Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατες δημοσιεύσεις δείχνουν ότι η νεοπλασματική έναρξη και η εξέλιξη εξαρτώνται από μια μικρό υποσύνολο των κυττάρων, που ονομάζονται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). Αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς (ATC) είναι μια πολύ επιθετική συμπαγείς όγκους με κακή πρόγνωση, που χαρακτηρίζεται από υψηλή αποδιαφοροποίηση. Η ύπαρξη των ΚΕΠ θα μπορούσαν να ευθύνονται για την ετερογένεια της ATC βλαβών. CD133 έχει αναγνωριστεί ως ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων για την κανονική και καρκινικούς ιστούς, αν και η βιολογική λειτουργία του παραμένει άγνωστη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

κυτταρικές ATC γραμμές ARO, ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18 και FRO αναλύθηκαν για έκφραση CD133. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε CD133

κύτταρα θέση μόνο σε ARO και KAT-4 (64 ± 9% και 57 ± 12%, αντίστοιχα). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώθηκαν από qRT-PCR και ανοσοκυτταροχημεία. ARO και KAT-4 ήταν επίσης θετικά για την εμβρυϊκή δείκτη ογκοεμβρυϊκών φιμπρονεκτίνης και αρνητικά για thyrocyte-ειδικούς δείκτες διαφοροποίησης θυρεοσφαιρίνης, thyroperoxidase και /ιωδιούχου συμμεταφορέα νατρίου. Κατάταξη σύμφωνα ARO /CD133

κύτταρα pos παρουσίασαν υψηλότερο πολλαπλασιασμό, αυτο-ανανέωση, την ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με ARO /CD133

αρν. Επιπλέον, ARO /CD133

pos έδειξαν επίπεδα του παράγοντα θυρεοειδούς μεταγραφής TTF-1 παρόμοιο με το εμβρυϊκό θυρεοειδή κυτταρική σειρά TAD-2, ενώ η έκφραση σε ARO /CD133

αρνητικά ήταν αμελητέα. Η έκφραση του δείκτη βλαστικών κυττάρων Οκτώβριος-4 ανιχνεύθηκε με RT-PCR και κυτταρομετρία ροής ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ARO /CD133

POS σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά. Η δείκτες βλαστικών κυττάρων c-KIT και Thy-1 ήταν αρνητικές. Ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ερευνήθηκε, δείχνοντας αξιοσημείωτη αντίσταση στη χημειοθεραπεία απόπτωση σε ARO /CD133

POS σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά.

Συμπεράσματα /Σημασία

περιγράφουμε CD133

κύτταρα θέση σε κυτταρικές σειρές ATC. ARO /CD133

pos κύτταρα παρουσιάζουν βλαστικών κυττάρων, όπως χαρακτηριστικά – όπως η υψηλή διάδοση, την ικανότητα αυτο-ανανέωσης, έκφραση Οκτώβριος-4 – και χαρακτηρίζονται από υψηλότερη αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Η ταυτόχρονη θετικότητα για θυρεοειδούς ειδικός συντελεστής TTF-1 και onfFN προτείνουν θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν υποτιθέμενο καρκίνο του θυρεοειδούς βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

in vitro

ευρήματά μας μπορεί να παρέχει νέες ιδέες για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις

Παράθεση:. Zito G, Richiusa P, Bommarito Α, Carissimi Ε, Russo L, Coppola A, et al. (2008)

In Vitro

ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό του CD133

Καρκίνος POS βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με αναπλαστικό Θυρεοειδούς γραμμές καρκινώματος κυττάρων. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10.1371 /journal.pone.0003544

Επιμέλεια: Karen Σ Aboody, City of Hope Medical Center και Beckman Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Απριλίου 2008? Αποδεκτές: 6 Οκτωβρίου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτωβρίου του 2008

Copyright: © 2008 Zito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς (ATC) είναι μία από τις πιο επιθετικές ενδοκρινείς όγκους με μορφολογικά χαρακτηριστικά των αδιαφοροποίητα νεόπλασμα. Οι ασθενείς με ATC έχουν φτωχή πρόγνωση με μέσο χρόνο επιβίωσης των 2-6 μηνών. Χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία δεν βελτιωθεί το ποσοστό επιβίωσης [1].

Πρόσφατα, τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα εντοπίστηκαν σε ανθρώπινο θυρεοειδή αδένα [2]. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν αρκετούς ειδικούς δείκτες, όπως ο παράγοντας μεταγραφής πυρηνικής ΥΧΕ-4 (επίσης γνωστή ως οκτ-3, ΟΚΤ-3/4) και τους δείκτες ενδοδερμικής GATA-4 και HNF4α [2] – [4].

