Abstract

υπερεκφράζεται CEACAM6 σε ιστούς όγκων παίζει σημαντικούς ρόλους σε εισβολή, μετάσταση και αντίσταση anoikis σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Εμείς ανέφερε πρόσφατα ότι η έκφραση CEACAM6 ρυθμίζεται αυξητικά στο γαστρικό καρκίνο (GC) σε ιστούς και προωθείται μετάσταση GC. Εδώ, αναφέρουμε ότι CEACAM6 προωθεί περιτοναϊκή μεταστάσεις

στο

vivo

και συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση Ε-καδερίνης σε ιστούς GC. Υπερεκφράζεται CEACAM6 επαγόμενη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε GC, όπως μετρήθηκε από τις αυξήσεις των δεικτών ΕΜΤ Ν-cadherin, βιμεντίνη και Slug ενώ η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε σε κύτταρα GC CEACAM6 υπερεκφράζουν? αντιτιθέμενα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα CEACAM6-σιγήσει. Επιπλέον, η έκφραση Ε-καδερίνης σχετίστηκε αρνητικά με το βάθος διείσδυσης του καρκίνου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες και το στάδιο TNM σε ιστούς GC. Επιπλέον, CEACAM6 ανυψωμένη μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) δραστικότητα σε GC, και αντίσωμα αντι-ΜΜΡ-9 θα μπορούσε να αντιστρέψει την αυξανόμενη εισβολή και τη μετανάστευση που προκαλείται από CEACAM6. CEACAM6 αύξησε επίσης τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ, η οποία εμπλέκεται στην εξέλιξη μιας ποικιλίας ανθρώπινων όγκων. Παρατηρήσαμε επίσης ότι LY294002, ένας αναστολέας ΡΙ3Κ, θα μπορούσε να αντιστρέψει CEACAM6 επαγόμενη EMT μέσω μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι CEACAM6 ενισχύει την εισβολή και τη μετάσταση στο GC με την προώθηση της EMT μέσω της οδού σηματοδότησης PI3K /AKT

Παράθεση:. Zang Μ, Ζανγκ Β, Zhang Υ, Li J, Su L, Zhu Ζ, κ.ά. . (2014) CEACAM6 Προωθεί γαστρικός καρκίνος Εισβολή και Μετάσταση επάγοντας Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση μέσω του PI3K /AKT μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10.1371 /journal.pone.0112908

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 7 Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 16 Οκτ 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Νοεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Zang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81172324, Αρ 91229106, Αρ 81272749 και Νο 81372231), και βασικό έργο της επιτροπής της Σαγκάης Παιδείας (Αρ 12ZZ105 και No.12ZZ102) και Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (Νο 13ZR1425600). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

GC είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους και ένα μείζον θέμα για την υγεία σε όλο τον κόσμο, ιδιαίτερα σε χώρες της Ανατολικής Ασίας, όπως η Ιαπωνία, η Κορέα, η Κίνα, όπου είναι η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1] – [3]. Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο που σχετίζονται με μορίου προσκόλλησης κυττάρου 6 (CEACAM6) είναι ένα γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) μέλους υπεροικογένειας ανοσοσφαιρινών -δεσμευμένα που υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, ειδικά γαστρεντερικούς καρκίνους [4], και λειτουργεί ως μόριο ενδοκυτταρικής συγκολλήσεως [4] – [6]. Παρά το γεγονός ότι CEACAM6 είναι μια GPI-αγκυροβολημένα κυτταρικής επιφάνειας γλυκοπρωτεΐνη στερείται διαμεμβρανική ή ενδοκυτταρική περιοχή, αλλά είναι σε θέση να επηρεάσει ενδοκυτταρική σηματοδότηση γεγονότων και παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του γαστρεντερικού [4], [6] – [8]. GPI-αγκυροβολημένα μόρια συχνά συν-εντοπισμένη σε μικρές μικροεπικράτειες μεμβράνη στην μεμβράνη του πλάσματος [9], η οποία μπορεί να ενεργοποιήσει κατάντη καταρρακτών σηματοδότησης, όπως η ιντεγκρίνη μονοπάτι σηματοδότησης [10]. CEACAM6 δρα ως ένα ογκογονίδιο σε όγκους και προάγει εισβολή καρκίνου, μετάσταση, την αντίσταση anoikis και χημειοαντίσταση, και αναστέλλει τη διαφοροποίηση [7], [8], [11]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά CEACAM6 και σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα σε ιστούς GC [12]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί μέσω των οποίων οι επιρροές CEACAM6 ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος σε GC απομένουν να καθοριστούν.

