Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανώμαλη ενεργοποίηση της κανονικής οδού /β-κατενίνης Wnt συμβαίνει σε όλες σχεδόν τις παχέος εντέρου και συμβάλλει στην ανάπτυξη, την εισβολή και την επιβίωσή τους. Φωσφολιπάσης D (PLD) έχει ενοχοποιηθεί στην πρόοδο του ορθοκολικού καρκινώματος Ωστόσο, η κατανόηση των στόχων και της ρύθμισης αυτού του σημαντικού οδού παραμένει ατελής και εκτός αυτού, η σχέση μεταξύ σηματοδότηση Wnt και PLD δεν είναι γνωστή.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι PLD ισοένζυμα, PLD1 και PLD2 είναι άμεσοι στόχοι και τα θετικά ρυθμιστές ανάδρασης της σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt. Wnt3A και Wnt μιμητικά ενίσχυσε σημαντικά την έκφραση του PLDs σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο σε HCT116 ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα, ενώ αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου β-κατενίνης ή χρησιμοποίηση μιας κυρίαρχης αρνητικής μορφής Τ κυττάρων παράγοντα-4 (TCF-4) ανέστειλαν την έκφραση του PLDs . Επιπλέον, τόσο PLD1 και PLD2 ήταν ιδιαίτερα επάγεται στο κόλον, το ήπαρ και το στομάχι τους ιστούς των ποντικών μετά από ένεση του LiCl, ένα μιμητικό Wnt. Wnt3A διεγείρεται σχηματισμός των συμπλοκών β-κατενίνης /TCF προς δύο λειτουργικές TCF-4-δεσμευτικά στοιχεία εντός του υποκινητή PLD2 όπως εκτιμήθηκε με δοκιμασία χρωματίνης ανοσοκαθίζησης. Καταστολή PLD χρησιμοποιώντας γονιδιακή σίγηση ή εκλεκτικό αναστολέα μπλοκάρει την ικανότητα της β-κατενίνης σε μεταγραφικά ενεργοποιούν PLD και άλλων γονιδίων στόχου Wnt εμποδίζοντας το σχηματισμό του β-κατενίνης TCF-4 σύμπλοκο /, ενώ τακτική να ανυψώσει ενδοκυτταρικά επίπεδα φωσφατιδικό οξύ, το προϊόν δραστηριότητας PLD, ενισχυμένη αυτά τα αποτελέσματα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι PLD είναι απαραίτητη για Wnt3A γνώμονα εισβολή και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

PLD ισοενζύμου δρα ως νέο στόχο μεταγραφικά και θετικός ρυθμιστής ανατροφοδότηση του σηματοδότηση Wnt, και στη συνέχεια προωθεί Wnt-καθοδηγείται ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Προτείνουμε ότι οι θεραπευτικές παρεμβάσεις που στοχεύουν PLD μπορεί να προσδώσει ένα κλινικό όφελος σε Wnt /β-κατενίνης με γνώμονα κακοήθειες

Παράθεση:. Kang DW, Min DS (2010) Θετική κανονισμού Επικοινωνία μεταξύ φωσφολιπάσης D και σηματοδότηση Wnt Προωθεί Wnt- Driven Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10.1371 /journal.pone.0012109

Επιμέλεια: Sudha Agarwal, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Απρ, 2010? Αποδεκτές: 5 Ιουλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου, 2010

Copyright: © 2010 Kang, Min. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας Ε & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A080287). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες, που εμφανίζεται σε ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού. Περισσότερο από το 80% της σποραδικής και κληρονομικών καρκίνων του παχέος μπορεί να προκαλείται από εκτροπές στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης [1] – [3]. Έτσι, οι μεταβολές στο μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt ορίζουν ένα γεγονός κλειδί στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. β-κατενίνης είναι ένας μεταγραφικός συνενεργοποιητή του παράγοντα Τ-λεμφοκυττάρων (TCF) /λεμφικών παράγοντας ενισχυτή (Λεφ) παράγοντες μεταγραφής. β-κατενίνης σταθερότητα ρυθμίζεται από ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα που περιλαμβάνει αδενοματώδη πολυποδίαση coli (APC), γλυκογόνο 3β συνθάσης κινάσης (ΟδΚ3β) και αξίνη. Η φωσφορυλίωση του β-κατενίνης με ΟδΚ3β στοχεύει β-κατενίνης για ουβικιτινίωση και πρωτεασώματος αποδόμησης [4]. Έτσι, η ενεργοποίηση της οδού καταστέλλει αποικοδόμησης β-κατενίνης, οδηγώντας στην πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης. Στο πυρήνα, η συσσώρευση του TCF /β-κατενίνης οδηγεί σε μεταγραφική ενεργοποίηση των πολλαπλών γονιδίων στόχων, τα οποία μπορούν στη συνέχεια να συμβάλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου του [5], [6]. Έτσι, ο προσδιορισμός των άμεσων στόχων του /της β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι δυνητικά σημαντική για την κατανόηση του κεντρικού ρόλου της Wnt /β-κατενίνης /TCF εξαρτάται κανονική πορεία στην ογκογένεση.

