Αφηρημένο

Η κυτταροπλασματική παρουσία της Hsp60, η οποία είναι κατά κύριο λόγο ένα πυρηνικό γονίδιο-κωδικοποιημένα μιτοχονδριακό σαπερονίνης, έχει συχνά ήταν αναφέρθηκε, αλλά ο ρόλος του στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η κυτοσολική Hsp60 προωθεί την ΤΝΡ-α διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της οδού επιβίωσης ΙΚΚ /NF-κΒ μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με ΙΚΚα /β στο κυτταρόπλασμα. Επιλεκτική απώλεια ή αποκλεισμό της κυτοσολικής Hsp60 από ειδικές ολιγονουκλεοτίδιο αντίθετης φοράς ή το αντίσωμα εξουδετέρωσης μείωσε την ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ και την έκφραση των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ, όπως Bfl-1 /Α1 και MnSOD, που έτσι επαυξημένης παραγωγής ROS ενδοκυτταρικά και ASK1 εξαρτώμενης κυτταρικό θάνατο, σε απόκριση προς τον TNF-α. Αντιστρόφως, η έκτοπη έκφραση της κυτοσολίου στόχευσης Hsp60 αυξημένη ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ. Μηχανιστικά, η κυτοσολική Hsp60 αυξημένη ενεργοποίηση ΙΚΚ μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της ενεργοποίησης εξαρτώμενη φωσφορυλίωση σερίνης σε ένα συνοδό-ανεξάρτητο τρόπο. Επιπλέον, τα διαγονιδιακά μελέτη ποντικών έδειξαν ότι η κυτοσολική Hsp60 κατέστειλε ηπατικού κυτταρικού θανάτου που επάγεται από diethylnitrosamine

in vivo

. Η κυτοσολική Hsp60 είναι πιθανό να είναι μια ρυθμιστική συνιστώσα των πολύπλοκων ΙΚΚ και εμπλέκει το πρώτο μιτοχονδριακό παράγοντας που ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση μέσω NF-κΒ οδού

Παράθεση:. Chun JN, Choi Β, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY, et al. (2010) Κυτοσολικά Hsp60 εμπλέκεται στην NF-κΒ-Εξαρτημένων επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μέσω ΙΚΚ κανονισμού. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10.1371 /journal.pone.0009422

Επιμέλεια: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), η Βραζιλία

Ελήφθη: 2, Δεκεμβρίου, 2009? Αποδεκτές: 18, Ιανουαρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2010

Copyright: © 2010 Chun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από 21C Frontier Λειτουργική Έργου Πρωτεομική (FPR08-B1-190) που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης & amp? Τεχνολογία και από KOSEF μέσω του Κέντρου Κυτταρικής Σηματοδότησης & amp? Drug Discovery Έρευνας (CCS & amp? DDR, R15-2006-020) σε Ewha Γυναικείο Πανεπιστήμιο. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε επίσης εν μέρει από επιχορήγηση του Εθνικού R & amp? D Προγράμματος Ελέγχου Καρκίνου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας (0.420.190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Υ Lee, Β Α Choi, και H. Ι Kim υποστηρίχθηκαν από Brain Κορέα 21 επιχορήγησης από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης & amp Κορέα? Τεχνολογία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα κύτταρα των θηλαστικών εκφράζουν έναν αριθμό γονιδίων επιβίωσης που παίζουν τους ρόλους στην αναστολή της ενεργοποίησης της κασπάσης, αφαιρώντας βλαβερές ρίζες οξυγόνου, υπερασπίζεται μιτοχονδριακή λειτουργία, και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Μεταξύ των παραγόντων μεταγραφής υπεύθυνη για την επαγωγή των γονιδίων επιβίωσης, πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κΒ) είναι ένα βασικό στοιχείο που ενορχηστρώνει το σύμπλοκο απόκριση κυτταρικής επιβίωσης [1]. Ειδικότερα, οι ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο γονίδια επιβίωση περιλαμβάνουν αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως c-ΙΑΡ και c-flip, και μιτοχονδριακά γονίδια διασφάλισης, όπως μαγγάνιο-υπεροξειδική δισμουτάση (MnSOD) και 2 Bcl-μέλη της οικογένειας [2] , [3], [4]. Ένα κεντρικό κινάσης σε οδό ενεργοποίησης ΝΡ-κΒ είναι ο αναστολέας της κΒ κινάσης (κινάση ΙκΒ ή ΙΚΚ), που φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη ΙκΒ σε δύο αμινο-τερματικά υπολείμματα σερίνης, οδηγώντας σε ubiquitinylation και proteosomal αποδόμησής της και την επακόλουθη απελευθέρωση του ΝΡ-κΒ πρωτεΐνες [5]. Τα εξωκυτταρικά ερεθίσματα για την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ μονοπάτι συγκλίνουν προς ΙΚΚ [6]. Ως εκ τούτου, έχουν πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να οριοθετηθούν τη ρύθμιση της ενεργοποίησης ΙΚΚ. Πρώτον, το εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση ρύθμιση ενεργοποίησης ΙΚΚ έχει χαρακτηριστεί [7]. Η φωσφορυλίωση των δύο καταλοίπων σερίνης (Ser 177 /Ser181 στο ανθρώπινο ΙΚΚβ) στην ενεργοποίηση των Τ-βρόχος είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση, ενώ η αυτοφωσφορυλίωση του συμπλέγματος σερίνης καρβοξυλ-τερματικό απενεργοποιεί την ενεργοποίηση. Πολλές κινάσες έχουν ενοχοποιηθεί ότι εμπλέκεται στη φωσφορυλίωση ενεργοποίηση: ΝΡ-κΒ επαγωγής κινάσης (ΝΙΚ) [8], [9], που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση /ΕΚΚ κινάσες κινάσης 1 (ΜΕΚΚ1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], αιμοποιητικά προγονικά κινάση-1 (ΗΡΚ1) [13], Mixed-συγγενικής κινάσης 3 (MLK3) [14], ο ΤΟΡ-β ενεργοποιείται κινάση 1 (TAK1) [15]. Ωστόσο, εκτός από TAK1, δεν είναι σαφές πώς η ανάντη κινάσης ενεργοποιεί το συγκρότημα ΙΚΚ. Δεύτερον, η ουβικιτίνη-εξαρτώμενη ρύθμιση της ενεργοποίησης ΙΚΚ έχει μελετηθεί για πολλά χρόνια [15], [16]. Πρόσφατα, η ρυθμιστική υπομονάδα IKKγ (ή NEMO) συμπλόκου ΙΚΚ έχει δειχθεί να ουβικουιτινωμένης, καθώς και για την αναγνώριση Lys63-συνδεδεμένη αλυσίδα polyubiquination επί πρωτεΐνη υποδοχέα-1 αλληλεπίδραση (RIP1) [17], [18]. Τρίτον, η ρύθμιση της ενεργοποίησης ΙΚΚ μέσω των αλληλεπιδρώντων πρωτεϊνών έχει χαρακτηριστεί. Τα καλύτερα παραδείγματα είναι πρωτεΐνες θερμικού σοκ. Για παράδειγμα, Cdc37 και Hsp90 έχει αναφερθεί ότι δρα ως επιπλέον συστατικά του συμπλόκου ΙΚΚ που σταθεροποιούν το σύμπλοκο [19], [20]. Hsp27 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με ΙΚΚβ σε ΤΝΡ-α με τρόπο που εξαρτάται [21]. Hsp70 αλληλεπιδρά επίσης με IKKγ αλλά παρεμβαίνει στην ενεργοποίηση ΙΚΚ [22]. Εκτός αυτού, η συσχέτιση μεταξύ της πρωτεΐνης φωσφατάση 2Cβ (PP2Cβ) και το συγκρότημα ΙΚΚ έχει αποδειχθεί [23], και άλκες έχει επίσης αναγνωριστεί ως μια νέα ρυθμιστική υπομονάδα των πολύπλοκων ΙΚΚ που μεσολαβεί για την πρόσληψη ΙκΒ στο σύμπλεγμα [24]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία ένδειξη μιτοχονδριακής πρωτεΐνης που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ.