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) δεν είναι μόνο μια φυσιολογική διαδικασία κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη ή την αναγέννηση των ιστών, αλλά επίσης μια παθολογική στοιχείο σε εξέλιξης του καρκίνου, με τη συμμετοχή μετάσταση όγκου, απόπτωση και αντίσταση γήρανση [13] – [15]. EMT υποδεικνύει πάντοτε μία φτωχή κλινική πρόγνωση σε ανθρώπινους καρκίνους. Ένας αριθμός μηχανισμών που σχετίζονται με την έναρξη EMT έχουν τεκμηριωθεί, συμπεριλαμβανομένου του ΤΟΡ-β, IL-6, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, RAF /ΜΑΡΚ, και μονοπάτια SRC [15] – [18]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, παρατηρήσαμε CEACAM6 που προκαλείται από την ενεργοποίηση SRC στα κύτταρα GC [12], και παρατηρείται αύξηση του αριθμού των ατρακτοειδή κύτταρα CEACAM6-υπερεκφράζουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ως εκ τούτου, ήμασταν πολύ ενδιαφέρονται για τον καθορισμό της σχέσης μεταξύ CEACAM6 και EMT στα κύτταρα GC. Αν και αρνητική συσχέτιση μεταξύ CEACAM6 και EMT έχει καταγραφεί σε παγκρεατικά καρκινώματα [19], οι μηχανισμοί με τους οποίους CEACAM6 ρυθμίζει EMT είναι ελάχιστα κατανοητή.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις και τις πιθανές πορείες της CEACAM6 στο GC εισβολή και τη μετάσταση, και διερευνάται ο συσχετισμός της με EMT.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση στη μελέτη έχει ληφθεί από όλους τους συμμετέχοντες. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Ruijin Νοσοκομείο, Σαγκάη Jiao Tong University School of Medicine. πειραμάτων σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών ζώων Φροντίδα και Χρήση (IACUC) στο Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Κίνα.

Οι κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

Το ανθρώπινο κυτταρικές σειρές GC SGC-7901, ΜΚΝ-45 και ΜΚΝ-28 αγοράστηκαν από την Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 και κορεσμό υγρασίας σε RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου.

γαστρικού όγκου και των παρακείμενων μη οιδηματώδης ιστού ελήφθησαν από 93 ασθενείς με GC που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική επέμβαση στη Σαγκάη Jiaotong Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Συγγενείς Ruijin Νοσοκομείο από το 2010 έως το 2013. Οι ασθενείς αποτελούνταν από 69 άνδρες και 24 γυναίκες με μέση ηλικία 62,1 χρόνια (εύρος, 30-85 ετών). Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα συλλέχθηκαν και παθολογική σταδιοποίηση όγκου προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ταξινόμηση UICC ΤΝΜ. Η ιστολογική πληκτρολόγηση πραγματοποιήθηκε από τουλάχιστον δύο παθολόγους εμπειρογνωμόνων που εργάζονται ανεξάρτητα σε ένα διπλό-τυφλό τρόπο. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Σαγκάης Ruijin Νοσοκομείο, και όλοι οι ασθενείς ενημερώνονται πλήρως για τις πειραματικές διαδικασίες.

Vector κατασκευή και επιμόλυνση

Ολόσωμη CEACAM6 cDNA ελήφθη με RT- PCR από ολικό RNA που εκχυλίζεται από δείγματα GC. Οι αλληλουχίες εκκινητή ήταν 5′-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3’ (αντίστροφο). Μαζευτήκαμε μια pIRES2-eGFP-CEACAM6 κατασκευή εισάγοντας CEACAM6 cDNA σε φορέα pIRES2-eGFP. Είμαστε δίπλα επιμολυσμένα pIRES2-eGFP-CEACAM6 ή φορέα pIRES2-eGFP σε SGC-7901 και ΜΚΝ-45 κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με συνεχή θεραπεία με G418 (1.2 mg /ml? Gibco, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ)

