Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα εξωκυττάρια μήτρα (ECM) αναδιαμόρφωση κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από ινοβλάστες χρησιμοποιώντας ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών μονοπάτια. Αν και είναι καλά γνωστό ότι εξωκυτταρική αποικοδόμηση του ECM από πρωτεάσες που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα διευκολύνει την κυτταρική εισβολή, η ενδοκυτταρική αποικοδόμηση των συστατικών ECM από καρκινικά κύτταρα δεν έχει αποσαφηνιστεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει εσωτερίκευσης κολλαγόνο, το οποίο είναι το αρχικό βήμα της ενδοκυτταρικής πορείας αποικοδόμησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, υπό το φως της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ).

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Αναλύσαμε την λειτουργία της εσωτερίκευσης κολλαγόνου σε δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, κοστούμι-2 και ΚΡ-2, και παγκρεατικών αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ) χρησιμοποιώντας Oregon Green 488-ζελατίνη. ΚΕΕ είχε μια ισχυρή ικανότητα για πρόσληψη του κολλαγόνου, και τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εσωτερικεύεται επίσης κολλαγόνο αν και λιγότερο αποτελεσματικά. Οι ικανότητες εσωτερικοποίηση κολλαγόνου κυττάρων KP-2 SUIT-2 και προωθήθηκαν από EMT που προκαλείται από ανθρώπινο ανασυνδυασμένο αυξητικό παράγοντα β1 μετασχηματισμού (

P

& lt? 0,05). Έκφραση Endo180, ενός υποδοχέα πρόσληψη του κολλαγόνου, ήταν υψηλή σε μεσεγχυματικά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όπως προσδιορίζεται από την έκφραση δείκτη EMT (

P

& lt? 0,01). Ποσοτική RT-PCR και στύπωμα Western αναλύσεις έδειξαν ότι η έκφραση Endo180 αυξήθηκε επίσης με επαγωγή EMT σε κύτταρα KP-2 SUIT-2 και. Endo180 νοκ ντάουν από την RNA παρεμβολής εξασθενεί την πρόσληψη του κολλαγόνου (

P

& lt? 0,01) και επεμβατική ικανότητες (

P

& lt? 0,05). Κυττάρων KP-2 SUIT-2 και

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι ικανά εσωτερίκευσης κολλαγόνου, το οποίο ενισχύεται από EMT. Αυτό το σύστημα εκκαθάρισης ECM μπορεί να είναι ένα νέο μηχανισμό για την κυτταρική εισβολή και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Ikenaga Ν, Ohuchida Κ, Mizumoto Κ, Akagawa S, Fujiwara Κ, Eguchi D, et al. (2012) Τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος ενισχυθεί η ικανότητα του κολλαγόνου εσωτερίκευση κατά τη διάρκεια επιθηλιακά μεσεγχυματικά Μετάβασης. PLoS ONE 7 (7): e40434. doi: 10.1371 /journal.pone.0040434

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 του Φλεβάρη 2012? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουλ 2012

Copyright: © 2012 Ikenaga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας, το Ίδρυμα Uehara Memorial και το Ίδρυμα Φουκουόκα για καλή υγεία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες μορφές καρκίνου, και το ποσοστό της επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 5% [1]. Χαρακτηρίζεται από υπερβολική desmoplasia με άφθονη εξωκυτταρική μήτρα (ECM), η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιθετική συμπεριφορά του [2], [3]. Η ECM εντός παγκρεατικών όγκων παράγεται κυρίως από τον ενεργοποιημένο φαινότυπο των παγκρεατικών αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ), και ECM αναδιαμόρφωση από ΚΕΕ και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι ένα από τα κρίσιμα βήματα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του [2], [4], [5]. Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός εξωκυτταρικών πρωτεασών που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα έχουν ταυτοποιηθεί ως συνεισφέροντες στην εισβολή και την πρόοδο του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), μια disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών (Adams) και ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης [6].

κολλαγόνα είναι τα πιο άφθονα συστατικά ECM στο σώμα και υφίστανται συνεχή σύνθεση και αποικοδόμηση υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Στρωματικά ινοβλάστες, τα οποία είναι τα πρωτογενή κύτταρα για τη διατήρηση της ομοιόστασης ECM, αποικοδομούν ινίδια κολλαγόνου ενδοκυτταρικά εκτός από το εξωκυτταρικό αποδόμηση με τη μεσολάβηση πολλαπλών πρωτεασών [7], [8]. Το αρχικό στάδιο της πρόσληψης κολλαγόνου είναι δεσμευτική κολλαγόνου με υποδοχείς της μεμβράνης, όπως α

2β

1-ιντεγκρίνης [7], [9] και Endo180 [10], που ακολουθείται από μετέπειτα ενδοκύτωση, μεταφορά στα λυσοσώματα και την υποβάθμιση με λυσοσωματικές καθεψίνες κυστεϊνης [11]. Endo180 είναι μέλος της μακροφάγων μαννόζης οικογένεια υποδοχέων που υπόκεινται σε συστατική εσωτερίκευση και την ανακύκλωση [12] και είναι απαραίτητη για την κυτταρική πρόσληψη του κολλαγόνου στους ινοβλάστες [10]. Πρόσφατα, Endo180 βρέθηκε να εκφράζεται σε όχι μόνο ινοβλάστες, αλλά και ένα υποσύνολο των νεοπλασμάτων συμπεριλαμβανομένων γλοιοβλαστώματα [13] και της βασικής-όπως όγκους του μαστού [14].

