Αφηρημένο

CDKN2A

(κωδικοποιεί p16

ΙΝΚ4 & και Ρ14

ARF) διαγραφή, που έχει σαν αποτέλεσμα τόσο Rb και αδρανοποίηση ρ53, είναι η πιο κοινή χρωμοσωμική ανωμαλία σε ανθρώπινους καρκίνους. Για να χαρτογραφηθούν με ακρίβεια τα σημεία διακοπής διαγραφή είναι σημαντική για την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού των γονιδιακή αναδιάταξη και μπορεί επίσης να είναι χρήσιμο για κλινικές εφαρμογές. Ωστόσο, οι τρέχουσες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της σημείο διακοπής είναι είτε χαμηλής ανάλυσης ή να απαιτούν την απομόνωση σχετικά καθαρών καρκινικών κυττάρων, η οποία μπορεί να είναι δύσκολο για κλινικά δείγματα που συνήθως είναι μολυσμένα με διάφορες ποσότητες φυσιολογικών κυττάρων ξενιστών. Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, έχουμε αναπτύξει μια νέα προσέγγιση, που ορίζεται Primer προσέγγιση Multiplex PCR (PAMP), για τον εμπλουτισμό breakpoint ακολουθίες ακολουθούμενα από γονιδιωματικής υβριδοποίησης σειρά πλακάκια για να εντοπίσετε τα σημεία διακοπής. Σε μια σειρά πειραμάτων απόδειξη της έννοιας, ήμασταν σε θέση να εντοπίσει τον καρκίνο που προέρχονται από

CDKN2A

γονιδιωματικής σημεία διακοπής, όταν περισσότερο από το 99,9% του γονιδιώματος άγριου τύπου ήταν παρούσα σε ένα πρότυπο σύστημα. Αυτό το σχέδιο μπορεί να κλιμακωθεί με την υποστήριξη της βιοπληροφορικής και μπορεί να εφαρμοστεί για την επικύρωση άλλες υποψήφιες καρκίνου που σχετίζονται με τόπους που αποκαλύπτονται από άλλες δοκιμασίες πιο συστηματικές, αλλά χαμηλότερη απόδοση

Παράθεση:. Liu ΥΤ, Carson DA (2007) A νέα προσέγγιση για τον προσδιορισμό του καρκίνου Γονιδιωματική Breakpoints στην παρουσία του φυσιολογικού DNA. PLoS ONE 2 (4): E380. doi: 10.1371 /journal.pone.0000380

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: David Levens, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Φεβρουαρίου, 2007? Αποδεκτές: 27, Μαρτίου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 18 Απριλίου, 2007

Copyright: © 2007 Liu, Κάρσον. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από τις επιχορηγήσεις για την UCSD NanoTumor Κέντρο αριστείας για τον Καρκίνο νανοτεχνολογία (CA119335), CA23100 (ΕΑΒ) και AI36214-12S1 (ΥΤ L.) από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συγγραφείς (Υ-TL & amp? DAC) έχουν υποβάλει προσωρινή αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας με βάση αυτή τη μελέτη

Εισαγωγή

οι όγκοι εξελίσσονται μέσα από τη συνεχή συσσώρευση και την επιλογή των τυχαία μεταλλαγμένων γονιδίων.. Ενώ τα σύνολα συμφέρουσα μεταλλάξεις που επιλέγονται σε όγκους, ουδέτερα ή ακόμα και ελαφρώς επιζήμιες μεταλλάξεις μπορεί επίσης να συμβεί λόγω γενωμική αστάθεια και γενετικής παρέκκλισης. Πρόσφατα, πολύ προσπάθεια έχει δαπανηθεί για τον εντοπισμό σε πρωτογενείς ανθρώπινους καρκίνους σημειακών μεταλλάξεων στο εξόνια των γονιδίων σχετιζόμενων με τον καρκίνο. Ωστόσο, η συστηματική χαρτογράφηση του γονιδιωματικού DNA αναδιατάξεις έχει μείνει πίσω, λόγω τεχνικών δυσκολιών στην ανίχνευση μικρότερων διαγραφές, ετερογένεια του όγκου, και η ανάγκη για τον καθαρισμό κακοήθη από τα φυσιολογικά κύτταρα [1]. Ιστορικά, τέτοιες εργασίες πραγματοποιήθηκαν από χρονοβόρα και εντατική εργασία γενετικής και μοριακής κλωνοποίησης σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου [2], [3], [4]. Ένα από τα πιο εντυπωσιακά παραδείγματα είναι η ομόζυγη διαγραφή του

CDKN2A

(

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

) ογκοκατασταλτικό θέση, η οποία ανακαλύφθηκε σε αυτό και άλλα εργαστήρια [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Η

CDKN2A

διαγραφές εμφανίζονται νωρίς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [9], [10], [11]. Το p16

ΙΝΚ4 & (μία από τις

CDKN2A

προϊόντων [12]) πρωτεΐνη περιορίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από την οδό Rb και μπορεί να είναι υπεύθυνη για την πτώση στο δυναμικό αντιγραφής των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της γήρανσης [13] . Το p14

ARF (το άλλο εναλλακτικό πλαίσιο ανάγνωσης του

CDKN2A

[14]) γονιδιακό προϊόν ρυθμίζει την έκφραση MDM2, ο κύκλος εργασιών της p53, και έτσι να ελέγχει την κυτταρική απόκριση στο στρες (επανεξεταστούν [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Επειδή το Rb και μονοπάτια p53 είναι κεντρικής σημασίας για τον καρκίνο πύλη διατήρησης και φυλάξεως [18], [19], υπάρχουν ισχυρές πιέσεις επιλογής για τη διακοπή του συνόλου του

CDKN2A

τμήμα γονιδίου και στα δύο χρωμοσώματα. Λίγες άλλες διαγραφές, καθώς χαρακτηρίζεται, αν και αναμένεται ότι περισσότερα θα βρεθεί όταν περισσότερα δεδομένα από σειρά με βάση τη συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (array-CGH) αναφέρονται και επίσης, μέσω του έργου του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) [20], [21 ], [22], [23], [24]. Θα είναι σημαντικό να αξιολογηθεί η συνάφεια των εν λόγω γονιδιωματικών αναδιατάξεων για την ανάπτυξη του καρκίνου, δεδομένου ότι πολλές από τις γονιδιωματικές δομικές αλλαγές μπορεί να είναι απλώς λόγω γονιδιώματος αστάθειας στον καρκίνο. Μεγάλες μελέτες κλίμακα με κλινικά δείγματα θα είναι η πιο αξιόπιστη επιβεβαίωση.