Έχουμε πρόσφατα εντοπιστεί θερμικού σοκ πρωτεΐνη 60 (Hsp60) ως ένα ΙΚΚ-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης. Hsp60 είναι η μιτοχονδριακή σαπερονίνης που προωθεί την αναδίπλωση της εισαγόμενης πρωτεΐνης στην φυσική διαμόρφωση. Παρ ‘όλα αυτά, η ύπαρξη και η λειτουργία του Hsp60 σε μιτοχονδριακών διαμερίσματα έχει συχνά αναφερθεί [25]. Για παράδειγμα, Hsp60 μπορεί να είναι ένας συνδέτης για υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, όπως υποδοχέα ΤοΙΙ [26]. Ενδοκυτταρικώς, Hsp60 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με προ-κασπάση-3 ή Bax [27], [28], [29]. Ωστόσο, η λειτουργία της Hsp60 που σχετίζονται με σηματοδότηση επιβίωσης των κυττάρων δεν έχει αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, Hsp60 βρέθηκε να μεσολαβούν την ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενη σηματοδότηση επιβίωσης στα κύτταρα. Συγκεκριμένα, Hsp60 αλληλεπιδράσει άμεσα με ΙΚΚα /β σε κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια προώθησε την φωσφορυλίωση εξαρτώμενη ενεργοποίηση της κινάσης σε απόκριση σε TNF-α. Τέτοια λειτουργία σηματοδότησης της Hsp60 ήταν ανεξάρτητη από συνοδού της δραστηριότητα, η οποία θέτει Hsp60 εκτός από άλλες πρωτεΐνες θερμικού σοκ που λειτουργούν μέσω σταθεροποιήσεως ή αποσταθεροποίηση σύμπλεγμα σηματοδότησης [30]. Δείξαμε επίσης

in vivo

απόδειξη ότι κυτοσολική έκφραση της Hsp60 προστατεύει ηπατικά κύτταρα κατά των χημικών που προκαλείται από βλάβες μέσω ενίσχυσης της ενεργοποίησης ΙΚΚ. Έτσι, το εύρημα αυτό αντιπροσωπεύει τη νέα λειτουργία προ-επιβίωσης της κυτοσολικής Hsp60 και να ρίξει φως στην κατανόηση της λειτουργίας της Hsp60 σε εξω-μιτοχονδριακής διαμερίσματα [25].

Αποτελέσματα

Hsp60 αλληλεπιδρά με το ΙΚΚ συγκρότημα στο κυτταρόπλασμα

Για να εντοπίσετε ένα πρόσθετο συστατικό, εξετάσαμε την μοριακή σύνθεση της λανθάνουσας συγκρότημα ΙΚΚ χρησιμοποιώντας μια πρωτεομική τεχνική που συνδυάζει τον καθαρισμό ανοσο-συνάφειας και φασματομετρία μάζας. Εν συντομία, το συγκρότημα ΙΚΚ καταβυθίστηκε από τα προϊόντα λύσης των μη διεγερμένα κύτταρα HeLa S3 χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αντι-ΙΚΚα αντίσωμα, και οι συν-καταβυθίστηκαν πρωτεΐνες αλληλουχήθηκαν με φασματομετρία μάζας υγρής χρωματογραφίας-tandem. Ο εντοπισμός των υπομονάδων ΙΚΚ και Hsp90 έδειξε ότι το ανοσολογικό του ΙΚΚ συγκρότημα αρκετά εργαστεί (Εικ. 1Α). Κατά συνέπεια, αυτή η πρωτεομική μελέτη προσδιόρισε μία πρωτεΐνη θερμικού σοκ, Hsp60, στα ιζήματα (Εικ. 1Α και 1Β). Η παρουσία των υπομονάδων ΙΚΚ και Hsp60 στα ιζήματα επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, αποφασίσαμε να ερευνήσουμε τη βιολογική έννοια της αλληλεπίδρασης ΙΚΚ-Hsp60.