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μια εξελικτική διαδικασία στην οποία πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα στραφούν σε μια ιδιαίτερα κινητικό φαινότυπο μεσεγχυματικά να υποστεί πολλαπλές βιοχημικές αλλαγές [15]. Στον καρκίνο επιθηλιακής, επαγωγή ΕΜΤ είναι μια κεντρική διαδικασία στην ανάπτυξη του καρκίνου, και παρέχει τα καρκινικά κύτταρα με επεμβατικές και μεταστατικό ικανότητες. Μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, ένα από τα επιθηλιακά δεικτών, δείχνει μεσεγχυματικά μετάβαση των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων, και εμπλέκεται στην κακή πρόγνωση του καρκίνου του παγκρέατος [16]. Τα μόρια EMT σχετίζονται αναμένεται επίσης να είναι θεραπευτικοί στόχοι.

Με βάση αυτές τις γραμμές απόδειξης ότι οι ινοβλάστες έχουν μια ισχυρή ικανότητα να αποδομούν το κολλαγόνο και ότι ο φαινότυπος μεσεγχυματικών σχετίζεται με εισβολή καρκίνου, υποθέσαμε ότι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επίσης εσωτερικεύουν το κολλαγόνο, παρόμοια με ινοβλάστες, και να ενισχυθεί η επεμβατική ικανότητά τους μέσω της πραγματοποίησης EMT. Μέχρι σήμερα, εξωκυτταρική αποδόμηση ρυθμίζεται από εξωκυτταρικές πρωτεάσες, συμπεριλαμβανομένων των MMPs, που προέρχεται από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχει εδραιωθεί. Ωστόσο, η ενδοκυτταρική αποικοδόμηση του κολλαγόνου από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα δεν έχει τεκμηριωθεί. Ερευνήσαμε αν παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να εσωτερικεύουν το κολλαγόνο σε ένα

in vitro

μελέτη, και αξιολόγησε τον αντίκτυπο της εσωτερίκευσης του κολλαγόνου στο παγκρεατικό καρκίνο εισβολή στο φως της EMT.

Αποτελέσματα

Όχι μόνο ΚΕΕ αλλά και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να εσωτερικεύουν το κολλαγόνο

Εμείς ιδρύθηκε

in vitro

ΚΕΕ από την εκτομή του παγκρέατος να εξετάσει κατά πόσον ΚΕΕ έχουν τη λειτουργία της πρόσληψης του κολλαγόνου, παρόμοια για ινοβλάστες. Η ταυτότητα των ενεργοποιημένων ΚΕΕ επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση για βιμεντίνη και α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Oregon Green 488-ζελατίνης (OG-ζελατίνη), ένα μετουσιωμένη μορφή του κολλαγόνου, οπτικοποιήθηκε στο κυτταρόπλασμα του ΚΕΕ μετά από επώαση για 2 ώρες (Σχήμα 1Α), και αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι περισσότερο από το 95% των ΚΕΕ είχαν εσωτερικευθεί κολλαγόνου ( Εικόνα 1Β). Οι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές SUIT-2 και ΚΡ-2 ήταν επίσης σε θέση να εσωτερικεύουν φυσικό κολλαγόνο Ι, αν και λιγότερο αποδοτικά (Εικόνα 1Β). Οι αναλύσεις συνεστιακή μικροσκοπία επιβεβαίωσε την ενδοκυτταρική εντόπιση του OG-ζελατίνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1Γ). Ειδικότερα, ατρακτοειδή καρκινικά κύτταρα με μεσεγχυματικά μορφολογία φάνηκε να εσωτερικεύουν το κολλαγόνο έντονα. Τα κύτταρα επωάζονται με βόεια λευκωματίνη ορού φλουορεσκεΐνη συζευγμένο (φλουορεσκεΐνη-BSA) ως έλεγχος δεν περιείχε σήματα τόσο μικροφωτογράφισης φθορισμού και κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία χρώση ανοσοφθορισμού των α- SMA στην ΚΕΕ. Τα ΚΕΕ έχουν αστεροειδή μοιάζει ή ατρακτοειδή μορφολογία, και εκφράζουν α-SMA (κόκκινο). Τα ΚΕΕ έχουν εσωτερικεύσει πολλά μόρια κολλαγόνου (πράσινο). bar κλίμακας: 100 μm. Αρχική μεγέθυνση: × 200. (Β) αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής των ΚΕΕ, κοστούμι-2 κύτταρα και κύτταρα KP-2 μετά από επώαση με OG-ζελατίνη επί 2 ώρες. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και τα ποσοστά των κυττάρων με κολλαγόνο εσωτερικεύεται παρουσιάζονται ως μέσο ± SD στα αντιπροσωπευτικά σχήματα. (Γ) συνεστιακή μικροσκοπία εικόνες του κολλαγόνου στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων KP-2 SUIT-2 και. Τα κύτταρα επωάστηκαν με OG-ζελατίνης (πράσινο), σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Alexa Fluor 647 συζευγμένο με φαλλοειδίνη (κόκκινο) για να απεικονίσει το κύτταρο περιγράφει. Τα ορθογώνια τμήματα στα XY, XZ και YZ αεροπλάνα εμφανίζονται. Τα Υ και Ζ αξόνων απεικονίζουν τον εντοπισμό του εσωτερικεύονται κολλαγόνου με μεγαλύτερη σαφήνεια (αιχμές βελών). Ειδικότερα, οι ατρακτοειδή καρκινικά κύτταρα με μεσεγχυματικά μορφολογία περιέχουν πολλά μόρια κολλαγόνου (βέλη). Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. Αρχική μεγέθυνση:. × 400