Ενώ σημειακές μεταλλάξεις και πολύ μικρές παρεμβολές ή διαγραφές σε γονιδιωματικό DNA μπορεί να ανιχνευθεί από το εξόνιο εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας, μπορεί να είναι πιο δύσκολο για την ανίχνευση μεταβολών γονίδιο δοσολογία μεγαλύτερων γενωμικά θραύσματα, ειδικά διαγραφές [1]. Οι τρέχουσες καθιερωμένες τεχνικές για τη χαρτογράφηση διαγραφής, περιλαμβανομένων κηλίδωση Southern [25], φθορίζουσες

in situ

υβριδισμού (FISH) [26], ποσοτική PCR [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], και array-CGH [31] βασίζονται στην απουσία ενός ανιχνεύσιμου σήματος άγριου τύπου [1]. Αυτό είναι προβληματικό, όταν ένας σημαντικός αριθμός των φυσιολογικών κυττάρων είναι παρόντα σε ένα δείγμα του όγκου. Array-CGH έχει τη δυνατότητα να αναλύσει μεταβολές του αριθμού αντιγράφων του DNA σε κλίμακα γονιδιώματος σε επίπεδο με σχετικά υψηλή ανάλυση, ανάλογα με το αν οι BACs, PCR προϊόντα ή ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται για τα στοιχεία του πίνακα. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές συχνά αποτυγχάνουν όταν υπάρχει ετερογενής πληθυσμός κυττάρων ή δείγματα κακής ποιότητας [31]. FISH είναι λιγότερο ευάλωτες στην παρουσία κυτταρικών πληθυσμών ετερογενής, αλλά έχει σχετικά χαμηλή ανάλυση και είναι δύσκολο να κλιμακωθούν. Εκτός από τα ψάρια, οι άλλες τεχνικές που αναφέρονται δεν είναι πρακτικό για τη χαρτογράφηση γονιδιωματική μεταθέσεις και αναστροφές. προφίλ End-αλληλουχίας αναπτύχθηκε για να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα, αλλά η προσέγγιση ήταν δαπανηρή και δύσκολο να αναβαθμίσουν [32]. Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί μια εξελικτική προσέγγιση για την ανίχνευση τέτοιων γονιδιωματικής διαρθρωτικές αλλαγές σε συμπαγείς όγκους όπου ετερογενείς πληθυσμούς κυττάρων είναι παρόντες.

Εδώ αναφέρουμε μια νέα προσέγγιση, που ορίζεται ως Primer Προσέγγιση Multiplex PCR (PAMP), για τον εμπλουτισμό μικρές ποσότητες διαγράφεται γονιδιωματικών αλληλουχιών DNA παρουσία του DNA άγριου τύπου. Οι γονιδιωματικές θέσεις των εμπλουτισμένων αλληλουχιών αποκωδικοποιείται στη συνέχεια από μια γονιδιωματική σειρά πλακάκια και επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση.

Αποτελέσματα

CDKN2A

τόπο

Το

CDKN2A

βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9p21 (Σχήμα 1). Είναι κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες σε διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης: p16

ΙΝΚ4 & και Ρ14

ΤΑΠ, που και οι δύο έχουν 3 εξώνια και το μερίδιο εξώνια 2 και 3.

CDKN2B

(p15

INK4B) και

ΜΤΑΡ

(μεθυλθειοαδενοσίνης φωσφορυλάση) (δεν φαίνεται) είναι κεντρομερική και τελομερή γειτονικών γονιδίων αντίστοιχα [3], [17], [33], [34]. BAC κλώνος RP11-149I2 περιέχει ολόκληρο το

CDKN2A

θραύσμα γονιδιώματος και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την δημιουργία ανιχνευτές (εκτός από επαναλαμβανόμενες περιοχές) για την εκτύπωση στο minigenomic σειρά πλακάκια. Η συχνότητα των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών που προβλέπεται από RepeatMasker εμφανίζεται στο κάτω μέρος του διαγράμματος.

Ο χάρτης του γονιδιώματος καλύπτει περίπου 55 kb περίπου

CDKN2A

σύμφωνα με Ensemble [59].

CDKN2A

/B βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9p21 και RNA τα προϊόντα τους που κωδικοποιούνται από την αντίστροφη σκέλος.

CDKN2A

κωδικοποιεί 2 πρωτεΐνες (p16

ΙΝΚ4 & και Ρ14

ARF) που μοιράζονται τις ίδιες εξώνια 2 και 3. Το πρώτο εξώνια του

ΙΝΚ4 &

και

ARF

είναι περίπου 20 kb χώρια.

CDKN2B

κωδικοποιεί p15

INK4B που είναι ομόλογο με p16

ΙΝΚ4 &. Εκτός από τις μεταγραφές, ο χάρτης δείχνει επίσης επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Επανάληψη) και είναι διαθέσιμη κλώνο BAC (κλώνοι του Ανθρώπου tilepath), RP11-149I2.

Η

Primer Προσέγγιση Multiplex PCR (PAMP)

είναι δύσκολο να ανιχνευθεί ένα μικρό κλάσμα του διαγράφεται μεταλλαγμένου γονιδιωματικού DNA παρουσία ενός τεράστιου περίσσεια DNA άγριου τύπου με array CGH ή άλλα δημοφιλή εργαλεία μοριακής βιολογίας [26], [27], [35]. Σε τυπικά μολυσμένα δείγματα όγκων, γονιδιωματικό DNA αποτελείται από διάφορες αναλογίες WT και

CDKN2A

ανεπάρκεια DNA. Επιδιώξαμε να επωφεληθούν από το γεγονός ότι ένα βραχύτερο διαγραφεί αλληλουχία του γονιδιώματος θα πρέπει κατά προτίμηση να ενισχυμένου σύγκριση με ένα πολύ μεγαλύτερο WT ακολουθία χρησιμοποιώντας το «προσέγγιση» που πλευρίζουν εκκινητές (Σχήμα 2Α) [36].

