Mouse

Αφηρημένο

Ο καρκίνος συνδέεται συχνά με την καχεξία, καρδιαγγειακά συμπτώματα και αυτόνομο απορρύθμισης. Ελέγξαμε εάν ο καρκίνος εξωκάρδιες επηρεάζει άμεσα την νεύρωση της αριστερής κοιλίας μυοκαρδίου. Ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Lewis (ομάδα όγκου, TG) ή PBS (ομάδα ελέγχου, CG) αναλύθηκαν μετά από 21 ημέρες. Η καρδιακή λειτουργία (ηχοκαρδιογραφία), τα επίπεδα του TNF-α και IL-6 (ELISA) ορού, δομικές αλλαγές καρδιομυοκυττάρων και νεύρωσης τους (σχεδιασμός με βάση στερεολογία) και τα επίπεδα του mRNA νεύρωσης σχετίζονται (ποσοτική RT-PCR) αναλύθηκαν. Οι ομάδες δεν διέφεραν σε διάφορες λειτουργικές παραμέτρους. Ορός επίπεδα TNF-α και IL-6 ήταν αυξημένα σε TG. Το συνολικό μήκος των αξόνων στην αριστερή κοιλία ήταν μειωμένη. Ο αριθμός των πυκνό πυρήνα κυστιδίων ανά προφίλ νευράξονα μειώθηκε. Μειωμένη myofibrillar όγκο, αυξημένη σαρκοπλασμικό όγκο και αύξηση του όγκου των σταγονιδίων των λιπιδίων ήταν ενδεικτική των μεταβολικών αλλαγών του TG καρδιομυοκύτταρα. Στην καρδιά, το επίπεδο του mRNA του αυξητικού παράγοντα νεύρων μειώθηκε, ενώ αυτή του υποδοχέα β1-αδρενεργικών ήταν αμετάβλητο στα TG. Στην αστεροειδής γάγγλιο του TG, τα επίπεδα mRNA του παράγοντα ανάπτυξης των νεύρων και το νευροπεπτίδιο Υ μειώθηκαν και εκείνη της υδροξυλάσης της τυροσίνης αυξήθηκε. Συνοπτικά, ο καρκίνος προκαλεί μια συστημική προ-φλεγμονώδη κατάσταση, μια σημαντική μείωση του εμφράγματος του νεύρωση και ένα καταβολικό φαινοτύπου καρδιομυοκύτταρα στο ποντίκι. Μειωμένη έκφραση του αυξητικού παράγοντα νεύρων μπορεί να ευθύνεται για τη μειωμένη μυοκαρδιακή νεύρωση

Παράθεση:. Mühlfeld C, Das SK, Heinzel FR, Schmidt Α, Ταχυδρομείο Η Schauer S, et al. (2011) Cancer Προκαλεί καρδιομυοκυττάρων αναδιαμόρφωση και Hypoinnervation στην αριστερή κοιλία της καρδιάς Ποντίκι. PLoS ONE 6 (5): e20424. doi: 10.1371 /journal.pone.0020424

Επιμέλεια: Gian Paolo Fadini, Πανεπιστήμιο της Πάντοβα, Ιταλία

Ελήφθη: δέκατης του Φεβρουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2011

Copyright: © 2011 Mühlfeld et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Αριστεία Cluster Καρδιοπνευμονική συστήματος (WK) και από το Verein zur Förderung der Krebsforschung στο Gießen eV (ΕΚ). SD χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το διδακτορικό πρόγραμμα Μοριακής Ιατρικής του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Γκρατς. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καχεξία του καρκίνου είναι ένα σύνθετο σύνδρομο κλινικά εκδηλώνεται ως προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, με ή χωρίς μειωμένη πρόσληψη τροφής, και αυτό συσχετίζεται με μία φτωχή πρόγνωση [1]. Η παθολογική εμπλοκή της καρδιάς υπό αυτές τις συνθήκες ήταν περιγράφεται ως μια νέα οντότητα από Burch et al. [2] και ονομάζεται «καχεκτικά καρδιά». Εκτός από τις αλλαγές στο ECG και μειωμένη μέγεθος της καρδιάς σε ακτινογραφίες θώρακος, ο καχεκτικός καρδιά χαρακτηρίζεται από απώλεια της επικαρδιακή λίπους, αύξηση σε κόκκους λιποφουσκίνης και μείωση στην καρδιομυοκυττάρων εμβαδόν διατομής παρά γενικά φυσιολογική καρδιακή λειτουργία [3], [4] . Επιπλέον, η μάζα της πρωτεΐνης μειώνεται ως αποτέλεσμα της αυξημένης καταβολισμό των πρωτεϊνών [5].

Είναι ενδιαφέρον ότι, ο καρκίνος σχετίζεται με λειτουργικές μεταβολές του καρδιαγγειακού συστήματος, όπως η μειωμένη μεταβλητότητα του καρδιακού ρυθμού σε ασθενείς με οξεία λευχαιμία [6], η αυξημένη ανάπαυσης καρδιακό ρυθμό, μειωμένη ηρεμίας πίεση του αίματος και αυξημένη ορθοστατική πτώση της αρτηριακής πίεσης σε ασθενείς με βρογχικό καρκίνωμα [7], και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρδιαγγειακής αυτονόμου ανεπάρκειας όπως αξιολογείται με μια ποικιλία από ηλεκτροκαρδιογραφικές και των κλινικών δοκιμών σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [8], [9] . Πρόσφατα, ένας σύνδεσμος έχει υποτεθεί μεταξύ σύνδρομο κόπωσης του καρκίνου (συνδυασμός δύσπνοιας, περιορισμός άσκηση και μυϊκή αδυναμία) και κλινικά μη εμφανή καρδιακή ανεπάρκεια, γεγονός που υποδηλώνει τα συμπτώματα κόπωσης να προκύψουν από δυσλειτουργία του αυτόνομου συστήματος [10]. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι μελέτες δείχνουν σαφώς μια συμμετοχή της καρδιακής νεύρωσης στην καχεξία του καρκίνου, οι συστηματικές μελέτες για το θέμα αυτό λείπει μέχρι στιγμής.