Η

EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ενισχύει την εσωτερίκευση του κολλαγόνου τους

Ερευνήσαμε αν EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που σχετίζονται με τη λειτουργία της εσωτερίκευσης του κολλαγόνου, επειδή ΚΕΕ, τα οποία έχουν φαινότυπο μεσεγχυματικά, έχουν μια ισχυρή ικανότητα για την εσωτερίκευση του κολλαγόνου. Για την επαγωγή EMT στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (TGF) -β1, η οποία είναι ένας σημαντικός παράγοντας κατά τη διάρκεια της EMT με πολλές ανταποδοτικού ρόλους [15]. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 παρουσίασαν ινοβλαστική μορφολογία σκέδασης και κυττάρων σχήματος ατράκτου σε σύγκριση με μη καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2Α). Western blotting αναλύσεις έδειξαν ότι η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε και η έκφραση βιμεντίνης αυξήθηκε στο κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κυττάρων μετά από επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 2Β). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, μεταβάλλεται σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά, που σημαίνει ότι ΕΜΤ προκλήθηκε από τον TGF-β1. Οι ικανότητες εσωτερίκευση του κολλαγόνου του SUIT-2 και KP-2 κύτταρα που προωθείται από την επαγωγή EMT με τη θεραπεία TGF-β1 για 72 ώρες (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 2C, 2D).

τα (Α) κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα μετασχηματισμένα με ένα ατρακτοειδή μορφολογία μετά από αγωγή με ΤΟΡ-β1 για 72 ώρες. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. Αρχική μεγέθυνση: × 200. (Β) ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ότι η έκφραση Ε-καδερίνης είναι μειωμένη και η έκφραση βιμεντίνη είναι αυξημένη στο κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα με κατεργασία του ΤΟΡ-β1. Οι φορές διαφορές στις αντιπροσωπευτικές ανοσοστυπώματα ποσοτικά με πυκνομετρία φαίνονται κάτω από τις αντίστοιχες λωρίδες. unt: χωρίς θεραπεία. (C) SUIT-2 και ΚΡ-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ΤΟΡ-β1 για 72 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με OG-ζελατίνης (πράσινο) για 2 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με Alexa Fluor 647 συζευγμένο με φαλλοειδίνη (κόκκινο) για την οπτικοποίηση των κυττάρων περιγράμματα. μικροσκοπία φθορισμού αποκαλύπτει ότι το κολλαγόνο εσωτερικεύονται από τα κύτταρα KP-2 SUIT-2 και αυξάνεται μετά από κατεργασία με ΤΟΡ-β1. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. Αρχική μεγέθυνση: × 400. (D) Ποσοτικά στοιχεία για εσωτερικοποίηση κολλαγόνου με κοστούμι-2 και τα κύτταρα KP-2 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής αποκαλύπτει σημαντικές διαφορές στην ικανότητα πρόσληψης κολλαγόνου μεταξύ μη επεξεργασμένα και ΤΟΡ-β1-αγωγή καρκινικών κυττάρων. Κάθε κυτταρική γραμμή αναλύθηκε εις τριπλούν και τα ποσοστά των κυττάρων με κολλαγόνο εσωτερικεύεται εκφράζονται ως μέσο ± SD. Συγκρίσεις μεταξύ μη επεξεργασμένα και ΤΟΡ-β1-επεξεργασμένα κύτταρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας του Student

t-τεστ

. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν περισσότερες από τρεις φορές και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες.

Η

Endo180 έκφραση συνδέεται με το φαινότυπο μεσεγχυματικά των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

Στη συνέχεια, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του EMT δείκτες, συμπεριλαμβανομένης της E-cadherin και βιμεντίνης, το κύριο υποδοχέα κολλαγόνου α2β1-ιντεγκρίνης και του υποδοχέα πρόσληψη του κολλαγόνου Endo180 στα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ EMT και εσωτερίκευση του κολλαγόνου. Τα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές καρκίνου εξέφρασαν διάφορα επίπεδα της δεικτών EMT, α2β1-ιντεγκρίνης και Endo180 (Σχήμα 3Α). Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε την αναλογία του Ε-καδερίνης για βιμεντίνη να ταξινομήσει τα κύτταρα ως επιθηλιακά ή μεσεγχυματικά φαινότυπο, και στη συνέχεια συγκρίνονται τα επίπεδα της α2-ιντεγκρίνης, β1-ιντεγκρίνης και έκφραση Endo180 μεταξύ των κυττάρων ταξινομούνται σε δύο φαινοτύπους. Endo180 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε μεσεγχυματικών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές από ό, τι στα επιθηλιακά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, ενώ η έκφραση του β1-ιντεγκρίνης και α2-ιντεγκρίνης δεν συσχετιζόταν με τις κυτταρικές φαινοτύπους (

