές, τα κύτταρα απεικονίστηκαν με περιστρεφόμενου δίσκου συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (Olympus IX71, Ιαπωνία). FITC ήταν ενθουσιασμένος με ένα λέιζερ 488 nm ιόντων αργού (Mells Griot, CA) .Τα σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν με στόχο 40 × (NA 0.90, UPLSAPO, τον Όλυμπο, Ιαπωνία). Οι εικόνες αναλύθηκαν από FV10-ASW Έκδοση 3.1.

Η εσωτερίκευση του απταμερούς

Το κύτταρο-στόχο PC-3 διαχωρίστηκαν με 0,02% EDTA. Μετά την πλύση, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε 5 σωλήνες. Ένας σωλήνας χωρίς καμία επεξεργασία ως κενό? ένας σωλήνας επωάστηκε με 0.25 μΜ FITC-επισημασμένο DNA Library ως negtive ελέγχου? ένας σωλήνας επωάστηκε με 0.25 μΜ FITC-επισημασμένο Wy-5a ως θετικός έλεγχος? ένας σωλήνας προ-επεξεργασία με 0.05% θρυψίνη για 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 0,25 μΜ FITC-επισημασμένο Wy-5a (προ-θεραπείας)? ένας σωλήνας επωάστηκε με 0.25 μΜ FITC-επισημασμένο Wy-5α και στη συνέχεια κατεργάζεται με 0.05% θρυψίνη για 10 λεπτά (μετά-θεραπεία). Όλες οι επωάσεις με DNA πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες σε RPMI 1640 χωρίς ορό. Στη συνέχεια, τα πέντε δείγματα εφαρμόστηκαν για δοκιμασία κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται παραπάνω. Για το συνεστιακό παρατήρηση, τα κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με 0,25 μΜ FITC-επισημασμένο Lib ή Wy-5α σε 1640 ελεύθερο ορού RPMI σε 37 ° C για 2 ώρες και στη συνέχεια εφαρμόστηκε για την απεικόνιση, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

Σχήμα S1.

κυτταρομετρία ροής αναλύσεις των κυττάρων μετά από επώαση με απταμερή tdifferent. Λευκά:. Είναι ο φθορισμός υποβάθρου των μη επεξεργασμένων κυττάρων

doi: 10.1371 /journal.pone.0100243.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Κυτταρομετρία ροής προσδιορισμού της PC-3 κύτταρα μετά από επώαση με Wy-5α στους 4 ° C ή 37 ° C. Η ικανότητα δέσμευσης των Wy-5a δείχνουν καμία διαφορά στους 4 ° C ή 37 ° C.