Αφηρημένο

πρόσληψη βιταμίνης Ε έχει εμπλακεί στην μείωση του κινδύνου καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, οι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Εδώ αναφέρεται ότι δ-τοκοτριενόλη (δ-Τ3), ένα από βιταμίνη Ε ισομερή, κατείχε την πιο ισχυρή κυτταροτοξική ικανότητα έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων κύστης, σε σύγκριση με άλλα ισομερή βιταμίνη Ε. δ-T3 ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και colonogenicity μέσω επαγωγής της σύλληψης G1 φάση και απόπτωση. Western δοκιμασία κηλίδωση αποκάλυψε ότι δ-Τ3 αύξησε τα επίπεδα έκφρασης των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου (p21, ρ27), προ-αποπτωτική πρωτεΐνη (Bax) και κατέστειλε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του κυτταρικού κύκλου (Κυκλίνη D1), αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2 , Bcl-x

L και Mcl-1), με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και διάσπαση της PARP. Επιπλέον, η θεραπεία δ-T3 ανέστειλε επίπεδο φωσφορυλίωσης ETK και επάγεται SHP-1 έκφραση, η οποία συσχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση της ενεργοποίησης STAT3. Σύμφωνα με αυτό, δ-T3 μείωσε το επίπεδο πρωτεΐνης STAT3 στο πυρηνικό κλάσμα, καθώς και δραστηριότητα μεταγραφή του. Knockdown του SHP-1 αντιστραφεί μερικώς δ-T3-επαγόμενη διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων. Σημαντικά, χαμηλή δόση δ-T3 ευαισθητοποιημένα Γεμσιταβίνη επαγόμενη κυτταροτοξικά αποτελέσματα στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης. Συνολικά, τα ευρήματα μας απέδειξε, για πρώτη φορά, οι κυτταροτοξικές επιδράσεις του δ-Τ3 επί καρκινικών κυττάρων κύστης και υποδηλώνουν ότι δ-Τ3 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη αντιδραστήριο χημειοευαισθητοποίηση για Γεμσιταβίνη στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Ye C, Zhao W, Λι Μ, Zhuang J, Γιαν X, Lu Q, et al. (2015) δ-Tocotrienol Προκαλεί Ανθρωπίνων καρκίνο της ουροδόχου κύστης Η ανάπτυξη των κυττάρων σύλληψης, απόπτωση και Χημειοευαισθητοποίηση μέσω της αναστολής της STAT3 Διαδρομής. PLoS ONE 10 (4): e0122712. doi: 10.1371 /journal.pone.0122712

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Andrea Morrione, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 2 Δεκ 2014? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη, 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (2011CB944104), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172009, 81372168) , Διδακτορική Ταμείο του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20110091120028) για να Dr. J. Γιαν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα σε όλο τον κόσμο. Είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου του ουροποιητικού συστήματος στις αναπτυγμένες χώρες, με την εκτίμηση των 74.690 νέα κρούσματα και 15.580 θανάτους στις ΗΠΑ το 2014 [1]. Δυστυχώς, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι επίσης ένα από τα πιο επαναλαμβανόμενο και ακριβά κακοήθειες, με τέσσερα δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ, το ετήσιο κόστος για ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης στις ΗΠΑ κατά τη διάρκεια του 2010 [2-4]. Η χειρουργική εκτομή, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία είναι κοινές θεραπευτικές προσεγγίσεις για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, οι διαφορετικές παρενέργειες που σχετίζονται με την κάθε αγωγή και μερικά καρκινικά κύτταρα τελικά καταστεί ανθεκτικοί. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων συμπληρωματικές θεραπείες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με τις τρέχουσες θεραπείες.

Η βιταμίνη Ε πρόσληψη έχει αντίστροφη σχέση με τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης μεταξύ των ηλικιωμένων ατόμων ή βαρείς καπνιστές από πολλαπλές επιδημιολογικές μελέτες [5,6]. Αμφότερες οι τοκοφερόλες (TP) και τοκοτριενόλες (Τ3) ανήκουν στην οικογένεια της βιταμίνης Ε, και κάθε υπο-οικογένεια αποτελείται από τέσσερα ισομερή: α-, β-, δ- και γ. Η κύρια διαφορά μεταξύ TP και Τ3 είναι η δομή των πλευρικών αλυσίδων τους, με φαρνεσύλιο για Τ3 και κορεσμένο φυτύλιο για TP [7-9]. Σε σύγκριση με το TPS, που βρίσκονται συνήθως στα φύλλα και οι σπόροι των περισσότερων φυτών, T3S είναι λιγότερο άφθονα και βρίσκονται κυρίως στο φοινικέλαιο και πίτουρο ρυζιού. Δύο κλινικές μελέτες, η Γυναίκες Μελέτη Υγείας (WHS) δίκη και το Σελήνιο Βιταμίνη Ε και του καρκίνου του προστάτη Chemoprevention Trial (SELECT), διεξήχθησαν για τη διερεύνηση της ιδιοκτησίας πρόληψη του καρκίνου του α-TP [10,11]. Ούτε δοκιμή έδειξε σημαντική επίδραση της α-TP έναντι του πνεύμονα, του μαστού και καρκίνο του παχέος εντέρου στις γυναίκες και τον καρκίνο του προστάτη στους άνδρες. Ως εκ τούτου, διαφορετικά ισομερή Τ3 περιέγραψαν περισσότερη έρευνα προσοχή πρόσφατα, λόγω των πιθανών εφαρμογή τους ως μη τοξικά διαιτητική αντικαρκινικό παράγοντα [12-14]. Μεταξύ αυτών, δ-T3 έδειξε ισχυρή δραστικότητα έναντι διαφόρων τύπων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του μαστού [15-17]. Ωστόσο, αν δ-T3 διαθέτει αντικαρκινική δράση κατά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.