Α. Μια άργυρο γέλη πολυακρυλαμιδίου επίλυση του συμπλόκου ΙΚΚ συγγένεια καθαρισμένο. B. MS /MS φάσματα του [Μ + 2Η]

2+ ιόντων των πεπτιδίων που προέρχονται από την ζώνη πρωτεΐνης που αντιστοιχεί στην Hsp60. Γ Ανοσοστύπωμα (ΙΒ) αναλύσεις υπομονάδων ΙΚΚ και Hsp60 στο σύμπλοκο συγγένεια καθαρισμένο. Δ Αλληλεπίδραση της Hsp60 με πολύπλοκες ΙΚΚ. σύμπλοκο ΙΚΚ ανοσοκατακρημνίστηκε (ΙΡ) από προϊόντα λύσης κυττάρων HeLa (ολικές πρωτεΐνες 500 μg για το καθένα) με ΙΚΚα, ΙΚΚβ, και IKKγ-ειδικά αντισώματα. Οι υπομονάδες ΙΚΚα /β /γ, Hsp60 και Hsp90 ανοσοστυπώθηκαν. ΠΣΟ, λύμα ολόκληρο το κύτταρο. Ε TNF-α-ανεξάρτητη αλληλεπίδραση του Hsp60 και ΙΚΚ σύμπλοκο. ΣΤ συνανοσοκαθίζηση του Hsp60 και ΙΚΚ συγκρότημα στο κυτοσολικό κλάσμα.

Άνω πάνελ

, μετα-πυρηνική υπερκείμενο (PNS), ανοσοστυπώθηκαν κυτταρόπλασμα (Cyto), και τα μιτοχόνδρια (Mito) κλάσματα από κύτταρα HeLa. COX4 και τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως μιτοχονδριακό και κυτοσολικά δείκτες, αντίστοιχα.

Κάτω πάνελ

, Hsp60 ανοσοκαταβυθίστηκε από το κυτοσολικό κλάσμα χρησιμοποιώντας είτε IgG αίγας ελέγχου ή αντισώματα αντι-Hsp60 (Κ-19 και Ν-20). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες εμφανίζονται (

n

= 3).

Η

Το πρώτο βήμα ήταν να εξακριβωθεί η ενδογενής αλληλεπίδραση των Hsp60 και IKKS από πειράματα συνανοσοκαθίζησης. Όταν οι ετερογενείς σύμπλοκα ΙΚΚ κατακρημνίστηκαν με αντισώματα έναντι ΙΚΚα, ΙΚΚβ, και IKKγ, κάθε μία από τις υπομονάδες ειδικών αντισωμάτων ΙΚΚ παρομοίως καθιζάνει Hsp60 (Σχ. 1D). Επιπλέον, Hsp90 ήταν επίσης συν-καθιζάνει με ΙΚΚ σύμπλοκο [20], [21]. Αυτή η αλληλεπίδραση βρέθηκε να είναι ανεπηρέαστη από κατεργασία ΤΝΡ-α (Σχ. 1Ε), υποδεικνύοντας ότι Hsp60 είναι ένα συστατικό πρωτεΐνη ετερογενών συμπλοκών ΙΚΚ. Μια αντίστροφη ανοσοκαθίζηση συνέχεια διεξάγεται με το κυτοσολικό κλάσμα να αποκλεισθεί η μιτοχονδριακή μόλυνση. Τα αντισώματα αντι-Hsp60 συγκαταβυθισμένο IKKγ με Hsp60, ενώ κατσίκα έλεγχος IgG όχι (Εικ. 1 F), επιβεβαιώνοντας ότι κυτοσολική Hsp60 αλληλεπίδραση και ΙΚΚ. Για να απεικονίσει την εικονική αλληλεπίδραση της Hsp60 με IKKS στο κυτταρόπλασμα, η χρώση immunogold σε συνδυασμό με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΕΜ) εκτελέστηκε. Τα άνοσα σύμπλοκα Hsp60 και ΙΚΚ με ειδικά αντισώματα τους ανιχνεύθηκαν διαφορετικά χρησιμοποιώντας δευτερεύοντα αντισώματα επισημασμένα με 20 ηΜ-40 και τα σωματίδια nm διαμέτρου χρυσού, αντιστοίχως. Ως αποτέλεσμα, οι Hsp60-επισήμανση σωματίδια χρυσού κατανεμημένο σε όλη των κυτταρικών δομών: όχι μόνο στη μήτρα και intermembrane χώρο των μιτοχονδρίων, αλλά επίσης και στο κυτταρόπλασμα και το πλάσμα μεμβράνη (Εικόνα 2Β).. Σε αντίθεση, τα σωματίδια χρυσού IKKα- και ΙΚΚβ σήμανσης ανιχνεύθηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 2C και 2D), ενώ ο ΙΚΚα ανιχνεύθηκε επίσης στον πυρήνα, το οποίο είναι συνεπές με τις προηγούμενες εκθέσεις [31], [32] . Αν και οι βασικές υπομονάδες ΙΚΚ δειχθεί να βρεθεί στο μιτοχονδριακό κλάσμα [33], τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα ΙΚΚ-επισήμανση σωματίδια χρυσού συχνά παρατηρήθηκαν στις κυψελιδικές δομές και όχι των μιτοχονδρίων (σχ. 2C και 2D). Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να οφείλεται στην προηγούμενη μελέτη που έγινε με υποκυτταρική κλασμάτωση. Όταν η Hsp60 και IKKS συν-χρώση, η άμεση σύνδεση του 20 nm και 40 nm σωματίδια χρυσού ήταν σαφώς ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 2Ε και 2F). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν είναι όλα τα ΙΚΚα και ΙΚΚβ συσχετίστηκαν με Hsp60. Αυτά τα αποτελέσματα συλλογικά δείχνουν ότι η Hsp60 αλληλεπιδρά άμεσα με σύμπλεγμα ΙΚΚ στο κυτταρόπλασμα.

HeLa κύτταρα ανοσοαντέδρασαν χωρίς πρωτογενή (Α), αντι-Hsp60 (Β), αντι-ΙΚΚα (C), αντι-ΙΚΚβ (D), αντι-Hsp60 /ΙΚΚα (Ε), και αντι-Hsp60 /ΙΚΚβ (F) αντισώματα, και στη συνέχεια επισημαίνονται με τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με 20 nm ή 40 nm σωματίδια χρυσού, όπως περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία. Η επισήμανση εκτιμήθηκε με ανοσο-χρυσό ηλεκτρονική μικροσκοπία. Πυρήνες (Nu) και τα μιτοχόνδρια (Μ) υποδεικνύονται.