Η αποτελεσματικότητα του πολλαπλασιασμού με PCR είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την απόσταση του ανάντη και κατάντη εκκινητές. Σε αυτό το παράδειγμα, εκκινητές για την ενίσχυση γονιδιωματικών αλληλουχιών γύρω από το τόπο του ενδιαφέροντος (LOI) χωρίζονται σε 20 ομάδες: 10 κάθε για προς τα εμπρός (F1-F10) και αντίστροφη (R1-R10) ομάδες (Α). Ενώ όλες οι πιθανές εμπρός και αντίστροφη ζεύγη εκκινητών είναι πολύ μακριά η μία στην άλλη για ενίσχυση PCR στο γονιδίωμά άγριου τύπου, ορισμένες ζεύγος εκκινητών είναι έφερε πιο κοντά ( «προσέγγιση») λόγω διαγραφή (F3 και R3) σε μεταλλαγμένο γονιδίωμα. Οι αντιδράσεις Multiplex PCR που και αντιπροσωπεύεται σαν μία μήτρα ώστε να περιλαμβάνει ένα προς τα εμπρός και μία ομάδα αντίστροφο εκκινητή. Τα αναμενόμενα αποτελέσματα της PCR παρουσιάζεται ως σκιές κλίμακας του γκρι στην μήτρα (Β). Αυτό το παράδειγμα δείχνει ότι μόνο τα ζεύγη ομάδα κοντά στο σημείου τύπου δώσουν προϊόντα PCR (F3-R3, F3-R4, F4-R3).

Η

Η προσέγγιση απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Σε αυτό το παράδειγμα, ακόμη και σχετικώς οι -spaced εκκινητές (μέσος όρος 1 kb πέρα) που περιβάλλει το γεωμετρικό τόπο του ενδιαφέροντος διαιρούνται σε 20 ομάδες για PCR. Υπάρχουν 10 ομάδες που η κάθε της προς τα εμπρός εναρκτήρες, F1, F2 …, F10 και αντίστροφο εκκινητή R1, R2, …, R10, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α). Ως εκ τούτου, υπάρχουν 100 ζεύγη (F1-R1, F1-R2, …, F1-R10? F2-R1, F2-R2, …, F2-R10? …?. F10-R1, F10-R2, …, F10- R10) των αντιδράσεων PCR (Σχήμα 2Β). Αναμένεται ότι μόνο ένα ή δύο ζεύγη αντιδράσεων PCR θα παράγει ειδική PCR προϊόντα που καλύπτουν το όριο διαγραφή, εφόσον τα άλλα ζεύγη εκκινητών θα πρέπει να είναι πολύ μακριά από το σημείο θραύσης για αποτελεσματική ενίσχυση. Στη συνέχεια, δείγματα από κάθε αντίδραση μπορούν να αναμιχθούν για να υβριδοποιούνται με μία μόνο γενωμική συστοιχία πλακάκια. Σε αντίθεση με τις παραδοσιακές array-CGH, ​​αναμένεται ότι μόνο τα σημεία που αντιπροσωπεύουν αλληλουχίες γονιδιώματος κοντά στα σημεία διακοπής θα θεωρητικά φωτίζεται, η οποία επιβεβαιώθηκε με τα επόμενα πειράματα.

Για να αυξήσετε την απόδοση και να μειώσει το κόστος των αντιδραστηρίων , κάθε προς τα εμπρός (F1-10) και την ομάδα αστάρι αντίστροφη (R1-10) μπορεί να έχει πολλαπλά εναύσματα. Ως εκ τούτου, κάθε ομάδα PCR (για παράδειγμα F1-R1) ζεύγος γίνεται πολλαπλή PCR. Ως εκ τούτου, έχουμε ορίσει τη διαδικασία αυτή ως Primer Προσέγγιση Multiplex PCR (PAMP).

Διαγραφή breakpoint κλωνοποίηση από PAMP και minigenomic σειρά παράθεσης

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η 562 κυτταρική σειρά Ντιτρόιτ έχει μια κατά προσέγγιση 20 kb (συμπεριλαμβανομένων των

ΙΝΚ4 &

εξώνια 1 και 2) διαγραφή στο χρωμόσωμα 9p21 [3]. Χρησιμοποιήσαμε αυτή την κυτταρική σειρά για να δοκιμάσετε την προσέγγιση σάρωσης διαγραφή μας. Τέσσερις ομάδες (F

A, F

Β, R

Υ και R

Ζ) του εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για τέσσερις αντιδράσεις PAMP (Σχήμα 3Α) με τη χρήση γενωμικού προτύπου DNA είτε από το Detroit 562 (

CDKN2A

ανεπάρκεια) ή ΗΕΚ293 (

CDKN2A

άγρια ​​κυτταρικές σειρές τύπου). Κλάσματα των 4 PAMP προϊόντα αντίδρασης συνενώθηκαν και σημάνθηκαν για υβριδισμό σε

ΙΝΚ4 &

minigenomic συστοιχία πλακάκια που καλύπτει περίπου 25 kb, συμπεριλαμβανομένων όλων των εξονίων του

ΙΝΚ4 &

. Όπως είχε προβλεφθεί στην Εικόνα 2, μόνο σημεία με ανιχνευτές κοντά στα σημεία διακοπής υβριδοποιήθηκε στους αμπλικόνια όταν Detroit 562 γενωμικό DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα (Εικόνα 3Β). Σχεδόν κανένα σήμα ανιχνεύθηκε όταν ΗΕΚ293 γενωμικού DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα. Το δείγμα ελέγχου ΗΕΚ293 είχαν σημαντικά υψηλότερο σήμα για Cot-1 σημεία DNA παρά τη γενική απόλυτη ένταση του σήματος είναι χαμηλή.