Η ενεργοποίηση των Signal Transducer και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) συχνά ανιχνεύεται σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [18 ]. Η φωσφορυλίωση του υπολείμματος τυροσίνης 705 σε STAT3 πρωτεΐνη, η οποία είναι ένα κρίσιμο γεγονός για την ενεργοποίηση του, οδηγεί σε σχηματισμό ομοδιμερών STAT3 και μετατόπιση εντός των πυρήνων. Πυρηνική εντοπισμένη διμερές STAT3 συνδέεται με τους υποκινητές των διαφόρων γονιδίων στόχων και ρυθμίζει μεταγραφές τους, τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την επιβίωση και την εισβολή [19]. Επιπλέον, αναφέρεται ότι επάγεται υπεριώδης κυτταρικής απόπτωσης μπορεί να κατασταλεί από την ενεργοποίηση STAT3? ενώ η αναστολή STAT3 επάγει εξαρτώμενη από κασπάση απόπτωση και αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων και την αγγειογένεση σε καρκινικά κύτταρα [20,21]. Πρόσφατη μελέτη έδειξε επίσης ότι ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη STAT3 σε urothelial κύτταρα επιταχύνει την πρόοδο σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, υποδεικνύοντας ότι STAT3 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [22].

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε το ισχυρότερο κυτταροτοξικότητα της δ-T3 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως από ό, τι μη κακοήθων αθανατοποιημένα ουροθηλιακό κύτταρα. Μηχανιστικά, δείξαμε ότι δ-Τ3 ανέστειλε την ενεργοποίηση ETK και επάνω ρυθμισμένη έκφραση SHP-1, η οποία συσχετίζεται με την καταστολή της STAT3 μονοπατιού σηματοδότησης. Δείξαμε επίσης χαμηλή δόση του δ-Τ3 ενίσχυσε την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων κύστης με χημειοθεραπευτικό παράγοντα -. Γεμσιταβίνη

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

Όλα τα χημικά και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. α-, γ-, δ-Τ3 και α-τοκοφερόλη (α-TP) είχαν την καλοσύνη να παρέχονται από το Νταβός Life Science Ltd (Synapse, Σιγκαπούρη). Η γεμσιταβίνη ήταν από Eli Lilly Company (Indianapolis, ΙΝ). Bcl-2, Bcl-x

L, MCL1, PARP, προ-κασπάση-3, pSTAT3 (Y705), pETK (Y40), STAT3, και αντισώματα SHP-1 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers , ΜΑ). ETK, ρ21 και ρ27 αντισώματα ήταν από BD Biosciences (San Jose, CA). β-ακτίνης αντίσωμα αγοράστηκε από AbMax Biotechnology Company (Πεκίνο, Κίνα). Bax αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Το μη-κακοήθεις απαθανάτισε ουροφόρων κυτταρικής σειράς SV-HUC-1, καρκίνος της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές Τ24, 5637, J82 και UMUC-3 λήφθηκαν από την Cell Bank, Type Culture Collection, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. Όσο για siRNA δοκιμασία παρεμβολής, SHP-1 στόχευση siRNA: 5′-GAGAACGCUAAGACCUACAtt-3 ‘και τον έλεγχο siRNA: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’ διαμολύνθηκαν σε καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), αντίστοιχα

. κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Για τη μελέτη της βιωσιμότητας κυττάρου, 1.5 × 10

3 κύστη καρκινικά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις (50, 100, 150, 200 μΜ) από τα ισομερή βιταμίνη-Ε για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά τη θεραπεία, 10 μΐ 5 mg /ml διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης στη συνέχεια επανα-εναιωρήθηκαν σε 100 μΐ DMSO και η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και οι καμπύλες ανάπτυξης έδειξαν τα μέσα και την τυπική απόκλιση.