Η φωσφολιπάση D (PLD) καταλύει υδρόλυση φωσφατιδυλοχολίνης (PC) για να δημιουργήσει το φωσφατιδικό οξύ (ΡΑ), το οποίο δρα ως δεύτερος αγγελιοφόρος σε πολλές φυσιολογικές αποκρίσεις [7]. Δύο ισοένζυμα PLD θηλαστικού PC-ειδικών ορίζονται ως PLD1 και PLD2 έχουν κλωνοποιηθεί. PLD έχει αναδειχθεί ως κρίσιμο ρυθμιστή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των οποίων απορύθμιση συμβαίνει κατά τη διάρκεια ανάπτυξη μιας ποικιλίας ανθρώπινων όγκων [8]. Αυξημένα έκφραση PLD1 και PLD2 έχει αναφερθεί σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς [9]? ειδικότερα, το επίπεδο έκφρασης PLD2 και η σύνδεσή της με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά έχουν πρόσφατα ερευνηθεί σε ορθοκολικό καρκίνωμα [10]. Τα επίπεδα έκφρασης του PLD2 συσχετίζονται σημαντικά με το μέγεθος του όγκου και επιβίωσης των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνωμα [10]. Η σημειακή μετάλλαξη PLD2 έχει βρεθεί επίσης στον καρκίνο του μαστού [11]. Τα κύτταρα που υπερεκφράζουν PLD ενισχύσει ισοενζύμου μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 έκφρασης και των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μορφή μεταστάσεων σε συγγενή ποντίκια [12], [13]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι PLD παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ορθοκολικού καρκινώματος, και θα μπορούσε να είναι ένας στόχος για θεραπεία καρκίνου. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα σε σημαντικές συν-υπερέκφραση PLD ισοενζύμων με β-κατενίνης σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου [14]. Χρησιμοποιώντας δύο παρεμβολή RNA (RNAi) -με βάση την απώλεια-του-λειτουργία οθόνες, τα ογκογονίδια που ρυθμίζουν β-κατενίνης-εξαρτώμενη μεταγραφή και ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου έχουν εντοπιστεί [15].

Μεταξύ ένα από τα γονίδια προσδιορίζονται στην οθόνη αυτή ήταν PLD1, και η καταστολή της PLD1 ανέστειλε σημαντικά τόσο την β-κατενίνης πολλαπλασιασμό μεταγραφική δραστηριότητα και καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει η δράση της PLD ισοενζύμων ως νέων στόχων και θετικές ρυθμιστές ανάδρασης της Wnt σηματοδότησης. Έτσι, η αναγνώριση ενός Wnt-β-κατενίνης TCF-ρυθμίζονται άξονα PLD παρέχει νέες μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Ανθρώπινο παχέος καρκινικά κύτταρα (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO) και κύτταρα καρκίνου του μαστού (Hs578T) αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Καθαρισμένη ανασυνδυασμένη Wnt3A αγοράστηκε από την R &? D Systems Inc. ΒΙΟ ελήφθη από την Calbiochem. LiCl, 1- ή 3-βουτανόλη, διοκτανοϋλο ΡΑ, και 1-προπρανολόλη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. εκλεκτικοί αναστολείς PLD1 και PLD2 αγοράστηκαν από την Cayman χημικών. κιτ δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης αγοράστηκαν από Promega.

πλασμίδια και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA

Ανθρώπινο PLD1 (pGL4-PLD1 Luc) και PLD2 (pGL4-PLD2 Luc) πλασμίδια υποκινητή περιέχει -1.9 kb ( -1930 /+ 1) και 2,6 kb (-2180 /+ 491) του ανάντι 5′-πλευρικό DNA που συνδέεται με λουσιφεράσης γονίδια αναφοράς, αντίστοιχα, και έχουν περιγραφεί αλλού [14]. Χρησιμοποιήσαμε τον υποκινητή του hPLD1 (pGL4-PLD1? -1930 /+ 1), που μεταγράφεται από το εξόνιο 2, μεταξύ των δύο αναπληρωματικών μεταγραφές του PLD1 που πρόκειται να μεταγραφεί σε δύο διαφορετικές θέσεις μεταγραφής (εξόνιο 1 και το εξόνιο 2). Η μέθοδος βασίζεται σε PCR χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση του σειριακά διαγράφεται υποκινητή PLD2 κατασκευασμάτων στον φορέα ρεπόρτερ pGL4-14b στη θέση Κρη Ι και Bgl II. Η αλληλουχία των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές σε PCR ενισχύσεις φαίνεται στον Πίνακα S1.

Μεταλλάξεις του TCF-4 συνδετικών στοιχείων στον υποκινητή PLD2 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το Quick Change τοπο-Directed Mutagenesis Kit, σύμφωνα με τον κατασκευαστή του συστάσεις (Stratagene? Πίνακας S2). TOPflash και FOPflash πλασμίδια λουσιφεράσης που περιέχει πολλαπλά αντίγραφα των στοιχείων απόκρισης TCF /LEF χρησιμοποιήθηκαν για την μέτρηση της δραστικότητας TCF. Κυρίαρχα-αρνητικά TCF-4 (ΔN30 TCF-4) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Tesshi Yamada (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Κέντρο Ερευνών). Συστατική ενεργή μεταλλαγμένη β-κατενίνης (S37A β-κατενίνης) και φορείς TCF-4 έκφρασης άγριου τύπου ευγενικά από τον Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University). shRNA για β-κατενίνης παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Η Clevers (Utrecht, The. Κάτω Χώρες). SiRNAs για τον έλεγχο, PLD1 και PLD2 αγοράστηκαν από Dharmacon Research Inc (Lafayette, Colo). αλληλουχίες siRNA για PLDs έχουν ως εξής:. ανθρώπινη PLD1 (νουκλεοτίδια, 1571-1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) και την ανθρώπινη PLD2 (νουκλεοτίδια, 1378-1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA)

παροδική επιμόλυνση και Reporter Gene Δοκιμασία

Ακολουθώντας τις οδηγίες, πλασμίδια έκφρασης του κατασκευαστή ή siRNA επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη Plus (Invitrogen) ή Polyfect (Qiagen) αντιδραστήρια. δοκιμασίες Επιμόλυνση και λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης ελήφθη με ομαλοποίηση της δραστηριότητας του λουσιφεράσης πυγολαμπίδας κατά δραστηριότητα του εσωτερικού ελέγχου

Renilla

λουσιφεράσης.

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western

κυτταρολύματα αναλύθηκαν για ανοσοκαταβύθιση και /ή ανοσοαποτύπωμα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Αντι-α-τουμπουλίνης (Sigma, ΜΟ), αντι-βιμεντίνη (Sigma, ΜΟ), αντι-ο-Μγο (Santa Cruz, CA), αντι-β-κατενίνης (Santa Cruz, CA), αντι-NOS2 (Santa Cruz , CA), αντι-TCF-4 (Santa Cruz, CA), αντι-β-κατενίνης (BD Biosciences, CA), αντι-cycinD1 (BD Biosciences, CA), και αντι-φωσφο-ΟδΚ3β αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση, ΜΑ ) αγοράστηκαν. Το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-PLD που αναγνωρίζει τόσο PLD1 και PLD2 δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

δραστηριότητα PLD δοκιμασία

δραστηριότητα PLD αξιολογήθηκε με μέτρηση του σχηματισμού [

3Η] phosphatidylbutanol, το προϊόν του PLD μεσολάβηση διαφωσφατιδυλίωσης, παρουσία του 1-βουτανόλη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA (1 μg) ήταν προεπεξεργασία με DNase και χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή με την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen). Σε πραγματικό χρόνο Q-PCR πραγματοποιήθηκε σε μία συσκευή RG-6000A Rotor-Gene (Corbett Research): για 44 κύκλους των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 10 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 15 sec. Αντιδράσεις (20 μΐ) περιελάμβανε 2 μΐ cDNA, στόχος-ειδικοί εκκινητές, και το πράσινο κιτ PCR Quantitect SYBR (QIAGEN). Το εύρος θερμοκρασίας για την ανάλυση των καμπυλών τήξης ήταν 55 ° C έως 99 ° C επί 30 sec. Τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε αντίδραση εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με τιμές έκφρασης του γονιδίου GAPDH. Βλέπε Πίνακα S3 για ακολουθίες αστάρι Q-RT-PCR.

Προετοιμασία

των ζώων και των ιστών

Τα ποντίκια που παρέχονται με το πρότυπο συντήρησης και διατροφής από Dae Han Bio Σύνδεσμος (Σεούλ, Κορέα). Οι μελέτες σε ζώα έχουν εγκριθεί και εκτελείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ινστιτούτου των κατευθυντήριων γραμμών για την Υγεία για το Διοικητικό Institutional Review του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Πουσάν (Busan, Κορέα). Δώδεκα αρσενικά ποντίκια FVB εβδομάδων έλαβαν ενδοφλέβια ένεση με LiCl μία φορά την ημέρα για 2 ημέρες σε δόση 5 mg /kg. Η ομάδα ελέγχου εγχύθηκε με τον ίδιο όγκο αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ένεση LiCl, ζώα (η = 3 /ομάδα) αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με διαιθυλαιθέρα και αποκεφαλίζονται, και οι ιστοί καταψύχθηκαν αμέσως σε LN

2 και αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C για ανοσοκηλίδωση. Οι ποντικοί (η = 3 /ομάδα) αναισθητοποιήθηκαν επίσης και στη συνέχεια διαποτίστηκαν ενδοκαρδιακά με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS που περιέχει 0.34% L-λυσίνη (Sigma). Μετά στερεωτικό αιμάτωση, οι ιστοί απομακρύνθηκαν, τοποθετήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% στους 4 ° C όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα διάλυμα σακχαρόζης 30%. Οι ιστοί υποβάλλονται σε επεξεργασία από στεφανιαία κρυοστάτη τομή σε διάλυμα PBS του Dulbecco που περιείχε 0.1% αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιώντας ένα πάγωμα μικροτόμο (microM, Germany).

Ανοσοϊστοχημεία

παραφορμαλδεΰδη στερεωμένα τομές 4 μm παραφίνης των ιστών του παχέος εντέρου θερμάνθηκαν σε αυτόκλειστο σε 10 mM ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0). Μετά τον αποκλεισμό με 5% BSA και 1% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS, οι τομές επωάστηκαν με αντι-β-κατενίνης (BD μεταγωγή) και αντισώματα PLD όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από έκπλυση με PBS. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με Alexa 488 φθορίου ή Alexa φθόριο 555-συζευγμένο IgG δευτερεύον αντίσωμα (Santa Cruz, 1: 200) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, ακολουθούμενη από πλύση με PBS. Μετά counterstaing με DAPI, και τα πλακίδια τοποθετούνται σε Permount

® (Fisher Scientific, USA). Δύο χρωμάτων φθορισμού εικόνα για αντι-PLD και χρώση αντισώματος β-κατενίνης συλλέχθηκαν σε ένα Zeiss LSM 510 συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, Germany). Φθορίζουσες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Zeiss LSM λογισμικό του προγράμματος περιήγησης εικόνων (Zeiss).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία

πειράματα ChIP έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], με μικρές τροποποιήσεις. κύτταρα HCT116 χρησιμοποιήθηκαν για διασύνδεση με 1% παραφορμαλδεϋδη σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 10 λεπτά. Τα κύτταρα ξύστηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Hepes, ρΗ 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100, 0.1% δεοξυχολικό, και 1.0 mM αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ) και κατεργασία με υπερήχους για 20 δευτερόλεπτα 3 φορές. Κανονική IgG ποντικού, αντι-β-κατενίνης ή αντι-HDAC1 αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε για 6 ώρες στους 4 ° C. Immnunocomplexes εκχυλίστηκαν 3 φορές με 1% SDS, 0,1 Μ NaHCO3, και εγκάρσια σύνδεση αντιστράφηκε με επώαση στους 65 ° C όλη τη νύκτα. Η αποθηκευμένη χρωματίνη κλάσμα εισόδου επίσης σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο. Τα δείγματα στη συνέχεια υπέστησαν πέψη με DNase- και RNase-free πρωτεϊνάση Κ στους 50 ° C για 4 ώρες, και εκχυλίζεται με φαινόλη /χλωροφόρμιο /ισοαμυλαλκοόλη. δείγματα DNA καθαρίστηκαν με Qiagen απορρύπανση στήλες. Η περιοχή PLD2 ή NOS2 προαγωγού αναλύθηκε με Q-RT-PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S4).

μετανάστευση των κυττάρων και

Τα κύτταρα προστέθηκαν σε θαλάμους Transwell μεμβράνη (Εισβολή Δοκιμασίες

μέγεθος πόρων, 12.0 μm? Corning). Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω της μεμβράνης προς τον κατώτερο θάλαμο μετρήθηκε μετά από 24 ώρες. Για τα πειράματα siRNA, τα κύτταρα σπάρθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNAs, και δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν για άλλες 24 ώρες. Για τους προσδιορισμούς εισβολής, Matrigel (1: 5? BD) προστέθηκε σε θαλάμους Transwell μεμβράνη και επωάστηκε για 5 ώρες? κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται. Έκταση της μετανάστευσης και της εισβολής εκφράστηκαν ως μέσος αριθμός κυττάρων ανά μικροσκοπικό πεδίο.

Anchorage ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης

Anchorage ανεξάρτητη ανάπτυξη μετρήθηκε με τη χρήση του CytoSelect ™ 96-Καλά

Σε vitro

όγκου ευαισθησία της ανάλυσης (Cell Biolabs, CA), σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Anchorage ανεξάρτητη ανάπτυξη εξετάστηκε σε μαλακό άγαρ? 50 μΙ μήτρας βάσης άγαρ προστίθεται στο κάτω μέρος κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Μόλις το άγαρ ήταν σταθερή, 75 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος μαλακό μήτρα /άγαρ που περιέχει 3 χ 10

3 κύτταρα απλώθηκε επάνω στην κορυφή, ακολουθούμενα από 50 μΙ 2 χ πλήρους μέσου με Wnt3A ή /και αναστολείς. Μετά από 10 ημέρες επώασης, η μήτρα άγαρ διαλυτοποιήθηκε, και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) βρωμιούχου τετραζολίου -2,5-διφαινυλο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση που παράγεται με σχηματισμό αδιάλυτων προϊόντος φορμαζάνης από βιώσιμα κύτταρα καταγράφηκε στα 570 nm.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές, με παρόμοια αποτελέσματα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με

t

test του Student, και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

σηματοδότηση Wnt προωθεί την έκφραση της PLD. ισοένζυμα

για να εξετάσει το ζήτημα του κατά πόσον ή όχι σηματοδότηση Wnt αυξάνει την έκφραση PLD, HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα εκτέθηκαν σε Wnt3A ή Wnt3A μιμητικά (Σχήμα 1). Όπως προσδιορίζεται με ανοσοκαταβύθιση και Western blot, έκφραση τόσο PLD1 και PLD2 ενισχύθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από έκθεση σε καθαρισμένη ανασυνδυασμένη Wnt3A (150 ng /ml) (Σχήμα 1Α, άνω πάνελ). Αντι-PLD αντίσωμα δημιουργήθηκε έναντι Ο-τερματικού πεπτιδίου της PLD1 στις οποίες 7 αμινοξέα μεταξύ 12 αμινοξέα ήταν η ίδια με αυτή του PLD2, και αναγνωρίζει τόσο PLD1 και PLD2 [18]. Αποδείχθηκε ότι τα κύτταρα HCT116 έχουν μεταλλάξεις σε β-κατενίνης στα Ser-45, και ότι αυτή η Ser-45 μεταλλαγμένο αλληλόμορφο δεν ήταν επαρκής για να στηρίξει την ογκογένεση των κυττάρων HCT116 [20] – [22]. Έτσι, προτείνεται ότι η οδός β-κατενίνης σε κύτταρα HCT116 δεν ενεργοποιείται πλήρως από τη μετάλλαξη, και ως εκ τούτου μπορεί να διεγερθεί από επιπλέον εξωκυτταρικά αγγελιοφόρους, όπως σηματοδότηση Wnt, με αποτέλεσμα την περαιτέρω ογκογόνο μετασχηματισμό. Στη συνέχεια διερευνήθηκε το ερώτημα του κατά πόσον ή όχι Wnt έκφραση PLD σηματοδότηση που προκαλείται μπορεί να ρυθμιστεί σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο. Wnt3A ενισχυμένη τα επίπεδα mRNA του PLD1 και PLD2 σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα S1). Για να αποκλειστεί ότι Wnt-εξαρτώμενη αύξηση του PLD mRNA προκαλείται μόνο από τις αλλαγές στη σταθερότητα του mRNA, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία αποσύνθεση mRNA χρησιμοποιώντας ακτινομυκίνη D, η οποία εμποδίζει τη μεταγραφή. Η έκφραση του PLD1 και PLD2 αυξήθηκε με το χρόνο σε ένα συγκρίσιμο τρόπο μεταξύ Wnt-θεραπεία και κύτταρα ελέγχου όπως αναλύεται με Q-RT-PCR (Εικόνα S2). Προεπεξεργασία με ακτινομυκίνη D κατέστειλε σημαντικά τόσο τη βασική όσο και Wnt3A που προκαλείται από τα επίπεδα PLD mRNA (Εικόνα S2). Έτσι, Wnt-εξαρτώμενη αύξηση του PLD mRNA είναι πράγματι οφείλεται σε αυξημένη μεταγραφή. Με στόχο την περαιτέρω ενίσχυση των αποτελεσμάτων μας, προσδιορίσαμε την επίδραση του αποκλεισμού της GSK-3β στην έκφραση PLD. LiCl και BIO είναι εγκατεστημένοι αγωνιστές που μιμούνται την οδό Wnt σηματοδότησης, οδηγώντας σε ενεργοποίηση και σταθεροποίηση του β-κατενίνης [23], [24]. Όπως αναλύθηκε με ανοσοκατακρήμνιση και στύπωμα Western, LiCI (20 mM), ΒΙΟ (1 μΜ), και Wnt3A (150 ng /ml) αύξησε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του PLD ισοενζύμων (Σχήμα 1Β). Wnt μιμητικά αύξησε επίσης το πρωτεϊνικό επίπεδο του β-κατενίνης, καθώς και την έκφραση του c-myc και NOS2, γονίδια στόχους του σηματοδότηση Wnt. Όπως αναλύθηκε με Q-RT-PCR, σηματοδότηση Wnt αξιόλογα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του PLD mRNA (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, Wnt και μιμητικά του ενίσχυσε σημαντικά τη δραστικότητα προαγωγού τόσο PLD1 και PLD2 (Σχήμα 1D)? Wnt3A συνοδεύεται μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του γονιδίου από ένα TCF /LEF συγκεκριμένη λουσιφεράση πλασμίδιο ανταποκριτή (TOPflash) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Επιπλέον, βρήκαμε ότι Wnt3A αυξημένα επίπεδα έκφρασης του PLD ισοενζύμων σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (HCA-7, RKO, Colo-741) και κύτταρα καρκίνου του μαστού (Hs578T) (Σχήμα S3). Για να παρατηρήσουμε την επαγωγή της PLD ισοενζύμων σε απόκριση προς σηματοδότηση Wnt, επιλέξαμε καρκινικά κύτταρα στα οποία η κατάσταση του μονοπάτι Wnt είναι φυσιολογική. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα είναι γνωστό ότι εκφράζουν άγριου τύπου APC και β-κατενίνης [25] – [29]. Έτσι, προτείνεται ότι σηματοδότηση Wnt-επαγόμενη έκφραση PLD θα μπορούσε να είναι ένα γενικό φαινόμενο. Προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης PLDs από Wnt3A και Wnt μιμητικά ενοχοποιηθεί έντονα έναν κεντρικό ρόλο για την αναστολή της ΟδΚ3β και την κανονική οδό σηματοδότησης Wnt σε Wnt-προκαλούμενα αποτελέσματα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επαγωγή του ισοενζύμου PLD ως νέο στόχο σηματοδότηση Wnt ρυθμίζεται τόσο σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο.

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθαρισμένο ανασυνδυασμένο Wnt3A (150 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και τα προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα σε PLD. β-κατενίνης αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας πυρηνική λύματα (άνω πάνελ). Ιστογράμματα δείχνουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του PLD1 και PLD2, που κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες τιμές α-τουμπουλίνης (κάτω πίνακας). (Β-Ο) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Wnt3A (150 ng /ml), LiCI (20 mM), ή ΒΙΟ (1 μΜ) για 24 ώρες. (Β) επίπεδο πρωτεΐνης PLDs αναλύθηκε με ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοκηλίδωση. c-Myc και έκφραση NOS2 αναλύθηκε με κηλίδωση Western (άνω πάνελ). Ιστογράμματα δείχνουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του PLD1 και PLD2, που κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες τιμές α-τουμπουλίνης (κάτω πίνακας). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. επίπεδα (C) mRNA των υποδεικνυόμενων γονιδίων αναλύθηκαν με Q-RT-PCR. *

P

& lt? 0,05

έναντι

όχημα. (D) Τα αναφερόμενα πλασμίδια ανταποκριτές υποκινητή επιμολύνθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Wnt3A, LiCl, ή ΒΙΟ για 12 ώρες? δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε στη συνέχεια. *

P

& lt? 0,01

έναντι

όχημα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

LiCl επάγει την έκφραση της PLD ισοενζύμων

in vivo

Η

Για να ενισχύσει περαιτέρω τα αποτελέσματά μας, μελετήσαμε την επίδραση του αποκλεισμού της ΟδΚ3β σε PLD έκφραση

in vivo

. LiCl εγχύθηκε σε ποντικούς, και η έκφραση του PLD διερευνήθηκε σε διάφορους ιστούς με τη χρήση αντι-PLD αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει τόσο PLD1 και PLD2. Έχουμε αναφέρει σχετικά με την ειδικότητα του αντισώματος για PLD [18], [30]. Όπως αναλύθηκε με ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοστύπωμα, LiCl αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης τόσο PLD1 και PLD2 στο παχύ έντερο, το στομάχι, και οι ιστοί του ήπατος (Εικόνα 2Α). Ως θετικός έλεγχος, το επίπεδο της β-κατενίνης και NOS2, καθώς και η φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β, αυξήθηκε σε LiCl ένεση ιστούς. Ένα συμπληρωματικό αποτέλεσμα όσον αφορά την έκφραση του PLDs μετά την εφαρμογή του LiCl ελήφθη επίσης με ανοσοφθορισμό σε ιστούς του κόλου (Σχήμα 2Β). Πυρήνες αντιχρωματίζεται με DAPI. Ενώ β-κατενίνης έδειξε ένα μεμβρανικό πρότυπο χρώσης σε PBS-εγχυθεί κόλον ελέγχου, β-κατενίνης αυξήθηκε με LiCl στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων. επίπεδο PLD ήταν ταυτόχρονα αυξήθηκε τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων σε LiCl ένεση κόλου ως β-κατενίνης ήταν αυξημένη (Σχήμα 2Β). Συλλογικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η έκφραση και των δύο PLD1 και PLD2 ενισχύεται σε ιστούς ποντικών LiCl φάρμακο.

(Α) Ποντικοί εγχύθηκαν ενδοφλεβίως με LiCl, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Κυτταρολύματα από διάφορους ιστούς ανοσοκαταβυθίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα να αναγνωρίζει τόσο PLD PLD1 και PLD2 (αριστερό πάνελ). Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Ιστογράμματα δείχνουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του PLD1 και PLD2, που κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες τιμές α-τουμπουλίνης (δεξί πάνελ). τμήματα (Β) Παραφίνη ιστών κόλου υποβλήθηκαν σε αναλύσεις ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντι-β-κατενίνης (Alexa fluor 488? πράσινο) και PLD (Alexa fluor 555? κόκκινο) αντισώματος. Οι ιστοί παρακολουθούνταν χρησιμοποιώντας Zeiss LSM 510 ομοεστιακό μικροσκόπιο. πεδία Μικροσκοπία παρατηρήθηκαν σε × 650 μεγέθυνση. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

β-κατενίνης και TCF-4 διεγείρουν την έκφραση της PLD ισοενζύμων

Εμείς εξέτασε το ζήτημα του κατά πόσον η έκφραση της PLD ισοενζύμων ή όχι είναι πράγματι μεταγραφικά ενεργοποιείται από β-κατενίνης ή TCF-4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3

A

, έκτοπη έκφραση του TCF-4 και ενός μεταλλαγμένου σταθερή β-κατενίνης (S37A β-κατενίνης), η οποία δεν είναι ευαίσθητη σε ουβικουϊτινίωση του β-κατενίνης, η ενισχυμένη μεταγραφική ενεργοποίηση τόσο PLD1 και PLD2. TCF-4 και σταθερό μεταλλαγμένη β-κατενίνης αυξήθηκε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου από ένα TCF /LEF συγκεκριμένη λουσιφεράση πλασμίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Αυτή η επαγωγή μειώθηκε σημαντικά με την προσθήκη μιας δεσπόζουσας αρνητικό (dn) TCF-4 φορέα έκφρασης (ΔN30 TCF-4) (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, η ανάλυση με ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοστύπωμα έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση της β-κατενίνης ή TCF-4 αύξησε τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης PLD1 και PLD2 ισοενζύμων σε κύτταρα HCT116. TCF-ρυθμιζόμενα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των c-Myc και NOS2, αυξήθηκαν επίσης κατά την έκφραση του β-κατενίνης ή TCF-4 (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η επιμόλυνση των dnTCF-4 ή εξάντληση των β-κατενίνης χρησιμοποιώντας shRNA μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης και των δύο ισοενζύμων PLD και γονιδίων-στόχων Wnt σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του PLD ισοενζύμων απορυθμίζεται τόσο από β-κατενίνης και TCF-4.

(Α) κύτταρα HCT116 συν-επιμολύνθηκαν με pGL4-PLD ή ρεπόρτερ TOP /FOP και τις υποδεικνυόμενες φορείς έκφρασης. *

P

& lt? 0,01

έναντι

μακέτα? †

P

& lt? 0,05

έναντι

S37A β-κατενίνης /TCF-4. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με το φορέα έκφρασης TCF-4 ή β-κατενίνης, και προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίζονται ή ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (άνω πάνελ). Ιστογράμματα δείχνουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του PLD1 και PLD2, που κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες τιμές α-τουμπουλίνης (κάτω πίνακας). (C) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με ΔN30 TCF-4 ή shRNA για β-κατενίνης. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με ανοσοκαταβύθιση ή με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (άνω πάνελ). Η έκφραση της πρωτεΐνης μετρήθηκε ποσοτικά με ανάλυση πυκνόμετρο. Ιστογράμματα δείχνουν σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του PLD1 και PLD2, που κανονικοποιούνται προς τις αντίστοιχες τιμές α-τουμπουλίνης (κάτω πίνακας). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

β-κατενίνης και TCF-4 συνδέονται με τα TBE που του υποκινητή PLD2 και ενισχύουν την έκφραση PLD2

Ένα πολυμορφισμός του γονιδίου PLD2 έχει πρόσφατα έχουν συσχετιστεί με την επικράτηση του ορθοκολικού καρκινώματος [31]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των PLD2 που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας 97 ιστούς ορθοκολικού καρκινώματος συσχετίζονταν σημαντικά με το μέγεθος του όγκου και επιβίωσης των ασθενών με ορθοκολικό καρκίνωμα? Έτσι, προτάθηκε ότι το επίπεδο έκφρασης PLD2 θα μπορούσε να είναι ένας προγνωστικός δείκτης σε ορθοκολικό καρκίνωμα [10]. Συνεπώς, επιχειρήσαμε να εξετάσουμε τις περιοχές που είναι υπεύθυνες για την /β-κατενίνης /έκφραση PLD2 TCF-4-επαγόμενη Wnt.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ο -2180 /+ 491 PLD2 προαγωγό μετενεργοποίησε με TCF -4 (4,6 φορές) ή S37A β-κατενίνης (2,3 φορές) πρωτεΐνες. Διαδοχική 5 ‘διαγραφές του υποκινητή PLD2 στις θέσεις -1601, -1210, -784 και δεν επηρέασε TCF-4- ή S37A β-κατενίνης μεσολάβηση τρανσενεργοποίηση του υποκινητή PLD2 (TCF-4, 4,2-πλάσια? Β-κατενίνης 2,2-πλάσια ενεργοποίηση όλων των μεταλλάξεων)? Ωστόσο, η διαγραφή των -380 περιοχών μειώθηκε σημαντικά TCF-4 ή S37A β-κατενίνης διεγείρεται δραστικότητα PLD υποκινητή. Έτσι, προτείνεται ότι η σύνδεση υποθετική TCF στοιχείο (ΤΒΕ) στις θέσεις -784 ~ -380 μπορεί να είναι απαραίτητη για την ρύθμιση του γονιδίου PLD2 με TCF-4 και β-κατενίνης.

(Α) ανάλυση Απαλοιφή του pGL4- PLD2 στα κύτταρα HCT116. Μια σχηματική αναπαράσταση του pGL4-PLD2 κατασκευάσματα ανταποκριτή φαίνεται. Τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με pGL4-PLD2 και τις υποδεικνυόμενες φορείς έκφρασης, που ακολουθείται από προσδιορισμό της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. (Β) Σχηματική απεικόνιση της -2180 να +491 περιοχή του υποκινητή ανθρώπινης PLD2. Οι αριθμοί πάνω από τις γραμμές αναφέρονται στη θέση έναρξης της μεταγραφής του

PLD2

γονίδιο (1). Δύο υποθετικές θέσεις σύνδεσης για TCF-4 αναφέρεται στην αλληλουχία (τα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση). (C) κύτταρα HCT 116 διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχει την άγριου τύπου (wt) PLD2 προαγωγό, μία ή διπλό ΤΒΕ μεταλλαγμένες μορφές (mt) του PLD2 υποκινητή, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Wnt3A (150 ng /ml) ή ΒΙΟ (1 μΜ). Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε. *

P

& lt? 0,05

έναντι

wtTBE /Wnt3A? †

P

& lt? 0,01

έναντι

wtTBE /ΒΙΟ. (D) κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα φορείς έκφρασης, μαζί με τα wt ή TBE μεταλλαγμένες μορφές του υποκινητή PLD2. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε. *

P

& lt? 0,05

έναντι

επιμολυσμένα με wtTBE /β-κατενίνης? †

P

& lt? 0,05

έναντι

wtTBE /TCF4? **

P

& lt? 0,05

έναντι

επιμολυσμένα με wtTBE /β-κατενίνης /TCF4. (Ε) Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στο πείραμα chip. Η δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας προάνοσο IgG, αντι-β-κατενίνης, ή αντι-HDAC1 αντίσωμα και αναλύθηκαν με Q-RT-PCR. Ως θετικός έλεγχος, εκτελέστηκε ChIP ανάλυση του υποκινητή NOS2 περιέχει ΤΒΕ. *

P

& lt? 0,05

έναντι

β-κατενίνης /όχημα? †

P

& lt? 0,05

έναντι

HDAC1 /οχήματος. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (F) Σχηματικό διάγραμμα για τη σύγκριση των γραμμών με TBE στις περιοχές υποκινητή PLD2 από διάφορα είδη. TCF-4 συνδετικά στοιχεία σε 5 ‘πλευρικές περιοχές του ανθρώπινου PLD2 έναρξης μεταγραφής θέση (TSS) συγκρίθηκαν με εκείνες των γονιδιωμάτων από 4 διαφορετικά είδη. Ένας πυρήνας

μοτίβο

, CTTTG (Α /Τ) (Α /Τ) [ή η συμπληρωματική αλληλουχία (Α /Τ) (Α /Τ) CAAAG] του TCF αλληλουχιών δεσμευτική για PLD2 υποκινητής είναι εξαιρετικά

συντηρημένη μεταξύ των ειδών

.

η

όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, η ανάλυση αλληλουχίας του 5′-πλευρικής αλληλουχίας του γονιδίου PLD2 προσδιόρισε δύο υποθετικών γραμμών με TBE (ορίζεται ως TBE1 και TBE2). TBE1 (ATGAAAG) βρίσκεται -512 b ανάντη, και περιέχει ένα σχεδόν ανεστραμμένη αντιστοιχία με την συναινετική CTTTG (A /T) (Α /Τ) αλληλουχία για TCF-4 δεσμευτικός [32]? TBE2 (CTTTCAT) βρισκόταν -497 β ανάντη και σχεδόν ταίριαζε με την ομόφωνη αλληλουχία (Πίνακας S2) [33].

Για να εξεταστεί η λειτουργική σημασία του μοτίβου TBE στη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής PLD2, τοπο-κατευθυνόμενη μετάλλαξη του ΤΒΕ sites δημιουργήθηκε στο πλαίσιο ενός υποκινητή PLD2. Μετάλλαξη στην θέση TBE1 ή TBE2 μειώθηκε σημαντικά δράση προαγωγού PLD2 Wnt3A-επάγεται σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 4C). Οι μεταλλάξεις των δύο χώρων TBE1 και TBE2 (TBE1 /2) καταστέλλεται δραματικά δράση προαγωγού PLD2 Wnt3A διεγείρεται. Επιπλέον, TCF-4 ή /και της δραστηριότητας PLD2 υποκινητή β-κατενίνης που προκαλείται επίσης καταργήθηκε όταν TBE1 και TBE2 μεταλλάχθηκαν (Εικόνα 4D). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ο προαγωγός PLD2 είναι ο στόχος του συγκροτήματος /β-κατενίνης TCF μέσω συναίνεσης ΤΒΕ του.

Επίσης, στη συνέχεια, εκτελείται ένα χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία σε κύτταρα HCT116 να επιβεβαιώσει

στο vivo

σύνδεση του β-κατενίνης /TCF-4 με τον προαγωγό PLD2. DNA-β-κατενίνης /TCF-4 συμπλέγματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα που φαίνεται στο Σχήμα 4Ε, ακολουθούμενη από αναστροφή της εγκάρσιας σύνδεσης και Q-RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που πλευρίζουν τόσο TBE1 και TBE2, τα οποία βρίσκονται σε εγγύς θέση μεταξύ τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Ε, καθαρισμένη ανασυνδυασμένη Wnt3A ενισχυμένη σύνδεση του β-κατενίνης /TCF-4 και στις δύο γραμμών με TBE του υποκινητή PLD2. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με εκείνα της δοκιμασίας προαγωγού χρησιμοποιώντας μεταλλαξογένεση. Wnt στόχους σηματοδότησης β-κατενίνης σε χρωματίνη για την απομάκρυνση του HDAC1 συνκαταστολέα (αποακετυλάσης ιστόνης 1) [34]. Όπως ήταν αναμενόμενο, Wnt3A κατέστειλε σημαντικά τη σύνδεση του β-κατενίνης σε δύο γραμμών με TBE του υποκινητή PLD2 μετά τη δοκιμασία ChIP, χρησιμοποιώντας αντι-HDAC1 αντίσωμα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι TCF θέσεις επί του υποκινητή PLD2 πρόσδεσης είναι διατηρημένες μεταξύ των ειδών (Σχήμα 4F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το γονίδιο PLD2 είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος της β-κατενίνης /σηματοδότηση TCF in vivo.

Τα ισοένζυμα PLD απαιτείται για το σχηματισμό της β-κατενίνης /TCF-4 συγκρότημα και την προώθηση της β-κατενίνης /TCF μεταγραφική δραστηριότητα

Ερευνήσαμε το ερώτημα του κατά πόσον ή όχι Wnt σηματοδότησης που προκαλείται από PLDs αυξητική ρύθμιση θα μπορούσε να ρυθμίζουν-κατενίνης-εξαρτώμενη β δραστηριότητας TCF μεταγραφική μέσω μιας θετικής ανάδρασης. Η έκτοπη έκφραση ενός ιδιοσυστατικού ενεργό μετάλλαγμα του β-κατενίνης αυξημένη δραστηριότητα μεταγραφικής TCF σε HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου (Σχήμα 5Α). Οι εκλεκτικοί αναστολείς PLD έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα [35], [36].