(Α) Πέντε ομάδες εκκινητών (F

A, F

Β, R

x, R

Υ και R

Z, τα μικρά βέλη και αιχμές βελών) κοντά τα πιθανά σημεία διακοπής δημιουργήθηκαν για PAMP με βάση την προηγούμενη χαρτογράφηση μας [3]. Αντιστοιχισμένη

CDKN2A

σημεία διακοπής της 562 κυτταρικής σειράς Ντιτρόιτ (Σχήμα 5) ενδείκνυνται για διευκρινίσεις. Το «Ε1», «Ε2» και των ονομασιών «Ε3» (μπλε γραμματοσειρές) είναι οι σχετικές θέσεις του

ΙΝΚ4 &

εξόνια. Το πρώτο εξόνιο του

ARF

είναι περισσότερο προς τα δεξιά του διαγράμματος και δεν καλύπτεται από την παρούσα διάταξη. Οι ανιχνευτές πλακάκια για τη συστοιχία αναγράφεται με δύο χρώματα εναλλασσόμενο (κοντό μαύρο και πορτοκαλί γραμμές) για ευκολία αναγνώρισης. (Β) Η πρώτη γραμμή του

ΙΝΚ4 &

minigenomic σειρά είχε εντοπιστεί με τους ανιχνευτές πλακόστρωση φαίνεται στον πίνακα Α Cot-1 DNA (επαναλαμβανόμενη ακολουθία γονιδιακού DNA) σημεία υποδεικνύονται σε αυτό το φάσμα. Το υπόλοιπο των κηλίδων είναι DNA σπέρματος ρέγγας. Τόσο σπέρμα DNA Cot-1 και η ρέγκα χρησιμοποιούνται ως μη ειδικά χειριστήρια. Αυτό συστοιχία υβριδοποιήθηκε με επισημασμένο δείγματα προέρχονται από δύο κυτταρικές σειρές. Οι ίδιες ομάδες εναυσμάτων (F

A, F

Β, R

Υ και R

Z) χρησιμοποιήθηκαν για PAMP αντιδράσεις Detroit 562 (μεταλλαγμένη) και ΗΕΚ293 (άγριου τύπου) γενωμικού DNA για να χαρτογράφηση των πιθανών

CDKN2A

σημεία διακοπής. Τα αμπλικόνια σημάνθηκαν με διαφορετικές χρωστικές, αποδίδοντας ένα πράσινο σήμα (Cy-3) για τον μεταλλαγμένο δείγμα και ένα κόκκινο σήμα (Cy-5) για το δείγμα άγριου τύπου, να υβριδοποιούνται ταυτόχρονα στη συστοιχία (array δύο χρωμάτων). Οι δύο πράσινες κηλίδες στην πρώτη σειρά αποκάλυψε το σημείο διακοπής θέση, όπως συζητήθηκε στο Σχήμα 2.

Η

Επιπλέον, τέσσερις ξεχωριστές συστοιχίες χρησιμοποιήθηκαν για να υβριδοποιηθούν τα μεμονωμένα προϊόντα PAMP περιγράφεται παραπάνω. Μια απλή οικόπεδο αναλογία έντασης σήματος του μεταλλαγμένου /WT PCR προϊόντα στη συστοιχία πλακάκια αποκάλυψε την γενωμική θέση του σημείου διακοπής (Σχήμα 4). Αυτή η ανάλυση δείχνει μια πολύ απλή ανάγνωση-η θέση της διαγραφής συνορεύει με δύο κορυφές. Μόνο F

Β-Κ

Y (array 27) και όλα τα προϊόντα ομαδοποίηση (array 29) παράγει το ίδιο αποτέλεσμα όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Σε αντίθεση, τα άλλα τρία ζεύγη απέφερε μόνο αμυδρά σήματα υποβάθρου στις συστοιχίες. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι PAMP προϊόν συγκέντρωση με μία μόνο ανάλυση της σειράς δίνει το ίδιο σημείο διακοπής πληροφορίες τέσσερις μεμονωμένες συστοιχίες. Τα δεδομένα που υποστηρίζουν τις αρχικές πειραματικές προβλέψεις, και δείχνουν ότι η διαδικασία θα πρέπει να είναι γενικής εφαρμογής για τη διαγραφή και τη σάρωση μετατόπιση.

Τέσσερις ομάδες (F

A, F

Β, R

Y και R

Ζ) του εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για τέσσερις αντιδράσεις PAMP καθένα με την αντιστοίχιση όλων των πιθανών προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή ομάδων χρησιμοποιώντας Detroit 562 (μεταλλαγμένη) και ΗΕΚ293 (έλεγχος) ως πρότυπα. Η διαδικασία έχει περιγραφεί εν συντομία στο σχήμα 3. Τα προϊόντα σημάνθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για υβριδισμό συστοιχίας: F

Α-Κ

Y για συστοιχία 25? F

Α-Ε

Z για σειρά 26? F

BR

Y για τον πίνακα 27 και F

AR

Z για τον πίνακα 28. Κλάσματα των επιμέρους δειγμάτων PAMP επίσης συγκεντρωθούν και επισημανθεί προς υβριδισμό συστοιχίας (array 29, array εικόνα εμφανίζεται στην Εικόνα 3Β). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με ένταση σήματος αναλογία (Υ-άξονας) των δειγμάτων από το Detroit 562 (μεταλλαγμένη) και ΗΕΚ293 (μάρτυρας) κατά την τοποθεσία ανιχνευτή (Χ-άξονας). Τα όρια μπορούν να εντοπιστούν μέσω αυτού του οικοπέδου, βρίσκοντας τις δύο κορυφές που είναι ανάλογες με τα φωτεινά πράσινα σημεία στο Σχήμα 3Β.

Η

Για να εντοπίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια την έκταση της διαγραφής, ένθετα PCR με ζεύγη ειδικοί εκκινητές σχεδιάστηκε σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα PAMP. Το προϊόν PCR σημάνθηκε για υβριδισμό συστοιχίας, αποδίδοντας ένα αποτέλεσμα πολύ παρόμοιο με αυτό που φαίνεται στο Σχήμα 4 και φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Επιπλέον, το ενιαίο κύριο προϊόν των PCR αντιδράσεων αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, αποκόπτεται, εκχυλίζεται και η αλληλουχία (Σχήμα 5Β). Το σημείο διακοπής κλωνοποιημένο είναι σε συμφωνία με δύο άλλες εκθέσεις (Σχήμα 5Β) [37], [38].