βέλη

κατέδειξαν άμεσες τήρηση των Hsp60- και σωματίδια χρυσού ΙΚΚ-επισημασμένο. Δεν ανοσοαντιδραστικό σήμα παρατηρήθηκε στο δείγμα χωρίς πρωτογενή αντισώματα (Α). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με τα ίδια αποτελέσματα, και Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται.

Η

Hsp60 αλληλεπιδρά άμεσα με ΙΚΚα /β, δεν IKKγ

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την μοριακή αλληλεπίδραση του Hsp60 και IKKS. Για να γίνει αυτό, ένας κυτοσολίου στοχευμένη έκδοση του Hsp60 (Hsp60c), όπου η μιτοχονδριακή αλληλουχία σήμα στόχευσης διαγράφεται, κατασκευάστηκε. Όταν Hsp60c συν-εκφράζεται με κάθε μία από τις βασικές υπομονάδες ΙΚΚ, Hsp60c αλληλεπίδρασε με ΙΚΚα και, αν και σε μικρότερο βαθμό, με ΙΚΚβ, αλλά όχι με IKKγ (Εικ. 3Α). Στη συνέχεια, ένας

in vitro

δεσμευτικός πείραμα με τη χρήση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών της γλουταθειόνης-δ-τρανσφεράσης (GST) -συγχωνευμένο Hsp60 και (His)

6-tagged ΙΚΚ πυρήνα υπομονάδων εκτιμήθηκε με GST pull-down χημική δοκιμή. Το αποτέλεσμα, και πάλι, δείχνει ότι Hsp60 συνδέεται άμεσα με ΙΚΚα και ΙΚΚβ, αλλά όχι να IKKγ (Σχ. 3Β).

A. Άμεση σύνδεση του Hsp60 και ΙΚΚ υπομονάδες. Τα κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με Hsp60c (ΗΑ tag) και κάθε ένα από πρωτεΐνες υπομονάδας ΙΚΚ (Flag ετικέτα) για 24 ώρες. Β

In vitro

σύνδεση της Hsp60 με ΙΚΚα και ΙΚΚβ. GST-συντηγμένο Hsp60 πρωτεΐνες δεσμεύονται στα σφαιρίδια γλουταθειόνης Sepharose επωάστηκε με τα προϊόντα λύσης κυττάρων εντόμων Sf9 που εκφράζουν His

6-tagged πρωτεΐνες ΙΚΚ. Hsp60 και IKKS ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για GST και ΗΑ ετικέτες, αντίστοιχα. διάγραμμα C. Σχηματικά δείχνει μεταλλάξεις διαγραφής του Hsp60. Οι πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης των κινασών, συμπεριλαμβανομένων των ΡΚΑ /PKG (1) και PKC (2), υποδεικνύονται. Δ και Ε Αλληλεπίδραση Hsp60 άγριου τύπου (WT) και μεταλλάγματα εξάλειψης με εκτοπικά-εκφράζεται ΙΚΚα σε 293Τ κύτταρα (D) ή σε ενδογενείς συγκρότημα ΙΚΚ σε κύτταρα HeLa (Ε). Ο φορέας ελέγχου (C) υποδεικνύεται. Αντιπροσωπευτικές κηλίδες και οι εικόνες εμφανίζονται (

n

= 3). N.S., μη ειδικό.

Η

Η μοριακή αλληλεπίδραση του Hsp60 με ΙΚΚ χαρακτηρίστηκε περαιτέρω με πειράματα χαρτογράφησης τομέα. Επειδή το C-τερματική διαγραφή εμπόδισε την έκτοπη έκφραση, μια σειρά μεταλλάξεων Ν-τερματικής διαγραφής της Hsp60c δοκιμάστηκε για δέσμευση ΙΚΚ μέσω συν-έκφραση με Flag-tagged ΙΚΚα σε κύτταρα ΗΕΚ293 (Σχ. 3C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Ν-τερματικό τμήμα (~160 αμινοξέα από Ν-άκρο) της Hsp60 πρωτεΐνης δείχθηκε να είναι περιττή για την αλληλεπίδραση (Σχ. 3D). Το ίδιο αποτέλεσμα ελήφθη όταν ενδογενές σύμπλεγμα ΙΚΚ ανοσοκαταβυθίστηκε από κύτταρα HeLa διαμολυσμένα με τα κατασκευάσματα Hsp60c (Σχ. 3Ε). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αρκετά το πεδίο σύνδεσης πυρήνας βρίσκεται στη μέση της Hsp60 πρωτεΐνης.