φορέα λεντοϊού κατασκευή

Με βάση τα δεδομένα ανθρώπινο γονίδιο CEACAM6, ένα ζευγάρι ολιγονουκλεοτιδικών αλληλουχιών. και αρνητικού αλληλουχίες ελέγχου σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Σαγκάη Novobio Scientific Co., Ltd. shRNA αλληλουχίες ήταν ως εξής: CEACAM6, 5′-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3′ (αντίστροφο)? ελέγχου, 5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 ‘(προς τα εμπρός), και 5′-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’ (αντίστροφο). CEACAM6 shRNA υποκλωνοποιήθηκε σε PL /shRNA /F φορέα λεντοϊού να ληφθεί ένα PL /shRNA /SHR-CEACAM6 κατασκεύασμα. Στη συνέχεια, PL /shRNA /SHR-CEACAM6 ή ελέγχουν φορείς λεντοϊών επιμολύνθηκαν σε ΜΚΝ 28 κύτταρα GC. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με επεξεργασία με 5 μg /ml βλαστισιδίνη και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό και την περαιτέρω έρευνα.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (Solarbio, Beijing, China ) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης PMSF 1%. Ένα κιτ δοκιμασίας BCA (Pierce, Rockford, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, και οι επιλυθεί πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Πρωτογενή αντισώματα ήταν ως εξής: CEACAM6 (1:500? Abcam, USA), Ε-καδερίνης (1:500? Cell Signaling Technology (CST), USA), Ν-cadherin (1:500? CST, USA), βιμεντίνη ( 1:1000? CST, USA), Slug (1:500? CST, USA), π-ΑΚΤ (Ser473) (1:1000? CST, USA), η συνολική ΑΚΤ (1:1000? CST, USA) και GAPDH ( 1:10000? Abcam, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

χρώση ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες για 24 ώρες και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 για 20 λεπτά και αποκλείστηκαν με 5% BSA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Εμείς επόμενη χρώση των κυττάρων με αντίσωμα CEACAM6 (1:50? Abcam) στους 37 ° C για 2 ώρες, που ακολουθείται από επώαση με δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. αντισώματος ροδαμίνης phalloidin (1:150? Κυτταροσκελετού) χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τον κυτταρικό σκελετό των κυττάρων GC. Διαφάνειες αναλύθηκαν και απεικονίστηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τμήματα μm πάχους 4 κόπηκαν από τεμάχια ιστού εμπεδωθεί με παραφίνη και στη συνέχεια αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Ανοσοϊστοχημική χρώση τομών διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο ϋΑΚΟ, χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-CEACAM6 (1:100? Abcam) και Ε-καδερίνης (1:100? CST) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με HRP-σημασμένο δευτερογενές αντίσωμα και οπτικοποιήθηκαν με διαμινοβενζιδίνη. Δύο παθολόγους που αγνοούσαν όλα τα δεδομένα του ασθενούς αξιολογείται ανεξάρτητα και σημείωσε τα τμήματα. βαθμολογία βαθμολογία = θετική κυτταρική ανοσοϊστοχημεία λεκέ + χρώση βαθμολογίας ένταση. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) και 4 (& gt? 75%). Η ανοσοϊστοχημική χρώση ένταση βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής χρώση), 2 (καφέ χρώση), και 3 (σκούρο καφέ χρώση). Συνολική βαθμολογία της ≥3 ορίστηκαν ως θετικός για την απλοποίηση ανάλυση των δεδομένων. Για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ CEACAM6 και της έκφρασης Ε-καδερίνης, Image-Pro Plus έκδοση 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του CEACAM6 και Ε-καδερίνης σε 20 δείγματα.

ζελατίνη zymography

Για να εξεταστεί δραστικότητα ΜΜΡ-9, ζυμογραφία πραγματοποιήθηκε με χρήση 10% πηκτών SDS-PAGE που περιείχε 1 mg /ml ζελατίνη (Sigma). Εν συντομία, τα κύτταρα GC καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες και το υπερκείμενο στη συνέχεια συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Οι γέλες πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα αναδιάταξης (2,5% Triton Χ-100) για 30 λεπτά κάθε φορά για να απομακρυνθεί SDS μετά από ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). Εμείς επόμενη βάφονται τα πηκτώματα με 0.5% Coomassie brilliant blue R-250 για 2 ώρες και αποχρωματίζονται των πηκτωμάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα (30% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ). Διαφανές λωρίδες στο φόντο του μπλε χρώση αντιπροσώπευαν τις δραστηριότητες ζελατινάσης.