Η νεύρωση των κοιλιών αποτελείται κυρίως από μεταγαγγλιακές συμπαθητικού νευραξόνων, αν και, σε μικρότερο βαθμό, επίσης, αισθητηριακές και μεταγαγγλιακές παρασυμπαθητικό άξονες υπάρχουν [11], [12]. Στο φως μικροσκοπικό επίπεδο, η ανοσοϊστοχημεία είναι απαραίτητη για να απεικονίσει τις unmyelinated καρδιακές νευρικές ίνες. Κάθε νευρικών ινών μπορεί να αποτελείται από ένα ή περισσότερα άξονες, ο αριθμός των οποίων μπορεί να προσδιοριστεί μόνο με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Εκτός από την κλασική νοραδρεναλίνης νευροδιαβιβαστή, συμπαθητικών νευρώνων περιέχουν επίσης νευροπεπτίδια που παράγονται στο περικάρυο και αποθηκεύονται σε φυσαλιδώδη δομές που ονομάζονται μεγάλες πυκνό πυρήνα κυστίδια (LDCV). LDCV Οι ορθόδρομα μεταφέρονται μέσω του άξονα και απελευθερώνονται κατά την έκρηξη ή υψηλή συχνότητα πυροδότησης [13]. Στην περίπτωση της καρδιακής συμπαθητικών νευραξόνων, LDCV κυρίως περιέχει το νευροπεπτίδιο Υ (ΝΡΥ) [14].

Εδώ, υποθέσαμε ότι καρκινική καχεξία σχετίζεται με ποιοτικά ή /και ποσοτικά δομικές μεταβολές του εμφράγματος του νεύρωση. Προκειμένου να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ποντικού της καχεξίας όγκου και εξετάζονται τα χαρακτηριστικά του σε σχέση με τα επίπεδα ορού της κυτοκίνης και της καρδιακής λειτουργίας. Σε αυτό το μοντέλο, πραγματοποιήσαμε μια λεπτομερή φωτός και ηλεκτρονίων μικροσκοπική ανάλυση της αριστερής κοιλίας και απασχολούνται στερεολογικές μεθόδων σχεδιασμού που βασίζεται στην ποσοτικοποίηση διάφορα χαρακτηριστικά της καρδιομυοκύτταρα και νεύρωση τους. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA διαφόρων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την καρδιακή νεύρωση ποσοτικοποιήθηκαν στην καρδιά και στο γάγγλιο αστεροειδής, ένα σημαντικό γάγγλιο προμηθεύει συμπαθητικές ίνες προς την καρδιά.

Αποτελέσματα

Ζώα

από το χρονικό σημείο της εμφύτευσης του όγκου μέχρι το τέλος του πειράματος μετά από 21 ημέρες, τα ποντίκια TG έχασε 2,32 ± 0,82 g άπαχου σωματικού βάρους, ενώ τα ποντίκια σε CG αποκτήθηκε 2,11 ± 0,37 g άπαχου σωματικού βάρους (ρ & lt? 0.001) την επικύρωση του μοντέλου ποντικού ως μοντέλο της καχεξίας όγκου. Οι ίδιοι οι όγκοι είχαν ένα μέσο βάρος 3.3 ± 0.57 g. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο βάρος της αριστερής κοιλίας μεταξύ των ομάδων, ωστόσο, η αναλογία μεταξύ αριστερής κοιλίας και του σωματικού βάρους ήταν σημαντικά υψηλότερη σε TG λόγω της μειωμένης σωματικού βάρους (Πίνακας 1).

Η

υπερηχοκαρδιογραφία

Ο Πίνακας 2 δείχνει τα δεδομένα που λαμβάνονται με ηχοκαρδιογράφημα στην αναισθησία, σε φυσιολογική θερμοκρασία ποντίκια. Καμία από τις παραμέτρους που διέφερε σημαντικά μεταξύ TG και CG που δείχνει διατήρηση της καρδιακής λειτουργίας στην ομάδα του όγκου σε συνθήκες ηρεμίας.

Η

TNF-α και IL-6 επίπεδα

Τα επίπεδα ορού TNF-α και IL-6 ήταν σημαντικά αυξημένες σε σύγκριση με TG CG (Πίνακας 3).

η

Ποσοτική RT-PCR

στην καρδιά, η έκφραση του β1-αδρενεργικών υποδοχέα ήταν αμετάβλητη σε TG εναντίον CG. Επιπλέον, η έκφραση του αυξητικού παράγοντα νεύρων (NGF) ήταν μειωμένη σε σύγκριση με το TG CG. Τα επίπεδα έκφρασης των δύο υποδοχέων TNF (TNF-R1, TNF-R2) έχουν τριπλασιαστεί ή περισσότερο, αντίστοιχα, σε TG εναντίον CG.

Στην stellate γάγγλια του TG, η έκφραση του ΝΡΥ μειώθηκε σημαντικά ενώ η έκφραση της υδροξυλάσης της τυροσίνης, το ένζυμο περιορισμού του ρυθμού για σύνθεση νοραδρεναλίνη, αυξήθηκε τριπλάσια. NGF ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ποντικούς που φέρουν όγκο, αλλά οι αλλαγές ήταν λιγότερο εκτεταμένη από τις αλλαγές στην έκφραση του πομπού. Και οι δύο υποδοχείς TNF ήταν σημαντικά αυξημένη σε TG εναντίον CG (Πίνακας 4).