Colony σχηματισμός δοκιμασία

Μετά από 14-ημερών επώαση 100 μΜ α-TP, α-Τ3, γ- Τ3 και δ-Τ3, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη, και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Μόνο αποικίες με & gt? 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Κάθε αγωγή επανελήφθη εις τριπλούν.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του δ-Τ3 για 48 ώρες, προτού τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10 mg /ml RNase Α που περιέχει PBS για 30 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από προσθήκη 1 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma). Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογή ροής (FACS) Calibur κυτταρόμετρο (BD FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA).

Η απόπτωση ανάλυση

αννεξίνης V /προπίδιο ιωδιούχο χρώση (ΡΙ) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 488 αννεξίνης V /Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit (Invitrogen, Cat # V13245, Inc., Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1×10

6 κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, που ακολουθείται από επαναιώρηση σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης και επωάστηκε με 1,0 μΙ PI και 5,0 μΙ αννεξίνης V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS Calibur Μέσο (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7,6 λογισμικού.

σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης μεταγραφής ανάλυση αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Ολικό RNA εξήχθη με ΤπζοΙ (Invitrogen ). Τα επίπεδα έκφρασης του

BCL2

,

bclxl και MCL1

γονιδίων ανιχνεύθηκαν με ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR). Οι εκκινητές παρατίθενται ως εξής:

BCL2

: προς τα εμπρός, 5′-CGTACAGTTCCACAAAGGCA-3 ‘και αντίστροφος, 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’?

bclxl

: προς τα εμπρός, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3’?

MCL1

: προς τα εμπρός, 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3’?

β-ακτίνης

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές για το

β-ακτίνης

ήταν 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 ‘και 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’. qPCR διεξήχθη με τη χρήση του SYBR Green (Takara Biotechnology Co Ltd, Dalian, Κίνα) μέθοδος ανίχνευσης βαφής επί ΑΒΙ StepOne Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας υπό προεπιλεγμένες συνθήκες: 95 ° C για 10 λεπτά, και 40 κύκλοι των 95 ° C για 5 s και 55 ° C για 31 μέθοδο S. Συγκριτικό Ct χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταγραφών.

Western blotting

δοκιμασία

τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό RIPA που περιέχει πρωτεάση ταμπλέτα κοκτέιλ αναστολέα (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ Ι (Sigma). Τα κυτταρικά λύματα (20 μ§) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Μετά από κηλίδωση σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο που περιέχει 0.1% Tween-20 (PBST), οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 1: 500 έως 1 000 αραιώσεις σε PBST ή 5% BSA επί μία νύκτα στους 4 ° C , σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Οι κηλίδες πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα, και τελικά ανιχνεύθηκε με αντιδραστήριο ECL (Thermo Scientific).

δραστικότητα λουσιφεράσης

δοκιμασία

Η επίδραση της δT3 επί STAT3 αποκρίνεται στοιχείο που περιέχει προαγωγό (STAT3-Luc) δραστηριότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης. κύτταρα Τ24 (2.5 × 10

5 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) με 0,5 μg του STAT3-Luc και 1 ng πλασμιδίου λουσιφεράσης TK-Renilla. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα επωάστηκαν με δT3 για 24 ώρες και συλλέχθηκαν. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (Promega) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλάκας Victor (Perkin-Elmer).

πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευή

κύτταρα Τ24 επιστρώθηκαν σε cm πιάτο 10, ακολουθούμενη από την κατεργασία με 150 μΜ δ-Τ3 για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε απαλά σε όγκους 4Χ παγωμένου υποτονικού ρυθμιστικού λύσης (10 mM HEPES, ρΗ 7.9, 1.5 mM MgCl

2, 10 mM KCl, 0,3% ΝΡ-40, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM DTT) με αναστολείς πρωτεάσης (Roche), και διατηρήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στο ρυθμιστικό μέχρι να έχουν διογκωθεί. Τα κυτταρολύματα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 10.000 χ g. Τα υπερκείμενα εκχυλίσματα κυτοσολίου. Επαναιωρήστε το ίζημα (πυρηνικό κλάσμα) σε όγκους 4Χ ισχυρών ρυθμιστικού διαλύματος λύσης πρωτεΐνη (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl

2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 25% γλυκερόλη, 0,5 mM DTT) με πρωτεάση αναστολέα για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως πυρηνική πρωτεΐνη με φυγοκέντρηση στις 12.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας)

δοκιμασία ChIP διεξήχθη με χρήση κιτ δοκιμασίας πλινθίου (Cat. 17- 295, Millipore), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά πυρηνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν όπως φαίνεται παραπάνω, το αντίσωμα έναντι STAT3 (CAT # 9139, Cell Signaling Technology) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκαταβύθιση χρωματίνη στα πυρηνικά κλάσματα, ενώ ένα μη ειδικό αντίσωμα IgG χρησιμοποιήθηκε ως τεχνική αρνητικός έλεγχος. Οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν και γίνεται από την Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, USA). Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση τσιπ qPCR του