η σύνδεση μεταξύ στελέχους και τα καρκινικά κύτταρα έχει προταθεί σε διάφορους ιστούς όπου τα καρκινικά κύτταρα υποτίθεται ότι προέρχονται από ανώριμα προγόνους ή βλαστοκύτταρα [5]. έχουν καρκίνο βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ) έχουν βρεθεί σε λευχαιμία [6], γλοιοβλάστωμα [7], του μαστού [8], του προστάτη [9], γαστρικό [10], του πνεύμονα [11], και του παχέος εντέρου [12] του καρκίνου. Αυτά τα κύτταρα, τα οποία αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό πληθυσμό μέσα στον όγκο του όγκου, έχουν την ταυτόχρονη ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποιούνται σε άλλους cytotypes [13]. Ο φαινότυπος στέλεχος-όπως έχει αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να αντέχει συμβατικών θεραπειών, οδηγώντας έτσι σε υποτροπή της νόσου, ακόμη και όταν η πρωτογενής βλάβη έχει εξαλειφθεί [14], [15]. Μέχρι σήμερα, ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει οριστικά έδειξαν ότι τα βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για θυρεοειδή καρκινογένεση. Ωστόσο, η σπανιότητα και την ταχεία ανάπτυξη του προτύπου ATC μοιάζει με την φύση των βλαστικών κυττάρων. Μόνο μία μελέτη περιέγραψε έναν πολύ μικρό πληθυσμό, που ονομάζεται πλευρά του πληθυσμού, εμπλουτισμένα για βλαστοκύτταρα μεταξύ καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές γραμμές [16]. Επιπλέον, η υπόθεση του κυττάρου καρκινογένεσης εμβρύου, στην οποία τα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από τα απομεινάρια των εμβρυϊκών κυττάρων θυρεοειδούς αντί των ενήλικων θυρεοκύτταρα, έχει προταθεί [17].

Αρκετές δείκτες έχουν εντοπιστεί για το χαρακτηρισμό του ΚΕΠ. Ανθρώπινα CD133, ένα άκρως συντηρημένη ομόλογο αντιγόνο του ποντικού προμινίνη-1, ταυτοποιήθηκε αρχικά σε έναν υποπληθυσμό CD34

+ αιμοποιητικών κυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινο εμβρυϊκό ήπαρ και το μυελό των οστών [18] – [19]. CD133 έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση και την απομόνωση ενός υποθετικού πληθυσμού CSC από διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [20], [21]. Επιπλέον, η έκφραση του CD133

ΚΕΠ θέση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) φάνηκε να προσδώσει χημειοαντίσταση

in vitro

[14]. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία του παραμένει άγνωστη. Ο μεταγραφικός παράγοντας Οκτώβριος-4 θεωρείται ένας κύριος ρυθμιστής των ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων pluripotency και αυτο-ανανέωση ικανοτήτων εμβρυϊκά [22]. Είναι ενδιαφέρον, αυτές οι ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που δόθηκε στη Οκτώβριος-4Α, μια παραλλαγή ματίσματος της ΥΧΕ-4 γονίδιο που βρίσκεται στον πυρήνα [23], [24].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει η έκφραση του υποτιθέμενου δεικτών των βλαστικών κυττάρων σε καθιερωμένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ATC, όπως ARO, ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18 μπρος και πίσω. Εντοπίσαμε CD133

κύτταρα θέση σε ARO και κυτταρικές σειρές KAT-4. Αυτό το υποσύνολο αυτό χαρακτηρίζεται από υψηλότερο

in-vitro

πολλαπλασιασμό, αυτο-ανανέωση και η ικανότητα σχηματισμού αποικιών. ARO /CD133

pos ήταν πιο ανθεκτική από ό, τι ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά στη χημειοθεραπεία απόπτωση. Επιπλέον, ARO /CD133

κύτταρα POS εξέφρασε την thyroblast ειδικό μεταγραφικό παράγοντα TTF-1 και ο δείκτης βλαστικών κυττάρων Οκτώβριος-4, ενώ ήταν αρνητικό για την δείκτες βλαστικών κυττάρων c-Kit και Thy-1.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ATC ARO, ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18 και FRO ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Α Fusco, Πανεπιστήμιο της Νάπολης , Ιταλία. Κατά τη διάρκεια της διαστολής φάση και για τα κύτταρα δοκιμασία αυτο-ανανέωση καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα (FBS). Για όλα τα άλλα πειράματα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού RPMI1640 (SFM), συμπληρωμένο με βασικό Αυξητικό Παράγοντα Ινοβλαστών (bFGF, 20 ng /ml? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και Επιδερμικού Παράγοντα Ανάπτυξης (EGF, 20 ng /ml?. Sigma-Aldrich) [25]

κυτταρομετρίας ροής

Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD133, ΟΚΤ-4, c-Kit και Thy-1 αξιολογήθηκε με ροής κυτταρομετρία (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Για την ανάλυση CD133, τα κύτταρα πρώτα σε επεξεργασία με FcR αντιδραστήριο αποκλεισμού (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) και στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι στους 4 ° C για 10 λεπτά με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένο ποντικού IgG2b αντι ανθρώπινο CD133 /2 (κλώνος 293C3, Miltenyi Biotec). Για συν-χρώση με c-Kit και Thy-1, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται με μονοκλωνικό IgG1 ποντικού αντι-ανθρώπινο ο-ΚΙΤ και αντι-ανθρώπινο ΤΗΥ-1 αντισώματα IgG 1 ποντικού (Chemicon International, Temecula, CA, USA) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης πολυκλωνικό γίδινο αντι-ποντικού στους 4 ° C για 30 λεπτά. Για χρώση με OCT-4, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με κιτ Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα μετά επωάστηκαν με μονοκλωνικά ποντικού IgG2b αντι-ανθρώπινο ΥΧΕ-3/4 για (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) στους 4 ° C για 30 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένο πολυκλωνικό κατσίκας αντι-ποντικού στους 4 ° C για 30 λεπτά. Το πρωτογενές αντίσωμα αναγνωρίζει το εργαλείο OCT-4Α ισομορφή της πρωτεΐνης (αα 1-134).