P

& lt? 0,01 ? Σχήμα 3Β). Η έκφραση του Endo180 mRNA στο κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα ρυθμίζεται αυξητικά με επαγωγή EMT με κατεργασία του ΤΟΡ-β1, μαζί με τις αυξήσεις στην κυτταρική επιφάνεια έκφραση του Endo180 από 9,3 ± 0,1% έως 19,9 ± 2,4% στο κοστούμι-2 κύτταρα και από 19,1 ± 1,0% έως 24,8 ± 1,5% σε κύτταρα KP-2 (

P

& lt? 0,01, Εικόνα 3C).

(Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης, βιμεντίνη , Endo180, β1-ιντεγκρίνης και α2-ιντεγκρίνης σε 10 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και τέσσερις PSC καλλιέργειες. Τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων ομαλοποιήθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης β-ακτίνης. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± SD. Το ένα πέμπτο των αποκτώμενων επίπεδα για το E-cadherin και Endo180 φαίνονται στο γράφημα για ευκολία αναφοράς. (Β) Οι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χωρίστηκαν σε δύο ομάδες που δείχνει ένα επιθηλιακό φαινότυπο (SW1990, HS766T, BxPC-3, Capan-1 και AsPC-1) και ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά (SUIT-2, CFPAC-1, MIA PaCa- 2, Panc-1 και ΚΡ-2) με βάση την αναλογία έκφραση της Ε-καδερίνης για βιμεντίνη. Endo180 είναι περισσότερο εντόνως εκφρασμένος στις κυτταρικές γραμμές με τον φαινότυπο μεσεγχυματικά σε σχέση με εκείνους με την επιθηλιακή φαινότυπο, ενώ οι εκφράσεις του β1-ιντεγκρίνης και α2-ιντεγκρίνης δεν συσχετίζονται με τις κυτταρικές φαινοτύπους. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Mann-Whitney

U

-test. (C) κύτταρα KP-2 SUIT-2 και επωάστηκαν με ή χωρίς TGF-β1 επί 72 ώρες, και τα επίπεδα έκφρασης του Endo180, β1-ιντεγκρίνης και α2-ιντεγκρίνης προσδιορίσθηκαν με ποσοτική RT-PCR (άνω πάνελ). Τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων ομαλοποιήθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης του 18S rRNA. Οι πολλαπλές μεταβολές υπολογίστηκαν ως τα επίπεδα mRNA σε κύτταρα TGF-β1 επεξεργασμένο διαιρείται με τα επίπεδα σε μη επεξεργασμένα κύτταρα. έκφραση Endo180 mRNA σε κύτταρα KP-2 SUIT-2 και είναι πιο πολύ αυξάνεται με επαγωγή EMT από β1-ιντεγκρίνης και την έκφραση του mRNA α2-ιντεγκρίνης. Αυξημένη έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του Endo180 σε ΕΜΤ-επαγόμενη κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα (κόκκινες γραμμές) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κοστούμι-2 και τα κύτταρα KP-2 (μπλε γραμμές), αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκε με αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής (

P

& lt? 0,01 για κάθε μία? κάτω πάνελ). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και οι συγκρίσεις μεταξύ μη επεξεργασμένων και ΤΟΡ-β1-κατεργασμένων κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Student

t-τεστ

.

Η

εξόντωση Endo180 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εξασθενίζει τους πρόσληψη του κολλαγόνου και της εισβολής ικανότητες

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση Endo180 συνδέεται με την πρόσληψη του κολλαγόνου από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, που γκρέμισε Endo180 mRNA σε κύτταρα KP-2 χρησιμοποιώντας την τεχνολογία παρεμβολής RNA SUIT-2 και. Παροδική διαμόλυνση siEndo180-1 και siEndo180-2 μειωμένη έκφραση Endo180 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 4Α). Τα κυτταρικά μορφολογίες των κυττάρων KP-2 SUIT-2 και δεν άλλαξε μετά Endo180 νοκ ντάουν. Οι ικανότητες εσωτερικοποίηση κολλαγόνου κυττάρων KP-2 SUIT-2 και υπό αγωγή με ΤΟΡ-β1 ήταν δραματικά εξασθενημένη από την καταστολή της έκφρασης Endo180 (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 4Β). Επιπλέον, 3D αναλύσεις μήτρα κολλαγόνου έδειξε ότι οι EMT που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται λιγότερο επεμβατική φαινότυπο όταν Endo180 έκφραση καταστέλλεται με siRNA. ΤΟΡ-β1 ακόμη ενισχυμένη εισβολή των καρκινικών κυττάρων με την παρουσία του ελέγχου siRNA (Εικόνα 5Α, 5Β). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση Endo180 δεν συμμετείχε στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετανάστευση των SUIT-2 και τα κύτταρα KP-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με siEndo180-1 ή siEndo180-2, και knockdown έκφρασης Endo180 σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα επιβεβαιώθηκε με ποσοτική RT-PCR (άνω πάνελ) και κηλίδωση Western ανάλυση (κάτω πάνελ) για τουλάχιστον 3 ημέρες. (Β) Μετά EMT επαγωγή με 10 ng /ml ΤΟΡ-β1, κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα επωάστηκαν με OG-ζελατίνη επί 2 ώρες. Τα ποσοστά του OG-ζελατίνης-εσωτερικεύεται κύτταρα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα οικόπεδα dot δείχνουν αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρία ροής δεδομένων για το μη επεξεργασμένο SUIT-2 και κύτταρα KP-2 και κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο του siRNA, siEndo180-1 ή siEndo180-2 (άνω πάνελ). Οι βαθμολογίες εσωτερικοποίηση κολλαγόνου αντιπροσωπεύουν τις σχετικές αναλογίες των κυττάρων με κολλαγόνο εσωτερικεύεται μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA, siEndo180-1 ή siEndo180-2 με εκείνα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Οι ενισχυμένες ικανότητες εσωτερικοποίησης κολλαγόνου στο κοστούμι-2 και τα κύτταρα KP-2 μετά την αγωγή ΤΟΡ-β μειωθεί δραματικά με knockdown έκφρασης Endo180 (κάτω πίνακας). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και οι συγκρίσεις μεταξύ κυττάρων ΤΟΡ-β1 αγωγή επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA και άλλα κύτταρα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Student