γονίδιο bclxl

προαγωγού είναι ως ακολούθως: Bcl-XL-εκκινητή 5′-2F CTGGGTTCCCTTTCCTTCCA-3 ‘, Bcl-XL-εκκινητή 5’-2R TCCCAAGCAGCCTGAATCC -3 ‘[23]? Bcl-xL-εκκινητή 5’-1F CCCTTGCAGCTAGTTTTCTA-3 ‘, Bcl-XL-εκκινητή 5′-1R TGAATTCTGAGGCCAAGGGAA-3′? Bcl-xL-εκκινητή 5’-NCF TGCCAGGCCTTCGCTCAA-3 ‘, Bcl-XL-εκκινητή NCR 5-CAGATAAACTCTGTCCACAGA-3’. Primer που είναι 1 954 bp καθοδικά από την περιοχή έναρξης της μεταγραφής, ενώ σετ εκκινητών 2 είναι 1.277 bp προς τα κάτω από TSS, καλύπτοντας ένα συντηρημένο μοτίβο δέσμευσης STAT3 προβλέπεται από την ιστοσελίδα (www.dcode.org). Primer NC είναι εντοπισμένη στο 1880 bp καθοδικά από το τελευταίο εξόνιο, που χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι αριθμητικές τιμές παρουσιάζονται ως η μέση ± SD. Η Student ασύζευκτο t-test χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Σημαντικότητας ορίστηκε ως

P

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση της βιταμίνης Ε ισομερή σε κύστης καρκινικά κύτταρα

Για να εξετάσουν ποια βιταμίνη Ε ισομερή έχουν κυτταροτοξική επιπτώσεις για την ανθρώπινη καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα

in vitro

, υποβάλλαμε σε αγωγή τέσσερα κοινώς χρησιμοποιούνται ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ουροδόχου κύστης, Τ24, 5637, J82 και UMUC-3. Αυτές οι τέσσερις κυτταρικές γραμμές περιέχουν διάφορους βαθμούς γενετικής πολυπλοκότητας, καλύπτοντας τις κοινές γενετικές μεταλλάξεις που βρίσκονται σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Αυτές περιλαμβάνουν την αδρανοποίηση των TP53 και Rb1, η ενεργοποίηση του Κ-Ras και H-Ras ή απώλεια της PTEN (www.atcc.org). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο γ- και δ-T3 εμφανίζεται αντικαρκινικές επιδράσεις σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ α-T3, καθώς και α-TP δεν έδειξε κυτταροτοξικά αποτελέσματα εντός του εύρους δοσολογιών που δοκιμάσαμε (Σχ 1Α ). Για να δοκιμαστεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα Ε ισομερούς βιταμίνης σε φυσιολογικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης, μπορούμε επίσης να αντιμετωπίζονται SV-HUC-1, μία αθανατοποιημένη μη-κακοήθεις ουροθηλιακό κύτταρο με τα βιταμίνη Ε ισομερή. Αξίζει να σημειωθεί, γ- και δ-Τ3 που ασκείται μικρότερη τοξικότητα σε μη-κακοήθη επιθηλιακά κύστη κυττάρων (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η θεραπεία του δ-Τ3 και γ-T3 επίσης μειώθηκαν σημαντικά οι αριθμοί των αποικιών, σε σύγκριση με α-Τ3 και α-TP (Σχήμα 1Β). Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ και ποσοτικού προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας, αποδείξαμε ότι η σειρά ανασταλτικό αποτέλεσμα από τη βιταμίνη Ε ισομερή είναι δ-Τ3 & gt? γ-Τ3 & gt? & gt? α-Τ3 και α-TP σε όλες τις τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης? Ως εκ τούτου, δ-T3 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη.

(Α) καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστης Τ24, 5637, τα κύτταρα J82 και UMUC-3, όπως επίσης και μη κακοήθεις ανθρώπινο urothelial SV-HUC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε βιταμίνη Ε ισομερή (α-TP, α-Τ3, γ-Τ3 και δ-Τ3) που κυμαίνεται από 0 έως 200 μΜ για 72 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των Τ24 5637, J82 και UMUC-3 κυττάρων με 100 μΜ α-TP, α-Τ3, γ-Τ3 και δ-T3 για 14 ημέρες. Οι κατακόρυφες μπάρες δείχνουν την μέση τιμή του αριθμού των κυττάρων ± SD σε κάθε ομάδα θεραπείας. *,

P

& lt? 0,05? ***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με την ομάδα θεραπείας με το όχημα.

Η διανομή

δ-Τ3 προκαλεί G1 σύλληψη και απόπτωση

Για να καταδειχθεί περαιτέρω τα αντικαρκινικά αποτελέσματα του δ-Τ3, αναλύσαμε κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 2Α-2D). Τ24 και 5637 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις δ-Τ3 (0, 50, 100 και 150 μΜ) για 48 ώρες. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η θεραπεία δ-Τ3 (≥ 100 μΜ) προκάλεσε τη σύλληψη φάση G1 και μείωση του πληθυσμού των κυττάρων στη φάση S. Επιπλέον, αποπτωτικών κυτταρικό πληθυσμό (υπο-G1) αυξήθηκε σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α-2D). Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η διέγερση απόπτωσης, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό χρώσης V /ΡΙ Annexin. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η κατεργασία δ-Τ3 που προκαλείται αποπτωτικό δείκτη σε αμφότερα T24 (Σχήμα 3Α) και 5637 κύτταρα (Σχ 3Β) σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δ-Τ3 που κυμαίνονται από 0-150 μΜ για 48 ώρες. αναλογίες των κυττάρων κατανομή του κύκλου και Sub-G1 αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001.