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με κασπάσης 3 δοκιμασίας. Τα κύτταρα πρώτο σταθερό και διαπερατά με κιτ Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα μετά επωάστηκαν με μονοκλωνικά IgG κουνελιού αντι-δραστική κασπάση 3 (BD ​​Pharmingen) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης πολυκλωνικό IgG αίγας αντι-κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά.

τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest Pro (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Περίφραξη υλοποιήθηκε βασίζεται σε αρνητικό προφίλ χρώση ελέγχου.

Ανοσοκυτοχημεία

ARO και KAT-4 κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε διαφάνειες θάλαμο (Lab-Tek, Nunc, Inc. Naperville, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), επέτρεψε να προσκολληθούν για 48 ώρες και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για ανοσοκυτταροχημεία. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μετά πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, αποκλείστηκαν με 3% BSA και διαπερατά με PBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινης CD133 (IgG1, κλώνος AC133, Miltenyi Biotec) σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια ξεπλένεται με PBS. Η έκφραση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δευτερογενή βιοτινυλιωμένα αντισώματα και στρεπταβιδίνη /υπεροξειδάση αρμορακίας. Χρωμογόνο 3-αμινο-9-αιθυλκαρβαζόλης (AEC) υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε και πλακίδια με αιματοξυλίνη.

Ταξινόμηση των ARO /CD133

κύτταρα pos

κύτταρα ARO τρυψινοποιήθηκαν και επισημαίνονται με πρωτοβάθμια CD133-βιοτίνη και βιοτίνη-Μικροσφαιρίδια (Έμμεση CD133 κελί απομόνωσης Kit, Miltenyi Biotec), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά μαγνητική διαλογή, καθαρότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-ανθρώπινου CD133 /2 (κλώνος 293C3, Miltenyi Biotec).

Απομόνωση του συνολικού RNA, RT-PCR και qRT-PCR

Το συνολικό RNA εκχυλίζεται και καθαρίζεται από καλλιεργημένα ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18, FRO και ARO (χωρίς διαλογή, ταξινομούνται CD133

αρνητικά και CD133

pos) κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία), συμπεριλαμβανομένου ενός σταδίου χώνευση με DNase Ι θέσει. ποσότητα και ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με φασματοφωτομετρία UV. 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε έναν όγκο 20 μΙ με ολίγο dT εκκινητές (Applied Biosystems, Darmstad, Germany) και Stratascript RT (Stratagene, Amsterdam, Ολλανδία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Θυρεοσφαιρίνης (Tg), thyroperoxidase (ΤΡΟ), νάτριο /ιωδιούχο συμμεταφορέα (NIS), ογκοεμβρυϊκά ινονεκτίνη (onfFN) και OCT-4 έκφραση αναλύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) [26] – [27]. 1 μΙ συμπληρωματικό DNA προστέθηκε σε αντίδραση 50 μΐ που περιέχει 5 μΐ 10 Χ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης, 50 mmol /L MgCl

2, 1 μΙ dNTPs, 50 pmol με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες και 0,5 U Taq Gold ϋΝΑ πολυμεράση. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στους 95 ° C για 10 λεπτά? 35 κύκλοι στους 95 ° C για 45 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 45 δευτερόλεπτα (εκκινητή ειδικό) και 72 ° C για 45 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από μια επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά και τερματισμό σε 4 ° C. Primer αλληλουχίες ζεύγος, cDNA θραύσμα μεγέθη και θερμοκρασίες ανόπτησης ήταν ως εξής: Tg (762 bp): 5′-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 ‘και 5′-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3′ (55 ° C), ΤΡΟ (593 bp): 5’- TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 ‘και 5′-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3′ (55 ° C), NIS (179 bp): 5’-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 ‘και 5′-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3′ (57 ° C), onfFN (215 bp) : 5’-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 ‘και 5′-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3′ (55 ° C), ΟΚΤ-4 (456 bp): 5’-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 ‘και 5′-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3′ (63 ° C) , β-ακτίνη (439 bp): 5’-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 ‘και 5′-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3′ (55 ° C). Για Οκτώβριο-4 ανάλυσης, NTERA2 cDNA (θετικός μάρτυρας) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. S. Liedtke, Πανεπιστήμιο του Ντίσελντορφ, Γερμανία. Για onfFN και TTF-1, TAD-2 cDNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. CD133 και TTF-1 έκφραση αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qRT-PCR) σε μεμονωμένα δείγματα. Σύνολο 2 μg χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των επιπέδων του mRNA σε σχέση με το β-ακτίνης mRNA έκφραση. PCR εκκινητές και ανιχνευτές αγοράστηκαν από την Qiagen (Quantitect Primer Prominin1 και TTF1). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα τελικό όγκο 20 μΐ με 2 μΐ προτύπου cDNA χρησιμοποιώντας LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Germany). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με qBASE Browser που χρησιμοποιεί μια σχετική μοντέλο ποσοτικοποίηση Δ-Ct με τη διόρθωση της αποτελεσματικότητας της PCR και την ομαλοποίηση γονίδιο ενιαίο αναφοράς (β-ακτίνης: 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 ‘και 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’) [28] .