t-τεστ

. *

P

& lt? 0,01? **

P

& lt?. 0.001

Η

κύτταρα KP-2 SUIT-2 και (4 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) διατέμνεται με siRNAs ανεστάλησαν σε 50 μg του 3D κολλαγόνου τύπου Ι μήτρα και σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους με ή χωρίς ΤΟΡ-β1. Μετά το σχηματισμό γέλης από επώαση στους 37 ° C για 30 λεπτά, οι ανώτεροι θάλαμοι τοποθετήθηκαν σε φρεάτια ενός δίσκου καλλιέργειας των 24 φρεατίων που περιέχουν 750 μΐ 10% FBS /DMEM. Τα κύτταρα που εισέβαλαν στην κάτω επιφάνεια του κάθε άνω μεμβράνη θάλαμο διαμέσου της μήτρας κολλαγόνου Ι σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και μετρήθηκαν. (Α) Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες της εισβολής SUIT-2 και KP-2 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο του siRNA, siEndo180-1 ή siEndo180-2. Ράβδοι κλίμακας, 100 μm. Αρχική μεγέθυνση, × 200. (Β) Οι επεμβατικές ικανότητες των κυττάρων KP-2 SUIT-2 και αυξάνονται κατά την επαγωγή EMT, αλλά εξασθενεί με νοκ ντάουν της έκφρασης Endo180. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και οι συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων έγιναν με τη χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001. βαθμολογίες εσωτερίκευση (C) κολλαγόνο σε κύτταρα KP-2 κοστούμι-2 και μετά συγκαλλιέργεια με ΚΕΕ για 72 ώρες. Οι ικανότητες εσωτερίκευσης κολλαγόνο είναι ελαφρώς βελτιωμένη σε κοστούμι-2 και KP-2 κύτταρα μέσω αλληλεπιδράσεων καρκίνο στρώμα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και οι συγκρίσεις μεταξύ των δεδομένων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας του Student

t-τεστ

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

ΚΕΕ ενισχύσει την εσωτερίκευση του κολλαγόνου από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Τέλος, διερευνήσαμε αν ΚΕΕ είχε αντίκτυπο στην εσωτερίκευση του κολλαγόνου με παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, δεδομένου ότι οι ΚΕΕ γνωστό ότι προάγει την εξέλιξη και EMT του καρκίνου του παγκρέατος μέσω αλληλεπιδράσεων με τον καρκίνο στρώμα [18], [19]. Οι ικανότητες εσωτερίκευση του κολλαγόνου του SUIT-2 και κύτταρα KP-2 καλλιεργήθηκαν με ΚΕΕ ήταν ελαφρώς ενισχυμένη σε σύγκριση με εκείνα των monocultured καρκινικά κύτταρα (

P

& lt? 0,05 και

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα? Σχήμα 5C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις με τον καρκίνο στρώμα προωθήσει επίσης την πρόσληψη του κολλαγόνου από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Συζήτηση