Η

ανάλυση αννεξίνης V /PI έδειξε ότι δT3 επαγόμενη απόπτωση σε Τ24 (Α) και 5637 (Β) καρκινικά κύτταρα κύστης, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου έλαβαν όχημα.

Η

δ-Τ3 επάγει αναστολείς του κυτταρικού κύκλου και ρυθμίζει προς τα κάτω προ-μονοπάτι επιβίωσης

ανάλυση κηλίδωσης Western διεξήχθη για να εξεταστούν περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση. Μετά τη θεραπεία 24 ώρες με δ-Τ3 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε Τ24 και 5637 κύτταρα, παρατηρήσαμε τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου, p21

WAF1 /Cip1 και p27

Kip1, και μειωμένα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης D1 ( Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η θεραπεία δ-Τ3 ενεργοποιούνται επίσης προ-κασπάση-3, και είχε ως αποτέλεσμα τη διάσπαση PARP (Σχήμα 4Β). Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 μπορεί να γίνει μέσω της μιτοχονδριακής οδού, δοκιμάσαμε την απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες επί των μιτοχονδρίων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ, το επίπεδο έκφρασης της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Βαχ ενισχύθηκε? από την άλλη μεριά, αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl-1 καταστέλλονται κατά τη θεραπευτική αγωγή δ-T3. Όπως φαίνεται στο S1 σχήμα, τη διάσπαση των αποπτωτικών δεικτών (κασπάση-3 και PARP), την επαγωγή του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax, καθώς και μείωση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών επίσης επιβεβαιώθηκε σε δύο ακόμη κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως (J82 και UMUC-3).

Western blotting ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (Α), την απόπτωση (Β) και άλλων σχετίζονται με την απόπτωση (Γ) τα επίπεδα πρωτεΐνης σε Τ24 και 5637 κύτταρα, μετά την αγωγή δ-Τ3 για 24 h. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

δ-Τ3 αποφωσφορυλιωμένο ETK και υπερεκφράζεται SHP-1 να καταστείλει STAT3 σηματοδότησης

Για να αναλύσουμε περαιτέρω τα αποτελέσματα του δ-Τ3 σε μεταγενέστερους σηματοδότησης, αναλύσαμε STAT3 μονοπάτι σηματοδότησης, το οποίο είναι ένα από τα σημαντικότερα αντι-αποπτωτικών οδών, η οποία παρέχει το πλεονέκτημα επιβίωσης και χημειο-αντίσταση των καρκινικών κυττάρων κύστης έναντι διαφόρων χημειοθεραπευτικών παραγόντων [18-21]. Βρήκαμε ότι δ-T3 κατέστειλε το επίπεδο φωσφορυλίωσης της STAT3 (Y705) σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο T24 και 5637 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Α). Η ενεργοποίηση της STAT3 ρυθμίζεται από ανάντη κινάσες και φωσφατάσες. Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κινάσης τυροσίνης (ETK) συχνά υπερεκφράζεται [24]. Ως κινάσης τυροσίνης μη υποδοχέα, ETK ενεργοποίηση /έκφραση απαιτείται για την ενεργοποίηση STAT3 σε καρκινικά κύτταρα. Σύμφωνα με αυτό, παρατηρήσαμε ότι η δραστική μορφή του ETK (φωσφορυλίωση στη Y40) υπέστη αναγωγή με δ-Τ3 θεραπεία, αρχίζοντας από τη συγκέντρωση των 50 μΜ σε τόσο Τ24 και 5637 κύτταρα. Περαιτέρω, δ-T3 εντυπωσιακά επαγόμενη το επίπεδο έκφρασης της φωσφατάσης τυροσίνης πρωτεΐνης SHP-1, το οποίο λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής για την ενεργοποίηση STAT3 (σχήμα 5Β). Πυρηνική μετατόπιση του STAT3 είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του ως παράγοντα μεταγραφής. Τα πυρηνικά και κυτοσόλιο κλάσματα λύματος πρωτεΐνης από τα κύτταρα επεξεργασμένα δ-T3 διαχωρίστηκαν. Κατά την αγωγή δ-Τ3, το επίπεδο της πρωτεΐνης STAT3 σε πυρήνες μειώθηκε σε κύτταρα Τ24 (Σχήμα 5C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η μείωση της πληρότητας των πυρηνικών STAT3 σε γονίδια στόχους της, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ChIP χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι STAT3. Όπως φαίνεται στο Σχ 5D, δ-T3 μείωσε σημαντικά την πρόσληψη STAT3 επάνω σε θέσεις πρόσδεσης του σε

bclxl

τόπο με 5,55 πτυχώσεις (σετ εκκινητών 1) και 5,93 πτυχώσεις (σετ εκκινητών 2), ενώ σετ εκκινητή αρνητικό έλεγχο (NC) δεν έδειξαν καμία διαφορά. Σε συμφωνία με αυτό το αποτέλεσμα, η μεταγραφική δραστικότητα του STAT3 προαγωγός που αποκρίνεται σημαντικά κατασταλεί με θεραπεία δ-Τ3 σε μια δοκιμασία ρεπόρτερ λουσιφεράσης (Σχήμα 5Ε). Επιπλέον, τα αποτελέσματα qRT-PCR αποκάλυψε ότι τα τρία γονίδια άμεσο στόχο STAT3 (

BCL2

,

bclxl

και

MCL1

) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε επίπεδα mRNA και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης δύο (Σχήμα 5F), υποδεικνύοντας ότι η μείωση οφείλεται κυρίως στην μεταγραφική ρύθμιση. Να εξετάσει κατά πόσον SHP-1 είναι απαραίτητη για την επιβίωση ενεργοποίηση STAT3 που προκαλείται από κύτταρο, έχουμε χτυπηθεί κάτω ενδογενή SHP-1 από την παρεμβολή RNA (Σχήμα 5G) και διαπίστωσε ότι η εξάντληση του καταργήθηκε μερικώς δ-Τ3 που προκαλείται τοξικότητα σε κύτταρα Τ24 (Σχήμα 5Η). Αυτό επιβεβαίωσε επίσης ότι η δ-Τ3 που προκαλείται από την ουροδόχο κύστη αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων μερική μέσω επαγωγής SHP-1. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η θεραπεία δ-T3 μείωσε το επίπεδο φωσφορυλίωσης μαζί με την πυρηνική μετατόπιση της STAT3 πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα την μεταγραφική μείωση των κατάντη γονιδίων στόχων του σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης.

κηλίδωση Western ανάλυση τα επίπεδα STAT3 /ETK σηματοδότηση μονοπατιού που σχετίζονται με (Α) και SHP-1 (Β) πρωτεΐνης σε Τ24 και 5637 κύτταρα κάτω από τη θεραπεία δ-Τ3 για 24 ώρες. Δυτική ζώνες ποσοτικά με το λογισμικό J Image και τα ψηφία εμφανίζονται κάτω από το άνω πάνελ ήταν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης STAT3 ομαλοποιηθεί από ελέγχους φόρτωσης. (Γ) μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης πυρηνικής STAT3 με την κατεργασία 150 μΜ δ-Τ3 σε κύτταρα Τ24. LaminB1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος πυρηνική φόρτωσης. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως κυτταροπλασματική έλεγχος φόρτωσης. (Δ) Γονιδιωματική δομή του

bclxl

γονίδιο που φαίνεται, με τις ετικέτες των τριών σετ εκκινητών για προσδιορισμό chip. Primer σετ 1 και 2 περιέχουν STAT3 στοιχείο δεσμευτική? λαμβάνοντας υπόψη ότι η αστάρι σετ 3 (NC) χρησιμεύει ως αρνητικός μάρτυρας. STAT3 πληρότητας στο

bclxl

υποστηρικτής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης Τ24 κυτταρική γραμμή που έλαβαν θεραπεία με 150 μΜ δ-Τ3 ή το όχημα για 18 ώρες αναλύθηκαν με τη δοκιμασία chip. DNA εισόδου και ανοσοκαταβυθίστηκε DNA αναλύθηκαν με qPCR αναλύσεις χρησιμοποιώντας σύνολα εκκινητών απεικονίζεται παραπάνω και ομαλοποιήθηκε από τον έλεγχο IgG. Το μπαρ σφάλμα υποδεικνύει τα μέσα ± SD. ***

P & lt?

0.001. (Ε) θεραπεία δ-Τ3 μείωσε τα γονίδια προς τα κάτω στόχος STAT3 (

BCL2

,

bclxl

και

MCL-1

) έκφραση στο επίπεδο του mRNA. (F) ανάλυση δραστικότητα λουσιφεράσης των STAT3-Luc κατά την επεξεργασία των 150 μΜ δ-Τ3 σε κύτταρα Τ24 για 24 ώρες. πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla ΤΚ-χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (G) Νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα της SHP-1 σε κύτταρα Τ24 από Δυτικών δοκιμασία κηλίδωσης. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. sinc, αρνητικό siRNA ελέγχου. siSHP-1, siRNA που στοχεύει να SHP-1. (H) κύτταρα Τ24 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA για SHP-1 ή SINC, ακολουθούμενη από κατεργασία με δ-Τ3 ή όχημα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001.