In Vitro

Πολιτισμού και Δοκιμασία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ARO /CD133

κύτταρα pos

Μετά την απομόνωση, ARO /CD133

pos και ARO /CD133

κύτταρα αρν καλλιεργήθηκαν αμέσως σε SFM συμπληρωμένο με bFGF και EGF σε μία ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρωματομετρική δοκιμασία χρησιμοποιώντας 3- (4,5 -Dimethylthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) και BrdU (χρωματομετρική) κιτ (Roche Diagnostics GmbH, Germany). Για τη δοκιμασία ΜΤΤ, ταξινομημένο ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων σε 100 μλ SFM /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν μέχρι 72 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C με ΜΤΤ? Μετά την επώαση, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO για 5 λεπτά. Η βιωσιμότητα εκτιμήθηκε από το φάσμα απορρόφησης UV στα 550 nm με Microplate Reader Μοντέλο 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Για την δοκιμασία BrdU, ταξινομημένο ARO /CD133

pos και ARO /CD133

neg απλώθηκαν σε τρυβλίο 96 φρεατίων σε 100 μλ SFM /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν μέχρι και 144 ώρες. Η βιωσιμότητα εκτιμήθηκε από το φάσμα απορρόφησης UV στα 450 nm με Microplate Reader Μοντέλο 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Αυτο Ανανέωση-Δοκιμασία των ARO /CD133

pos κύτταρα

Κατάταξη σύμφωνα ARO /CD133

pos κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. έκφραση CD133 ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής κατά τις ημέρες 0, 4, 8 και 11. Την ίδια χρονικά σημεία απόπτωση εκτιμήθηκε με Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των ARO /CD133

κύτταρα pos

Κατάταξη σύμφωνα ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6-φρεατίων σε μεθυλική SFM (HSC-CFU βασικό μέσο, ​​Miltenyi Biotec). Οι πλάκες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή για 2 εβδομάδες. Ο αριθμός των αποικιών εκτιμήθηκε με μικροσκοπική καταμέτρηση.

Η χημειοθεραπεία παράγοντες

ARO /CD133

pos και CD133

αρνητικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε SFM συμπληρωθεί με bFGF (20 ng /ml ) και EGF (20 ng /ml) με ή χωρίς σισπλατίνη (5, 10, 15 και 20 μΜ? Pharma, Αυστρία), δοξορουβικίνη (0,5, 1, 1,5 και 2 μΜ? Ebewe Pharma, Αυστρία), ετοποσίδη (10, 30 , 100 μΜ? Teva Pharma, Ολλανδία). Το ποσοστό των βιώσιμων ARO /CD133

pos και CD133

αρνητικά κύτταρα εκτιμήθηκε σε 24, 48 και 72 ώρες από την δοκιμασία ΜΤΤ και στις 48, 96 και 120 ώρες με δοκιμασία BrdU.

Για την απόπτωση αξιολόγησης, ARO /CD133

POS και CD133

neg κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την υψηλότερη συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου (20 μΜ σισπλατίνη, 2 μΜ δοξορουβικίνης και 100 μΜ ετοποσίδη) έως 120 ώρες. αξιολόγηση απόπτωσης (κασπάσης 3 δοκιμασία) εκτιμήθηκε με citometry ροής όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS v. 11 λογισμικό για Windows. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με βάση την μη παραμετρικές δοκιμές και η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε σε ρ & lt? 0.05. Για πειράματα με chemoterapics, οι διαφορές στην βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών ATC υπολογίστηκαν με το Mann-Whitney test? σ για τάση με διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου υπολογίστηκε με την W του τεστ Kendall.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση CD133

pos κύτταρα σε κυτταρικές σειρές ATC

Για να προσδιορίσει CSCs σε κυτταρικές γραμμές ATC, αναλύσαμε την έκφραση της CD133 με κυτταρομετρία ροής σε ARO, ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18 και FRO (Σχήμα 1Α). ARO και ΚΑΤ-4 έδειξε μία μέση θετικότητα των 64 ± 9% και 57 ± 12%, αντίστοιχα? ΚΑΤ-18 και FRO ήταν αρνητικές. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με qRT-PCR (Σχ. 1Β). CD133

POS κυττάρων σε κυτταρικές σειρές ARO χαρακτηρίζονταν από κυτταροπλασματική και πολωμένο εντοπισμό του αντιγόνου στην κορυφαία επιφάνεια των κυττάρων (Εικ. 1 C). Η αδιαφοροποίητη κατάσταση των κυτταρικών σειρών ATC επιβεβαιώθηκε σε PCR από την παρουσία onfFN [26] και την απουσία thyrocyte ειδικής διαφοροποίησης δείκτες Tg, ΤΡΟ και ΝΑΚ [27] (Σχ. 2Α και Β).