εισβολή των καρκινικών κυττάρων, ένα κρίσιμο βήμα στην εξέλιξη του καρκίνου, αποτελείται από την υποβάθμιση της ECM και την επακόλουθη μετανάστευση τα καρκινικά κύτταρα να σχηματιστεί πρόσφατα εξωκυτταρικό χώρους. Οι MMPs έχουν θεωρηθεί ως τα σημαντικότερα πρωτεάσες ικανό να αποικοδομεί διάφορα συστατικά ECM για να βοηθήσει την εξέλιξη του όγκου, και θεωρούνται ότι είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου [20], [21]. Ωστόσο, οι περισσότερες κλινικές δοκιμές των αναστολέων ΜΜΡ απέδωσαν απογοητευτικά αποτελέσματα με περιορισμένη επιτυχία [22], [23]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι όχι μόνο εξωκυτταρική αποδόμηση της ECM, αλλά και ενδοκυτταρική πρόσληψη των συστατικών ECM μπορεί να εμπλέκεται στην κυτταρική εισβολή. Ένα σύστημα που περιλαμβάνει πρωτεόλυση αποικοδόμηση της εσωτερικεύεται κολλαγόνα με καθεψίνες λυσοσωματική κυστεΐνη έχει επίσης παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες και αναφέρθηκε ότι συνδέεται με εισβολή και μετάσταση όγκου [24], [25], [26]. Quintanilla-Dieck et al. [27] έδειξε ότι η καθεψίνη Κ σε μελάνωμα ρυθμίζει εισβολή μεσολαβώντας ενδοκυτταρική αποδόμηση των συστατικών ECM. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των παγκρεατικών καρκινικών ιστών αποκάλυψε ότι οι εκφράσεις του καθεψίνη Β και η καθεψίνη L είναι δείκτες κακής πρόγνωσης [28]. Αυτές οι γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων μπορεί να προτείνει ότι για την κυτταρική εισβολή, είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί ένας χώρος για να μεταναστεύσουν σε από την εσωτερίκευση και εξευτελιστική συστατικά ECM ενδοκυτταρικά εκτός από την περικυτταρικό υποβάθμιση τους. Το σύστημα εκκαθάρισης των συστατικών ECM εκτίθενται από τα καρκινικά κύτταρα είναι δυνητικά ένα νέο μηχανισμό για την εισβολή στο καρκίνο του παγκρέατος.

EMT θεωρείται ότι είναι ένα κρίσιμο βήμα στην εξέλιξη του καρκίνου, αν και η σημασία και η συνάφεια της έχουν παραμείνει ένα θέμα συζήτησης [15]. Απώλεια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, μεταβολές στο σχήμα των κυττάρων και την αυξημένη κινητικότητα οδηγούν στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων μέσω της βασικής μεμβράνης εντός του ιστού στρωματικό [15], [29]. Οι ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα εμφανίζεται συνήθως στο μεταναστευτικό μέτωπο των πρωτογενών όγκων και να εξελιχθεί σε μετέπειτα στάδια της βαθιάς μετανάστευσης στην ECM, ενδαγγείωση, μεταφορά μέσω της κυκλοφορίας και το σχηματισμό μικρομεταστάσεων [30]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, έχουν μικρά συσσωματώματα κυττάρων όγκου που εκτείνεται από την μάζα του όγκου εντός του γειτονικού στρώματος δειχθεί ως μορφολογικά στοιχεία του ΕΜΤ στις επεμβατικές μέτωπα του ανθρώπινου καρκίνου [31]. Rhim et al. [32] έδειξε ότι tagged κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα εισέβαλαν στο στρώμα μέσω ΕΜΤ και intermingled με στρωματικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα γενετικό μοντέλο ποντικού με αυθόρμητο καρκίνο του παγκρέατος. Βρήκαμε ότι EMT που προκαλείται από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να προωθήσουν επεμβατική ικανότητά τους όχι μόνο από την αύξηση της κινητικότητας, αλλά και την ενίσχυση της εσωτερίκευσης του κολλαγόνου. Το κολλαγόνο εσωτερικοποίηση μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην πρόοδο του καρκίνου που παρέχονται από EMT, και αυτοί οι πληθυσμοί κυττάρων ικανό πρόσληψης κολλαγόνο μπορεί να είναι κορυφαία κυττάρων για εισβολή. Σε ινοβλάστες, α

2β

1-ιντεγκρίνης θεωρείται ότι είναι σημαντική για κυτταρικές αλληλεπιδράσεις με το κολλαγόνο και έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στη διαδικασία εσωτερίκευσης [33]. Ωστόσο, στη μελέτη μας, α

2β

1-ιντεγκρίνης έκφραση δεν συμμετέχουν στις κυτταρικές φαινοτύπους του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και δεν αυξήθηκε σε ΕΜΤ-επαγόμενη κοστούμι-2 και ΚΡ-2 κύτταρα. Σύμφωνα με πειράματα χρησιμοποιώντας ένα αντι-β

1-ιντεγκρίνης και Endo180 ανεπάρκεια ινοβλάστες [8], η Endo180-προσκόλληση των ινοβλαστών σε μήτρες κολλαγόνου είναι ένα β

1-ιντεγκρίνης-ανεξάρτητη διαδικασία. Στο σύνολό τους, την κυτταρική εισβολή ενισχύεται από EMT θα μπορούσε να αποδοθεί σε Endo180 μόνο και δεν σε α

2β

1-ιντεγκρίνης.