Η

Χαμηλή συγκέντρωση της δ-Τ3 ενίσχυσε την αποπτωτική δράση της γεμσιταβίνης σε Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα

Γεμσιταβίνη είναι η χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής για τους καρκίνους της ουροδόχου κύστης [25,26]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε κατά πόσο χαμηλή συγκέντρωση του δ-Τ3 μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων κύστης για γεμσιταβίνη. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι η θεραπεία 25 μΜ δ-T3 ενίσχυσε την κυτταροτοξική δράση της γεμσιταβίνης στη Τ24, 5637, J82 και UMUC-3 κυτταρικές σειρές (Σχ 6Α και S2 Εικ). Η κυτταρομετρία ροής δεδομένων από αννεξίνης V /costaining PI αποκάλυψε ότι η συνδυασμένη θεραπεία αύξησε το αποπτωτικό αποτέλεσμα, σε σύγκριση με θεραπεία γεμσιταβίνη μόνη της. Το αποπτωτικό ποσοστό αυξήθηκε από 34,6% και 19,28% στα κύτταρα Γεμσιταβίνη-αντιμετωπίζονται με 53,3% και 28,4% στη συνδυασμένη θεραπεία Τ24 και 5637 κυττάρων, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε επίσης ότι η θεραπεία της γεμσιταβίνης σε συνδυασμό με δ-Τ3 κατέστειλε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων Τ24 (Σχήμα 6C). Όπως φαίνεται στο Σχ 6D, συν-θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις δ-Τ3 και γεμσιταβίνη εντυπωσιακά επάγεται Βαχ και καταστέλλεται Bcl-xL και Bcl-2, η οποία συνοδεύεται από την παρουσία της διάσπασης PARP. Σταθερά, βρήκαμε επίσης ότι η μειωμένη συν-κατεργασία επίπεδο φωσφορυλίωσης του ETK, επάγεται SHP-1 έκφραση και ανέστειλαν κατάντη ενεργοποίηση τους STAT3 (σχήμα 6Ε).

(Α) Τ24 και 5637 κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες σε η παρουσία των 25 μΜ δ-Τ3 και /ή 0.08 μΜ GEM. Στη συνέχεια, το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Τ24 και 5637 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία 25 μΜ δ-Τ3 και /ή 0.08 μΜ GEM, αντίστοιχα. Τα αποπτωτικά ποσοστά αναλύθηκαν με δοκιμασία χρώσης αννεξίνης V /PI. (C) Συνδυασμένη θεραπεία με GEM (0,08 μΜ) και δ-Τ3 (25 μΜ) για 14 ημέρες εξαλειφθεί πλήρως η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων Τ24. (Δ) Ανάλυση κηλιδώσεως Western της απόπτωσης που συνδέονται και STAT3 σηματοδότηση που σχετίζονται με τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα Τ24, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δ-Τ3 ή /και GEM για 48 ώρες. (Ε) κηλίδωση Western ανάλυση των σηματοδότησης που σχετίζονται με τα επίπεδα πρωτεΐνης STAT3 σε κύτταρα Τ24, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δ-Τ3 ή /και GEM για 24 ώρες. **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001.

Η

Συζήτηση

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με την κυτταροτοξική δράση του δ-Τ3 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης. Σε σύγκριση με άλλα ισομερή βιταμίνη Ε, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και οι δύο δ- και γ-Τ3 είναι ισχυροί αναστολείς του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης. Σε αντίθεση, α-Τ3 και α-TP δεν έχουν αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα κάτω από τις ίδιες πειραματικές ρυθμίσεις. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο δ- και γ-Τ3 έχουν σημαντική κυτταροτοξικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης, δ-T3 φαίνεται να είναι πιο ισχυρή από γ-Τ3, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι πιο βιοδραστικά. Αυτό είναι σύμφωνο με τις παρατηρήσεις όταν δ-T3 χρησιμοποιείται στις αγωγές άλλων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων και του καρκίνου του παγκρέατος [13,15,27]. Επιπλέον, σε σύγκριση με γ-Τ3, είναι λιγότερο γνωστά για τις αντικαρκινικές επιδράσεις του δ-T3. Ως εκ τούτου, θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί εάν δ-Τ3 θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί ως ένας από τους κορυφαίους βιταμίνες για χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Σε αυτήν την έκθεση, αποδείξαμε επίσης ότι δ-Τ3 αναστέλλεται σηματοδότησης STAT3 μονοπάτι, το οποίο παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση. Έχει αναφερθεί ότι STAT3 συχνά ενεργοποιούνται σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Με τη χρήση του επιπέδου φωσφορυλίωσης της STAT3 σε Y705 ως υποκατάστατο δείκτη, Λιν και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι STAT3 είναι υπερενεργοποιημένος στο 19% καρκινικούς ιστούς ανθρώπινης ουροδόχου κύστης (