Hsp60 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση

ΙΚΚ /NF-κΒ

Στη συνέχεια, το βιολογικό αποτέλεσμα του κυτοσολίου Hsp60- ΙΚΚ αλληλεπίδραση διερευνήθηκε σε ΤΝΡ-α με τη μεσολάβηση μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Για να επιτευχθεί ο στόχος, το ουσιώδες βήμα είναι να χειριστεί το επίπεδο κυτοσολικού Hsp60 χωρίς να επηρεάζεται η μιτοχονδριακή, διότι ανεπάρκεια Hsp60 είναι γνωστό ότι προκαλεί ένα μιτοχονδριακό λειτουργική ατέλεια [34], [35], [36]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένας αριθμός μελετών έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι ένα αντινοηματικό ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο (AS-ODN) συμπληρωματική προς μία αλληλουχία που περιβάλλει το κωδικόνιο έναρξης του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης ανθρώπινης Hsp60 μειώνει πραγματικά το κυτοσολικό επίπεδο Hsp60 [27], [37], [38] . Εμείς, ως εκ τούτου, αποφάσισε να δοκιμάσει αυτό το AS-ODN (που ορίζεται ως AS-1) για επιλεκτική νοκ ντάουν αποτέλεσμα. Προκειμένου να αποκλειστεί η πιθανότητα της μη-ειδικής δράσης μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας ODN, επιλέξαμε ένα δεύτερο AS-ODN (AS-2) που είναι συμπληρωματικό προς την περιοχή (+ 95~ + 110 από το κωδικόνιο έναρξης) κοντά στο 5 ‘άκρο , αλλά μετά από μιτοχονδριακή αλληλουχία σήμα στόχευσης (MTS), της Hsp60 ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (Εικ. S1 Α). Η αίσθηση ΟϋΝ (S-ODN) συμπληρωματικά προς AS-1 χρησιμοποιήθηκε ως ένα ODN ελέγχου. Δεδομένου ότι το αντινοηματικό ODN είναι μια μέτρια μεταφραστική blocker, δεν προκαλούν την μείωση του συνολικού επιπέδου Hsp60 (Εικ. S1B). Ωστόσο, η επιμόλυνση των AS-ODNs πράγματι επιλεκτικά μειωμένη κυτοσολική Hsp60 επίπεδα σε σύγκριση με την πλαστή ή ελέγχου S-ODN χωρίς να επηρεάζεται το μιτοχονδριακό επίπεδο (Σχ. 4Α). Για να κατανοήσουμε αυτό το φαινόμενο, υποθέσαμε ότι ο χρόνος ημιζωής της Hsp60 πρωτεΐνης σε δύο διαμερίσματα μπορεί να διαφέρουν. Για να το αποδείξει, ο χρόνος ημίσειας ζωής της κυτταρόπλασμα στοχευμένη Hsp60 (Hsp60c) εκτιμήθηκε μετά την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Παραδόξως, το επίπεδο της πρωτεΐνης κυτοσολίου Hsp60 ταχέως μειώθηκε (υπολογισμένο

t

½ = 3,2 min), ενώ το συνολικό επίπεδο των ενδογενών πρωτεϊνών Hsp60 και ΙΚΚα ήταν αμετάβλητη (Εικ. 4Β). Επιπλέον, αυτή η μείωση ήταν εντελώς αποκλεισμένη από τη θεραπεία ενός αναστολέα πρωτεασώματος MG132 (Εικ. 4C). Σημειώνεται ότι η θεραπεία MG132 είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αξιοσημείωτη αύξηση του βασικού επιπέδου της πρωτεΐνης Hsp60c. Έτσι, το αποτέλεσμα αυτό, τουλάχιστον εν μέρει, εξηγεί γιατί το επίπεδο κυτοσολικού Hsp60 ήταν περισσότερο ευαίσθητη σε θεραπεία AS-ODN, και επιπλέον υποδεικνύει ότι το επίπεδο της κυτοσολικής Hsp60 μπορεί να ελεγχθεί με πρωτεασώματος.

A. Κατάλυση της κυτοσολικής Hsp60 από ODNs αντίστροφης φοράς. Τα κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα που παρασκευάζονται από ψευδο ή ODN-επιμολυσμένα HeLa κύτταρα ανοσοστυπώθηκαν. S, αίσθηση ODN? AS-1 και AS-2, ODNs αντίστροφης φοράς. Το μιτοχονδριακό κλάσμα φορτώθηκε σε έναν όγκο ένα πέμπτο του αντίστοιχου κυτοσολικό κλάσμα. Ειδικότερα, Prx III, το οποίο είναι ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο που υπάρχει στη μιτοχονδριακή μήτρα, χρησιμοποιήθηκε ως μιτοχονδριακό δείκτες για να παρακολουθήσουν την μη ειδική μιτοχονδριακή ρήξη. B. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του εκτοπικά-εκφρασμένης πρωτεΐνης Hsp60c (ΗΑ tag) μετά από αναστολή της σύνθεσης πρωτεΐνης με κυκλοεξιμίδιο. Η ένταση της ζώνης ΗΑ μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκε από το ποσό των ΙΚΚα μπάντα. Τα δεδομένα στο γράφημα είναι μέσα ± S.D. από δύο ανεξάρτητα πειράματα και τοποθετούνται σε SigmaPlot 8.0 λογισμικό. Γ πρωτεασώματος που εξαρτάται από τον κύκλο εργασιών της κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Hsp60c. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς MG132 (5 μΜ) 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία κυκλοεξιμίδιο. Δ TNF-α επαγόμενης ενεργοποίησης ΙΚΚ και JNK1 σε εικονικές ή ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Η

in vitro

δραστικότητα κινάσης (ΚΑ) ήταν κατά μέσο όρο με τις τιμές από δύο ανεξάρτητα πειράματα, και αυτό αντιπροσωπεύεται ως πλάσια αύξηση της δραστικότητας έναντι των μη διεγερμένα και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 1). Ε ΝΡ-κΒ μεταγραφικής ενεργοποίησης σε ψευδο ή ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Η αυξανόμενη συγκέντρωση του AS-ODN (100 nm ή 200 ηΜ) ελέγχθηκε. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε στην δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης και τα δεδομένα είναι μέσοι ± S.D. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα (*

P

& lt? 0,0001, **

P

& lt? 0.001 έναντι διεγείρονται S-ΟϋΝ-επιμολυσμένων κυττάρων).

Η

Ο TNF -α-επαγόμενη ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ εξετάστηκε στη συνέχεια στα AS-ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Ένα

in vitro δοκιμασία κινάσης

έδειξε ότι η επιμόλυνση των AS-ODNs μειωθεί αισθητά την ενεργοποίηση ΙΚΚ σε απόκριση προς τον TNF-α κατά 60% σε σύγκριση με εκείνη του mock ή S-ODN (Εικ. 4D). Ωστόσο, τα AS-ODNs δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση της ΜΑΡ κινάσης σε απόκριση σε TNF-α (Εικ. 4D και το Σχ. S1c), αποκαλύπτοντας το συγκεκριμένο αποτέλεσμα της Hsp60 AS-ΟϋΝ στην ενεργοποίηση ΙΚΚ. Επιπλέον, οι AS-ODNs κατήργησε σχεδόν εντελώς την μεταγραφική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε απόκριση προς τον TNF-α, ενώ S-ODN δεν είχε, σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4Ε). Λόγω knockdown αποτελεσματικότητά του, AS-1 είναι πιο ισχυρός ότι AS-2. Ωστόσο, η επιμόλυνση ίδια ODNs δεν προκάλεσε βασική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, υποδεικνύοντας καμία επίδραση εκτός στόχου των ODNs. Επιπλέον, η αναγωγική δράση του AS-ODNs επί μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ήταν επίσης εμφανής σε 293Τ και Α549 κύτταρα (Σχ. S1D). Ένα επιπλέον πείραμα ελέγχου έδειξαν ότι τα AS-ODNs δεν είχε καμία επίδραση άλλων ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα, όπως AP-1, NF-ΑΤ, και CRE (Εικ. S1E).