Δοκιμασίες

Η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

Για προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής, συνολικά 1 × 10

5 κύτταρα αιωρούνται σε RPMI-1640 χωρίς ορό με ή χωρίς ΜΜΡ-9 αντίσωμα (Abcam, 2 μg /200 υΐ) και τοποθετήθηκαν σε επικοινωνούντα δοχεία (8 μm για πλάκα 24 φρεατίων? Corning Costar, ΝΥ, USA) με ή χωρίς Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για αμφότερους τους προσδιορισμούς, μέσο που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Τέλος, τα κύτταρα στον κατώτερο θάλαμο φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού

Four-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c γυμνά ποντίκια (Ινστιτούτο Ζωολογίας, Κίνα Ακαδημία επιστήμες) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί ο ρόλος της CEACAM6 στην περιτοναϊκή διασπορά

στο

vivo

. Γυμνά ποντίκια στεγάστηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-ελεύθερο περιβάλλον στο Εργαστήριο Ζωικής Μονάδας, της Ιατρικής Σχολής, Shanghai Jiao Tong University, την Κίνα. Ποντίκια έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα και τα πρωτόκολλα μελέτης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Κίνα. Ένα σύνολο των 2 × 10

6 SGC-7901-CEACAM6 ή κύτταρα SGC-7901-NC εγχύθηκαν σε πέντε ποντίκια κοιλιακή κοιλότητα της κάθε ομάδας (τυχαιοποίηση). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την 30η ημέρα μετά την ένεση, και οι κοιλιακοί μάζες απεικονίστηκαν και φωτογραφήθηκαν. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις επίσημες συστάσεις της κινεζικής κοινότητας των ζώων.

Στατιστικά

Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τα στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων . Οι συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης Ε-καδερίνης σε ιστούς GC και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και έκφραση CEACAM6 αναλύθηκαν με chi-square ή ακριβής δοκιμές του Fisher ή Pearson ανάλυση συντελεστή συσχέτισης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

P

& lt? 0,05 και

P

& lt?. 0.01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και άκρως σημαντική, αντίστοιχα

Αποτελέσματα

CEACAM6 επηρεάζει κυτταρική μορφολογία και η κυτταροσκελετού

προηγούμενα αποτελέσματα μας άφησε να εννοηθεί ότι τα κύτταρα ΜΚΝ-28 GC εγγενώς εκφράζουν υψηλά επίπεδα CEACAM6, ενώ SGC-7901 και ΜΚΝ-45 GC κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα [12]. Η υπερέκφραση του CEACAM6 στη ΓΓΕ-7901 και ΜΚΝ-45 κύτταρα GC και εξασθένηση της έκφρασης CEACAM6 στα κύτταρα ΜΚΝ-28 GC με PL /shRNA /SHR-CEACAM6 φορείς λεντοϊών επιβεβαιώθηκαν στο πρωτεϊνικό επίπεδο με ανάλυση Western Blot (Εικ. 1Α). δοκιμασίες ανοσοφθορισμού πάντα έδειξε ότι τα κύτταρα SGC-7901-CEACAM6 εκφράζεται περισσότερο CEACAM6 πρωτεΐνη από SGC-7901-NC κύτταρα (Εικ. 1Β).

(Α) Σταθερό υπερέκφραση και την καταστολή των CEACAM6 στα κύτταρα GC. έκφρασης (Β) CEACAM6 αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό και πιο έκφραση CEACAM6 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν CEACAM6-από ότι στα κύτταρα ελέγχου (200 Χ). Μπλε: DAPI? κόκκινο: CEACAM6. (Γ) Η υπερέκφραση του CEACAM6 στη ΓΓΕ-7901 και ΜΚΝ-45 κυττάρων που προκαλείται από ένα μεσεγχυματικά μορφολογία, ενώ νοκ ντάουν της CEACAM6 σε ΜΚΝ 28-κυττάρων που προκαλείται από μια επιθηλιακών μορφολογία (200 ×). (D) Ανοσοκηλίδωση των F-ακτίνης σε κύτταρα CEACAM6 υπερεκφράζουν και κύτταρα ελέγχου (400 Χ). Κόκκινο: F-ακτίνης? μπλε:. DAPI

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, η μορφολογία των κυττάρων άλλαξε, μετά CEACAM6 εξασθένηση και υπερέκφραση. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, SGC-7901-CEACAM6 και ΜΚΝ-45-CEACAM6 κύτταρα παρουσίασαν περισσότερο μεσεγχυματικά-όπως μορφολογία, και ήταν ατρακτοειδή και ατρακτοειδές σχήμα (Σχ. 1 C). Αντιστρόφως, οι τυπικές μετάβαση από μεσεγχυματικά σε επιθηλιακό μορφολογία ανιχνεύθηκε σε ΜΚΝ-28-sh κυττάρων σε σύγκριση με ΜΚΝ-28-NC κύτταρα (Σχ. 1 C). Ωστόσο, δεν ήταν σαφές αν η υπερέκφραση CEACAM6 είχε επίδραση επί του κυτταροσκελετού, έτσι ανοσοφθορισμού χρώση χρώσης F-ακτίνη διεξήχθη. Είναι ενδιαφέρον ότι, μεγαλύτερου μεγέθους ατρακτοειδές σχήμα κύτταρα παρατηρήθηκαν για ΜΚΝ-45-CEACAM6 και SGC-7901-CEACAM6 γραμμές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 1D).

CEACAM6 συνδέεται αρνητικά με Ε-καδερίνης σε ιστοί GC

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης σε καρκινικούς ιστούς και αντιστοιχισμένο παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξαν έκφραση Ε-καδερίνης ήταν χαμηλότερη σε καρκινικούς ιστούς από ότι σε παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς, και αποκάλυψε ότι Ε-καδερίνης βρίσκεται κυρίως στην cytomembrane των επιθηλιακών κυττάρων (Σχ. 2D, E, F). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η σχέση μεταξύ της έκφρασης Ε-καδερίνης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά του GC, και διαπίστωσε ότι μειωτικά E-cadherin συνδέθηκε με το βάθος της εισβολής (

P

= 0,046), μετάσταση λεμφαδένα (

P

= 0.013), και το στάδιο ΤΝΜ (

P

= 0.035), αλλά όχι με άλλους παράγοντες που περιλαμβάνουν κλινικοπαθολογοανατομικές φύλο, την ηλικία, ή την διαφοροποίηση (Πίνακας 1). Επιπλέον, CEACAM6 σχετίστηκε αρνητικά με EMT σε παγκρεατικά καρκινώματα [19] και την καταστολή CEACAM6 θα μπορούσαν να αυξήσουν δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [20].

(α) αρνητική έκφραση CEACAM6 σε μη-όγκου γαστρικού βλεννογόνου. (Β, C) Θετική ή αρνητική έκφραση CEACAM6 σε δείγματα GC. (D) Ισχυρή θετική έκφραση Ε-καδερίνης σε μη νεοπλασματικής γαστρικού βλεννογόνου. (Ε, F) αρνητικά ή θετικά την έκφραση Ε-καδερίνης σε δείγματα GC. (G) αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CEACAM6 και E-cadherin ανιχνεύθηκε σε ιστούς GC (R = -0,636,

P

& lt? 0,01). (200 ×)

Η

Επιπλέον, διερευνήθηκε η συσχέτιση μεταξύ της E-cadherin και την έκφραση CEACAM6 σε GCs με σειριακό τμήμα ανοσοϊστοχημεία (20 δείγματα). έκφραση CEACAM6 σε ιστούς όγκων ήταν μεγαλύτερη από ότι σε συμφωνημένα μη ογκογόνους ιστούς (Σχ. 2Α, Β, C), σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα μας [12]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η έκφραση CEACAM6 σχετίστηκε αρνητικά με Ε-καδερίνης έκφραση σε ιστούς GC από Pearson ανάλυση συντελεστή συσχέτισης (

P

& lt? 0,01? Σχ. 2G).

CEACAM6 επάγει EMT σε κύτταρα GC

ΕΜΤ-συναφείς πρωτείνες σε κύτταρα GC αξιολογήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. Παρατηρήσαμε ότι το Ν-cadherin, βιμεντίνη και τα επίπεδα πρωτεΐνης Slug αυξήθηκαν, ενώ Ε-καδερίνης μειώθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν CEACAM6 σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3Α, Β). Converse αποτελέσματα προέκυψαν μετά CEACAM6 χτυπήθηκε κάτω στο ΜΚΝ-28 κύτταρα (Σχ. 3C, D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ένα λειτουργικό ρόλο για CEACAM6 στη ρύθμιση ΕΜΤ σε κύτταρα GC. Επιπλέον, αυτές οι παρατηρήσεις σε κύτταρα GC ήταν παρόμοια με τα ευρήματα σε ιστό GC.

(A, C) Τα επίπεδα πρωτεΐνης των δεικτών ΕΜΤ προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western σε GC κυττάρων με CEACAM6 υπερέκφραση ή knockdown. (Β, D) σχετική έκφραση δείκτη EMT σε CEACAM6 υπερεκφράζουν και -silenced κύτταρα GC υπολογίστηκαν από την αναλογία της κλίμακας του γκρι. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα στα γραφήματα bar. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

CEACAM6 εξυψώνει τη δραστηριότητα των MMP-9 σε κύτταρα GC

είναι γνωστό ότι η προσκόλληση, η υποβάθμιση και η μετανάστευση αποτελούν σημαντικά ζητήματα στη μετάσταση του καρκίνου. Η ζελατίνη ζυμογραφία διεξήχθη για να εξετασθούν τα αποτελέσματα του CEACAM6 επί της δραστικότητας του ΜΜΡ-9, το οποίο είναι σημαντικό στην αποικοδόμηση ECM. δραστικότητα ΜΜΡ-9 σε SGC-7901-CEACAM6 και τα κύτταρα ΜΚΝ-45-CEACAM6 ήταν αυξημένη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου τους (Σχ. 4Α, Β). Στην συνέχεια διερευνήσαμε εάν η αυξημένη δραστικότητα του ΜΜΡ-9 που προκαλείται από CEACAM6 σε κύτταρα GC είχε ως αποτέλεσμα μια πραγματική αύξηση του αριθμού των εισβάλλοντας και μεταναστεύουν κύτταρα. Εξετάσαμε έτσι τη συμβολή του ενεργού αντισώματος αντι-ΜΜΡ-9 ή PBS σε κύτταρα GC CEACAM6 υπερεκφράζουν. Όπως ήταν αναμενόμενο, υπήρξαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό των εισβάλλοντας και μεταναστεύουν κύτταρα σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα σε σύγκριση με PBS-κατεργασμένα κύτταρα (

P

& lt? 0,01? Σχ. 4C, D, E, F).

(Α) Το υπερκείμενο των κυττάρων GC συλλέχθηκε μετά από 24 ώρες. Στη συνέχεια, η δραστικότητα ΜΜΡ-9 εξετάστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης. (Β) σχετική έκφραση ΜΜΡ-9 σε κύτταρα GC. δοκιμασίας (C, E) Transwell. Εικόνες δείχνουν κύτταρα που είχαν ταξιδέψει μέσω της μεμβράνης μικροσκοπικούς πόρους, με ή χωρίς matrigel (200 ×). (D, F) Ιστογράμματα έδειξε τον αριθμό των μεταναστευτικών κυττάρων και εισβάλλοντας κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα στα γραφήματα bar. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

CEACAM6 απορυθμίζει φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ στα κύτταρα GC

Εμείς προηγουμένως παρατηρηθεί ότι η δραστηριότητα SRC προκλήθηκε από CEACAM6 στα κύτταρα GC SGC-7901. AKT είναι μεταγενέστερος πρωτεΐνη του SRC και δραματικά σχετίζεται με EMT, εισβολή και μετάσταση στην εξέλιξη των όγκων. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκαν δραστηριότητα ΑΚΤ στα κύτταρα GC CEACAM6 υπερεκφράζουν. Κηλίδωση Western έδειξε ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ στην σερίνη 473 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα GC CEACAM6 υπερεκφράζουν σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Σχ. 5Α, Β). Για να εξεταστεί αν οι αλλαγές ΕΜΤ προκλήθηκαν με CEACAM6 μέσω της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, SGC-7901-CEACAM6 και ΜΚΝ-45-CEACAM6 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ LY294002 για 24 ώρες. Είναι ενδιαφέρον ότι, η Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη και Ν-καδερίνης μειώθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν CEACAM6-LY294002 αγωγή σε σχέση με τους ελέγχους, όπως μετρήθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 5C, D).

(Α) Western η ανάλυση στυπώματος έδειξε ότι η υπερέκφραση του CEACAM6 αυξήθηκε-ΑΚΤ p (Ser473) φωσφορυλίωση. GAPDH και συνολική ΑΚΤ χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης. (Β) Η ποσοτικοποίηση των π-ΑΚΤ (Ser473) έκφραση σε κύτταρα GC. έκφραση (Γ) Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη ενώ η έκφραση Ν-καδερίνης μειώθηκε σε κύτταρα GC CEACAM6 υπερεκφράζουν αγωγή με LY294002, ένας αναστολέας της ΡΙ3Κ. (D) Σχετική Ε-καδερίνης και της έκφρασης Ν-καδερίνης σε CEACAM6 υπερεκφράζουν και LY294002 επεξεργασμένα GC κύτταρα υπολογίστηκε με αναλογία της κλίμακας του γκρι. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα στα γραφήματα bar. *

P

& lt?. 0.05

Η

CEACAM6 προωθεί την περιτοναϊκή διασπορά in vivo

Τέλος, εξετάσαμε τις επιδράσεις της CEACAM6 υπερέκφραση για τη διάδοση και την περιτοναϊκή μετάσταση

σε

vivo

. Εμείς ένεση SGC-7901-CEACAM6 και SGC-7901-NC κύτταρα στις κοιλίες των άτριχων ποντικών. Εκτεταμένες περιτοναϊκή διασπορά παρατηρήθηκε στην ομάδα SGC-7901-CEACAM6 σε σύγκριση με την ομάδα SGC-7901-NC (Σχ. 6Α). Υπήρχαν σημαντικά πιο ορατή περιτοναϊκή οζίδια στην ομάδα SGC-7901-CEACAM6 από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (5.400 ± 0.510

vs

1.400 ± 0.245,

P

& lt?. 0.01? Σχ. 6Β ). Επιπλέον, η υπερέκφραση του CEACAM6 ενίσχυση της μετάστασης

στο

vivo

έχει επίσης αναφερθεί σε καρκίνο του παγκρέατος [19].

(Α) Αύξηση του αριθμού των μεταστατικών οζιδίων παρατηρήθηκαν στην ομάδα SGC-7901-CEACAM6 από την ομάδα ελέγχου, όπως υποδεικνύεται από τα μαύρα βέλη. (Β) Μέσος αριθμός περιτοναϊκή οζίδια σε δύο ομάδες. Περισσότερα οζίδια συνέβη στην ομάδα SGC-7901-CEACAM6 από την ομάδα SGC-7901-NC.

Η

Συζήτηση

GC είναι η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1] . Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι CEACAM6 παίζει σημαντικό ρόλο στο γαστρεντερικό καρκίνο εξέλιξης [7], [20] – [22], και CEACAM6 είναι πιο ευρέως διαδεδομένο από CEA (CEACAM5) σε φυσιολογικούς ιστούς, με σημαντική έκφραση σε πολλές επιθήλια [4]. CEACAM6 επιρροές ενδοκυτταρικά συμβάντα σηματοδότησης μέσω ομόφιλη και ετερόφυλα πρόσφυση με άλλα CEACAMs ή ιντεγκρίνες [23], [24]. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει τις συνεισφορές των GPI-αγκυροβολημένα πρωτεΐνη CEACAM6 σε εξέλιξη GC.

Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι η μορφολογία των κυττάρων και τη δομή του κυτταροσκελετού μεταβλήθηκε από σταθερή ανοδική ρύθμιση και αρνητική ρύθμιση CEACAM6 στα κύτταρα GC. κύτταρα CEACAM6 υπερεκφράζουν ήταν περισσότερο μεσεγχυματικά-όπως και επέδειξε μία άτρακτο και ατρακτοειδές σχήμα, και περισσότερες ίνες ακτίνης στρες ανιχνεύθηκαν σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, σε μια διαδικασία που ορίζεται ως EMT. Ο φαινότυπος μεσεγχυματικά κύτταρα προικίζει με περισσότερα μεταναστευτικά και επεμβατική ιδιότητες [15]. Αυτή η παρατήρηση ήταν σύμφωνη με το

στο

vivo

αποτελέσματα σύμφωνα με την οποία CEACAM6 που προκαλείται εξαπλώνεται σε άτριχα ποντίκια εκτεταμένη περιτοναϊκή. ΚΟΑ παρατηρήθηκε μετά αποσιώπηση των CEACAM6 στα κύτταρα GC. Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι CEACAM6 μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή ΕΜΤ σε GC. Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ CEACAM6 και Ε-καδερίνης, ενός δείκτη της EMT, σε ιστούς GC με ανοσοϊστοχημική χρώση. Όπως αναμενόταν, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ CEACAM6 και Ε-καδερίνης, και η έκφραση Ε-καδερίνης συνδέθηκε με το βάθος διείσδυσης του καρκίνου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες και το στάδιο TNM σε ιστούς GC. Επιπλέον, CEACAM6 προωθείται μετάσταση στους λεμφαδένες (

P

= 0.001) σε 98 ιστούς GC σε προηγούμενη μελέτη μας [12]. Προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι CEACAM6 εξασθένηση αυξημένη δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [20]. Με βάση τα προαναφερθέντα ευρήματα, έχουμε δεδομένο ότι CEACAM6 προωθείται GC εισβολή και τη μετάσταση με την πρόκληση EMT και μπορεί να χρησιμεύσει ως μεσεγχυματικά δείκτη.

Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο, αλλά ήταν δύσκολο να μελετηθεί, διότι περιλαμβάνει μια σειρά από σπάνια, στοχαστικές εκδηλώσεις. Ένας αριθμός δυνητικών μονοπατιών σηματοδότησης που σχετίζονται με τη μετάσταση καρκίνου έχουν απεικονισθεί, συμπεριλαμβανομένης της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, ΡΑΚ-SRC, JAK /STAT, NF-KΒ, και τα μονοπάτια MMPs [25] – [27]. Σε αυτή τη μελέτη, η υπερέκφραση του CEACAM6 αυξημένα δραστικότητα ΜΜΡ-9, και αντίσωμα αντι-ΜΜΡ-9 θα μπορούσε να αντιστρέψει τις αυξανόμενες επεμβατική και μεταναστευτικών ιδιοτήτων που προκαλείται από CEACAM6. EMT μύηση συσχετίστηκε σημαντικά με τη μετάσταση καρκίνου, και επάγει ιδιότητες βλαστοκυττάρων, προλαμβάνει την απόπτωση και γήρανση, και συμβάλλει στην ανοσοκαταστολή σε εξέλιξης του καρκίνου [15]. EMT μπορεί να επαχθεί μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [28], [29]. CEACAM6 λειτουργεί ως μόριο ενδοκυτταρικής συγκόλλησης και μπορούν να σχηματίσουν μεγαλύτερες σχεδίες λιπιδίων με αλληλεπίδραση με την ίδια ή άλλη CEACAMs, ενεργοποιώντας έτσι τα κατάντη καταρρακτών σηματοδότησης, όπως η ιντεγκρίνη και οδούς ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [10], [30]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τις επιδράσεις της CEACAM6 υπερέκφραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ στα κύτταρα GC. Η φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ επίπεδα ήταν αυξημένα σε κύτταρα που υπερεκφράζουν CEACAM6, σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα σημειώνεται σε παγκρεατικά καρκινώματα [8], [11]. Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, προτείνουμε μια υπόθεση σύμφωνα με την οποία CEACAM6 επαγόμενη EMT εμφανίζεται μέσω της ενεργοποίησης του PI3K /AKT καταρράκτη σηματοδότησης στο GC. Επιπλέον, τα κύτταρα CEACAM6-υπερεκφράζουν αγωγή με LY294002, ένας αναστολέας ΡΙ3Κ, υποβλήθηκε σε μια αντιστροφή της EMT μέσω ΚΟΑ. Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι CEACAM6 προκαλεί EMT με την ενεργοποίηση της PI3K /AKT οδό σηματοδότησης σε GC και μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανός στόχος στην θεραπεία των όγκων.

Εν κατακλείδι, έχουμε φαίνεται ότι CEACAM6 δρα ως ογκογονίδιο με την προώθηση της EMT μέσω ενεργοποίησης PI3K /AKT στο GC. Επιπλέον, η Ε-καντερίνη αξιοσημείωτα μειωτικά σε ιστούς GC από ζεύγη γειτονικών μη ογκογόνους ιστούς. CEACAM6 προωθεί την εισβολή και τη μετάσταση

στο

vitro

και

στο

vivo

, και μπορεί να είναι μια πιθανή νέα διαγνωστική και προγνωστικός δείκτης και νέων στόχων για GC θεραπείας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Λίστα ελέγχου S1.

Η ΑΦΙΞΗ κατευθυντήριες γραμμές. Όλα τα in vivo πειράματα με το χέρι μας είχαν εξαχθεί σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΦΘΑΣΕΙ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112908.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

θα ήθελα να ευχαριστήσω Xuehua Chen και Jianian Zhang για τεχνική βοήθεια, για να Beiqin Yu για υλική υποστήριξη της.