Η

καρδιομυοκυττάρων μορφολογία

Στο φως μικροσκοπικό επίπεδο, το μυοκάρδιο φάνηκαν φυσιολογικά με καλοδιατηρημένα καρδιομυοκύτταρα, ευρέως άνοιξε τριχοειδή λόγω της καθήλωσης αιμάτωσης και ομαλή συνδετικού ιστού στο διάμεσο. Δεν υπήρχαν σημάδια καρδιακής ατροφία ή διάμεση ίνωση. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από το συνολικό όγκο και τον αριθμό των καρδιομυοκυττάρων οποία δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ομάδων (Σχήμα 1). Στο μικροσκοπικό επίπεδο ηλεκτρονίου, οι δύο ομάδες έδειξαν αξιοσημείωτες διαφορές σε σχέση με τους μυοϊνιδίων και σαρκόπλασμα τους. Όπως απεικονίζεται με τις αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες και τα στερεολογικές δεδομένα, το κλάσμα όγκου των μυοϊνιδίων μειώθηκε σημαντικά ενώ το κλάσμα όγκου σαρκοπλασματικό ήταν σημαντικά αυξημένη σε TG (Σχήμα 2). Ο απόλυτος όγκος των σαρκόπλασμα ήταν σημαντικά αυξημένη, ενώ η μείωση του συνολικού όγκου myofibril απέτυχε να φθάσει στατιστική σημαντικότητα (p = 0,06), πιθανώς επειδή άλλοι παράγοντες, όπως ο όγκος των καρδιακών και αριστερής κοιλίας όγκο εισαγάγει μια υψηλότερη μεταβλητότητα στα δεδομένα. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην πυκνότητα των πυρηνικών και μιτοχονδριακών όγκος ή όγκος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, σε TG υψηλότερος αριθμός μεγαλύτερου μεγέθους λιπιδίων σταγονίδια στο σαρκόπλασμα που επισημάνθηκαν η οποία αντικατοπτρίζεται από έναν υψηλότερο συνολικό όγκο σταγονίδια λιπιδίων στην αριστερή κοιλία (Σχήμα 2). Αυτή η αύξηση σε σταγονίδια λιπιδίων, όμως, είναι πάρα πολύ χαμηλή για να εξηγήσει την αύξηση του συνολικού όγκου σαρκοπλασμικό.

ημίλεπτες διατομές (1 μm πάχος) βάφονται με τολουιδίνη μπλε δεν έδειξαν διαφορές στις διαστάσεις του καρδιομυοκύτταρα μεταξύ ελέγχου (Α) και ποντικούς που φέρουν όγκο (Β). Ωστόσο, η υποκυτταρική οργάνωση των καρδιομυοκυττάρων εμφανίστηκε λιγότερο πυκνά στην ομάδα όγκου. Παραφίνης διαμήκεις τομές (πάχους 5-7 μm) βάφτηκαν με Masson τριχρωματική-Goldner δεν προέβλεπε απόδειξη για μια ενισχυμένη απόθεση κολλαγόνου στους ποντικούς που φέρουν όγκο (D) σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (C). Κλίμακα bar για Α και Β = 10 μm. Κλίμακα bar για Γ και Δ = 20 μm.

Η

Electron μικρογραφίες του μυοκαρδίου από τον έλεγχο (A, C, E) και ποντικούς που φέρουν όγκο (Β, D, F). Α και Β καταδεικνύουν την την αύξηση του όγκου των σαρκόπλασμα και την απώλεια των μυϊκών ινών σε περισσότερο ή λιγότερο κατά μήκος τομές μυοκύτταρα. Κλίμακα bar = 5 μm. Γ και Δ δείχνουν σαφώς την αύξηση των λιπιδίων του σταγονιδίου (ld) το μέγεθος και τον αριθμό της ομάδας του όγκου σε διαγώνια τομή μυοκύτταρα. Κλίμακα bar = 1 μm. Ε και F δείχνουν νευρικών ινών που περιέχει τρεις άξονες (αστερίσκο) η κάθε μία. Δεν υπήρχαν εμφανείς διαφορές στη μορφολογία. Οι γειτονικές μυοκύτταρα είναι περισσότερο ή λιγότερο εγκάρσια κοπεί. Συντομογραφίες:. Cap = τριχοειδή, MF μυϊκές ίνες, mi = μιτοχόνδρια

Η

λιποτοξικότητος

Οι βιοχημικές αναλύσεις του περιεχομένου των τριγλυκεριδίων επιβεβαίωσε την αύξηση των λιπιδίων στο καρδιομυοκύτταρα. Μηλονοδιαλδεϋδης και άλλες δραστικές ουσίες θειοβαρβιτουρικού οξέος είναι πολύ δραστικές ενώσεις που χρησιμοποιούνται ως δείκτες για οξειδωτικό στρες. Χρησιμοποιώντας δύο δοκιμές για τη μέτρηση των ουσιών αυτών, δεν βρήκαμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ CG και TG (Πίνακας 5). Το τελικό σημείο της τοξικής δράσης των λιπιδίων στην καρδιά είναι καρδιομυοκυττάρων απόπτωση. Ωστόσο, η δραστηριότητα της κασπάσης δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων (Πίνακας 5). Επιπλέον, δεν βρήκαμε κανένα μορφολογικά στοιχεία για καρδιομυοκυττάρων απόπτωση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

Η

Συνολικό μήκος και τη μορφολογία του εμφράγματος νευραξόνων

Το σχήμα 3 δείχνει τη μορφολογία του εμφράγματος του νεύρωση και την στερεολογικές δεδομένα του χαρακτηρισμού νευράξονα. Το συνολικό μήκος των αξόνων ramifying μεταξύ των καρδιομυοκυττάρων μειώθηκε σε λιγότερο από το μισό σε TG σε σύγκριση με CG. Ωστόσο, η σχετική συχνότητα των νευρικών ινών με ένα συγκεκριμένο αριθμό των νευραξόνων δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων. Δεν υπήρχαν επίσης διαφορές στο μέγεθος των διαμέτρων των νευρικών ινών αν και υπήρξε μια τάση για ένα πιο συχνή εμφάνιση των νευραξόνων με μικρότερες διαμέτρους στα ποντίκια όγκου. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αριθμός των νευροπεπτιδίου αποθήκευση LDCV ανά προφίλ νευράξονα μειώθηκαν κατά περίπου 50% σε σύγκριση με το TG CG.