n

= 100) [28]. Weissmann και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι pSTAT3 είναι αυξημένη στον κυτταρικό πληθυσμό καρκινικά βλαστικά σε δείγματα UBC, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του STAT3 παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση του καρκινικού κυττάρου βλαστική ικανότητα [29]. Σύμφωνα με αυτά, τα διαγονιδιακά έκφραση της STAT3 σε βασικά κύτταρα του επιθηλίου της ουροδόχου κύστης ποντικιού επιτάχυνε την εξέλιξη από το καρκίνωμα

in situ

σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης υπό καρκινογόνο θεραπεία νιτροζαμίνη, σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου υπό την ίδια μεταχείριση [22 ]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διακοπή της STAT3 μονοπατιού σηματοδότησης είτε με νοκ ντάουν STAT3 ή υπερέκφραση των κυρίαρχων αρνητικών μορφή STAT3 προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση [30], που δείχνει ότι η στόχευση σηματοδότηση STAT3 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

η ενεργοποίηση της STAT3 ρυθμίζεται από ανάντη κινάσες και phosphotases. ETK, επίσης γνωστή ως ΒΜΧ, είναι ένα μέλος της οικογένειας Tec των κινασών τυροσίνης μη-υποδοχέα. Περιέχει πολλά κρίσιμα πεδία, συμπεριλαμβανομένης της ομολογίας Plekstrin (PH), η ομολογία Tec (ΤΗ), η ομολογία SH3 Src, SH2, και ο τομέας κινάσης SH1. Αυξημένα έκφραση ETK έχει ανιχνευθεί σε υπερπλασία του δέρματος και του καρκίνου του προστάτη [31,32]. Πρόσφατα, ETK προτάθηκε για να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την πρόβλεψη του ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με κυστεκτομή στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [24]. ογκογόνο λειτουργία του έχει συσχετισθεί με την αλληλεπίδραση του με και ενεργοποίηση STAT3 [24,33]. Όπως υπερεκφράζεται στο γλοιοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα (GSCS), ETK ενεργοποιεί STAT3 να διατηρήσει αυτο-ανανέωση και ογκογόνο δυναμικό του GSCS [34]. Επιπλέον, knockdown του ETK καταστέλλει την ενεργοποίηση των STAT3 σε δύο κύστη καρκινικές κυτταρικές σειρές T24 και UM-UC-3 [24], υποδεικνύοντας ότι οι λειτουργίες ETK ανοδικά της STAT3 σε καρκινικά κύτταρα κύστης.

Επιπλέον, SHP- 1 είναι ένα μη-διαμεμβρανικές ΡΤΡ που λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής του μονοπατιού STAT3 [35]. Ως ογκοκατασταλτικό, ο υποκινητής του SHP-1 συχνά υπερμεθυλίωση σε λευχαιμία και λέμφωμα κυττάρων [36]. Αρχικά αναφέρθηκε ότι δ-Τ3 επάγει SHP-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Επειδή γ-Τ3 επάγει επίσης έκφραση SHP-1 να αναστέλλει σηματοδότηση STAT3 σε μυελώματος και κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [36,37], και οι δύο γ- και δ-Τ3 μπορεί να λειτουργεί με παρόμοιο τρόπο για να αναστείλει σηματοδότηση STAT3 με διέγερση έκφρασης SHP-1. Συνεπής με την καταστολή της STAT3 οδού, οι οποίες είναι πολύ σημαντικές για την καρκινογένεση της ουροδόχου κύστης [22], η καταστολή της STAT3 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τη μείωση των κατάντη στόχους της, όπως Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl- 1, τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Κυτταρική κλασματοποίηση με Western και δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας STAT3-Luc πλασμίδιο επιβεβαίωσε ότι δ-Τ3 επηρεάζει ενεργοποίηση STAT3 μέσω της αναστολής του πυρηνικού translocalization του να επάγει γονίδια-στόχους του. Αυτά τα δεδομένα τεκμηριώνεται περαιτέρω την αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης STAT3 με δ-T3.

Γεμσιταβίνη χρησιμοποιείται συνήθως χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Βρήκαμε ότι η χαμηλή δόση του δ-T3 ενισχυμένη Γεμσιταβίνη επαγόμενη απόπτωση. Σε σύγκριση με την αγωγή Γεμσιταβίνη μόνο, συν-θεραπεία με χρήση δ-Τ3 και γεμσιταβίνη κατέστειλε εντυπωσιακά την ενεργοποίηση του ETK, STAT3 και επαγωγή SHP-1. Αυτό υποστηρίζει την ιδέα ότι δ-T3 ενισχύει Γεμσιταβίνη απόπτωση μέσω επαγωγής των κυττάρων σε πληθυσμό SubG1 που ακολουθείται από διάσπαση της PARP. Σταθερά, Kanai

et al

διαπίστωσε ότι η επαγόμενη από βιταμίνη Ε ηλεκτρική απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και αυξημένη chemosenstivity με paclitaxel [38]. 0,01?