Μια παρόμοια μελέτη διεξήχθη από το κλείδωμα του κυτοσολική Hsp60 χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα (Hsp60N), η οποία έχει χρησιμοποιηθεί για ανοσοκαταβύθιση και immunostaing του Hsp60 (βλ. Σχήμα 1). Η μεταγωγή αντίσωμα επιτεύχθηκε με ένα σύστημα χορήγησης πρωτεΐνης μέσω πεπτιδίου [39]. Η IgG κατσίκα ελέγχου και Hsp60N αντισώματος βρέθηκαν να παραδοθεί με επιτυχία να κυτταρόπλασμα, ως μη συγχωνευθεί με Mitotracker (Εικ. 5Α), και Hsp60N, αλλά όχι έλεγχο IgG, συνδεδεμένο με Hsp60 (Εικ. 5Β). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι το χορηγούμενο αντίσωμα μπορεί να δράσει ως αναστολέας λειτουργία. Στη συνέχεια, η ενεργοποίηση ΙΚΚ /ΝΡ-κΒ εξετάστηκε σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα σε μεταγωγή. Το αντίσωμα Hsp60N μειώνεται προφανώς την ενεργοποίηση ΙΚΚ σε απόκριση προς τον TNF-α κατά 50% του επιπέδου που λαμβάνεται με την IgG ελέγχου (Εικ. 5C). Σε αντίθεση, ο TNF-α επαγόμενης ενεργοποίησης JNK δεν επηρεάστηκε, πράγμα που αποδεικνύει και πάλι ότι ο ρόλος της Hsp60 είναι ειδική στην ενεργοποίηση ΙΚΚ. Σταθερά, το αντίσωμα Hsp60N μείωσε σημαντικά την μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ (Σχ. 5D). Τα δεδομένα συμπεράνει ότι συλλογικά κυτοσολικής Hsp60 προωθεί την TNF-α που προκαλείται από σηματοδότηση ΙΚΚ /NF-κΒ.

Α. Μεταγωγή αντίσωμα Hsp60-εξουδετέρωσης (Hsp60N) στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων HeLa. Mitotracker Red (Molecular Probes, USA) και DAPI υποδεικνύουν μιτοχονδρίων και των πυρήνων, αντίστοιχα. B. Το αντίσωμα μετάγονται Hsp60N συνδέονται με την ενδογενή Hsp60. Μετά την επιμόλυνση αντίσωμα, τα κυτταρολύματα HeLa υποβλήθηκαν σε καταβύθιση με χρήση πρωτεΐνης-Α Sepharose. Οι καταβυθισμένες πρωτεΐνες ανοσοστυπώθηκαν για Hsp60. C. ΙΚΚ και JNK1 ενεργοποίηση σε απόκριση σε TNF-α σε IgG ελέγχου ή Hsp60N κύτταρα HeLa αντίσωμα-επιμολυσμένα. Η

in vitro

δραστικότητα κινάσης (ΚΑ) ήταν κατά μέσο όρο με τις τιμές από δύο ανεξάρτητα πειράματα, και αυτό αντιπροσωπεύεται ως πλάσια αύξηση της δραστικότητας έναντι του μη διεγερμένα και τον έλεγχο IgG-επιμολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 1). Δ TNF-α επαγόμενης μεταγραφικής ενεργοποίησης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα επιμολυσμένα (*

P

& lt? 0,01 έναντι διεγερμένων IgG-επιμολυσμένα κύτταρα).

Η

έκτοπη έκφραση του κυτοσολίου -targeted Hsp60 προωθεί επαρκώς ΙΚΚ /NF-κΒ

ενεργοποίηση

Αντίθετα, ο ρόλος της κυτοσολικής Hsp60 σε ΙΚΚ /NF-κΒ μονοπάτι αντιμετωπίστηκε με υπερ-έκφραση του κυτοσολίου στόχευση Hsp60c. Η εκτοπικά-εκφράζεται Hsp60c βρέθηκε να συνδέσουν με το σύμπλοκο (Εικ. 6Α) ΙΚΚ και σημαντικά ενισχυμένη την ενεργοποίηση ΙΚΚ και NF-κΒ σε απόκριση προς τον TNF-α (Σχ. 6Β και 6C). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η έκτοπη έκφραση της Hsp60c οριακά προκάλεσε την βασική ενεργοποίηση ΙΚΚ και NF-κΒ. Η επίδραση της έκφρασης Hsp60c σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ καταργήθηκε πλήρως σε ΙΚΚβ ελλειμματικών κυττάρων (Εικ. 6D), υποδεικνύοντας ότι η ρυθμιστική δραστηριότητα του κυτοσολικού Hsp60 είναι ΙΚΚ-εξαρτώμενη. Επιπλέον, η έκτοπη έκφραση της Hsp60c δεν ενίσχυσε ούτε ενεργοποίηση JNK ή την ενεργοποίηση άλλων παραγόντων μεταγραφής όπως ΑΡ-1, CRE, και ΝΡ-ΑΤ (Σχ. S2). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η αύξηση του κυτοσολικού επίπεδο Hsp60 αυξάνει TNF-α επαγόμενης ενεργοποίησης ΙΚΚ /NF-κΒ.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο (CGN) ή Hsp60c κωδικοποιεί πλασμίδιο (ΗΑ tag) για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με TNF-α. Α Ενσωμάτωση εκτοπικά-εκφράζεται Hsp60c (ΗΑ tag) στο συγκρότημα ΙΚΚ. Β TNF-α επαγόμενης ενεργοποίησης ΙΚΚ σε κύτταρα HeLa. C ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ σε κύτταρα HeLa (

n

= 4, *

P

& lt? 0,0001 έναντι μη διεγερμένα ομόλογό). Δ ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ στο διαμολυνθέν ΙΚΚβ

– /- 3Τ3 κύτταρα (

n

= 4, *

P

& lt? 0.001 έναντι διεγερμένων CGN-επιμολυσμένα κύτταρα, δεν ND ανιχνευθεί).