Ούτε ο όγκος των καρδιομυοκυττάρων (Α, ανοιχτοί κύκλοι), ούτε ο όγκος του διάμεσου χώρου (Α, μαύρα τετράγωνα) ήταν διαφορετική μεταξύ των ομάδων. Επιπλέον, ο αριθμός των καρδιομυοκυττάρων ήταν παρόμοια μεταξύ των ομάδων (Β). Ο όγκος του σαρκόπλασμα (C, μαύρα τετράγωνα) ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα όγκου, ενώ ο όγκος των μυοϊνιδίων (C, ανοικτοί κύκλοι) έτεινε να είναι μικρότερος. Μεγαλύτερος όγκος σταγονίδια λιπιδίων βρέθηκε στα καρδιομυοκύτταρα του όγκου που φέρει από ποντικών ελέγχου (D). Σημειώστε τη λογαριθμική κλίμακα στον γ-άξονα (D). Το συνολικό μήκος των αξόνων μειώθηκε περίπου στο ένα ήμισυ στην ομάδα όγκου (Ε), ενώ η σχετική συχνότητα των νευρικών ινών με έναν ορισμένο αριθμό αξόνων δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων (F). Ο αριθμός των LDVC ανά προφίλ νευράξονα μειώθηκε στην ομάδα όγκου (G), ενώ η διάμετρος των νευραξόνων ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες (Η). Κάθε κύκλος ή τετράγωνο αντιπροσωπεύει τα δεδομένα για ένα συγκεκριμένο ζώο. Οι οριζόντιες γραμμές αποδείξει η ομάδα σημαίνει.

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη εξέτασε την υπόθεση ότι η χρόνια έκθεση σε μεγάλο εξωκάρδιες όγκου προκαλεί δομικές και λειτουργικές μεταβολές της μυοκαρδιακής νεύρωσης σε ποντίκια. Η υπόθεση αυτή βασίζεται σε διάφορες εκθέσεις για λειτουργικές μεταβολές της καρδιάς σε ασθενείς που πάσχουν από μία ποικιλία μορφών καρκίνου [6] – [9] και η παρατήρηση της εκφυλιστικής δομικές βλάβες του καρδιομυοκύτταρα στην καρκινική καχεξία [2]. Σε συμφωνία με την υπόθεσή μας, παρατηρήσαμε μια έντονη μείωση του συνολικού μήκους των αξόνων που νευρώνουν αριστερής κοιλίας καρδιομυοκύτταρα και τον αριθμό των νευροπεπτιδίου αποθήκευση οργανιδίων, LDCV, σε αυτές τις νευράξονες. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια μείωση της myofibrillar όγκου αλλά αυξήθηκε σαρκόπλασμα και σταγονίδια λιπιδίων όγκο μέσα καρδιομυοκύτταρα. Οι δομικές αλλαγές συνοδεύονται από μειωμένα επίπεδα έκφρασης του NGF στην καρδιά και αστεροειδής γάγγλιο, μειωμένη έκφραση γαγγλιακό ΝΡΥ αλλά ενισχυμένη τυροσίνης υδροξυλάσης έκφραση.

Το μοντέλο ποντικού πνευμονικού καρκινώματος Lewis που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έχει καθιερωμένη για πολλά χρόνια [15] και είναι γνωστό ότι προκαλεί μια σημαντική καχεξία όγκου [16]. Σε αυτή τη μελέτη, ο χρόνος μεταξύ της εμφύτευσης των καρκινικών κυττάρων και τη θυσία των ζώων ήταν 21 ημέρες? η διάρκεια αυτή ήταν επαρκής για να προκαλέσει μια επιβάρυνση όγκου του 12-15% του συνολικού σωματικού βάρους και καχεκτικά συνθήκες που προσομοιώνουν την κλινική σενάριο της καχεξίας καρκίνου. Παρά τις μεταβολές στο βάρος σώματος οι καρδιές των TG ποντικοί είχαν παρόμοια υγρή μάζα με εκείνα του CG ποντικών που έρχεται σε αντίθεση με άλλες μελέτες χρησιμοποιώντας στερεούς όγκους [17]. Αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονται σε χαμηλότερο φορτίο όγκου, τη διάρκεια του πειράματος, το στέλεχος ή όγκου ποντικού κυτταρικό τύπο. Όπως συζητείται παρακάτω, τα αποτελέσματα δείχνουν στερεολογικές σαφώς ένα καταβολικό φαινότυπος των καρδιομυοκυττάρων αν και δεν εμφανίστηκε καρδιακή ατροφία με την έννοια της μειωμένης μάζας. Η λειτουργική απόδοση της καρδιάς αξιολογήθηκε με ηχοκαρδιογραφικών παραμέτρους υπό συνθήκες ηρεμίας. Συνολικά, η λειτουργία της καρδιάς δεν διέφερε μεταξύ CG και TG. Αυτό είναι σε αντίθεση με πρόσφατη μελέτη σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα του παχέος εντέρου-26 αδενοκαρκίνωμα από Tian και συνεργάτες [17] οι οποίοι ανέφεραν μία σημαντική μείωση στην κλασματική βράχυνση σε ποντικούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. Ωστόσο, η μελέτη τους έδειξε επίσης ένα διαφορετικό έμφραγμα μορφολογία συμπεριλαμβανομένων ίνωση και αποδιοργάνωση των μιτοχονδριακών ακρολοφίες που δεν παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Ως εκ τούτου, φαίνεται να υφίσταται γενικές διαφορές στα ζωικά μοντέλα μεταξύ τους και η μελέτη μας. Σύμφωνα με άλλες μελέτες με τη χρήση του καρκινώματος πνεύμονα Lewis [18], παρατηρήσαμε μια συστημική προ-φλεγμονώδη κατάσταση, όπως χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα στον ορό του IL-6 και TNF-α. Στην ανθρώπινη καρκινική καχεξία, μια ποικιλία επιπέδων κυτοκίνης είναι αυξημένα με ΤΝΡ-α είναι το κλειδί κυτοκίνης [19]. Η περίσσεια των κυτοκινών μπορεί να προέρχονται τόσο από τα καρκινικά κύτταρα και από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού που διεγείρονται από άμεση ή έμμεση σήματα του όγκου [19]. Προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, ιδιαίτερα του ΤΝΡ-α, είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με το νευρικό σύστημα και ως εκ τούτου μπορούν να επηρεάσουν νευρωνικό μεταβολισμό και την επιβίωση [20] – [22], ωστόσο, τα δεδομένα μας δεν παρέχουν μια σχέση αιτίου-αποτελέσματος μεταξύ της φλεγμονής και η νευρωνικό φαινότυπο και άλλες παθοφυσιολογικές εκδηλώσεις υπάρχουν στο μοντέλο καχεξία όγκου που μπορεί να επηρεάσουν το έμφραγμα νεύρωση (π.χ. απώλεια βάρους).