(Α) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CD133 σε ARO, ΚΑΤ-4, ΚΑΤ-18, και FRO κυτταρικές σειρές. Μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν θετική χρώση για CD133, γκρι γραμμές δείχνουν αρνητικό μάρτυρα με το αντίστοιχο αντίσωμα ισοτόπου. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Ανάλυση της έκφρασης CD133 σε κυτταρικές σειρές ATC με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής (σχετική κλίμακα), θεωρώντας ΚΑΤ-18 = 1. (C) Ανοσοκυτοχημεία του CD133 στην κυτταρική σειρά ARO. Τα βέλη δείχνουν ακραία και πολωμένο εντοπισμό του CD133 (20 × μεγέθυνση).

Η

Η έκφραση του θυρεοειδούς συγκεκριμένα γονίδια (Tg, TPO, NIS) (Α) και του εμβρύου δείκτη onfFN (Β) σε ARO, KAT- 4 και φυσιολογικό θυρεοειδούς με RT-PCR. TAD-2 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για onfFN mRNA. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και στα δύο πειράματα. ζεύγη bp = βάσης.

Η

C

ell πολιτισμό της ταξινομημένων ARO /CD133

κύτταρα pos

Cluster σχηματίζουν αποτελεσματικότητα των ταξινομημένων ARO /CD133

κύτταρα POS αξιολογήθηκε με ανάλυση FACS, δείχνοντας 90% CD133 θετικότητα (Σχ. 3Α). Μετά την απομόνωση, ARO /CD133

κύτταρα pos, καλλιεργήθηκαν σε SFM συμπληρωθεί με bFGF και EGF, μεγάλωσε ως ενιαίο, μη προσκολλημένα, σφαιρικά κύτταρα. Μετά από μερικές ημέρες, ARO /CD133

κύτταρα pos άρχισε να σχηματίσουν ομάδες που σταδιακά αυξήθηκαν σε αριθμό και μέγεθος, αν και δεν αποτελούν θύλακες. Αντίθετα, ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά δύσκολα συγκεντρώνονται σε ομάδες (Εικ. 3Β).

(Α) Καθαρότητα της ARO /CD133

κύτταρα θέση μετά την μαγνητική κυττάρων διαλογή αξιολογείται με κυτταρομετρία ροής. (Β) τα χαρακτηριστικά των ταξινομημένων ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά τις ημέρες 0, 3 και 10 του πολιτισμού. ARO /CD133

κύτταρα pos σχηματίζονται συστάδες οι οποίες αυξήθηκαν σε μέγεθος υπερωρίες.

Η

In vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αυτο-ανανέωση και η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των ARO /CD133

κύτταρα pos

ο πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε από ΜΤΤ και δοκιμασία BrdU. ARO /CD133

κύτταρα pos έδειξε

in vitro

αυξημένο πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά τόσο με ΜΤΤ σε 48-72 ώρες και BrdU σε 72-144 ώρες (p = 0,028 και p≤0.001, αντιστοίχως) (Σχ. 4Α και Β). Όσον αφορά κασπάσης 3, κυτταρομετρία ροής έδειξε αυθόρμητη απόπτωση σε SFM, η οποία κυμάνθηκε μετά από 144 ώρες από 0,5 έως 2% για το ARO /CD133

κύτταρα POS και 3,4 έως 8,8% για το ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). ανανέωση Αυτο εκτιμήθηκε επίσης (Σχ. 4C). CD133 έκφραση στο ARO /CD133

κύτταρα pos αρχικά μειώθηκαν από 90% την ημέρα 0-46% κατά την ημέρα 8 και διατήρησε σταθερή κατάσταση μέχρι την ημέρα 11. Η μείωση του CD133 υπερωρίες έκφραση δεν προκλήθηκε από τον κυτταρικό θάνατο (& lt? 2%, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντ ‘αυτού, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων συνεχίστηκε για ολόκληρη την περίοδο καλλιέργειας, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι ARO /CD133

κύτταρα pos χαρακτηρίζεται από ασύμμετρη ικανότητα διαίρεσης (δηλαδή η παραγωγή των δύο θυγατρικά κύτταρα, μία CD133

pos και ένα CD133

αρν). δοκιμασία σχηματισμού αποικιών επιβεβαίωσε την υψηλή ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ARO /CD133

pos, σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά. Στην πραγματικότητα, ARO /CD133

κύτταρα pos ήταν σε θέση να σχηματίσουν μια αύξηση του αριθμού των αποικιών του όγκου (p = 0,028) (Εικ. 4D και 4Ε).

(Α) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (ΜΤΤ). Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα pos. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. p & lt? 0,03. (Β) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (BrdU). Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα pos. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. p≤0.001. (C) ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ARO /CD133

κύτταρα pos. Μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ARO /CD133

κύτταρα pos αξιολογείται με κυτταρομετρία ροής. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει την βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. (D) δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε μεθυλική μέσο των ταξινομημένων ARO /CD133

pos και CD133

αρνητικά κύτταρα (40 × μεγέθυνση) (Ε) Αριθμός αποικιών της ARO /CD133

pos και CD133

αρν κύτταρα μετά από 15 ημέρες επώασης (p & lt? 0,03).

η

Θεραπεία της ARO /CD133

pos και CD133

αρνητικά κύτταρα με φάρμακα χημειοθεραπείας

ευαισθησία των ναρκωτικών αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και BrdU. ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της doxorubicin, σισπλατίνη και ετοποσίδη. ARO /CD133

κύτταρα pos έδειξε μια αξιοσημείωτη αντοχή στα φάρμακα στους τρεις παράγοντες σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου καλλιέργειας (p ≤ 0,05 για MTT και p≤0.001 για BrdU, αντίστοιχα). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα μετά από 48 ώρες της κάθε θεραπείας φαίνεται στο Σχ. 5A-F. Σταθερά με αυτά τα ευρήματα, η απόπτωση αξιολογείται με κασπάσης 3 δραστηριότητα παρουσίασαν δραματική ενεργοποίηση σε ARO /CD133

neg σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα POS σε όλα τα χρονικά σημεία που αναλύθηκαν (Σχήμα 6Α, αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με δοξορουβικίνη ). Τα ιστογράμματα στο χρονικό σημείο 72 ώρες φαίνονται στο Σχήμα 6Β. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τα άλλα φάρμακα που χρησιμοποιούνται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) ανάλυση ΜΤΤ μετά από 48 ώρες καλλιέργειας με την παρουσία 0,5, 1, 1,5 και 2 μΜ δοξορουβικίνη (Β) μετά από 48 ώρες με την παρουσία των 5, 10, 15 και 20 μΜ cisplatin (C) μετά από 48 ώρες με την παρουσία των 10, 30 και 100 μΜ ετοποσίδη. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (p ≤ 0,05). (D) (Ε) (F) αντιπροσωπεύουν ανάλυση BrdU υπό τις ίδιες συνθήκες των Α, Β, C (p≤0.001). Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά και η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα POS σε όλα τα γραφήματα.

Η

(Α) δραστηριότητα κασπάσης 3 μετά τη θεραπεία με doxorubicin. Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει ARO /CD133

κύτταρα pos. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (p≤0.001). 3 δραστηριότητα (Β) Κασπάση στο χρονικό σημείο 72 ώρες με δοξορουβικίνη. Μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει θετική χρώση για κασπάσης 3, γκρι γραμμή δείχνει αρνητικός μάρτυρας με το αντίστοιχο αντίσωμα ισοτόπου. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

In vitro

χαρακτηρισμό της ARO /CD133

κύτταρα pos

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η ARO /CD133

πληθυσμού pos, αξιολογήσαμε την συν-έκφραση των άλλων δεικτών των βλαστικών κυττάρων. Η έκφραση του mRNA της μεταγραφής του θυρεοειδούς παράγοντα-1 (TTF-1) σε ARO /CD133

pos ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στην ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, παρόμοιο με το αγοράκι-2 κυττάρων θυρεοειδούς γραμμή του εμβρύου (θετικός έλεγχος) ( Σχ. 7Α). Οκτώβριος-4 έκφραση ήταν 91 ± 3% σε ARO /CD133

κύτταρα pos

vs

5 ± 1,5% σε ARO /CD133

αρνητικά, γεγονός που υποδηλώνει τα πολυδύναμα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων του ARO /CD133

κύτταρα POS (Σχήμα 7Β). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν με ημιποσοτική PCR, χρησιμοποιώντας κυτταρική γραμμή NTERA2 ως θετικός έλεγχος (Σχήμα 7C). Ποσοτικοποίηση, εκφρασμένη ως σχέση με την πυκνότητα NTERA2, έδειξε επίπεδα Οκτώβριος-4 mRNA σε ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά σχεδόν δύο φορές χαμηλότερο σε σχέση με ARO /CD133

POS (35%

vs

62% αντίστοιχα , με NTERA2 = 100%)

(Α) qRT-PCR του TTF 1-έκφρασης mRNA σε ARO /CD133

pos και CD133

αρνητικά κύτταρα.? TAD-2 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. (Β) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ΥΧΕ-4Α σε ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά κύτταρα. Μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει θετική χρώση για Οκτώβριος-4A, γκρι γραμμή δείχνει αρνητικός μάρτυρας με το αντίστοιχο αντίσωμα ισοτόπου. (C) ποσοτικαί RT-PCR του Οκτώβρη-4 mRNA σε ARO /CD133

pos και ARO /CD133

αρνητικά κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. NTERA2 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Η

Η δείκτες μεμβράνη βλαστικών κυττάρων c-Kit -. Εκφράζεται σε ΕΤΣ (εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα) – και Thy-1 – χαρακτηριστικό των μεσεγχυματικών και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων – ήταν αρνητικές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Κατά τα τελευταία λίγα χρόνια έχουν αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευθεί που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι όγκοι προκύπτουν από ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς με διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι τα βλαστικά κύτταρα, που χαρακτηρίζεται από την αυτο-ανανέωση και την ικανότητα διαφοροποίησης, μπορεί να παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο ανάπτυξη [29], [30]. Από πολλαπλές μεταλλάξεις που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια πολλών ετών είναι απαραίτητη πριν από ένα κύτταρο γίνεται καρκινικό, τα βλαστικά κύτταρα με μεγάλη διάρκεια ζωής μπορεί να είναι οι καλύτεροι υποψήφιοι για τη συσσώρευση, όπως ο καρκίνος που προκαλεί ετερογενή κύτταρα [5], [31]. Ωστόσο, δεν είναι ακόμη σαφές κατά πόσον ή όχι αυτά τα ΚΕΠ προέρχονται από αποδιαφοροποίηση των ώριμων κυττάρων εντός των οργάνων ή από κάτοικο βλαστικά κύτταρα, τα οποία αποκτούν σταδιακά ένα κακοήθη φαινότυπο [32].

ATC είναι μία από τις πιο επιθετικές ενδοκρινικό όγκων που χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό αποδιαφοροποίηση [1]. Η ύπαρξη κάτοικος του θυρεοειδούς βλαστικών κυττάρων μπορεί να ευθύνεται τόσο για την συνεχή πολλαπλασιασμό και την ετερογένεια των βλαβών ATC [4]. Takano et al. υποτιθέμενη ότι μια στενή σχέση μεταξύ των βλαστικών κυττάρων και την καρκινογένεση μπορεί να υπάρχουν στο ATC [17], [26], [33]. ATC προφίλ γονιδιακής έκφρασης προτεινόμενες τουλάχιστον τρεις τύπους αδιαφοροποίητων κυττάρων ως προέλευση της: θυρεοειδούς βλαστικά κύτταρα, που εκφράζουν onfFN mRNA αλλά όχι Tg, με υψηλό δυναμικό διαφοροποίησης, αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να παράγουν αναπλαστικά καρκινώματα? thyroblasts, εκφράζοντας τόσο Tg και onfFN mRNA και θυλάκια που δεν αποτελούν? prothyrocytes, τα οποία είναι πιο διαφοροποιημένα από thyroblasts, εκφράζοντας Tg αλλά όχι onfFN mRNA, με την ικανότητα να σχηματίζουν θύλακες. Mitsutake et al. έχουν εντοπίσει μια πολύ μικρή πλευρά πληθυσμού (SP), υψηλού εμπλουτισμού για βλαστικά κύτταρα, σε αρκετές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του θυρεοειδούς. Ωστόσο, τόσο SP

pos και SP

πληθυσμούς αρνητικά σχηματίζεται όγκους όταν μεταμοσχεύονται σε γυμνούς ποντικούς, αποδεικνύοντας ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν να μην είναι αποκλειστικά ή ταυτόσημες με κύτταρα SP [16].

Στο παρούσα μελέτη, εμείς οι ίδιοι υποστηρίζουν ότι ATC μπορεί να προέρχονται από το θυρεοειδή βλαστικά κύτταρα. Περιγράφουμε CD133

κύτταρα POS με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων, αυξάνεται χωρίς σχηματισμό θυλάκων. Ωστόσο, μεταξύ των τεσσάρων κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν, μόνο ARO και ΚΑΤ-4 έδειξαν υψηλό ποσοστό των CD133

κύτταρα POS (64 ± 9% και 57 ± 12%, αντίστοιχα? Εικ. 1Α). Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με τις πρόσφατες παρατηρήσεις για εξαιρετικά επιθετική ηπατώματος κυτταρικές σειρές, χαρακτηρίζονται επίσης από πολύ υψηλό ποσοστό των CD133

κύτταρα pos [34]. υψηλή έκφραση CD133 σε ATC θα μπορούσε κατά συνέπεια να συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου. Ωστόσο, η απουσία αυτού του δείκτη στο FRO κυτταρικές σειρές ΚΑΤ-18 και, υποδηλώνει ότι η απλή παρουσία του CD133 δεν είναι επαρκής και πρέπει ακόμα να προσδιοριστεί άλλους δείκτες. Επιπλέον, όπως αναφέρθηκε από Takano et al. [17], διαπιστώσαμε ότι ARO και KAT-4 κυτταρικές σειρές εκφράζονται onfFN αλλά δεν Tg, TPO και ΝΑΚ, επιβεβαιώνοντας αδιαφοροποίητη κατάστασή τους.

Για να χαρακτηρίζουν καλύτερα τα λειτουργικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά αυτών των υποθετικών ΚΕΠ στο ATC, μελετήσαμε ταξινομημένα ARO /CD133

κύτταρα pos. ARO /CD133

pos κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με το CD133

αρνητικά κύτταρα (Εικ. 4Α και Β). Επιπλέον, η ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ARO /CD133

κύτταρα θέση επιβεβαιώθηκε από τη μείωση της CD133 παράλληλη έκφραση για την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, υποδεικνύοντας έτσι ασύμμετρη κατανομή, δηλαδή η παραγωγή των CD133

pos και CD133

κόρη αρνητικά κύτταρα. Ωστόσο, οι μηχανισμοί εκτός από ασύμμετρη διαίρεση (π.χ. CD133 μετα-μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω), δεν μπορεί να αποκλεισθεί. Ελάχιστη ποσοστά κυτταρικού θανάτου αποκλείσει ότι η μείωση στην έκφραση CD133 οφειλόταν σε απόπτωση (& lt? 2%).

Περαιτέρω επιβεβαίωση ότι τα περισσότερα από τα ARO /CD133

κύτταρα POS μπορεί να είναι βλαστικά /προγονικά κύτταρα προέρχεται από ανάλυση έκφρασης άλλων γονιδίων που σχετίζονται με «βλαστική ικανότητα». Παρά το γεγονός ότι οι δείκτες βλαστικών κυττάρων c-Kit και Thy-1 ήταν αρνητικές, μια ισχυρή θετικότητα βρέθηκε για Οκτώβριος-4. Οκτώβριος-4 ανήκει στην οικογένεια POU (Pit-Οκτ-Θείε) των μεταγραφικών παραγόντων που μεσολαβεί πλειοδυναμία στην ΟΚΕ, μέσω της αναστολής της ιστο-ειδική και προώθηση των βλαστικών κυττάρων γονίδια [22], [23]. ARO /CD133

pos ταξινομημένα κύτταρα ήταν έντονα θετικά για Οκτώβριος-4Α σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, και η έκφρασή τους ήταν παρόμοια με εκείνη του NTERA2 εμβρυϊκών τεράτωμα κυτταρική σειρά. Οι εκκινητές και το μονοκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας για την παραλλαγή ματίσματος πυρηνικό ΥΧΕ-4A αποκλείουν οποιαδήποτε μόλυνση ψευδογονιδίου ή αντικείμενα [24].

Ο πυρηνικός παράγοντας θυρεοειδούς ειδική μεταγραφή TTF-1 είναι ένας ομοπεδίου περιέχει πρωτεΐνη που ανήκει στην Nkx-2 κατηγορία γονιδίων ομοιοακολουθίας, η οποία απαιτείται για τη σωστή ανάπτυξη του θυρεοειδούς και χρησιμοποιείται ως δείκτης της θυρεοειδούς και του καρκινώματος του πνεύμονα [35]. TTF-1 βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη σε ARO /CD133

θέση από ό, τι στην ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, με τα επίπεδα του mRNA συγκρίσιμα με TAD-2 κυττάρων θυρεοειδούς γραμμή του εμβρύου (θετικός μάρτυρας). Αυτό σημαίνει ότι αν και όλες οι κυτταρικές σειρές ATC αποδιαφοροποιημένα (απούσα έκφραση του θυρεοειδούς-ειδικών γονιδίων, όπως η Tg, TPO και ΝΑΚ και θετικότητα για onfFN), σε ARO /CD133

poscells ένας δείκτης της θυρεοειδικής οργανογένεση εξακολουθεί να διατηρείται.

Επιπλέον, προκειμένου να χαρακτηρίσει λειτουργικά αυτά υποθετικό καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, ελέγξαμε ευαισθησία στις πιο κοινές φάρμακα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται στην ATC, δηλαδή η σισπλατίνη, η δοξορουβικίνη και ετοποσίδη. Η σισπλατίνη διασυνδέει DNA με πολλούς διαφορετικούς τρόπους παρεμβαίνει με την κυτταρική διαίρεση με μίτωση, δοξορουβικίνη αλληλεπιδρά με το DNA με παρεμβολή και αναστολή της μακρομοριακής βιοσύνθεσης και ετοποσίδη αναστέλλει το ένζυμο τοποϊσομεράση II [36] – [38]. ARO /CD133

κύτταρα pos αποκάλυψε μια σημαντική αντίσταση σε όλα τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σε κάθε χρονικό σημείο σε σύγκριση με ARO /CD133

κύτταρα αρνητικά, όπως αποδεικνύεται από σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα απόπτωσης ανιχνεύθηκαν μέσω της κασπάσης 3 (Εικ. 6). Το δυναμικό επαγωγής του αντιαποπτωτικών αντί αποπτωτικά μόρια, ή η απόφραξη του thyrocyte φυσιολογικών ρυθμιστικών μηχανισμών κυτταρικής κύκλο εργασιών, αποδείχθηκε σε άλλες ασθένειες του θυρεοειδούς, όπως η αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα [39], θα μπορούσε να εξηγήσει την αποκτήσει ικανότητα του θυρεοειδούς βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν να γίνουν πιο ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία.