Abstract

Η αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), ένα κρίσιμο στάδιο στη μετάσταση του καρκίνου, προσδιορίζεται από την ισορροπία μεταξύ MMPs (μήτρα μεταλλοπρωτεϊνασών) και αναστολείς TIMPs τους (αναστολείς ιστού των μεταλλοπρωτεϊνασών). Στα καρκινικά κύτταρα, αυτή η ισορροπία μετατοπίζεται προς MMPs, προωθώντας αποικοδόμησης ECM. Εδώ, δείχνουμε ότι ΕΖΗ2 διαδραματίζει ενεργό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία με την καταστολή της έκφρασης του Timp2 και Timp3 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. είναι οι

TIMP

γονίδια αποκαταστέλλεται με νοκ ντάουν της έκφρασης ΕΖΗ2 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, αλλά καταστέλλονται από υπερέκφραση του ΕΖΗ2 σε καλοήθη κύτταρα ανθρώπινων επιθηλιακών προστάτη. ΕΖΗ2 καταλύει H3K27 trimethylation και μετέπειτα μεθυλίωσης του DNA των

TIMP

γονίδιο υποστηρικτές. Η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 παρέχει μια επεμβατική φαινότυπο σε καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη? Ωστόσο, αυτή η φαινότυπος καταστέλλεται από cooverexpression του Timp3. ΕΖΗ2 knockdown μειώνει σημαντικά την πρωτεολυτική δραστικότητα της ΜΜΡ-9, μειώνοντας έτσι την επεμβατική δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταγραφική καταστολή του

TIMP

γονίδια από ΕΖΗ2 μπορεί να είναι ένα σημαντικό μηχανισμό για να μετατοπίσει την ισορροπία MMPs /TIMPs υπέρ της δραστηριότητας ΜΜΡ και, συνεπώς, για την προώθηση της υποβάθμισης της ECM και την επακόλουθη εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Παράθεση: Shin YJ, Kim JH (2012) Ο ρόλος της ΕΖΗ2 στον κανονισμό της δραστηριότητας της Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσες σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (1): e30393. doi: 10.1371 /journal.pone.0030393

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Νοεμ 2011? Αποδεκτές: 20 Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Shin, Κιμ. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από Grant GM087470 (J-HK) από το Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών, το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετάστασης η εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων από ένα πρωτογενή θέση σε άλλα μέρη του σώματος-είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των κακοηθών όγκων. Η διαδικασία της μετάστασης του καρκίνου αποτελείται από πολλαπλές, διαδοχικές βαθμίδες? καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από τον πρωτογενή όγκο, εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος, τα ταξίδια σε μακρινές περιοχές, και εξαγγειώνονται να σχηματίσουν δευτερεύουσες θέσεις όγκου [1]. Κατά τη διάρκεια της μετάστασης, τα καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν και να μεταναστεύσουν μέσω των συνήθων μοριακών περιορισμούς, όπως η εξωκυτταρική μήτρα (ECM) [2]. Η ECM, που συχνά αναφέρεται ως το συνδετικό ιστό, είναι ένα οργανωμένο δίκτυο εξωκυτταρικών υλικών που περιβάλλουν και υποστηρίζουν τα κύτταρα. Η ECM αποτελείται από μια μεγάλη ποικιλία πολυσακχαριτών και πρωτεϊνών, όπως λαμινίνες, κολλαγόνα, ινωδονεκτίνη, και πρωτεογλυκάνη, και παίζει αναπόσπαστο ρόλο στον καθορισμό του σχήματος, την ανάπτυξη, και βιοχημική λειτουργία των κυττάρων [2]. Το ύφασμα των πρωτεϊνών ECM αποτελεί τη βασική μεμβράνη (ΒΜ) που κρύβεται πίσω από την βασική επιφάνεια των επιθηλιακών ιστών και σχηματίζει ένα φυσικό φράγμα ενάντια εισβολή όγκου. Τα καρκινικά κύτταρα είναι ικανά να αποικοδομούν το φράγμα ECM χρησιμοποιώντας ένζυμα, με αποτέλεσμα διάλυση του ΒΜ. Εξέχουσα θέση μεταξύ των ενζύμων είναι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) [3].

MMPs είναι μια μεγάλη οικογένεια εξαρτώμενη από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδασών και υπεύθυνη για την αποικοδόμηση του ECM [4]. MMPs έχουν από καιρό γνωστό ότι σχετίζεται με φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες, όπως αναδιαμόρφωση των ιστών, την επούλωση των πληγών, στην αγγειογένεση, και την πρόοδο του καρκίνου [5] – [8]. MMPs εμφανίζονται σε λανθάνουσα πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα (προ-ΜΜΡ) και υφίστανται πρωτεολυτική επεξεργασία για να δώσουν τα ώριμα ένζυμα, τα οποία είναι, με τη σειρά τους, εκκρίνεται και συνδέεται με την επιφάνεια του κυττάρου και η ECM [9], [10]. Όταν εμφανίζεται στην επιφάνεια του κυττάρου, όμως, οι MMPs αναστέλλονται από τις ενδογενείς αναστολείς ιστού των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs), οι οποίες δεσμεύονται άμεσα με τους καταλυτικούς τομείς των MMPs σε 1:01 στοιχειομετρία [11]. Ως εκ τούτου, η ισορροπία μεταξύ των MMPs και TIMPs είναι κρίσιμη για την ενδεχόμενη αναδιαμόρφωση ECM και την υποβάθμιση. Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί τέσσερα TIMPs (TIMP1-TIMP4) που είναι λειτουργικά περιττές και αναστέλλουν ανθρώπινη 23 MMPs [12]. Σε πολλές κακοήθεις όγκους, η έκφραση του ΤΙΜΡ ρυθμίζεται προς τα κάτω, σύμφωνα με το ρόλο τους ως αναστολέων ΜΜΡ [13], [14]. Η καταστολή της έκφρασης ΤΙΜΡ από αντιπληροφοριακό RNA προσδίδει ογκογονικότητα επί Swiss 3Τ3 κύτταρα [15], [16]. Αντιστρόφως, η υπερέκφραση των αποτελεσμάτων TIMPs στην αναστολή της εισβολής και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων [17] – [23]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η καταστολή του

TIMP

γονίδια μπορεί να είναι ένα σημαντικό ρυθμιστικό μηχανισμό για την εξέλιξη του καρκίνου, αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή.

ΕΖΗ2 (Polycomb πρωτεΐνη ομάδα ενισχυτή Zeste ομόλογο 2 ) είναι η καταλυτική υπομονάδα του Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2) [24], [25] και υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [26]. Οι πρώτες μελέτες έδειξαν ότι υψηλά επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 συνδέονται με εισβολή και τη μετάσταση των κακοήθων όγκων όπως οι καρκίνοι του μαστού και του προστάτη [27] – [31] και ότι ΕΖΗ2 υπερέκφραση μετασχηματίζει τα καλοήθη κύτταρα του προστάτη RWPE-1 [32] και BPH1 [33 ] και τα αθανατοποιημένα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [28]. Πρόσφατα, ΕΖΗ2 έχει επίσης βρεθεί να ρυθμίζουν μονοπάτια που σχετίζονται με τον κυτταρικό μεταβολισμό, όπως η Ras ΟΤΡάσης ενεργοποίησης DAB2IP πρωτεΐνη [34], [35] και του αδρενεργικού υποδοχέα-βήτα-2 ADRB2 [36] σηματοδότησης, την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου. ΕΖΗ2 φαίνεται να μεσολαβεί μεταγραφική σίγηση είτε μεθυλίωση της λυσίνης 27 ιστόνης Η3 (3meH3K27) [23], [24] ή την πρόσληψη μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) για γονίδια-στόχους της, που καταλύουν de ηονο μεθυλίωση του DNA [37]. Ωστόσο, πρόσφατες αναφορές έχουν επίσης δείξει ότι H3K27 trimethylation με ΕΖΗ2 δεν συνδέεται πάντα με προαγωγέα DNA μεθυλίωση για την αποσιώπηση ορισμένων γονιδίων ΕΖΗ2-στόχου [38] – [41]. Ο λειτουργικός ρόλος του ΕΖΗ2 στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη έχει αναγνωριστεί από προφίλ γονιδιακής έκφρασης του RNA από μη καρκινογενής ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη που υπερεκφράζουν ΕΖΗ2 [27]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι δεν μεταβάλλουν σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης των πολλών μετάστασης που σχετίζονται με τα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν με γενετική χαρακτηριστικών των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη [42]. Η φύση αυτής της ασυμφωνίας είναι ασαφής αλλά θα μπορούσε να προκύψει από τις διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του ΕΖΗ2 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη που εξετάστηκαν.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του ΕΖΗ2 στην ενεργοποίηση των MMPs να προωθήσει την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Για την ταυτοποίηση των γονιδίων που σχετίζονται μετάστασης ρυθμίζεται από ΕΖΗ2 στον καρκίνο του προστάτη, η έκφραση του mRNA σε υψηλά διηθητικού καρκίνου του προστάτη κύτταρα στα οποία η έκφραση ΕΖΗ2 χτυπήθηκε κάτω σκιαγραφήθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινα μετάσταση συστοιχίες PCR. Βρήκαμε ότι τα υψηλά επίπεδα της έκφρασης ΕΖΗ2 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου να προκαλέσει καταστολή του

ΤΙΜΡ

γονίδια (

Timp2

και

Timp3

), που οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα των MMP-9 και ως εκ τούτου σε αυξημένη επεμβατική δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν για πρώτη φορά στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ΕΖΗ2 διαδραματίζει ενεργό ρόλο στη μετατόπιση της ισορροπίας MMPs /TIMPs προς MMPs και προάγοντας έτσι την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Αποτελέσματα

ΕΖΗ2 νοκ ντάουν μειώνει σημαντικά το επεμβατική και μεταναστευτικές δραστηριότητες των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