Τα βασικά ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι η μείωση της μυοκαρδιακής νεύρωσης και μια μείωση στο LDCV ανά προφίλ νευράξονας περίπου στο 50% των τιμών ελέγχου. Αυτά τα μορφολογικά δεδομένα είναι καλά υποστηρίζονται και συμπληρώνονται από την ανάλυση qRT-PCR που καταδεικνύει μια μειωμένη έκφραση του ΝΡΥ στους νευρώνες του γαγγλίου του stellate ενώ τα επίπεδα του mRNA της υδροξυλάσης της τυροσίνης ενισχυμένη σε TG. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του NGF μειώθηκαν στην καρδιά και αστεροειδής γάγγλιο. Η μείωση του συνολικού μήκους των αξόνων ramifying μεταξύ καρδιομυοκύτταρα είναι ενδεικτική της ατροφικής αλλαγές στο αυτόνομο νευρικό σύστημα της καρδιάς. Αυτό το νέο εύρημα επιβεβαιώνει την υπόθεσή μας και υποστηρίζει σθεναρά τη συμμετοχή του καρδιακού αυτόνομου νευρικού συστήματος στη νόσο του καρκίνου. Η μείωση του συνολικού μήκους των αξόνων μπορεί να προέρχονται i) από την απώλεια νευρώνων στο γάγγλιο, ii) από την απώλεια arborisation κάθε νευρώνα ή iii) από την απώλεια των επιμέρους μήκος άξονα. Η μελέτη μας δείχνει ότι η μείωση του συνολικού μήκους του νευράξονα οφείλεται κυρίως σε μια μείωση στην πυκνότητα των νευρικών ινών, όχι λόγω του μειωμένου αριθμού των νευραξόνων ανά νευρικών ινών. Ωστόσο, η μειωμένη πυκνότητα των νευρικών ινών παρατηρήθηκε σε όλη την κοιλία χωρίς μπαλώματα πλήρη απονεύρωση. Έτσι, το αποτέλεσμα μπορεί είτε να προέρχονται από μια εκφυλιστική διαδικασία που ξεκινά από την περιφέρεια των αξονικών κλάδων ή βασίζεται σε μια δομική ή /και μεταβολικές βλάβη του σώματος νευρικού κυττάρου. Μελέτες σε ομόζυγα ποντίκια με μηδενική μεταλλάξεις στο NGF ή το γονίδιο της κινάσης της τυροσίνης του υποδοχέα του NGF έχουν αποδείξει ότι η διατήρηση των νευρώνων και arborisation τους στο συμπαθητικό νευρικό σύστημα εξαρτάται από την προμήθεια με NGF από τους ιστούς-στόχους [23]. Η μειωμένη έκφραση του NGF στην καρδιά και αστεροειδής γάγγλιο καθιστά πολύ πιθανόν ότι η έλλειψη NGF παίζει έναν αιτιώδη ρόλο στη μείωση της μυοκαρδιακής νεύρωσης. Είναι ενδιαφέρον, υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι οι μεταβολικές λειτουργίες των νευρώνων διαταραχθεί όπως υποδεικνύεται από τη μείωση του αριθμού των LDCV και της μειωμένης έκφρασης ΝΡΥ mRNA. Σε αντίθεση με κατεχολαμινών που περιέχουν μικρά κυστίδια, αυτά LDCV περιέχουν νευροπεπτίδια τα οποία συντίθενται στο soma των νευρώνων και μεταφέρονται ορθόδρομα προς την περιφέρεια των νευραξόνων. Στην καρδιά, LDCV περιέχουν κυρίως NPY που έχει vasoconstrictory αποτελέσματα και εξυπηρετεί τροφικά τις λειτουργίες της καρδιομυοκύτταρα [24]. Προκαλεί την πρωτεϊνική σύνθεση καρδιομυοκυττάρων [25] και διεγείρει την υπερτροφία [26]. Η μείωση του ΝΡΥ περιέχουν LDCV μπορεί τουλάχιστον εν μέρει να είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη περιεκτικότητα του μυοϊνιδίων μέσα στα καρδιομυοκύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και το ΝΡΥ πιστεύεται ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην ανορεξία και την καχεξία που βασίζεται στην κεντρική μείωση του σε αυτές τις συνθήκες [16], οι μετρήσεις των επιπέδων πλάσματος ΝΡΥ σε ανθρώπους ασθενείς με καρκίνο και ελέγχου δεν αποκαλύπτουν τις διαφορές [27]. Παρ ‘όλα αυτά, εξακολουθεί να συζητείται το αν επηρεάζουν το σύστημα αυτό μπορεί να μετριάσει τον καρκίνο καχεξία [28]. Ο κύριος νευροδιαβιβαστής των συμπαθητικών νευρώνων (νοραδρεναλίνη) συντίθεται από τυροσίνη μέσω διαφόρων σταδίων που καταλύεται ενζυμικά. Το ένζυμο που περιορίζει την ταχύτητα, τυροσίνη υδροξυλάση, βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω στο γάγγλιο αστεροειδή σε TG που φαίνεται να είναι ένα αντι-ρυθμιστικός μηχανισμός στη μειωμένη νεύρωση του μυοκαρδίου. Η μείωση των υποκαταστημάτων άξονα στην αριστερή κοιλία μπορεί, επομένως, να αντισταθμίζεται από την αυξημένη παραγωγή κατεχολαμινών και ως εκ τούτου, μπορεί να εξηγήσει γιατί δεν είχαμε την ανίχνευση τυχόν λειτουργικές διαφορές υπό συνθήκες ηρεμίας. Από την άλλη πλευρά, μια εντελώς απονευρωμένο καρδιά παρουσιάζει μια πολύ σταθερή συχνότητα παλμού αλλά καμία λειτουργική βλάβη υπό υπόλοιπο [29], έτσι ώστε λειτουργικές αλλαγές που συνδέονται με την απώλεια ή διαταραχθεί εμφράγματος νεύρωση μπορεί μάλλον γίνουν εμφανείς υπό συνθήκες στρες ή με ανάλυση των ειδικών παραμέτρων όπως όπως η μεταβλητότητα του καρδιακού ρυθμού. Δυστυχώς, λόγω της πολυπλοκότητας του μοντέλου (ατροφία των καρδιακών, ατροφία των σκελετικών μυών, αναιμία) είναι σχεδόν αδύνατο να εκτελέσει μια δοκιμή καταπόνησης που θα κάνουν σαφή διάκριση μεταξύ των μεταβολών στην έμφραγμα νεύρωση και άλλα χαρακτηριστικά στοιχεία που εξωκάρδιες.

Η καρδιακών διαμέρισμα στα ποντίκια όγκου χαρακτηρίζεται κυρίως από τη μείωση των μυοϊνιδίων, και αύξηση των σαρκόπλασμα και λιπιδίων σταγονίδια. Έρευνες της παθολογίας του ανθρώπινου μυοκαρδίου, που λαμβάνεται από τις καρδιές των ασθενών που είχαν πεθάνει από καχεξία καρκίνου, είχαν καταδείξει μειωμένη επιφάνεια εγκάρσιας διατομής των καρδιομυοκυττάρων και μια αύξηση σε κόκκους λιποφουσκίνης [2], [3]. Εν μέρει λόγω των διαφορών ειδών, τα αποτελέσματα αυτά διαφέρουν από εκείνα που λαμβάνονται στην παρούσα μελέτη. Για παράδειγμα, σε αντίθεση με τον άνθρωπο, όπου ηλικία σχετίζεται με έναν αυξανόμενο όγκο λιποφουσκίνης, αυτό δεν συμβαίνει σε μεγάλο βαθμό σε ποντικού καρδιομυοκύτταρα, πιθανώς λόγω της μικρής διάρκειας ζωής των ποντικών. Η μειωμένη επιφάνεια εγκάρσιας διατομής των καρδιομυοκυττάρων όπως περιγράφεται από Burch et al. [2] είναι ενδεικτική της καρδιακής ατροφία. Ωστόσο, στο μοντέλο μας δεν παρατηρήθηκε μείωση στο συνολικό όγκο ή τον αριθμό των καρδιομυοκυττάρων. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου στις ανθρώπινες καρδιές, να η χρονική πορεία μεταξύ της νόσου αρχίζουν και ανάλυση (21 ημέρες σε ποντικούς έναντι μηνών ή ετών σε ανθρώπους) και φυσικά λόγω των διαφορών στην πολυπλοκότητα της νόσου (όχι μετάσταση στον ποντικό, μόνο ήπια καχεξία). Σε κουνέλια υποβλήθηκαν σε καχεξία του καρκίνου, δεν υπήρξαν αποπτωτικά καρδιομυοκύτταρα σε αντίθεση με άλλα όργανα όπου ένα μεγάλο μέρος των κυττάρων που υπέστησαν απόπτωση [30]. Στο υπερδομικό επίπεδο, ωστόσο, μια απώλεια των μυοϊνιδίων παρατηρήθηκε η οποία συνοδεύτηκε από αύξηση σαρκοπλασματικό όγκο. Η μείωση των μυοϊνιδίων είναι ενδεικτική μιας ανισορροπίας μεταξύ αποικοδόμησης των πρωτεϊνών και την σύνθεση που ευνοεί καταβολισμό των πρωτεϊνών [5]. Λόγω του όγκου των αμετάβλητη καρδιομυοκύτταρα οι αλλαγές στην myofibrillar /σαρκοπλασματικό όγκος δεν μπορεί να επαχθεί με κυτταρικά οίδημα. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση διαρθρωτικές ήταν η αύξηση σταγονίδια λιπιδίων η οποία επιβεβαιώθηκε από βιοχημικές μετρήσεις τριγλυκεριδίων. Σε καχεξία όγκου, τα λιπαρά οξέα απελευθερώνονται από το λιπώδη ιστό και συσσωρεύονται σε άλλους τύπους κυττάρων, όπου μπορούν να προκαλέσουν ανεπιθύμητες lipotoxic [31], [32]. Καρδιακές λιποτοξικότητος περιλαμβάνει την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου και την εμφάνιση των αποπτωτικών οδών [33]. Στην τρέχουσα ανάλυση, υπεροξείδωση λιπιδίων αξιολογήθηκε με μέτρηση μηλονοδιαλδεϋδης και συνδέονται ενώσεων, και η απόπτωση αξιολογήθηκε με δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης και μορφολογικές αξιολόγησης. Δεδομένου ότι καμία από αυτές τις παραμέτρους ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ TG και CG, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι παρατηρήσεις της μελέτης αυτής δεν έχουν σχέση με λιποτοξικότητος. Αν και η ακριβής λειτουργική σημασία των παρατηρούμενων υπερδομική μεταβολές των καρδιομυοκυττάρων παραμένει να διερευνηθεί, είναι πολύ πιθανό ότι αυτές οι αλλαγές είναι σε άμεση σχέση με την έλλειψη του τροφικού ερεθίσματος ΝΡΥ μέσω του υποδοχέα ΝΡΥ Υ5 [34] και μπορεί να γίνει λειτουργικά σχετικές εάν η μεταβολική ζήτηση της καρδιάς αυξάνεται. Λόγω της σχετικά μεγάλης καρδιακή πλαστικότητα οι αλλαγές αυτές μπορεί να μην οδηγήσει σε σημαντική βλάβη της καρδιακής λειτουργίας [35].