η

Hsp60 ρυθμίζει φωσφορυλίωση ΙΚΚ στην ενεργοποίηση των Τ-βρόχο

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό βασίζεται η ρυθμιστική δράση της Hsp60 στην ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ, είχαν προσπαθήσει αρκετές πειραματικές προσεγγίσεις. Για να καθοριστεί το κατά πόσον απαιτείται η δραστηριότητα chaperone του Hsp60, τα δύο υπολείμματα αμινοξέων που είναι γνωστό ότι είναι κρίσιμης σημασίας για θεωρήθηκαν η δραστικότητα συνοδού της Hsp60. Το ένα είναι ένα κατάλοιπο λυσίνης (Κ28), το οποίο εμπλέκεται στην ολιγομερισμό Hsp60 πρωτεΐνη [40], [41]. Το άλλο είναι ένα υπόλειμμα ασπαρτικού (D423), που είναι ένα ενεργό κατάλοιπο θέση για δραστικότητα ΑΤΡάσης [42], [43]. Έτσι, οι μεταλλάξεις Hsp60c, όπου Κ28 και D423 είναι υποκατεστημένα με γλουταμικό και αλανίνης αντίστοιχα, κατασκευάστηκαν. Το πείραμα συν-επιμόλυνση έδειξε ότι και οι δύο μεταλλάξεις συνδυάστηκαν με ΙΚΚα και ΙΚΚβ, καθώς και ή ίσως ακόμη καλύτερα από ό, τι του άγριου τύπου (σχ. 7Α). Η ενεργοποίηση ΙΚΚ σε απόκριση προς τον TNF-α στα κύτταρα μεταλλάκτη που εκφράζουν Hsp60 ήταν παρόμοιο με εκείνο του άγριου τύπου (σχ. 7Β), υποδεικνύοντας ότι αυτή η απώλεια του κύκλου λειτουργίας μεταλλάξεις δεν επηρεάζει τη δραστικότητα ΙΚΚ-ενίσχυση. Επιπλέον, ο ΤΝΡ-α επαγόμενη μεταγραφή ΝΡ-κΒ καν ενισχυμένη στα κύτταρα μεταλλάκτη που εκφράζουν Hsp60 σε περίπου 4-6 φορές υψηλότερο από ότι στον έλεγχο φορέα (Σχ. 7C). Το ενισχυτικό αποτέλεσμα των μεταλλάξεων ήταν σαφώς ΙΚΚβ-εξαρτώμενη, όπως δοκιμάστηκε πάλι σε ΙΚΚβ ανεπάρκεια κύτταρα 3Τ3. Έτσι, αυτό το πείραμα με τη χρήση των μεταλλακτών απώλειας λειτουργίας υποδεικνύουν έντονα ότι οι κυτοσολικές λειτουργίες Hsp60 ανεξαρτήτως της δραστηριότητας συνοδού σε ενεργοποίηση ΙΚΚ /NF-κΒ.

A. Σύλλογος Hsp60c άγριου τύπου (WT) και μεταλλάξεις με ΙΚΚα και ΙΚΚβ. Τα αναφερόμενα πρωτεΐνες συν-εκφράζονται σε κύτταρα 293Τ όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α. Β και C. ΙΚΚ (Β) και την ενεργοποίηση του NF-κΒ μεταγραφικό (C) σε κύτταρα που εκφράζουν Hsp60c άγριου τύπου και chaperone-ανενεργά μεταλλάγματα. Οι δραστηριότητες κινάσης και ρεπόρτερ αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχ. 4 (για δοκιμασία ρεπόρτερ,

n

= 6, *

P

& lt? 0,0001 έναντι μη διεγερμένα ομόλογό). Δ

In vitro

κινάσης δραστικότητα του ΙΚΚ παρουσία ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Hsp60. Το συγκρότημα ΙΚΚ ανοσοκαταβυθίστηκε από κυτταρολύματα HeLa και επωάστηκαν με ή χωρίς τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες GST (20 μ§ το καθένα) στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης κινάσης για 10 λεπτά πριν από την αντίδραση κινάσης. φωσφορυλίωση σερίνης της Ε ΙΚΚα /β σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με AS-1 ODN. Τα δεδομένα στο γράφημα είναι μέσα ± S.D. (

n

= 3, *

P

& lt? 0,02, *

P

& lt? 0.001). Σερίνη φωσφορυλίωση ΣΤ του ΙΚΚα /β σε Hsp60c-έκφραση κύτταρα HeLa. Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα εμφανίζεται (

n

= 3).

Η

Ένα από τα ΙΚΚ-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης, άλκης, έχει δειχθεί ότι μεσολαβούν στην πρόσληψη ΙκΒ να ΙΚΚ σύμπλοκο [24] . Για να εξεταστεί αυτή ο τρόπος δράσης, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Hsp60 ήταν άμεσα προστίθεται στην αντίδραση της κινάσης ΙΚΚ, όπου το ενεργοποιημένο σύμπλοκο ΙΚΚ επωάζεται με πλήρους μήκους ανθρώπινο ΙκΒ ως υπόστρωμα. Η

in vitro

δραστικότητα κινάσης της ενεργοποιημένης ΙΚΚ προς ΙκΒ δεν επηρεάζονται από την παρουσία της πρωτεΐνης Hsp60 (Εικ. 7D), υποδεικνύοντας ότι Hsp60 δεν εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση του ΙΚΚ και ΙκΒ υπόστρωμά της.

Τέλος, μια άμεση συμμετοχή της κυτοσολικής Hsp60 στην ενεργοποίηση ΙΚΚ αναλύθηκε με βάση την ενεργοποίηση εξαρτώμενη φωσφορυλίωση σερίνης στο Τ-βρόχο ΙΚΚα /β. Η διαμόλυνση AS-ODN κατήργησε σημαντικά την TNF-α επαγόμενης φωσφορυλίωσης του ΙΚΚ στη Ser178 /181, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση ΙΚΚ εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση ήταν μειωμένη (Εικ. 7Ε). Αντιστρόφως, η έκτοπη έκφραση της Hsp60c οδήγησε σε αύξηση της φωσφορυλίωσης ΙΚΚ (Σχ. 7F). Συνολικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι η κυτοσολική Hsp60 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση ΙΚΚ-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση, παρά το συνοδό εξαρτώμενη σταθεροποίηση του συμπλόκου ΙΚΚ.

κυτοσολίου Hsp60 επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου-στόχου και κυττάρων επιβίωση ΝΡ-κΒ

Για να προσδιοριστεί η σημασία της κυτοσολικής Hsp60 μεσολάβηση ρύθμιση του μονοπατιού ΙΚΚ /ΝΡ-κΒ, εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Όταν η έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων υποβλήθηκε σε διαλογή με μια δοκιμασία προστασίας ΚΝάσης [44], η έκφραση του TRAF1, c-IAP1, και c-IAP2 δεν επηρεάστηκαν από AS-ODN διαμόλυνση (Εικ. 8Α). Αυτό ήταν απρόσμενη, αλλά μας οδήγησε να υποθέσουμε ένα ενδεχόμενο που μπορεί να επηρεαστούν κάποιες επιλέξτε γονιδίων-στόχων που σχετίζονται με την μιτοχονδριακή προστασίας. Για να ελεγχθεί αυτό, εξετάσαμε την επαγωγή διαφόρων γονιδίων-στόχων, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών (βαριά αλυσίδα φερριτίνη και MnSOD) και Bcl-2 μελών (Bcl-2, Bcl-X

L, Bfl-1 /Α1). Είναι ενδιαφέρον ότι η AS-ODN μείωσε σημαντικά την επαγωγή MnSOD μόνο και Bfl-1 έκφραση /A1 σε απόκριση προς τον TNF-α (Εικ. 8Β). Το αντίσωμα Hsp60N επίσης μείωσε σημαντικά την επαγωγή αυτών των γονιδίων (Εικ. 8C). Ήταν και πάλι επιβεβαίωσε ότι η επαγωγή της έκφρασης c-IAP2 δεν επηρεάστηκε σε κάθε περίπτωση. Έτσι, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση της ενεργοποίησης ΙΚΚ από κυτοσολικής Hsp60 επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων στόχων επιλέξτε NF-κΒ.

Α. δοκιμασία προστασίας ΚΝάσης για την επαγωγή των αντι-αποπτωτικών γονιδίων σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Το αυτοραδιογράφημα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β και C. QPCR για την επαγωγή των ενδογενών γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα (Β) και αντίσωμα κύτταρα επιμολυσμένα (C) (

n

= 3, *

P

& lt ? 0,01, **

P

& lt? 0.001). Δ ΤΝΡ-α διαμεσολαβούμενη παραγωγή κυτταρικών ROS σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.D. της πλάσια αύξηση σε σχέση με μη επεξεργασμένα mock κύτταρα του σχετικού φθορισμού DCF (

n

= 4, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0.001). Ε JNK και την ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες εμφανίζονται. Τα δεδομένα στα γραφήματα είναι μέσα ± S.D. των εντάσεων της φωσφο-ΙΝΚ (Ρ46) ή ζώνες φωσφο-ρ38 που είχε ομαλοποιηθεί από τα αντίστοιχα μη-φωσφο-ζώνες (

n

= 3, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0.001). F. ASK-1 ενεργοποίηση σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα. Η δραστηριότητα κινάσης (ΚΑ) ήταν κατά μέσο όρο με τις τιμές από δύο ανεξάρτητα πειράματα, και παρουσιάζονται ως ένα πλάσια αύξηση της δραστικότητας έναντι των μη διεγερμένα και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 1). G. TNF-α που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο σε ψευδο ή ODN-επιμολυσμένα HeLa. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.D. (

n

= 3, *

P

& lt? 0,01). H. TNF-α που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο των κυττάρων καρκινώματος κόλου επιμολυσμένα με ODNs. Το επίπεδο της Hsp60 σε υποκυτταρικά κλάσματα παρουσιάζεται (

Άνω

). Τα δεδομένα στο γράφημα είναι μέσα ± S.D. (

n

= 3, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01). Ο θάνατος των κυττάρων αναλύθηκε με FACS μετά από χρώση με ισοθειοκυανική και ιωδιούχο προπίδιο αννεξίνη V-φλουορεσκεΐνη.

Η

επόμενο αναρωτήθηκε αν μια τέτοια ρύθμιση επιλέξτε γονιδίων-στόχων έχει επίπτωση στην επιβίωση των κυττάρων. Δεδομένου ότι υπάρχει μια πιθανότητα ότι MnSOD και λειτουργία Bfl-1 /Α1 να καταστείλει τις αντιδραστικά είδη οξυγόνου προερχόμενα μιτοχονδριακό (ROS) [2], [45], το επίπεδο των κυτταρικών ROS εξετάστηκε σε ODN-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας μία οξείδωση- ευαίσθητη βαφή φθορισμού, CM-H

2DCFDA. Η διαμόλυνση AS-ODN προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση της κυτταρικής ROS σε απόκριση προς τον TNF-α θεραπεία σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, σε σύγκριση με ψευδο ή S-ODN διαμόλυνση (Σχ. 8D). Δεδομένου ότι το ενισχυμένο επίπεδο ROS συνδέεται με κυτταρικό θάνατο μέσω της ενεργοποίησης ΙΝΚ παρατεταμένης [46], η παρατεταμένη ενεργοποίηση του στρες πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται, JNK και ρ38 ΜΑΡΚ, εξετάστηκε. Απροσδόκητα, η ενεργοποίηση και των δύο JNK και ρ38 ΜΑΡΚ βρέθηκαν να διατηρηθεί σαφώς στο AS-ODN-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 8Ε). Η MAP3K ASK-1 είναι γνωστό ότι είναι υπεύθυνη για την παρατεταμένη ενεργοποίηση των JNK και ρ38 της ROS μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο [47]. Όπως φαίνεται στο Σχ.