Για να χαρτογραφήσει το ακριβές σημείο διακοπής, ένα ένθετο σετ εκκινητών PCR σχεδιάστηκαν για UNIPLEX PCR βασίζεται στην προηγούμενη PAMP αποτελέσματα (Σχήματα 3 και 4). Τα προϊόντα PCR που χρησιμοποιούνται για την επισήμανση και υβριδοποιήθηκαν στη συστοιχία και επίσης για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Τα δεδομένα συστοιχία εμφανίζεται ως ίδιο οικόπεδο στο Σχήμα 4. Μία μονή κύρια ζώνη στο πήκτωμα αγαρόζης αποκόπηκε και καθαρίστηκε για αλληλούχηση (Β). Το σημείο διακοπής υποδεικνύεται (από το # 21975226 έως 21960809 # συμφώνως προς αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος NCBI χτίσει 36).

Η

Για να μιμούνται την ετερογενή πληθυσμό του καρκίνου και κύτταρα ξενιστές που τυπικά βρίσκονται σε στερεούς όγκους, διάφορες ποσότητες γονιδιωματικού DNA που προέρχεται από το Detroit 562 (μεταλλαγμένη) και ΗΕΚ293 (άγριου τύπου) αναμίχθηκαν για PAMP και υβριδισμό συστοιχίας. Προκειμένου να ελεγχθεί η ευαισθησία της προσέγγισης μας, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα τιτλοδότησης. Το ολικό γονιδιωματικό DNA για κάθε δοκιμασία διατηρήθηκε σταθερή (100 ng). Αυτό είναι ισοδύναμο με περίπου 28.000 αντίγραφα απλοειδές γονιδίωμα (με βάση την εκτίμηση του 2,8 × 10

5 μόρια /μα απλοειδές γονιδίωμα). Η

CDKN2A

διαγράφεται κυτταρική γραμμή Detroit 562 αραιώθηκε σειριακά με

CDKN2A

άγριου τύπου ΗΕΚ293 όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Η δοκιμασία ήταν σε θέση να ανιχνεύσει περίπου 1 αλληλουχία σημείο διακοπής με την παρουσία ενός κατά προσέγγιση 2000 φορές περίσσεια του γονιδιώματος άγριου τύπου με ευαισθησία 5-16 τέτοιων μορίων (Πίνακας 1). Έτσι, η προσέγγιση PAMP παρέχει μια μέθοδο για την ανίχνευση γενωμικού διαγραφές DNA παρουσία πάνω από 99,9% άγριου τύπου DNA.

Η

Η στρατηγική κλωνοποίησης breakpoint PAMP επιβεβαιώθηκε σε ένα άλλο κυτταρική γραμμή. Επειδή σειρά μας καλύπτει μόνο το 25 kb του γονιδιώματος, θα σαρωθεί προηγούμενες πληροφορίες χαρτογράφησης μας για 100 κυτταρικές σειρές για να βρείτε αυτό που θα μπορούσε να έχει όρια ευαισθησίας εντός αυτής της περιοχής [3], [33]. Ο καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή Hs578T έχει μια διαγραφή στο p16

εξώνια ΙΝΚ4 & 1-3. Με εκκινητές εντός και τελομερές (F

Α και R

X ομάδες, Πίνακας 2) στο γονιδιακό θραύσμα, πραγματοποιήσαμε PAMP και υβριδισμό συστοιχίας, και προσδιόρισε ένα μόνο σημείο πάνω στη συστοιχία (που φαίνεται σαν μία απλή κορυφή στην Εικόνα 6Α). Η αλληλουχία αυτού του ανιχνευτή είναι βρίσκεστε από 69971 71219 να στην αλληλουχία RP11-149I2 BAC (GenBank AL449423). Ως εκ τούτου, το κεντρομερές άκρο του σημείου διακοπής θα πρέπει να βρίσκεται κοντά σε αυτήν την περιοχή. Uniplex PCR με εκκινητές από τις δύο ομάδες για PAMP διεξήχθη για αλληλούχιση. Ένα προϊόν PCR περίπου 2 kb παρήχθη με ένα ζεύγος εκκινητών και υποβλήθηκε σε άμεση αλληλουχία (Σχήμα 6Β). Η κεντρομερική τέλος του σημείου διακοπής προσδιορίζονται από PAMP είναι συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά [37]. Το τέλος τελομερές του σημείου διακοπής είχε συναχθεί από τα εναύσματα που χρησιμοποιούνται για PAMP και επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση, αν και δεν υπήρχε γονιδιωματικής καθετήρα κοντά στο σημείο διακοπής που περιλαμβάνεται στην σειρά

Δύο ομάδες εκκινητών:. F

A (F

Α1-F

Α4) και το R

X (R

X1-R

X5) χρησιμοποιήθηκαν για PAMP με βάση την προηγούμενη χαρτογράφηση μας. Το προϊόν σημάνθηκε για υβριδοποίηση array (Α). Μόνο και μόνο κορυφή είναι εμφανής από το οικόπεδο. Δείχνει τη θέση του άλλου σημείου διακοπής δεν καλύπτεται από την παρούσα minigenomic συστοιχία. Δύο εκκινητές (R

Χ3 και R

Χ4) βρίσκεται κοντά στην γονιδιωματική θέση του καθετήρα (ανθρώπινο χρωμόσωμα 9, 21969229 έως 21970477, NCBI χτίσει 36) που υποβλήθηκε σε υβριδισμό και δύο εκκινητές (F

Α1 και F

Α2) που βρίσκεται έξω από το πεδίο συστοιχίας επιλέχθηκαν για UNIPLEX PCR. Το F

Α2-R

ζεύγους X3 αναμένεται να έχει τη μικρότερη απόσταση, όταν συμβεί μια διαγραφή. Μία ζώνη περίπου 2 kb επί γέλης αγαρόζης αποκόπηκε από την πηκτή, καθαρίστηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία (Β). Η οριακή τιμή και την τοποθεσία υποδεικνύεται (από το # 21955827 έως 21968338 # σύμφωνα με NCBI ακολουθία του ανθρώπινου γονιδιώματος χτίσει 36).

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει μια γενική στρατηγική που μπορεί πρέπει να εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό των γονιδιωματικής σημεία διακοπής σε ακαθάριστα πρωτογενείς καρκίνους. Το πρωτόκολλο ενισχύσεως και πλακάκια που περιγράφονται εδώ επιτρέπει την απλή και ακριβή

CDKN2A

breakpoint κλωνοποίηση, χρησιμοποιώντας μολυσμένα DNA ως μήτρα. Σε αντίθεση με τις τρέχουσες διαθέσιμες τεχνικές για τη χαρτογράφηση διαγραφής (συμπεριλαμβανομένων κηλίδωση Southern, φθορίζοντα

in situ υβριδισμού

, PCR σε πραγματικό χρόνο, και array CGH), που βασίζονται στην απουσία ενός ανιχνεύσιμου σήματος άγριου τύπου, PAMP μετρά άμεσα το διαγράφεται DNA. Ως εκ τούτου, η προσέγγιση αυτή είναι πολύ λιγότερο ευάλωτες σε προβλήματα που σχετίζονται με την κανονική μόλυνση των κυττάρων. Η πειραματική διαδικασία είναι αρκετά ισχυρή για να ανιχνεύσει διαγραφές παρουσία τουλάχιστον 99,9% μόλυνση αλληλουχία άγριου τύπου, η οποία δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί με άλλες διαδικασίες [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].

Primer προσέγγιση PCR διαλογή υπήρξε ένα χρήσιμο εργαλείο για την απομόνωση μεταλλάξεων διαγραφής στο

C. elegans

[36]. Η μέθοδος βασίζεται στην αναγνώριση μία μονή ζώνη η οποία είναι το προϊόν μιας επιτυχούς αντίδρασης PCR όταν ένα ζεύγος ειδικών εκκινητών φέρεται μαζί με διαγραφή, σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Η διαδικασία μπορεί να προσδιορίσει μόνο εξαλείψεις που συμβαίνουν σε ένα πολύ μικρό γονιδιωματικό τεμάχιο (3 kb) σε μία σχετικά χαμηλή απόδοση της μόδας. Είναι πάσχει επίσης από σχετικά υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών, διότι η ταυτότητα των ζωνών στο πήκτωμα αγαρόζης είναι δύσκολο να γνωρίζουμε. Ωστόσο, με την εφαρμογή πολλαπλή PCR μαζί με ένα γενωμικό συστοιχία πλακόστρωση, ένας μπορεί ταυτόχρονα διαλογή ένα ευρύτερο φάσμα των γονιδιωματικών περιοχών [40]. Επιπλέον, προτιμησιακή ενίσχυση των αλληλουχιών κοντά στα σημεία διακοπής παράγει ένα σχετικά απλή ανάγνωση στη συστοιχία πλακόστρωση. Ο λόγος σήματος προς θόρυβο για τα υβριδοποιημένων κηλίδων είναι προφανής σε σύγκριση με την ανάγνωση από array CGH (βλέπε σχήμα 4). Η διασταύρωση μπορεί άμεσα να προσδιοριστεί όσο το ένα άκρο του γειτονικού γονιδιωματικού θέση των σημείων διακοπής καλύπτεται από τη συστοιχία πλακόστρωση, όπως φαίνεται στην περίπτωση του Hs578T κυττάρων καρκίνου του μαστού (Σχήμα 6). Από υψηλής πυκνότητας γονιδιωματικής συστοιχίες πλακάκια είναι διαθέσιμα στο εμπόριο, η προσέγγιση αυτή μπορεί εύκολα να υιοθετηθεί. Επιπλέον, η τεχνολογία αλληλουχίας του γονιδιώματος υψηλής απόδοσης μπορεί επίσης να εντοπίσει την ακριβή ακολουθία σημείο διακοπής μετά PAMP, παρακάμπτοντας την ανάγκη για σειρά υβριδισμού [41], [42], [43].

Συνηθίζαμε multiplex PCR για να μειωθεί η φόρτο εργασίας και το κόστος για PAMP. Είχαμε τη δυνατότητα να multiplex 28 εναρκτήρες εύκολα σε μία μόνο αντίδραση PCR. Θεωρητικά, κάποιος μπορεί να καλύψει πάνω από το 90% των 0,5 Mb του γονιδιωματικού θραύσματος περίπου

CDKN2A

locus με συνολικά 500 εκκινητών σε μία μόνο αντίδραση PCR μέσω υπολογιστικών προσομοίωσης, η οποία θα περιγραφεί αλλού (υποβλήθηκε χειρόγραφο). Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε μια επιτυχημένη πολλαπλή PCR με περισσότερα από 1000 ζεύγη εκκινητών με την βοήθεια του υπολογιστικού σχεδιασμού [44]. Η προσέγγιση PAMP στοχεύει μεγέθη διαγραφή μεταξύ 10 kb και 1 Mb. Τα μικρότερα ή μεγαλύτερα διαγραφές μπορεί να ανιχνευθεί με επαναδιάταξη των cells και FISH αντίστοιχα.

Όπως και άλλες τεχνολογίες PCR, PAMP μπορεί εύκολα να υιοθετηθεί σε ένα ρομποτικό σύστημα για κλινική και ερευνητικούς σκοπούς. Ένα παράδειγμα ενός πιθανού κλινική εφαρμογή είναι η χρήση της μοναδικής σημείο διακοπής αλληλουχία όπως μια εξατομικευμένη ειδική για τον καρκίνο βιοδείκτη για την παρακολούθηση της νόσου μετά τη θεραπεία, όταν ο ακριβής σημείο διακοπής έχει χαρτογραφηθεί. Για παράδειγμα, σε αντίθεση με πολλές τρέχουσες δείκτες όγκου, όπως CA19-9, CA125 και PSA, τα οποία δεν είναι πραγματικά ειδική για τον καρκίνο, η

CDKN2A

σημεία διακοπής είναι ειδικές και μοναδικές για κάθε καρκίνο με αυτό τον τόπο διαγράφονται. Ένα εξαιρετικά ευαίσθητη δοκιμασία, όπως PCR πραγματικού χρόνου, μπορεί να σχεδιαστεί για την παρακολούθηση της κατάστασης της εξέλιξης του καρκίνου στο αίμα ή άλλα σωματικά υγρά. Η δοκιμασία θα πρέπει να είναι πολύ συγκεκριμένη, διότι ενίσχυση αναμένεται να συμβεί μόνο από διαγραφή περιέχουν DNA λόγω των πολύ μεγάλη απόσταση μεταξύ των εκκινητών στο γονιδίωμα άγριου τύπου (βλέπε Εικόνα 2). Αυτό είναι ανάλογο με την ανίχνευση μιας αλληλουχίας ξένου ιού, που έχει εφαρμοστεί ως ένα χρήσιμο βιοδείκτη για σχετιζόμενου ιού καρκινώματος ρινοφαρυγγικής Epstein-Barr [45], [46].

Η προσέγγισή μας μπορεί να διευκολύνει επίσης την παραδοσιακή υπεβλήθησαν εντατική πειράματα που στοχεύουν να κατανοήσουμε πώς γενωμική σημεία διακοπής δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου, ιδιαίτερα σε πρωτογενείς όγκους. Αν και παράνομη V (D) J ανασυνδυασμό μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία

CDKN2A

διαγραφές στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, θα χρειαστούν περισσότερα στοιχεία breakpoint ακολουθία για άλλους τύπους καρκίνου να οριοθετηθούν των μοριακών μηχανισμών [37], [38] , [47], [48]. Επιπλέον, η τεχνική που περιγράφεται στο παρόν έγγραφο μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τη χαρτογράφηση διαγραφή, αλλά μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για τη χαρτογράφηση άλλων τύπων γονιδιακή αναδιάταξη, όπως μεταθέσεις και αναστροφές. Παρόμοια με την περίπτωση του γενωμικού διαγραφής (βλέπε Εικόνα 2), μόνο «κατά προσέγγιση» εκκινητές μπορούν να παράγουν αμπλικόνια όταν οι εν λόγω εκκινητές είναι κοντά στα θραύσματα γενωμικού που επανατοποθετούνται σε μετατοπίσεις και αναστροφές.

Χρησιμοποιώντας breakpoint αλληλουχίες όπως ειδική για τον καρκίνο βιοδείκτες για την παρακολούθηση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσων έχει διερευνηθεί [49], [50], [51], [52], [53]. παρακολούθηση της νόσου με βάση εξατομικευμένη γενωμικού DNA σημείο διακοπής θεωρείται ότι είναι ιδιαίτερα ελκυστική προσέγγιση για διάφορους λόγους [49]. Πρώτον, πολλές γενωμικού DNA αναδιατάξεις που σχετίζονται άμεσα με ογκογόνο διαδικασία, ως εκ τούτου, είναι πραγματικά ο καρκίνος-ειδικά και σταθερή συναρτήσει του χρόνου. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την πιο βολική δοκιμασία που βασίζεται Ig /TCR αναδιάταξη. Πράγματι βρήκαμε ακριβώς το ίδιο

CDKN2A

σημεία διακοπής των δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτήν την μελέτη, όπως αναφέρθηκε από τους άλλους. Δεύτερον, το DNA είναι πιο σταθερό από το RNA, αν και είναι πιο εύκολο να χαρτογραφήσει μετάγραφο σύντηξης εάν υπάρχει, όπως

BCR-ABL

. Τρίτον, οι γονιδιωματικές σημεία διακοπής είναι πολύ πιθανό να είναι διαφορετικές από κάθε ασθενή και να γίνει εξατομικευμένη βιοδείκτες, έτσι, μειώνοντας τον κίνδυνο εσφαλμένων θετικών αποτελεσμάτων λόγω διασταυρούμενη μόλυνση. Ωστόσο, αυτό είναι επίσης το μεγαλύτερο εμπόδιο για να ξεπεραστεί. Για παράδειγμα, πολλές προσπάθειες για να βελτιωθεί το εύρος ενίσχυσης PCR για την ανίχνευση

μεταθέσεις C-MYC

/ανοσοσφαιρίνης είχαν περιορισμένη επιτυχία, γιατί τα σημεία διακοπής διάσπαρτα σε μια περιοχή πάνω από 300 kb [54], [55], [ ,,,0],56]. Η στρατηγική μας μπορεί να είναι χρήσιμο για την εν λόγω εφαρμογή.

Η προσέγγισή μας έχει ως στόχο να εντοπίσει σημεία διακοπής εντός 1 Mb θραύσμα γονιδιώματος όπως ψάρια ή άλλα κυτταρογενετικής τεχνικές είναι διαθέσιμες για τα μεγαλύτερα γονιδιωματική αναδιατάξεων και το κόστος και την εργασία αυξάνει σημαντικά όταν η περιοχή-στόχο επεκτείνεται. Είμαστε σε θέση να παράγουν ανέξοδα μια σειρά παράθεσης καλύπτει ένα θραύσμα γονιδιώματος των 0,5 Mb γύρω από το

CDKN2A

με ανάλυση 1 kb. Αυτή τη στιγμή εργάζονται για τις μεθόδους για την αύξηση της πολυπλεξίας και να μειώσει τον όγκο της κάθε αντίδρασης PAMP για ευρύτερες εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και προετοιμασία δείγματος

Οι κυτταρικές σειρές περιγράφεται στο έγγραφο ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται. Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται με DNazol (Ερευνητικό Κέντρο Μοριακής, Inc., Cincinnati, ΟΗ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Minigenomic πλακόστρωση σειρά

Έχουμε δημιουργήσει ένα

ΙΝΚ4 &

minigenomic σειρά πλακάκια που καλύπτουν ένα θραύσμα 25 kb στο

CDKN2A

τόπο για την απόδειξη της έννοιας της προσέγγισής μας. DNA ανιχνευτές δημιουργήθηκαν με PCR με BAC κλώνο RP11-149I2 (που ελήφθη από το Κέντρο Bacpac Πηγές στο Νοσοκομείο Oakland Ερευνητικό Ινστιτούτο Παίδων, Oakland, CA) ως εκμαγείο και αποφεύγοντας τις επαναλαμβανόμενες γονιδιωματικές αλληλουχίες που προβλέφθηκε από RepeatMasker. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με DNA Clean-up και συγκεντρωτή-5 (Zymo Research, Orange, CA), επαναιωρήθηκαν σε 3 χ SSC και εκτυπώνονται σε διαφάνειες πολυ-L-λυσίνη σε 0,1 mg /ml, μαζί με Human Cot-1 DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), το οποίο είναι εμπλουτισμένο για επαναληπτικές ακολουθίες, και σπέρμα ρέγγας DNA (Promega, Madison, WI), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μη ειδικό έλεγχο. Η διαδικασία της εκτύπωσης έχει περιγραφεί και ουσιαστικά ακολούθησε τις οδηγίες του arrayer DeRisi με καρφίτσες microcontact εκτύπωση πυριτίου (Παράλληλη Σύνθεση Technologies, Inc. Santa Clara, CA) [57], [58]. Συστοιχίες μετα-επεξεργασία με ηλεκτρικό ανυδρίτη μέθοδος που βασίζεται για τον αποκλεισμό πριν υβριδισμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [57]. Τα πρωτόκολλα που σχετίζονται με την εκτύπωση συστοιχία και ο υβριδισμός σε αυτό το έγγραφο γενικά μπορεί να βρεθεί σε microarrays.org (https://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).

Primer-Εναρμόνιση Multiplex PCR (PAMP ) και συστοιχία υβριδισμού

Ένα απλοποιημένο καθεστώς PAMP φαίνεται στο Σχήμα 2. Μια σειρά εκκινητών (Πίνακας 2) προς

ΙΝΚ4 &

εξώνια 1-2 κατά μήκος του

CDKN2A

τόπο συντέθηκαν από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies (Coralville, ΙΑ). Ομάδες εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές (250 ηΜ το καθένα στην τελική αντίδραση) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία αμπλικόνια από 0.1 μg γονιδιωματικού πρότυπα DNA σε ένα σύνολο 10 μΙ διαλύματος ανάμιξη με 10 μΙ Taq 2 × Master Mix (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Η αντίδραση συναρμολογείται σε 4 ° C σε ένα σταθμό εργασίας PCR και μεταφέρεται σε ένα θερμικό κυκλοποιητή με το μπλοκ έχει προθερμανθεί στους 94 ° C. Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν ένα βήμα μετουσίωσης 3 λεπτών στους 94 ° C που ακολουθείται από 35 κύκλους στους 92 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 68 ° C για 2.5 λεπτά με ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 68 ° C για 5 λεπτά. Ένα μΐ ακαθάριστο προϊόν χρησιμοποιήθηκε ακολούθως ως πρότυπα για άλλον κύκλο ενίσχυσης για την επισήμανση των αμπλικονίων με το ίδιο πρωτόκολλο PCR εκτός του ότι dTTP αντικαταστάθηκε από ένα μίγμα 4:01 των αμινοαλλυλ dUTP (Ambion, Austin, ΤΧ) και dTTP για την επισήμανση ιχνηλάτη . Τα σημασμένα αμπλικόνια καθαρίστηκαν με DNA Clean-up και συγκεντρωτή-5 στήλες, εκλούσθηκε σε 9 μΙ διττανθρακικού νατρίου (ρΗ 9.0) και σε συνδυασμό με 1 μΙ DMSO διαλύονται Cy3 ή Cy5 NHS εστέρες (GE Healthcare, Piscataway, NJ) για 30 για 60 λεπτά. Το Cy3 και Cy5 επισημασμένα αμπλικόνια καθαρίστηκαν με DNA Clean-up και συγκεντρωτή-5 στήλες και εκλούεται με 10 μΐ 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0). Ζεύγη Cy3 και Cy5 επισημασμένα αμπλικόνια συνδυάστηκαν με 3.6 μΐ 20 χ SSC, 0,5 μΙ Hepes (ρΗ 7,0) και τέλος 0,5 μΐ 10% SDS. Το μικτό διάλυμα θερμάνθηκε για 2 λεπτά στους 95 ° C, ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου και υβριδοποιήθηκε στους minigenomic συστοιχίες πλακόστρωση στους 63 ° C όλη τη νύχτα, ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [57], [58]. Τα υβριδοποιημένα συστοιχίες πλύθηκαν και σαρώνεται με GenePix 4000B σαρωτή (Molecular Device, Sunnyvale, CA) και αναλύθηκαν από GenePix Pro 6.0 λογισμικό.

Πλακάκια ανάλυση των δεδομένων συστοιχίας

Το ανθρώπινο Cot-1 DNA και DNA σπέρματος ρέγκας σχεδιάστηκαν για να είναι θετικός και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα, και στίγματα πολλές φορές στη συστοιχία (βλέπε Σχήμα 3). Για την εξομάλυνση για την ημέρα με την ημέρα και το δείγμα προς δείγμα παραλλαγή, η μέση ένταση του όλα τα χαρακτηριστικά που αντιπροσωπεύουν το DNA σπέρματος ρέγγας (

50% -HS

) χρησιμοποιήθηκαν για να διαιρέσει την ένταση (

G

) κάθε χαρακτηριστικό που εκπροσωπούν γονιδιωματική ανιχνευτές. Κάθε (

I

G

): (

I

50% -HS

) αναλογία, το κανονικοποιημένο σήμα γενωμικού ανιχνευτή, παραστάθηκε γραφικά στο άξονα Υ έναντι του αντίστοιχου ανιχνευτή γονιδιωματική θέση στο Χ-άξονα για να διευκολύνει την ερμηνεία των δεδομένων (βλέπε σχήμα 4).

CDKN2A

σημείο διακοπής κλωνοποίηση

για να επιβεβαιώσετε

CDKN2A

breakpoint χαρτογράφηση από προσέγγιση PAMP, τα θραύσματα γενωμικού πλευρίζουν τις σημεία διακοπής κλωνοποιήθηκαν με παραδοσιακές προσεγγίσεις PCR καθοδηγούνται από τα αποτελέσματα από PAMP. Τα δύο παραδείγματα που δίνονται σε αυτό το χαρτί

Detroit 562 κυτταρική σειρά

:. Η ένθετη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση του

CDKN2A

σημείο διακοπής στο Ντιτρόιτ 562 ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος του επιθηλίου. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με ενδείξεις από το πείραμα PAMP (βλέπε σχήματα 3 και 4). Εξωτερικά αρχικά τεμάχια (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC και AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) χρησιμοποιήθηκαν για 35 κύκλους PCR (92 ° C, 30 δευτερόλεπτα? 55 ° C, 30 δευτερόλεπτα? 68 ° C, 2 λεπτά).