Εν περιλήψει, η μελέτη αυτή για πρώτη φορά καταδεικνύει ότι καρκινική καχεξία σχετίζεται με σημαντική δομικές αλλαγές του το αυτόνομο νεύρωση της καρδιάς, συμπεριλαμβανομένων τόσο βλάβη της δομικής ακεραιότητας του νευρώνα (μειωμένη συνολικού μήκους του νευράξονα) και απώλεια οργανιδίων. Ταυτόχρονα, η ποσότητα των λιπιδίων και ο αριθμός και ο όγκος των σταγονιδίων λιπιδίων αυξάνεται σε καρδιομυοκύτταρα και myofibrillar όγκος μειώθηκε, η οποία είναι σύμφωνη με την έννοια της συνεχούς τροφικής υποστήριξης καρδιομυοκυττάρων με αυτονόμου νευρώνες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο (GZ 66.010 /0085-II /10β /2009) εγκρίθηκε από την αυστριακή επιτροπή για τη δεοντολογία των πειραμάτων σε ζώα (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung)

.

Ζώα

Γυναίκα C57BL /6J ποντικοί διατηρήθηκαν σε τακτική κύκλο φωτός-σκότους (12 ώρες φως, 12 ώρες σκοτάδι) και διατηρείται σε μια τυπική δίαιτα εργαστηριακή τροφή (4,5% w /w λίπους). Τα ποντίκια που χρησιμοποιούνται για την έγχυση των κυττάρων όγκου καθώς και των ζώων ελέγχου ήταν 8-9 εβδομάδων. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων της πρόσληψης τροφής, καθώς και το σωματικό βάρος παρακολουθήθηκαν καθημερινά

Tumor εμφύτευση

Ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες:. Ελέγχουν μη-φέροντες όγκο ποντικούς (CG, n = 18) και ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Lewis (TG, n = 18). κύτταρα καρκινώματος διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια κυττάρων σε ϋΜΕΜ μέσο υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Στη συνέχεια, 2 × 10

6 κύτταρα LLC, που λαμβάνονται από ένα εκθετικά πολλαπλασιαζόμενα κυτταρικής καλλιέργειας, ενέθηκαν υποδορίως κάτω από το λαιμό του ζώου. Αδέλφια ποντίκια ενέθηκαν με PBS στο ίδιο μέρος για να χρησιμεύσουν ως μάρτυρες προσομοίωσης. Και τα δύο ποντίκια ελέγχου και φέρει όγκο θυσιάστηκαν μετά από 21 ημέρες. Σε ξεχωριστά σετ πειραμάτων, τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν (i) για ηχοκαρδιογραφία (n = 4 στην ομάδα όγκων, η = 5 στην ομάδα ελέγχου) και στερεολογία (η = 5 σε ομάδα όγκων, η = 6 στην ομάδα ελέγχου), (ii ) για τη μέτρηση της καρδιακής περιεκτικότητα σε λιπίδια, δράση της κασπάσης, υπεροξείδωση λιπιδίων και τα επίπεδα κυτοκίνης στον ορό (η = 6 σε κάθε ομάδα), και (iii) για τη μέτρηση του σώματος, της αριστερής κοιλίας και το βάρος του όγκου και για αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης της αριστερής κοιλίας και stellate γάγγλιο ( n = 6 σε κάθε ομάδα). Οι διαφορές στον αριθμό των ζώων που χρησιμοποιούνται για ηχοκαρδιογραφία και στερεολογία που προκαλείται από τον αποκλεισμό των ζώων που σταμάτησε να αναπνέει αυθόρμητα κατά τη διάρκεια της αναισθησίας (ηχοκαρδιογράφημα) ή ότι δεν ήταν κατάλληλα καθοριστεί από αγγειακή αιμάτωση (στερεολογία).