Για να διερευνηθεί αν τα υψηλά επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 συσχετίζεται με την επεμβατική φαινότυπο των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, θα προσδιορίζεται πρώτα επίπεδα πρωτεΐνης του ΕΖΗ2 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη (LNCaP, PC3, και DU145). Η ανάλυσή μας κηλίδας Western έδειξε ότι τα επίπεδα ΕΖΗ2 σημαντικά αυξημένα στα καρκινικά κυτταρικές γραμμές από ότι στο καλοήθη ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακή κυτταρική σειρά RWPE-1 (Εικόνα 1Α). Στη συνέχεια εξέτασε την επεμβατική δραστηριότητα των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα ΕΖΗ2 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου Transwell Boyden. Για το σκοπό αυτό, η έκφραση ΕΖΗ2 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά ΕΖΗ2 ειδικά Τα siRNAs, SH1 ή SH2 (Σχήμα 1 C, κορυφή). PC3 και DU145 κύτταρα ήταν πολύ επεμβατική, σε σύγκριση με τα καλοήθη κύτταρα RWPE-1 (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, ΕΖΗ2 knockdown μειώθηκε σημαντικά διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (Σχήμα 1 C, μέση)? μόνο 18~20% των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που έχουν μολυνθεί με φακοϊό εκφράζουν ΕΖΗ2 shRNA στόχευσης διεισδύσει στην μεμβράνη ΒΜΕ στο θάλαμο (SH1 και SH2), σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με τον έλεγχο (ΝΤ, nontargeting shRNA) φακοϊό (σχήμα 1 C, κάτω μέρος ). Αντιθέτως, η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 παρείχε επεμβατική φαινότυπο επί RWPE-1 κύτταρα (Σχήμα 1 D, WT)? Ωστόσο, RWPE-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΕΖΗ2 (ΕΖΗ2-H689A) με σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα HMT [44] δεν εμφανίζει επεμβατική δραστηριότητα (Σχήμα 1D, H689A). Επειδή ΕΖΗ2 διαδραματίζει ενεργό ρόλο στην εισβολή του καρκίνου του προστάτη (Σχήματα 1 C και 1ϋ), εξετάσαμε περαιτέρω την μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων DU145 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μετανάστευσης επούλωση της πληγής (Σχήμα 1Ε, κορυφή). Βρήκαμε ότι τα κύτταρα DU145 αναπληρώσει -80% και -50% των τραυματιών περιοχές πριν (ΝΤ) και μετά (SH1) knockdown έκφρασης ΕΖΗ2, αντίστοιχα, στις 24 ώρες μετά το ξύσιμο (Σχήμα 1Ε, κάτω). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 προώθηση εισβολή και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

(Α) ανάλυση Western blot της έκφρασης ΕΖΗ2 στην καλοήθη κυτταρική σειρά προστάτη RWPE-1 και οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη κακοήθη LNCaP, DU145, και PC3 (κορυφή). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad) (κάτω). (Β) δοκιμασία Εισβολή της RWPE-1, PC3 και DU145 κύτταρα. Κυττάρων διηθητικότητα αξιολογήθηκε από την εισβολή των κυττάρων μέσω ΒΜΕ επικαλυμμένα ενθέματα στην Boyden θάλαμο Transwell (κορυφή). Ο ρυθμός εισβολή προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων τα οποία μετανάστευσαν μέσα από τα ένθετα και εκφράζεται ως το ποσοστό σε σχέση με τον έλεγχο (RWPE-1, στο 100%) (κάτω). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E των πέντε πεδίων που μετρήθηκαν. (C) Ανάλυση Western blot της έκφρασης ΕΖΗ2 σε PC3 και DU145 κύτταρα μετά από μόλυνση με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA lentivirus (SH1 ή sh2? Δύο διαφορετικές ΕΖΗ2 ειδικά Τα siRNAs) ή με μη επεξεργασμένο shRNA (ΝΤ, έλεγχος) φακοϊού (κορυφή) . δοκιμασία εισβολή των PC3 ή DU145 κυττάρων μετά από μόλυνση με ΕΖΗ2 ειδικό shRNA (SH1 ή SH2) ή ελέγχου (ΝΤ) φακοϊού (μέση). Εκπρόσωπος πεδία εισέβαλε και βάφονται τα κύτταρα εμφανίζονται (μεσαία). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E πέντε πεδία μετρήθηκαν (κάτω). (D) ανάλυση κηλίδας Western υπερέκφρασης άγριου τύπου (WT) και μεταλλάκτη (H689A, ενζυματικώς ανενεργή) πρωτεΐνες ΕΖΗ2 σε RWPE-1 κύτταρα μολυσμένα με ΕΖΗ2-ΟΡΡ (WT)-ΟΡΡ, ΕΖΗ2 (H689A), ή τον έλεγχο (GFP διάνυσμα) lentivirus. ΕΖΗ2 πρωτεΐνες εκφράστηκαν από τον προαγωγό CMV (αριστερά). δοκιμασία Εισβολή των RWPE-1 κύτταρα μολυσμένα με ΕΖΗ2 (WT)-ΟΡΡ, ΕΖΗ2 (H689A)-ΟΡΡ, ή ελέγχου (φορέα GFP) ιού lenti (δεξιά). (Ε) Πληγή δοκιμασία κυττάρων DU145 μολυνθεί με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) ή τον έλεγχο shRNA (ΝΤ) φακοϊό επούλωσης. Εικόνες ελήφθησαν πριν (0 h) και μετά από τραύμα (24 h) (κορυφή). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το ποσοστό του υπόλοιπου χώρου που καθορίζεται από την ομαλοποίηση της περιοχής του τραύματος μετά από 24 ώρες από την αρχική περιοχή του τραύματος σε 0 h (οριστεί σε 100%). Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο ± SE των πέντε πεδίων μετρήθηκαν (κάτω)

* P & lt?. 0.05

,

** p & lt? 0.005 *** p & lt? 0.001

(σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου) .

η

Αναγνώριση των κατάντη γονιδίων στόχων του ΕΖΗ2 συνδέεται με τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη

Για την αναγνώριση των γονιδίων μετάστασης που σχετίζονται οποίων οι εκφράσεις ρυθμίζονται από ΕΖΗ2, μελετήσαμε μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης στην επεμβατική κυττάρων καρκίνου του προστάτη μετά ΕΖΗ2 knockdown. Έκφραση των διαφορετικών mRNAs στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη αξιολογήθηκε με τη χρήση της μετάστασης όγκου ανθρώπου RT

2

Profiler

™ PCR Array (PAHs-028D) που έχουν σχεδιαστεί για να αντιπροσωπεύουν 84 γονίδια είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη μετάσταση (Σχήματα 2Α και 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της 12 και 32 γονιδίων μεταβάλλεται & gt? 2 φορές σε DU145 (Πίνακας S1) PC3 (Σχήματα S1A και S1B και Πίνακας S2) κύτταρα, αντίστοιχα, από knockdown έκφρασης ΕΖΗ2. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, Timp3 βρέθηκε να είναι το γονίδιο που είναι πιο υψηλά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε δύο DU145 και τα κύτταρα PC3 (Σχήματα 2Β και S1B), οδηγώντας στην υπόθεση ότι Timp3 μπορεί να είναι ένας πρωταρχικός στόχος για καταστολή από ΕΖΗ2. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του Timp3 και ΕΖΗ2 με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντι-ΕΖΗ2 και αντισώματα αντι-Timp3 (Σχήμα 2C). Όπως φαίνεται στις εικόνες ανοσοχρώση, τα επίπεδα πρωτεΐνης Timp3 ήταν υψηλά σε φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (Σχήματα 2C-e και 2C-f), αλλά μόλις ανιχνεύσιμη σε ιστούς καρκίνου του προστάτη (Σχήματα 2C-g και 2C-h). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ανάλυση RT-PCR που δείχνουν ότι τα επίπεδα του mRNA Timp3 είναι αισθητά μειωμένη σε PC3 και DU145 κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα RWPE-1 (Σχήμα S1c). Σε αντίθεση, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΕΖΗ2 ήταν πολύ υψηλά σε ιστούς καρκίνου του προστάτη (Σχήματα 2C-c και 2C-D) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (Σχήματα 2C-α και 2C-b). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η έκφραση του Timp3 και ΕΖΗ2 συσχετίζεται αντίστροφα, πιθανόν λόγω μειορρύθμιση της έκφρασης Timp3 με ΕΖΗ2.

(Α) RT

2 profiler PCR συστοιχίας γονιδίων Μετάσταση ανθρώπινα καρκινικά σε κύτταρα DU145 μετά από μόλυνση με ΕΖΗ2 ειδικό shRNA ή ελέγχου (ΝΤ) λεντοϊού. Το διάγραμμα διασποράς της δοκιμής

vs δείγματα ελέγχου

δείχνει την εγκυρότητα του πειράματος. (Β) 12 γονίδια των οποίων η έκφραση επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από ΕΖΗ2 νοκ ντάουν εμφανίζονται (βλέπε επίσης πίνακες S1 και S2). Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα DU145 μετά από μια μόλυνση με ΕΖΗ2 ειδικό shRNA ή ελέγχου (ΝΤ) φακοϊό και υποβάλλονται σε επεξεργασία για συστοιχίας PCR (C) εικόνες ανοσοφθορισμού φυσιολογικό προστάτη (Normal 1 και Normal 2) και τα τμήματα του ιστού του όγκου του προστάτη (PCa1 και PCa2 ), χρησιμοποιώντας αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα (πράσινο) και αντίσωμα αντι-Timp3 (κόκκινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε).

Η

Η ελαττωμένη έκφραση της Timp3 από ΕΖΗ2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η μεταγραφική καταστολή της έκφρασης Timp3 από ΕΖΗ2, θα προσδιορίζεται ποσοτικά Timp3 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη τρία (LNCaP, PC3 και DU145) με και χωρίς knockdown της έκφρασης ΕΖΗ2. επίπεδα Timp3 mRNA βρέθηκαν να είναι ~10-13 φορές υψηλότερη στα καρκινικά κύτταρα επεξεργασμένα με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) από τα κύτταρα ελέγχου μη επεξεργασμένα με το shRNA (Σχήμα 3Α), και ως εκ τούτου, τα επίπεδα πρωτεΐνης Timp3 αυξήθηκαν σημαντικά με knockdown έκφρασης ΕΖΗ2 (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του λειτουργικού ΕΖΗ2 (WT), αλλά όχι της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ΕΖΗ2 (H689A), αποδείχθηκε ότι ελαττώνει Timp3 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε RWPE-1 κύτταρα (Σχήμα 3C). Down-ρύθμιση της έκφρασης Timp3 με ΕΖΗ2 επιβεβαιώθηκε επίσης με ανοσοχρώση Timp3 σε κύτταρα μολυσμένα με DU145 ΕΖΗ2-ειδικό shRNA φακοϊού (SH1) ή τον έλεγχο (nontargeting shRNA) φακοϊού (ΝΤ) (Σχήμα 3D). τα επίπεδα πρωτεΐνης Timp3 ήταν χαμηλά σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 3D-γ), αλλά σημαντικά αυξημένα από knockdown έκφρασης ΕΖΗ2 (Σχήμα 3D-h). Έτσι, Timp3 μπορεί να είναι ένας στόχος του ΕΖΗ2 για καταστολή σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

(Α) qRT-PCR ανάλυση της έκφρασης των Timp3 στα καρκινικά κύτταρα προστάτη (LNCaP, DU145, PC3 και) μετά από μια μόλυνση με ΕΖΗ2 ειδικό shRNA (SH1) ή τον έλεγχο shRNA φακοϊού (ΝΤ).

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (ΝΤ)). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των ενδογενών επιπέδων ΕΖΗ2 και πρωτεΐνης Timp3 σε καρκινικά κύτταρα προστάτη (LNCaP, DU145, PC3 και) μολυσμένα με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) ή ιό ελέγχου shRNA (ΝΤ). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Γ) Western blot (επάνω) και qRT-PCR (κάτω) αναλύσεις της έκφρασης του ΕΖΗ2 και Timp3 στην καλοήθη προστάτη RWPE-1 κύτταρα μετά από μόλυνση με ΕΖΗ2 (WT)-ΟΡΡ, ΕΖΗ2 (H689A)-ΟΡΡ, ή τον έλεγχο (φορέας GFP) lentivirus. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (vector)). Το στερεό βέλος δείχνει ΕΖΗ2-GFP που εκφράζεται από τον υποκινητή CMV, η διακεκομμένη βέλος υποδεικνύει ενδογενή ΕΖΗ2. (Δ) Η ανοσοχρώση ΕΖΗ2 και Timp3 εκφράζονται σε κύτταρα μολυσμένα με DU145 ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) ή τον έλεγχο (ΝΤ) φακοϊό, χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΕΖΗ2 (πράσινο) και αντίσωμα αντι-Timp3 (κόκκινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Οι συγχωνευμένες εικόνες επίσης δείξει (ΕΖΗ2 /Timp3 και DAPI /Timp3).

Η

Επιγενετική αποσιώπηση της έκφρασης Timp3 από ΕΖΗ2

ΕΖΗ2 είναι ένα συστατικό της PRC2 που καταλύει trimethylation της H3K27 ( 3meH3K27) [24], [25]. Για τη διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού της επιγενετικών καταστολή των TIPM3 από ΕΖΗ2, ερευνήσαμε επιδράσεις του αναστολέα μεθυλίωσης της ιστόνης 3-δεαζα-naplanocin A (DZNep) σχετικά με έκφραση Timp3. θεραπεία DZNep οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης Timp3 (Σχήμα 4Α), πιθανώς προκαλώντας αποκαταστολή της έκφρασης Timp3 (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η επεμβατική δυναμικό των κυττάρων PC3 ήταν ~ 5-φορές μειωμένη με κατεργασία DZNep (Σχήμα 4C).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των ενδογενών επιπέδων ΕΖΗ2, Timp3 και 3meH3K37 στα καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC3 κυττάρων) μετά από θεραπεία με DZNep (5 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) για 2 ημέρες. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης του Timp3 σε κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με DZNep (5 μΜ) ή DMSO (έλεγχος). (C) δοκιμασία εισβολή των κυττάρων PC3 αντιμετωπίζονται με DZNep (5 μΜ) ή DMSO (έλεγχος).

Η

Για να μελετήσει περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό της μεταγραφικής καταστολής της έκφρασης Timp3 από ΕΖΗ2, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ChIP σε κύτταρα DU145 και PC3 χρησιμοποιώντας αντι-ΕΖΗ2 και αντι-3meH3K27 αντισώματα. Επειδή οι πρωτεΐνες PCG προσλαμβάνονται στο DNA, μέσω της δέσμευσης του DNA της πρωτεΐνης ΥΥ1 [45], η ανοσοκαταβυθίστηκε DNA αναλύθηκε με PCR με τα σύνολα αρχικών τεμαχίων σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν περιοχές που περιέχουν τις θέσεις πρόσδεσης ΥΥ1 στο

Timp3

προαγωγό ( Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι: 1) ΕΖΗ2 δεσμεύεται με το

Timp3

υποκινητή και καταλύει trimethylation του H3K27 (3meH3K27) (Σχήματα 5Β και 5C), αλλά δεν δεσμεύεται με την

GAPDH

υποκινητή, που εξυπηρετείται ως ένας αρνητικός έλεγχος (Σχήμα 5C)? 2) RNA πολυμεράση ΙΙ (RNAP II) συνδέεται ισχυρά με το

GAPDH

υποστηρικτής, αλλά δεν έχει καμία αξιόλογη σύνδεση με το

Timp3

υποκινητή (σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση trimethylation του H3K27 αποτρέπει RNAP II από σύνδεση προς το

Timp3

υποκινητή και με αυτόν τον τρόπο οδηγεί σε μεταγραφική σίγηση του γονιδίου.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της περιοχής του υποκινητή του

Timp3

γονίδιο. Το λυγισμένο βέλος αντιπροσωπεύει τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής (+1). Οι γραμμές κάτω από το

Timp3

τόπο αντιπροσωπεύουν τις περιοχές ενισχύθηκαν με PCR. (Β-Ο) ανοσοκαταβυθίστηκαν DNA αναλύθηκε με PCR με ειδικά σύνολα εκκινητών (βλέπε επίσης Πίνακα S3). Χρωματίνης που λαμβάνεται από PC3 (Β) και κύτταρα DU145 (C) ανοσοκατακρημνίστηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα προς ΕΖΗ2, τριμεθυλ-ιστόνης H3K27 (3meH3K27), RNA πολυμεράσης II (ροΙ II) και IgG. Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA αναλύθηκε με PCR με το αρχικό τεμάχιο θέτει για να ενισχυθεί η περιοχή 4 στην Εικόνα 5Α. Η

GAPDH

υποστηρικτής χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Κάθε πείραμα ChIP επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. (D) Επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης Timp3 στα κύτταρα PC3. δοκιμασία ChIP διεξήχθη με τη χρήση των αντισωμάτων σε ΕΖΗ2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (ροΙ II), και ο έλεγχος IgG μετά από αγωγή με DZNep (1 μΜ), 5-Αζα (10 μΜ), DMSO (έλεγχος), ή EZH2- συγκεκριμένες shRNA (shRNA1). Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA αναλύθηκε με PCR με το αρχικό τεμάχιο θέτει για να ενισχυθεί η περιοχή 4 στην Εικόνα 5Α. ανάλυση (Ε) qRT-PCR της έκφρασης του Timp3 σε κύτταρα PC3 μετά από θεραπεία με DZNep (1 μΜ), 5-Αζα (10 μΜ), ή DMSO (έλεγχος) για 2 ημέρες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως αναλογία του Timp2 ή Timp3 mRNA για τον έλεγχο GAPDH mRNA.

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO))

Η

επόμενο καθοριστεί αν H3K27 trimethylation συνδυάζεται με. υποκινητής μεθυλίωσης DNA για την καταστολή της Timp3, εμείς κατεργασμένα κύτταρα PC3 με DZNep ή τον αναστολέα μεθυλίωσης DNA 5-Αζα ακολουθούμενη από ανάλυση chip. ΕΖΗ2 νοκ ντάουν ή θεραπεία DZNep ανέστειλε σημαντικά τόσο H3K27 trimethylation και μεθυλίωσης του DNA (πρωτεΐνη δέσμευσης MeCP2, μεθυλο CpG 2) του

Timp3

υποστηρικτής? Αντίθετα, η θεραπεία 5-Αζα ανέστειλε μόνο μεθυλίωσης του DNA, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση επί H3K27 trimethylation του υποκινητή (Εικόνα 5D). Επιπλέον, η επεξεργασία των PC3 κυττάρων με DZNep ή 5-Αζα είχε σαν αποτέλεσμα αποκαταστολή της έκφρασης Timp3 σχεδόν στον ίδιο βαθμό (Σχήμα 5Ε). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταγραφική καταστολή του

Timp3

γονιδίου γίνεται μέσω της ΕΖΗ2 μεσολάβηση H3K27 trimethylation και την επακόλουθη μεθυλίωση του DNA.

Επιγενετική αποσιώπηση της έκφρασης Timp2 από ΕΖΗ2

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί αν, όπως Timp3, άλλες τρεις TIMPs (TIMP1, Timp2 και TIMP4) τα μεταγραφικά καταστέλλεται από ΕΖΗ2. Μας RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι TIMP1 δεν ρυθμίζονται από ΕΖΗ2, ενώ TIMP4 είχε κατασταλεί όταν η έκφραση ΕΖΗ2 έχει χτυπηθεί κάτω (Σχήμα 6). Αντίθετα, η έκφραση Timp2 αυξήθηκε σημαντικά με ΕΖΗ2 knockdown, αλλά δεν αυξήθηκε όταν η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΕΖΗ2 (ΕΖΗ2-H689A) εκφράζεται. Μελέτες ChIP μας δείχνουν ότι Timp2, όπως Timp3, υπόκειται επίσης σε ΕΖΗ2 μεσολάβηση ιστόνης μεθυλίωση και επακόλουθη μεθυλίωση του DNA προαγωγέα (Σχήμα 7). Κάτω ρύθμιση του

γονίδιο Timp2

σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη αποδείχθηκε ότι συνδέεται με μεθυλίωση προαγωγού [13], υποδηλώνοντας ότι επιγενετικών ρυθμιστικών παραγόντων, όπως HDAC και DNMT, μπορεί να εμπλέκεται στην ρύθμιση της Timp2. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επιγενετική τροποποιητής ΕΖΗ2 μπορεί να είναι ο παράγοντας που μεσολαβεί επιγενετική αδρανοποίηση Timp2

(Α-Γ) Ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης του

ΤΙΜΡ

γονίδια (Α, TIMP1.? Β, Timp2? C, TIMP4) στα καρκινικά κύτταρα προστάτη (LNCaP, DU145, PC3 και) μετά από μια μόλυνση με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) ή τον έλεγχο shRNA φακοϊού (ΝΤ).

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (ΝΤ)). (D-F) ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης του

ΤΙΜΡ

γονίδια (D, TIMP1? Ε, Timp2? F, TIMP4) στην καλοήθη κυτταρική σειρά προστάτη RWPE-1 μετά από μια μόλυνση με ΕΖΗ2 υπερέκφραση φακοϊό ( WT ή H689A) ή τον έλεγχο του ιού για 4 ημέρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως αναλογία του

TIMP

mRNAs να

GAPDH

έλεγχο mRNA.

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

(σε σύγκριση με το μάρτυρα (GFP))

Η

(Α) Σχηματική αναπαράσταση των περιοχών προαγωγού του. η

Timp2

γονίδιο. Το λυγισμένο βέλος αντιπροσωπεύει τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής (+1). Οι γραμμές κάτω από το

Timp2

locus αντιπροσωπεύουν τις περιοχές ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας ομάδες εναρκτήρα (σετ 1, σετ 2, και καθόρισε 3 στο (Β)? Σετ 2 σε (C) και (D)) που έχουν σχεδιαστεί για να ενισχύσουν περιφέρειες που περιέχει τις θέσεις ΥΥ1 δέσμευσης (βλέπε πίνακα S3). (Β-Ο) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) πειράματα διεξήχθησαν με χρωματίνη που απομονώνεται από PC3 (Β) και κύτταρα DC145 (C) με τη χρήση αντισωμάτων για ΕΖΗ2, 3meH3K27, και IgG. Αποτελέσματα τσιπ μας στα δύο κύτταρα PC3 και DU145 είναι πολύ παρόμοια μεταξύ τους. Εμφανίζονται είναι ChIP αποτελέσματα στα κύτταρα DU145. (D) Επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης Timp2 στα κύτταρα PC3. δοκιμασία ChIP διεξήχθη με τη χρήση των αντισωμάτων σε ΕΖΗ2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (ροΙ II), και ο έλεγχος IgG μετά από αγωγή με DZNep (1 μΜ), 5-Αζα (10 μΜ), DMSO (έλεγχος), ή EZH2- συγκεκριμένες shRNA (shRNA1). ανάλυση (Ε) qRT-PCR της έκφρασης του Timp2 σε κύτταρα PC3 μετά από θεραπεία με DZNep (1 μΜ), 5-Αζα (10 μΜ), ή DMSO (έλεγχος) για 2 ημέρες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως αναλογία του

Timp2

mRNA για να

GAPDH

ελέγχου mRNA.

* P & lt? 0,05

,

** p & lt?. 0.005

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO))

Η

μεταγραφική καταστολή των Timp3 από ΕΖΗ2 προωθεί την εισβολή των καρκινικά κύτταρα προστάτη

Για να εκτιμηθεί η λειτουργική σύνδεση μεταξύ της προς τα κάτω ρύθμιση των Timp3 με ΕΖΗ2 (Σχήμα 3) και της μειωμένης επεμβατική φαινότυπο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη από ΕΖΗ2 knockdown (Σχήματα 1 C και 1ϋ), υπερεκφράσαμε ΕΖΗ2 και Timp3 χωριστά ή μαζί σε RWPE-1 κύτταρα (Σχήμα 8Α) και εξέτασαν την επεμβατική δραστηριότητα των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού θαλάμου Boyden Transwell (Σχήμα 8Β). Η επεμβατική φαινότυπος των κυττάρων RWPE-1 επάγεται από ΕΖΗ2 υπερέκφρασης όπως παρατηρήθηκε παραπάνω (Σχήμα 1 D), αλλά ήταν σημαντικά καταστάλθηκε από cooverexpression του Timp3 (Σχήμα 8Β), παρέχοντας άμεση απόδειξη ότι η καταστολή των Timp3 από τα αποτελέσματα ΕΖΗ2 σε αυξημένη επεμβατική δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της ΕΖΗ2 και έκφραση σε κύτταρα Timp3 RWPE-1 μετά από μια μόλυνση με τις υποδεικνυόμενες συνδυασμούς φακοϊό εκφράζουν ΕΖΗ2, Timp3 και τον ιό έλεγχο. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός Εισβολή των κυττάρων RWPE-1 μετά από μια μόλυνση με τις υποδεικνυόμενες συνδυασμούς φακοϊό εκφράζουν ΕΖΗ2, Timp3 και τον ιό έλεγχο. Top: α, ΕΖΗ2 (-) /Timp3 (-)? b, ΕΖΗ2 (-) /Timp3 (+)? c, ΕΖΗ2 (+) /Timp3 (-)? d, ΕΖΗ2 (+) /Timp3 (+). (Γ) Ζελατίνη ζυμογραφική δοκιμασία για την ΜΜΡ-2 και δραστικότητα ΜΜΡ-9 σε PC3 και DU145 κύτταρα μολυσμένα με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA (SH1) ή ιό ελέγχου shRNA (ΝΤ). Τα άνω και κάτω ταινίες δεικνύουν δραστική ΜΜΡ-9 (92 kDa) και ενεργός ΜΜΡ-2 (62 kDa), αντίστοιχα. Ζυμογραφική εντάσεις ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E από τρία πεδία μετρήθηκαν.

* P & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.005

,

*** p & lt? 0.001

(σε σύγκριση με τον έλεγχο (ΝΤ))

ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι γνωστό ότι είναι τα προεξέχοντα MMPs υπεύθυνο για την αποικοδόμηση ECM, και έτσι ελέγξαμε εάν ενζυματική δραστικότητα αυτών των δύο MMPs ρυθμίζεται από ΕΖΗ2 χρησιμοποιώντας δοκιμασία ζελατίνης ζυμογραφία. δραστηριότητα ΜΜΡ-2 δεν βρέθηκε να αλλάξει σημαντικά από ΕΖΗ2 νοκ ντάουν. Ωστόσο, η δραστικότητα ΜΜΡ-9 μειώθηκε κατά ~ 28% σε κύτταρα PC3 και -50% σε κύτταρα DU145, αντίστοιχα, που έλαβαν θεραπεία με ΕΖΗ2-ειδικό shRNA, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ΝΤ) (Σχήμα 8C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ΕΖΗ2 μεσολάβηση μεταγραφική καταστολή του Timp3 οδηγεί άμεσα στην ενεργοποίηση των ΜΜΡ-9.

Συζήτηση

Η ισορροπία μεταξύ MMPs και TIMPs είναι μια κρίσιμη παράμετρος για την υποβάθμιση της ECM και έτσι ένα κρίσιμο βήμα για την εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι παρεκκλίνουσα αυξορρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη μετατοπίσει την ισορροπία προς MMPs και κατά συνέπεια προωθούν αποικοδόμηση του ECM. ΕΖΗ2 κάνει αυτό με την ρύθμιση προς τα κάτω την έκφραση του

ΤΙΜΡ

γονίδια (

Timp2

και

Timp3

). Timp2 και Timp3, σε σύγκριση με TIMP1 και TIMP4, αναστέλλουν ένα ευρύ φάσμα των MMPs και αρκετοί από ντισιντεγκρίνης μεταλλοπρωτεϊνάσες, ο Adams και ADAMTSs [12]. Επιπλέον, Timp3 είναι το μόνο μέλος της οικογένειας ΤΙΜΡ που δεσμεύεται σφικτά με ECM και έτσι εμπλέκεται στην παθογένεση της νόσου [9], [10]. Timp3 έχει επίσης μια ανασταλτική δράση επί της αγγειογένεσης από απόφραξη της δέσμευσης του VEGF υποδοχέα-2 [46] και την ικανότητα να προάγουν την απόπτωση [47] – [49]. Ως εκ τούτου, η μεταγραφική καταστολή του Timp2 και Timp3 με ΕΖΗ2 πιθανό ενισχύει αποδόμηση της ECM και την αγγειογένεση αλλά μειώνει αποπτωτική δραστικότητα, ευνοώντας καρκινικών κυττάρων εισβολής και της μετάστασης.

Η παρουσία ή η αυξημένη έκφραση ορισμένων από MMPs συνδέεται θετικά με την εξέλιξη του καρκίνου [3], [50]. ανάλυση μετάσταση συστοιχία PCR μας δείχνει ότι ορισμένοι

ΜΜΡ

γονίδια, όπως

ΜΜΡ7

και

ΜΜΡ13

, σε PC3 κύτταρα αξιοσημείωτα κατιούσα ρύθμιση με knockdown έκφρασης ΕΖΗ2 (Σχήμα S1) . Έτσι, ΕΖΗ2 φαίνεται να δρα ως ενεργοποιητής, αντί για ένα καταστολέα, της έκφρασης αυτών των γονιδίων. Ωστόσο, αυτά τα αποτελέσματα δεν παρατηρήθηκαν σαφώς σε κύτταρα DU145, ίσως λόγω διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών [51]. Ενώ η μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων των ΜΜΡ με ΕΖΗ2, η οποία ήταν εκτός του πεδίου εφαρμογής της παρούσας μελέτης, είναι προς το παρόν υπό έρευνα, τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν την πιθανότητα ότι η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα προστάτη μπορεί να αυξήσει τη συνολική ΜΜΡ δραστικότητα τόσο με τη μείωση των επιπέδων του TIMPs (Timp2 και Timp3) και αυξάνοντας τα επίπεδα ορισμένων MMPs, όπως ΜΜΡ-9.

ο υποστηρικτής μεθυλίωση του DNA είναι η πλέον κοινή επιγενετική τροποποίηση σχετίζεται με γονιδιακή σίγηση σε καρκίνο. ΕΖΗ2 φαίνεται να προσλάβει DNMTs με γονίδια-στόχους του, με αποτέλεσμα μεθυλίωση των γειτονικών νησιών CpG και επακόλουθη γονιδιακή σίγηση [37]. Σε αυτό το μοντέλο, ΕΖΗ2 μεσολάβηση μεθυλίωση H3K27 μπορεί να είναι ένα προαπαιτούμενο για προαγωγέα DNA μεθυλίωση. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν αυτή την ιδέα, όπως έχουμε παρατηρήσει ότι

Timp2

και

Timp3

, όπως και άλλα γονίδια στόχους ΕΖΗ2 όπως

MSMB

[31],

RUNX3

[52], και

SLIT2

[39], οι σιγήσει μέσω των ιστονών (H3K27) μεθυλίωση που ακολουθείται από μεθυλίωση του DNA (Σχήματα 5 και 7). Ωστόσο, προαγωγέα DNA μεθυλίωση δεν απαιτείται πάντοτε για την καταστολή των γονιδίων-στόχων ΕΖΗ2. Για παράδειγμα, ΕΖΗ2 μεσολάβηση αποσιώπηση του γονιδίου Ε-καδερίνης λαμβάνει χώρα μέσω H3K27 μεθυλίωσης, αλλά δεν απαιτεί προαγωγέα DNA μεθυλίωση [38]. Επιπλέον, H3K27 trimethylation δεν σχετίζεται με προαγωγέα DNA μεθυλίωση για φίμωση ενός σημαντικού αριθμού των γονιδίων στόχων ΕΖΗ2 στον καρκίνο του προστάτη [41]. Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διακρίνει αυτούς τους μηχανισμούς.

Για τα καρκινικά κύτταρα για να κάνουν μετάσταση, πρέπει να απελευθερωθούμε από τις κανονικές φυσικά εμπόδια, με τη μετανάστευση και την εισβολή, όπως ECM και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Επιπλέον, η υποβάθμιση των απελευθερώσεων ECM μόρια που συνδέονται με την ECM, όπως αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες σηματοδότησης, που επηρεάζουν σημαντικά τη μετάσταση [53]. Έτσι, η αποδόμηση της ECM από τις ΜΜΡ είναι καίριας σημασίας για την εξάλειψη όχι μόνο των εμποδίων, αλλά επίσης κάνει τα μόρια σηματοδότησης προσιτή σε καρκινικά κύτταρα. Όπως αποδεικνύεται στη μελέτη αυτή, ΕΖΗ2, το οποίο δρα ως ένα δυνητικό ογκογονιδίου σε διάφορες κακοήθειες, διαδραματίζει ενεργό ρόλο στην ρύθμιση προς τα άνω της δραστηριότητας των ΜΜΡ και να προωθήσει την υποβάθμιση της ECM και την επακόλουθη εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, παρέχοντας μία νέα εικόνα για το ρόλο του ΕΖΗ2 σε μετάσταση καρκίνου του προστάτη

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Rockville, MD).. PC3, DU145 και LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS και πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Τα κύτταρα RWPE-1 καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων απαλλαγμένο από ορό μέσο (Κ-SFM) που περιέχει 50 μg ml βόειου εκχυλίσματος /υπόφυσης και 5 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43].