Η desmoplasia σε καρκίνο του παγκρέατος εκδηλώνεται ως μπάντες του ινώδους στρώματος που περιβάλλουν τα καρκινικά κύτταρα, με αποτέλεσμα την αύξηση σε ινιδώδη κολλαγόνα. Αυτή η ινώδης στρώμα αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου Ι, η οποία αναφέρθηκε στην προώθηση πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και χημειοαντίσταση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [2], [34]. Από την άλλη πλευρά, με όγκο επιρρεπή ποντίκια με ανεπάρκεια Endo180 ινοβλάστες έδειξαν αυξημένη συσσώρευση κολλαγόνου εντός των όγκων [35], και τα ποντίκια εμφυτεύτηκαν καρκινικά κύτταρα του μαστού εκφράζουν ένα εσωτερικοποίηση-ελαττωματικός μεταλλάκτης Endo180 είχε αυξηθεί ενδοογκική ίνωση [14]. Αυτά τα ευρήματα συσχετίζονται με μείωση της εσωτερίκευσης του κολλαγόνου και μείωση του κύκλου εργασιών του κολλαγόνου, με αποτέλεσμα τελικά στις κλειστές ανάπτυξη του όγκου. Στη μελέτη μας, ΚΕΕ είχε μια ισχυρή ικανότητα για την εσωτερίκευση του κολλαγόνου, και Endo180-επαρκή παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έδειξαν ισχυρότερη εισβολή από Endo180 ανεπάρκεια κύτταρα. Ως εκ τούτου, ο κύκλος εργασιών της ECM διαμεσολαβείται από Endo180 μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την επέκταση του όγκου και της εξέλιξης του καρκίνου.

Εν κατακλείδι, όχι μόνο τα μεσεγχυματικά ΚΕΕ αλλά και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να εσωτερικεύουν το κολλαγόνο. Το κολλαγόνο εσωτερίκευση από τα καρκινικά κύτταρα ενισχύθηκε σε συνεργασία με την EMT. Νοκ ντάουν του υποδοχέα πρόσληψης κολλαγόνου Endo180 καταργηθεί εσωτερίκευση του κολλαγόνου από τα καρκινικά κύτταρα και μειωμένη επεμβατική τις ικανότητές τους. Αυτή η πρώην παραγνωρισμένη επεμβατική μηχανισμός παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα πρέπει να αποσαφηνιστεί περαιτέρω για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων για καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Το παρακάτω 10 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν: AsPC-1, ΚΡ-2, Panc-1, κοστούμι-2, BxPC-3 (Dr. Η Iguchi, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Σικόκου, Matsuyama, Ιαπωνία), ΜΙΑ PaCa-2 (Ιαπωνικά Καρκίνος Τράπεζα Resource), Capan-1, CFPAC-1, HS766T και SW1990 (American Type Culture Collection). Ανθρώπινα ΙΕΑ απομονώθηκαν από φρέσκο ​​χειρουργικά δείγματα καρκίνου του παγκρέατος με τη χρήση της μεθόδου έκφυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [37]. Πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων ΚΕΕ που προέρχονται από τέσσερις ασθενείς με εν τω βάθει παγκρεατικούς καρκίνους καθιερώθηκαν στο εργαστήριο μας με έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kyushu και διεξάγονται σύμφωνα με τις Ηθικές οδηγίες για Ανθρώπινου Γονιδιώματος /Gene Έρευνας ψηφίστηκε από την ιαπωνική κυβέρνηση και η Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η ταυτότητα των ΚΕΕ επιβεβαιώθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού για την α-SMA (θετικό ρυθμό: σχεδόν το 100%) και βιμεντίνης (θετικό ρυθμό: σχεδόν το 100%) και της μορφολογίας (αστεροειδή-ομοειδών ή ατρακτοειδή κύτταρα) [17]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Sigma) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και πενικιλλίνη (100 μg /ml) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 10% CO

2.

Το κολλαγόνο δοκιμασία εσωτερικοποίηση

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 90 mm σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο και επωάστηκαν σε 1% FBS /DMEM με ή χωρίς 10 ng /ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου TGF-β1 (R &? D Systems) για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μg /ml OG-ζελατίνης σε 1% FBS /DMEM για 2 ώρες στους 37 ° C. Για απόσβεση της εξωκυττάριας μη εσωτερικεύεται OG-ζελατίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,4% trypan blue (Sigma) σε αλατούχο διάλυμα για 5 λεπτά. Μετά από τρεις πλύσεις με ψυχρό PBS, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση, και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της αναλογίας των κυττάρων που είχαν ενσωματωθεί κολλαγόνο. Ως μάρτυρας, 20 μg /ml με φλουορεσκεΐνη BSA (Molecular Probes) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο. Στην εσωτερίκευση του κολλαγόνου αναλύσεις για τα καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με τα siRNA, κοστούμι-2 και τα κύτταρα KP-2 ήταν επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA, siEndo180-1 ή siEndo180-2, σπάρθηκαν σε πιάτα 90 mm σε 4 × 10

5 κύτταρα /πιάτο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 48 ώρες για να προκληθεί EMT. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μg /ml OG-ζελατίνης ή φλουορεσκεΐνη-BSA σε 1% FBS /DMEM για 2 ώρες στους 37 ° C, και μη-εσωτερικεύεται OG-ζελατίνης ή φλουορεσκεΐνη-ΒδΑ σβήστηκε με επώαση με 0,4% trypan μπλε. Μετά την πλύση με ψυχρό PBS, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το σκορ εσωτερικοποίηση κολλαγόνου υπολογίστηκε ως η σχετική αναλογία των κυττάρων με κολλαγόνο εσωτερικεύεται μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA, siEndo180-1 ή siEndo180-2 με εκείνα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Laser σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο για χρώση ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα απλώθηκαν σε 35-mm Glass Bottom Πιάτα (Matsunami) σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /τρυβλίο και επωάστηκαν σε 1% FBS /DMEM με ή χωρίς 10 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μg /ml OG-ζελατίνης ή φλουορεσκεΐνη-BSA σε 1% FBS /DMEM για 2 ώρες στους 37 ° C, που ακολουθείται από στερέωση με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά απόσβεση του εξωκυτταρικού φλουορεσκεΐνης με 0,4% trypan blue. SUIT-2 και ΚΡ-2 κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexa Fluor 647 συζευγμένο με φαλλοειδίνη (Molecular Probes) για την χρώση F-ακτίνης για την οπτικοποίηση της κυτταρικής περιγράφει σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, ενώ ΚΕΕ επωάστηκαν με ένα αντι-α- κουνελιού αντίσωμα SMA (Epitomics? 1:100 αραίωση) επί 2 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με Alexa Fluor 647-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού (Molecular Probes) για 1 ώρα. Πυρηνική ΟΝΑ αντίθετη χρώση με 0.05 μg /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη. Ένα λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού (A1R? Nikon) χρησιμοποιήθηκε για ανοσοφθορισμό μικροφωτογράφισης. Οι εικόνες με χρήση του λογισμικού ΝΑΚ-Στοιχεία (Nikon).

Απομόνωση RNA

Το συνολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας υψηλής καθαρότητας Κιτ απομόνωσης RNA (Roche Diagnostics), με ϋΝάση Ι (Roche Diagnostics) θεραπεία. Το εκχυλισμένο RNA ποσοτικοποιήθηκε με την απορρόφηση στα 260 nm, και η καθαρότητα του αξιολογήθηκε από την αναλογία 260/280 απορρόφησης με NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies).

αλυσίδα Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης αντίδραση (RT-PCR)

Ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen) και Chromo4 Real-Time Σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad Laboratories). Σχεδιάσαμε ειδικούς εκκινητές για το E-cadherin και βιμεντίνης χρησιμοποιώντας Primer 3 λογισμικό και εκτελούνται BLAST ψάχνει να εξασφαλίσει τις ιδιαιτερότητες αστάρι. Εκκινητές για Endo180, β1-ιντεγκρίνης, α2-ιντεγκρίνης, β-ακτίνη και 18S rRNA αγοράστηκαν από την Takara Bio Inc. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Κάθε μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε πρώτα σε 50 ° C για 30 λεπτά για να επιτρέψει αντίστροφη μεταγραφή, στην οποία πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε με πριμοδότηση του συνολικού RNA με ένα γονίδιο-ειδικό εκκινητή. PCR άρχισε με επώαση στους 95 ° C για 15 λεπτά για να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 94 ° C για 15 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s (για Ε-καδερίνη και βιμεντίνης) ή 95 ° C για 5 s, 60 ° C για 20 s και 72 ° C για 30 s (για Endo180, β1-ιντεγκρίνης, α2-ιντεγκρίνης, β-ακτίνη και 18S rRNA). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων υπολογίσθηκαν με βάση πρότυπες καμπύλες κατασκευάζονται με ολικό RNA από κύτταρα SUIT-2. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν από την β-ακτίνη ή έκφραση 18S rRNA και εκφράζονται ως ο λόγος της έκφρασης του γονιδίου στόχου με εκείνη του β-ακτίνης ή 18S rRNA. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν. Κανένα ανιχνεύσιμο PCR προϊόντα ενισχύθηκαν χωρίς προηγούμενη αντίστροφης μεταγραφής. Η ακρίβεια και η ακεραιότητα των προϊόντων της PCR επιβεβαιώθηκαν με Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.).

Η

Η κυτταρομετρία ροής

Τα καλλιεργημένα κύτταρα συλλέχθηκαν με έκθεση σε θρυψίνη /EDTA για 5 λεπτά στους 37 ° C, και πλύθηκαν σε 10% FBS /DMEM. Τα ληφθέντα μονά κύτταρα αιωρήθηκαν σε παγωμένο διάλυμα 1% FBS /PBS και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (EC800? SONY) εξοπλισμένη με ένα λέιζερ που παρέχεται ένα μήκος κύματος διέγερσης των 488 nm. Eclipse λογισμικό ανάλυσης (SONY) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των σημάτων φθορισμού και να ρυθμίσετε τις λογικές ηλεκτρονική-gating παραμέτρους.

δοκιμασία Εισβολή σε 3D κολλαγόνο Ι μήτρα και τη μετανάστευση δοκιμασία

Η εισβολής του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα εκτιμήθηκε με βάση τον αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω επικοινωνούντα δοχεία (BD Biosciences) υπό συνθήκες καλλιέργειας 3D σε κολλαγόνο Ι μήτρας. Η γέλη μήτρα κολλαγόνου Ι παρασκευάστηκε με αραίωση κολλαγόνο ουράς αρουραίου τύπου Ι (BD Biosciences) σε 10% FBS /DMEM (1:10), συμπεριλαμβανομένων 0.023 Ν ΝαΟΗ (τελική συγκέντρωση κολλαγόνου: 0,38 μg /μΙ).