Ηχωκαρδιογραφία

2D καθοδηγείται ηχώ M-mode (30 MHz) ελήφθησαν από την θέα μικρών και μεγάλων άξονα στο επίπεδο του μεγαλύτερου LV-διαμέτρου χρησιμοποιώντας ένα VS-VEVO 770 Σύστημα υψηλής Ανάλυσης Imaging (Visualsonics, Τορόντο, Καναδάς) είναι εξοπλισμένα με 30 MHz RMV (Real time microvisualization) κεφαλή σάρωσης. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν ελαφρώς με 2% ισοφλουράνιο και αφέθηκαν να αναπνεύσουν αυθόρμητα. Το στήθος ξυρίστηκε, ακουστική γέλη σύζευξης εφαρμόστηκε, και ένα μαξιλάρι θέρμανσης χρησιμοποιήθηκε για τη διατήρηση νορμοθερμία. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν σε ένα ρηχό αριστερό πλάγια θέση κατάκλισης. Αριστερής κοιλίας τελοδιαστολική και τελοσυστολικός διαστάσεις μετρήθηκαν από το αρχικό ίχνη χρησιμοποιώντας τις κορυφαίες συμβάσεις άκρη της Αμερικανικής Εταιρείας Ηχωκαρδιογραφία. Η αριστερή κοιλιακή τοις εκατό κλασματική βράχυνση υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36].

TNF-α και IL-6 ELISA

Ελήφθησαν δείγματα αίματος από αναισθητοποιημένα ελέγχου και ποντίκια που φέρουν όγκο με οπισθοκογχική παρακέντηση. Ο ορός καταψύχθηκε στους -20 ° C. Τα επίπεδα ορού του ΤΝΡ-α και IL-6 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ΤΝΡ-α ELISA ReadySETGo (88 έως 7324, eBiosciences, San Diego, USA) και IL-6 ποντικού ELISA ReadySETGo (88-7064), eBiosciences, San Diego, USA) . Η πλάκα τελικά διαβάστηκε σε 450 nm.

τριγλυκεριδίων

μέτρηση

Τριγλυκερίδια εκχυλίστηκαν από καρδιακούς ιστούς του ελέγχου και ποντίκια που φέρουν όγκους χρησιμοποιώντας hexane:isopropanol και εστεροποιείται χρησιμοποιώντας 1% Triton-x διαλυμένο σε χλωροφόρμιο. Οι οργανικοί διαλύτες εξατμίστηκαν χρησιμοποιώντας Ν

2 αέριο και η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια μετρήθηκε με τη χρήση των τριγλυκεριδίων FS κιτ (Diasys, Γερμανία) σύμφωνα με το εγχειρίδιο του προμηθευτή. Τα επίπεδα τριγλυκεριδίων κανονικοποιήθηκαν προς το βάρος του ιστού.

Μέτρηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων και της δραστηριότητας κασπάσης

Για να αξιολογηθεί η παρουσία lipotoxic επιδράσεις στην καρδιομυοκύτταρα, υπεροξείδωση λιπιδίων προσδιορίστηκε με μέτρηση μηλονοδιαλδεϋδης και απόπτωση προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης.

ο καρδιακός ιστός πλύθηκε πλήρως με διάλυμα ηπαρίνης-PBS που περιέχει 1 mM EDTA και ομογενοποιείται σε 500 μΐ ρυθμιστικού ομογενοποίησης (0.25 Μ σακχαρόζη, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM δεφεροξαμίνη μεσυλικό , 1 mM PMSF) στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτείνης RC-DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) από το υπερκείμενο. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων μετρήθηκε στο υπερκείμενο χρησιμοποιώντας την Oxiselect MDA προϊόν προσθήκης κιτ ELISA (STA-332, Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) και TBARS ανάλυσης (STA-330, Cell Biolabs) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Για μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης 3/7, 15 έως 25 mg καρδιακού ιστού ομογενοποιήθηκαν σε 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης (25 mM Hepes ρΗ 7.5, 5 mM EGTA, 1 mM Pefabloc SC, 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [ν /ν ]) (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) στους 4 ° C. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η περιεκτικότητα πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη χρήση του DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). δραστικότητα Caspase προσδιορίστηκε με επώαση πρωτεΐνης 50 μg σε 100 μΙ της κασπάσης-Glo®3 /7 αντιδραστήριο (Promega, Madison, WI, USA) για 1,5 ώρες στους 20 ° C και η φωταύγεια προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Lumistar Optima BMG Labtec, Offenburg, Germany).

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από τις καρδιές και stellate γάγγλια του ελέγχου και οι ποντικοί που φέρουν όγκο (η = 6 το καθένα) με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen , Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα μικρογραμμάριο του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων εκκινητές αγοράστηκαν από MWG-Biotech (Ebersberg, Γερμανία) (Πίνακας 6). 18 s RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα πρότυπο 7900T Rea-ltime σύστημα PCR (Applied Biosystems) με τη χρήση πράσινου SYBR ως flurophore ανίχνευσης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σχετικά επίπεδα έκφρασης μετά από υπολογισμό με βάση το δέλτα του δέλτα C

μέθοδο T [37].

Η

καθήλωσης ιστών, τη δειγματοληψία και την επεξεργασία

Μετά το υπερηχοκαρδιογράφημα, ποντίκια ήταν αντιπηκτικό με 500 IE ip ηπαρίνη, αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο και θανατώνονται με αυχενική εξάρθρωση 3 λεπτά αργότερα. Η καρδιά στη συνέχεια αποκόπτεται, στερεώνεται σε μία συσκευή Langendorff, διαποτίστηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε ρυθμιστικό φωσφορικού ανάδρομα μέσω της αορτής για 10 λεπτά και διατηρήθηκε σε παραφορμαλδεΰδη στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία.