Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια πολύ επιθετική ασθένεια με λίγες θεραπευτικές επιλογές. Σε αυτή τη μελέτη, η διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης κινάσης C ζήτα (ΡΚΟζ) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. ΡΚΟζ έχει δειχθεί να δρα είτε ως καταστολέα όγκων ή προαγωγό όγκου ανάλογα με το κυτταρικό περιβάλλον. Θεωρούμε ότι η έκφραση ΡΚΟζ είτε διατηρείται είτε είναι αυξημένα σε πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικών όγκων, αλλά δεν χάνεται ποτέ, συνεπής με ΡΚΟζ παίζει προαγωγικός ρόλο στη φαινότυπο καρκίνου του παγκρέατος. Γενετική αναστολή της ΡΚΟζ μειωμένη προσκολλημένων ανάπτυξη, την επιβίωση των κυττάρων και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων in vitro. Επιπλέον, η αναστολή ΡΚΟζ μειωμένη ορθοτοπική το μέγεθος του όγκου in vivo με αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την αύξηση της νέκρωσης όγκου. Επιπλέον, η αναστολή ΡΚΟζ μειωμένη μεταστάσεις όγκου in vivo, και προκάλεσε μια αντίστοιχη μείωση σε παγκρεατικά εισβολή καρκινικών κυττάρων

in vitro

. μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) είναι συχνά ουσιαστικά δραστική στον καρκίνο του παγκρέατος, και παίζει σημαντικό ρόλο σε παγκρεατικά επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της ΡΚΟζ σημαντικά μειωμένη συστατική ενεργοποίηση STAT3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

. Η φαρμακολογική αναστολή της STAT3 μιμηθεί το φαινότυπο της αναστολής ΡΚΟζ, και έκφραση ενός ουσιαστικά δραστικής κατασκεύασμα STAT3 διασωθεί το μετασχηματισμένο φαινότυπο σε ΡΚΟζ ανεπάρκεια κυττάρων. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ΡΚΟζ απαιτείται για τον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρο μετασχηματισμένο ανάπτυξη και εισβολή in vitro και in vivo ογκογένεση, και ότι STAT3 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής κατάντη των προ-καρκινογόνα αποτελέσματα των ΡΚΟζ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Citation.: Butler AM, Scotti Buzhardt ML, Li S, Smith ΚΕ, πεδία AP, Murray NR (2013) πρωτεϊνικής κινάσης C Ζέτα Ρυθμίζει τα Ανθρώπινα καρκίνο του παγκρέατος κύτταρο μετασχηματισμένο την ανάπτυξη και την εισβολή μέσω ενός μηχανισμού STAT3-εξαρτώμενη. PLoS ONE 8 (8): e72061. doi: 10.1371 /journal.pone.0072061

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 16, 2013? Αποδεκτές: 5 Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Butler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από: ΝΙΗ /NCI R03 CA143164, ΝΙΗ /NCI R01CA140290 (NRM), Daniel Ίδρυμα της Αλαμπάμα μεταδιδακτορικής έρευνας (MLS), ΝΙΗ /NCI F31 CA168117 (AMB), ΝΙΗ /NCI R01 CA081436-16 (APF), το Ίδρυμα Mayo Clinic (NRM, APF). APF είναι η Monica Flynn Jacoby Προικισμένο Καθηγητής Cancer Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα Οι συντάκτες: ένα προσωρινό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με την έρευνα αυτή έχει κατατεθεί (MSB, APF, NRM? μέθοδοι και υλικά για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, US Patent Application # 20110190390). Συν-συγγραφέας Alan Fields είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας για PLoS ONE. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι το δέκατο πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του στις ΗΠΑ, και κατέχει την τέταρτη θέση στην θνησιμότητα [1]. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια του καρκίνου του παγκρέατος είναι μικρότερη από 5% και δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά τα τελευταία 30 χρόνια. Η θνησιμότητα του καρκίνου του παγκρέατος αποδίδεται εν μέρει στην αντίσταση στην τρέχουσα χημειοθεραπείες [2]. Χαρακτηρισμό νέων οδών ογκογονικής σηματοδότησης σε καρκίνο του παγκρέατος μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση περισσότερο αποτελεσματικών θεραπευτικών στόχων για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου.

πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση για πάνω από 30 χρόνια, αφού ήταν η πρώτη χαρακτηριζόμενη ως υποδοχέας για τις προαγωγής όγκων εστέρες φορβόλης [3]. PKC είναι τώρα γνωστό ότι είναι μια οικογένεια σχετικών ισομορφές, και πρόσφατες μελέτες έχουν χαρακτηρίσει τις συγκεκριμένες ρόλους των επιμέρους ισομορφών της ευαισθησίας σε, και την ανάπτυξη του, τον καρκίνο [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], [10]. Παρά το γεγονός ότι τα μέλη της άτυπης PKC (aPKC) υπο-οικογένεια των ισομορφών PKC είναι σε θέση να δεσμεύσει και να ενεργοποιηθεί από εστέρες φορβόλης, τον πιθανό ρόλο τους στο φαινότυπο του καρκίνου έχει επίσης διερευνηθεί. Οι δύο aPKCs, PKC γιώτα (PKCι) και PKC ζήτα (ΡΚΟζ), είναι δομικά παρόμοια? Ωστόσο, τα εμβρυϊκά νοκ-άουτ κάθε aPKC αποκαλύπτει μοναδικές φαινότυπους, υποδηλώνοντας μη-περιττές λειτουργίες στην ανάπτυξη και τον καρκίνο [11], [12]. PKCι προωθεί την ανάπτυξη καρκίνου σε μοντέλα ποντικών του πνεύμονα και του παχέος εντέρου, και είναι ένα ογκογονίδιο στον πνεύμονα και καρκίνο των ωοθηκών [5], [6], [13], [14], [15]. Παρομοίως, έχουμε επιδείξει μια προ-καρκινογόνα ρόλο για PKCι σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [16]. Αντίθετα, οι δύο ρόλοι προαγωγικός όγκου και ογκοκατασταλτικά έχουν αποδοθεί σε ΡΚΟζ [4], [17], [18], ωστόσο ο ρόλος του στην καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει αξιολογηθεί. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι ΡΚΟζ είναι αυξημένη σε ένα υποσύνολο των ανθρώπινων ιστών παγκρεατικού όγκου σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα παγκρεατική επιθήλιο. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι η αναστολή της ΡΚΟζ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παρεμποδίζει σημαντικά τον φαινότυπο του καρκίνου. Τα δεδομένα μας προσδιορίζει επίσης STAT3 ως σημαντικός μεσολαβητής ΡΚΟζ στο μετασχηματισμένο ανάπτυξη και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Biospecimens ελήφθησαν από το Mayo Clinic ιστών μητρώου στο πλαίσιο ενός εγκεκριμένου πρωτοκόλλου Mayo Clinic Institutional Review Board. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής Mayo Clinic Θεσμική.

Τα δείγματα ασθενών

RNA απομονώθηκε από ένα σύνολο δειγμάτων ασθενών αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος για το οποίο κατεψυγμένα, σε συνδυασμό όγκου και μη πάγκρεας όγκου ιστός ήταν διαθέσιμο όπως περιγράφεται [16]. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) -stained τμήματα συμφωνημένα όγκου και των παρακείμενων, μη καρκινικών ιστών παγκρεατικό αναλύθηκαν για να επιβεβαιωθεί η κατάλληλη ιστολογία

Αντιδραστήρια και κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο παγκρεατικό καρκινικό κύτταρο. γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν λιγότερο από 6 μήνες. Ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2 επωαστή υγροποιημένο καλλιέργειας ιστού σε DMEM με 10% FBS, όπως συνιστάται από την American Type Culture Collection. Αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές: ΡΚΟζ, β-ακτίνη, φωσφο-STAT3 (Y705), STAT3, φωσφο-ERK1 /2, ERK1 /2 και διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling Technologies), PKCι (BD Transduction Laboratories), 5-βρωμο-2′-δεοξυουριδίνη (BrdUrd) (DakoCytomation) και FLAG (SIGMA Life Sciences).

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNAqueous Κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. TaqMan® Gene Expression αστάρι Δοκιμασία και ο ανιχνευτής σετ (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου, ποσοτική PCR (qPCR) ανάλυση των hGAPDH (Hs99999905_m1), hPKCζ (Hs00177051_m1) και 18S (Hs99999901_s1). qPCR αναλύσεις διεξήχθησαν με τη χρήση 10 ng του cDNA (GAPDH και hPKCζ) ή 2 ng cDNA (18S) σχετικά με μια Applied Biosystems 7900 θερμικό κυκλοποιητή. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SDS 2.3. Η γονιδιακή έκφραση σε παγκρεατικά όγκους και σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές κανονικοποιήθηκε προς GAPDH 18S και, αντίστοιχα. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως 2

– (

CT

(στόχος) –

CT

(ενδογενή αναφοράς)).

Η ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση της έκφρασης

οι ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. χρώση ΡΚΟζ και φωσφο-STAT3 οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Envision συν αντι-κουνελιού επισημανθέν πολυμερές-HRP (Dako). Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση Aperio ImageScope και αναλύθηκαν με λογισμικό Aperio Spectrum.

Αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ

Οι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν παρεμβολή μικρή φουρκέτα RNA (RNAi) κατασκευές στόχευσης ανθρώπινη ΡΚΟζ παράχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τη λήψη σταθερών επιμολύνσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. ΡΚΟζ RNAi # 1 κατασκεύασμα στοχεύει μια αλληλουχία στην περιοχή κωδικοποίησης του ΡΚΟζ (GTTGTTCCTGGTCATTGAGTA) και ΡΚΟζ RNAi κατασκεύασμα # 2 στοχεύει μια αλληλουχία στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του ΡΚΟζ (GACAGACGCTTGCGCCGAGAC). επιλέχθηκαν και διατηρήθηκε με συμπερίληψη του πουρομυκίνης στο μέσο καλλιέργειας πληθυσμούς κυττάρων που μεταφέρουν τα βραδέος κατασκευάσματα.

Κυττάρων της μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (CellTiter 96 Υδατικό One Solution, Promega) , όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, Panc-1 (1 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και MiaPaCa-2 (1 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για 1, 3, 5 και 7 ημέρες πριν από την δοκιμασία.

ο κυτταρικός θάνατος δοκιμασία

ο κυτταρικός θάνατος αποτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Death Detection ELISA Plus δοκιμασία (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Anchorage- ανεξάρτητες δοκιμασίες ανάπτυξης

κύτταρα MiaPaCa-2 (5 × 10

3) απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ και αξιολογήθηκε για αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

μοντέλο όγκου ορθοτοπική

Panc-1 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα (1 χ 10

6) που φέρει ένα ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί λουσιφεράση πυγολαμπίδας pSIN-διακύμανση των [22] και εκφράζοντας είτε ΝΤ [16] ή ΡΚΟζ RNAi ήταν αναμιγνύεται με αυξητικό παράγοντα μειωμένη Matrigel (Becton Dickinson) και εγχέεται στο εγγύς πάγκρεας ηλικίας 4-6 εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (

n

= 16). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγιναν υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και τα ποντίκια χορηγήθηκαν βουπρενορφίνη ως αναλγητικό αμέσως πριν και περίπου 18 ώρες μετά την χειρουργική επέμβαση για να ελαχιστοποιείται η δυσφορία των ζώων. Ποντικοί που φέρουν όγκο παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια δυσφορίας και δύο φορές την εβδομάδα για την απώλεια βάρους. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία με απεικόνιση φθορισμού. Εν συντομία, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με διάλυμα D-λουσιφερίνης (Xenogen) σε μία δόση των 150 mg /kg σωματικού βάρους, αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης βιοφωταύγειας (δαγκάνας Life Sciences-Xenogen, Hopkinton, ΜΑ). Μία ώρα πριν από την θυσία, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 100 mg /kg BrdUrd.

ορθοτοπική όγκου ανάλυση

Οι όγκοι από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ΡΚΟζ RNAi είχαν μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και αναλύθηκαν για τον πολλαπλασιασμό (BrdUrd ενσωμάτωση) με ανοσοϊστοχημεία (IHC), όπως περιγράφηκε προηγουμένως για NT RNAi όγκους [16]. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με ανίχνευση της κασπάσης-3 διάσπαση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [23]. νέκρωση όγκου προσδιορίζεται σε Η &? Ε χρώση του ιστού. λογισμικό Spectrum χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό τοις εκατό νεκρωτική περιοχή του όγκου με διαίρεση νεκρωτική περιοχή του όγκου με συνολική έκταση του όγκου. μεταστάσεις των όγκων ταυτοποιήθηκαν με μεικτό ανατομική αξιολόγηση των κοιλιακών και το στήθος όργανα μετά την ολοκλήρωση της μελέτης, και επαληθεύεται από την H & amp? Ε χρώση των μεταστατικών βλαβών όπως περιγράφεται για όγκους NT RNAi [16]

δοκιμασία κυτταρική εισβολή

Κινητή εισβολή προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους εισβολή matrigel επικαλυμμένα (BD Biosciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

4 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα απλώθηκαν σε μέσο χωρίς ορό στην κορυφή του θαλάμου, και 2.5% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον κάτω θάλαμο ϋΜΕΜ που περιέχει. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 24 ώρες στους 37 ° C και τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και ποσοτικά όπως περιγράφεται προηγουμένως [20].

Έκφραση μόνιμα ενεργών STAT3 (STAT3-C)

τα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενο-Null ή FLAG ετικέτα-αδενο-STAT3-C [24]. Η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίσθηκε δι ‘αναλύσεως ανοσοκηλιδώσεως των συνολικών κυτταρικών λυμάτων. ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε σε κύτταρα που απομονώνονται σε 60-80% συρροή.

Στατιστική ανάλυση

Αμφίδρομη ANOVA και Student

t-test

χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων.

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

ΡΚΟζ είναι αυξημένα σε ένα υποσύνολο των ανθρώπινων παγκρεατικών όγκων

Ξεκινήσαμε τη μελέτη μας με την αξιολόγηση ΡΚΟζ έκφραση σε πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικών όγκων και τον περιβάλλοντα ιστό μη-όγκου (Σχήμα 1). Κλινικές και δημογραφικές πληροφορίες για αυτό τον πληθυσμό ασθενών δημοσιεύονται [16]. Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της πρωτεΐνης ΡΚΟζ σε αντιπροσωπευτικές ιστούς παγκρεατικού όγκου αποκάλυψε ένα μεταβλητό επίπεδο έκφρασης ΡΚΟζ που εντοπίζεται τόσο στο πυρήνα και του κυτταροπλάσματος (Εικόνα 1Α). έκφραση ΡΚΟζ επίσης ανιχνεύθηκε σε ένα μεταβλητό αλλά χαμηλότερο επίπεδο σε μη-όγκου, τους τύπους παγκρεατικών κυττάρων (Σχήμα 1Β). Νησίδος και λοβιώδη κύτταρα του παγκρέατος μη-όγκου έδειξαν χαμηλή έκφραση ΡΚΟζ (Σχήμα 1Β, αριστερό πάνελ). Η έκφραση του ΡΚΟζ σε κύτταρα των πόρων ήταν παρόμοια με, ή ελαφρώς υψηλότερη από, η έκφραση στα κύτταρα των νησιδίων και λοβιώδη (Σχήμα 1Β, δεξιά πάνελ). Αξιολογήσαμε την επόμενη έκφραση ΡΚΟζ mRNA σε ένα πάνελ από 28 ζεύγη ανθρώπινου παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος και παρακείμενες, παγκρέατος μη-όγκου. έκφραση ΡΚΟζ mRNA ανιχνεύθηκε σε όλα τα 28 πρωτογενείς όγκους του παγκρέατος που αναλύθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση των ζευγών δειγμάτων έδειξε ότι η έκφραση ΡΚΟζ ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στους όγκους σε ζεύγη, μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 1 C). έκφραση ΡΚΟζ mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα στο 25% των παγκρεατικών όγκων, σε σύγκριση με το μέσο όρο της έκφρασης mRNA ΡΚΟζ στο πάγκρεας μη-όγκου, και δεν παρατηρήθηκαν όγκοι εμφάνισαν σημαντική μείωση στην έκφραση ΡΚΟζ mRNA (Σχήμα 1 D). Ανάλυση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης ΡΚΟζ mRNA και την επιβίωση του ασθενούς διεξήχθη, αλλά σε αυτή τη μικρή ομάδα δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση

Α και Β) ανίχνευση της έκφρασης IHC ΡΚΟζ σε αντιπροσωπευτικές ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινώματα (Α?. Tumor) και παρακείμενο μη καρκινικό ιστό (Β? Normal). Β) Serial τμήματα χρωματίστηκαν με Η & amp? Οι Ε παρέχονται για τη διάκριση κυψελιδικά, νησίδα (επάνω αριστερά της εικόνας, παγκρεατικών νησιδίων σκιαγραφείται) και κύτταρα των πόρων (πάνω δεξιά εικόνα). Όλες οι εικόνες με τον ίδιο πίνακα είναι τα ίδια μεγέθυνση. Μπαρ = 100 μm. Γ) Ανάλυση ποσοτικής PCR της έκφρασης mRNA ΡΚΟζ διεξήχθη επί 28 αντίστοιχα δείγματα παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και μη καρκινικών ασθενών. έκφραση ΡΚΟζ ομαλοποιήθηκε με 18S αφθονία? * P = 0.001 υπολογίζονται ζεύγη

t-test

. Δ) έκφραση ΡΚΟζ είναι σημαντικά αυξημένα σε ένα υποσύνολο των παγκρεατικών όγκων. ΡΚΟζ υπερεκφράστηκε στο 25% των παγκρεατικών όγκων αναλύθηκαν, όπως ορίζεται από την αφθονία του mRNA όγκου μεγαλύτερο από 2 τυπικές αποκλίσεις πάνω από το μέσο όρο των ΡΚΟζ mRNA αφθονία σε όλες τις παρακείμενες δείγματα παγκρέατος μη όγκου.

Η

ΡΚΟζ ρυθμίζει το μετασχηματισμένο φαινότυπο των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων in vitro

για να αξιολογηθεί απευθείας το ρόλο της ΡΚΟζ στον φαινότυπο του καρκίνου του παγκρέατος, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές RNAi κατασκευάσματα να αναστείλουν την έκφραση ΡΚΟζ σε δύο καλά χαρακτηρισμένα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, Panc- 1 (Σχήμα 2Α) και MiaPaCa-2 (Σχήμα S1A). Σταθερά επιλέγεται κυτταρικών πληθυσμών παρουσίασαν σταθερά 70% ή μεγαλύτερη αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ mRNA, με αντίστοιχη μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης ΡΚΟζ (Σχήμα 2Α και S1 Α). Επιλεκτικότητα της ΡΚΟζ στόχευση RNAi κατασκευάσματα επιβεβαιώνεται από την έλλειψη επίδρασης αυτών των κατασκευασμάτων για την έκφραση του συνδέονται στενά με άτυπα PKCι ισοένζυμο (Σχήμα 2Α και S1 Α). Η αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ οδήγησε σε μικρή αλλά σημαντική μείωση σε λογαριθμική φάση, προσκολλημένα κυτταρικής ανάπτυξης (Σχήμα 2Β και S1B) και αύξηση των βασικών κυττάρων θανάτου (Σχήμα 2C). Επιπλέον, ΡΚΟζ γκρεμίζω (KD) μειώθηκε σημαντικά παγκρεατικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων (μαλακό άγαρ σχηματισμός αποικιών) (Εικόνα 2D και S1c), υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟζ είναι κρίσιμη για την επιβίωση του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων και το μετασχηματισμένο φαινότυπο.

Panc-1 κύτταρα σταθερώς που φέρουν φακοϊό εκφράζουν είτε ελέγχου, μη-στόχευσης (ΝΤ) ή ΡΚΟζ στόχευση RNAi (Ζ1 και Ζ2) αξιολογήθηκαν για Α) ΡΚΟζ και PKCι πρωτεΐνη η έκφραση με ανάλυση ανοσοστυπώματος (επάνω) και ΡΚΟζ mRNA αφθονία από ανάλυση qPCR (κάτω)? Β) τη βιωσιμότητα των κυττάρων (ΜΤΤ χρωματομετρική ανάλυση)? Γ) κυτταρικού θανάτου (που ανιχνεύεται από ΟβΙΙ Death Detection ELISA) και δ) ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (σχηματισμός αποικίας σε μαλακό άγαρ). Για κάθε Μπαρ πάνελ = μέσος όρος των 3 ή περισσότερες επαναλήψεις ± SD και γράφημα είναι αντιπροσωπευτική των 3 ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05 vs NT

Η

ΡΚΟζ διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε παγκρεατικά ογκογένεση

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της ΡΚΟζ KD επί του σχηματισμού παγκρεατικού όγκου και την ανάπτυξη χρησιμοποιώντας ένα περιγράφηκε προηγουμένως Panc- 1 ορθοτοπικό μοντέλο όγκου [16]. Panc-1 κύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (pSIN-διακύμανση των) και είτε NT ή ΡΚΟζ RNAi εγχύθηκαν στο πάγκρεας γυμνών ποντικών για το σχηματισμό ορθοτοπική όγκους. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με ανίχνευση βιοφωταύγειας (Σχήμα 3Α), και τα ποντίκια συλλέχθηκαν 5 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. σχηματισμός όγκου παρατηρήθηκε σε όλους τους ποντικούς που ενέθηκαν με Panc-1 κύτταρα που εκφράζουν είτε RNAi κατασκεύασμα? Ωστόσο, το τελικό βάρος του παγκρέατος ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ποντίκια που φέρουν ΡΚΟζ RNAi όγκους, λόγω μειωμένο μέγεθος του όγκου (Σχήμα 3Β και 3C). Υποθέσαμε ότι, παρόμοια με την επίδραση της ΡΚΟζ KD in vitro (Σχήμα 2Β-D), το μειωμένο μέγεθος του όγκου του ΡΚΟζ KD κύτταρα Panc-1 in vivo ήταν λόγω της μειωμένης πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και των καρκινικών κυττάρων ενισχυμένη θάνατο. Το επίπεδο της ενσωμάτωσης BrdUrd, ένα μέτρο του πολλαπλασιασμού των όγκων, αξιολογήθηκε σε Panc-1 ΡΚΟζ RNAi όγκους και σε σύγκριση με το επίπεδο ενσωμάτωσης BrdUrd σε Panc-1 NT RNAi όγκους [16]. Όπως είχε προβλεφθεί, ο πολλαπλασιασμός του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη σε όγκους ΡΚΟζ RNAi σε σύγκριση με τους όγκους NT RNAi (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον, δεν παρατηρήσαμε σημαντική επίδραση της ΡΚΟζ KD στην απόπτωση όγκου, ανιχνεύεται με διασπασμένης κασπάσης-3 (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, ΡΚΟζ RNAi όγκους είχαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο νέκρωσης από ΝΤ RNAi όγκους (Σχήμα 4C και 4D). Νέκρωσης όγκου αποτελέσματα από μια συσσώρευση του κυττάρου όγκου θανάτου, η οποία μπορεί να συμβεί όταν ένας όγκος ξεπερνά παροχή αίματος του. Αν και ΡΚΟζ RNAi όγκοι είναι δραστικά μικρότερη από όγκους NT RNAi, δεν επιδεικνύουν μείωση σε όγκο πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων, όπως ποσοτικοποιείται με CD31 χρώση (Σχήμα 4Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο μειωμένος όγκος του όγκου του ΡΚΟζ RNAi παγκρεατικών όγκων είναι το αποτέλεσμα του σωρευτικού αποτελέσματος της μειωμένης πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση πάνω από την χρονική πορεία της in vivo πείραμα.

Α) Αντιπροσωπευτική απεικόνιση βιοφωταύγειας ποντικών με ορθοτοπική Panc-1 NT και ΡΚΟζ RNAi του παγκρέατος. Β) Εκπρόσωπος H & amp? Ε τομές των ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων Panc-1 NT και ΡΚΟζ RNAi. Το υπόλοιπο φυσιολογικό πάγκρεας ποντικιού σε κύκλο με μπλε χρώμα. Γ) Αναστολή της ΡΚΟζ μειώθηκε σημαντικά το πάγκρεας και ορθοτοπική βάρους του όγκου? n = 16? * P & lt?. 0.001

Η

Α) Ποσοτική ανάλυση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών ανιχνεύεται με ενσωμάτωση BrdUrd? * P & lt? 0.003. Β) Ποσοτική ανάλυση απόπτωσης όγκου ανιχνεύονται με χρώση διασπασμένης κασπάσης-3. Γ) Εκπρόσωπος H & amp? Ε βάφονται ορθοτοπική Panc-1 NT και ΡΚΟζ RNAi του παγκρέατος όγκους με περιοχές νέκρωσης που προσδιορίζονται (κίτρινο περίγραμμα) (bar = 1 mm). Πράσινη γραμμή οριοθετεί ιστό του όγκου. Δ) Ποσοτική ανάλυση της νέκρωσης όγκου σχεδιάζονται ως επί τοις εκατό της συνολικής έκτασης του όγκου? * P & lt? 0,0002. Ε) Η ποσοτική ανάλυση των αγγείωση του όγκου, όπως προσδιορίζεται με χρώση CD31 τοις εκατό περιοχής. Α-Ε)

n = 16

NT RNAi όγκους και 15 ΡΚΟζ RNAi όγκους. F) Panc-1 NT και τα κύτταρα ΡΚΟζ RNAi (Z1 και Z2) αξιολογήθηκαν για κυτταρική εισβολή μέσω Matrigel επικαλυμμένα θαλάμους. Bars = μέσος όρος των 3 ή περισσότερα αντίγραφα +/- SD και γραφική παράσταση είναι αντιπροσωπευτική 2 ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05 vs NT

Η

ΡΚΟζ παίζει σημαντικό ρόλο σε παγκρεατικά εισβολή των καρκινικών κυττάρων

Στο παγκρέατος μοντέλο ορθοτοπική όγκου, κύτταρα Panc-1 αποτελούν δύο πρωτοπαθείς όγκους και μεταστατικών βλαβών [16]. Οι μεταστάσεις στο νεφρό, το ήπαρ, το διάφραγμα, και το μεσεντέριο παρατηρήθηκαν σε περισσότερο από το 50% των ποντικών που φέρουν όγκους NT RNAi (Πίνακας 1, [16]). Αντιθέτως, δεν μετάσταση όγκου προς το μεσεντέριο ή το διάφραγμα εντοπίστηκε σε ποντίκια που φέρουν όγκους ΡΚΟζ RNAi? μόνο 2 από 15 ΡΚΟζ RNAi ποντικούς που φέρουν όγκο (13%) είχαν μεταστάσεις στα νεφρά τους, και μόνο 1 από 15 ΡΚΟζ RNAi ποντικούς που φέρουν όγκο (6%) είχαν μετάσταση ήπατος (Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με μια ανασταλτική επίδραση της ΡΚΟζ KD επί παγκρεατικού μετάσταση όγκου. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η μειωμένη μετάσταση παρατηρήθηκε σε όγκους ΡΚΟζ RNAi μπορεί να είναι δευτερεύουσα ως προς το σημαντικά μειωμένο μέγεθος των όγκων. Εάν ΡΚΟζ ρυθμίζει μετάσταση όγκου in vivo, είναι πιθανό να ρυθμίζει επίσης τις πτυχές της μεταστατικής φαινότυπο, όπως κυτταρική εισβολή, in vitro. Πράγματι, κυτταρική εισβολή μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα ΡΚΟζ RNAi, όταν συγκρίνεται με NT RNAi παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4F και S2). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ένα ρόλο για ΡΚΟζ σε παγκρεατικά εισβολή των καρκινικών κυττάρων, και είναι σύμφωνες με ένα ρόλο για ΡΚΟζ στο μεταστατικό φαινότυπο των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων in vivo.

Η

ΡΚΟζ ρυθμίζει

ενεργοποίηση STAT3

μορφοτροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής-3 (STAT3) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ενσωματώνει πολυάριθμα εξωκυτταρικά σήματα για τη ρύθμιση του καρκίνου προάγουν κυτταρικές διεργασίες [25], [26]. Συστατική ενεργοποίηση STAT3 είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα πολλών ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [27]. ενεργοποίηση STAT3 προωθεί την ογκογόνο φαινότυπο του καρκίνου του παγκρέατος, και η απώλεια της STAT3 προλαμβάνει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και εξέλιξης σε ένα μοντέλο ποντικού

Kras

μεσολάβηση παγκρεατικού καρκίνου [27], [28]. Επιπλέον, η αναστολή της δραστικότητας STAT3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μειώνει επίσης την επιβίωση των κυττάρων, την εισβολή και την ανάπτυξη του όγκου [28], [29]. Λόγω της εντυπωσιακή ομοιότητα μεταξύ της αναφερόμενης φαινότυπο της αναστολής STAT3 και του φαινοτύπου που παρατηρήσαμε με αναστολή της ΡΚΟζ, αναρωτηθήκαμε εάν έκφραση ΡΚΟζ ρυθμίζει δραστικότητα STAT3 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Μια σημαντική μείωση στην ενεργοποίηση STAT3, ανιχνεύεται ως φωσφορυλίωση του STAT3 επί Tyr705, παρατηρήθηκε σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ΡΚΟζ RNAi (Σχήματα 5Α και S3A). Επιπλέον, η ενεργοποίηση STAT3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε όγκους ΡΚΟζ RNAi σε σύγκριση με ΝΤ RNAi όγκους (Σχήμα 5Β), υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟζ ρυθμίζει την ενεργοποίηση STAT3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τόσο in vitro όσο και in vivo. Από ΡΚΟζ έχει επίσης εμπλακεί στη ρύθμιση της 2 ενεργοποίησης /ERK1 στον καρκίνο και μη καρκινικό κύτταρο τύπων [30], [31], [32], [33], αναλύσαμε την επίδραση της ΡΚΟζ RNAi για ERK1 /2 φωσφορυλίωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Σε αντίθεση με φωσφορυλίωση STAT3, /2 φωσφορυλίωση ERK1 δεν αλλοιώνεται από τη σημαντική μείωση της έκφρασης ΡΚΟζ (Σχήματα 5Α και S3A) υποδηλώνοντας ότι η έκφραση ΡΚΟζ δεν ρυθμίζει σηματοδότηση μέσω της οδού της ERK1 /2 σηματοδότηση.

Α) Αναστολή της έκφραση ΡΚΟζ μειώνει συστατική ενεργοποίηση STAT3 (ανιχνεύεται ως φωσφο-STAT3 Y705), αλλά όχι ERK1 /2 ενεργοποίηση (ανιχνεύεται ως φωσφο-ERK1 /2). ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε σε συνολικά κυτταρολύματα από Panc-1 NT και κυττάρων ΡΚΟζ RNAi (αριστερά) και ανάλυση έκφρασης των ανίχνευση ανοσοκηλίδος διεξήχθη (δεξιά)

n =

3. Β) ανίχνευση Αντιπροσωπευτικά IHC ρ-STAT3 σε ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος Panc-1 NT και ΡΚΟζ RNAi (αριστερά), bar = 50 μm. Ποσοτική ανάλυση της χρώσης pSTAT3 IHC (δεξιά). Ο-Ε) Η επίδραση του αναστολέα STAT3 (S3I-201) επί C) φωσφορυλίωση STAT3, D) ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ και Ε) κυτταρική εισβολή μέσω Matrigel επικαλυμμένα θαλάμους. Σε όλους τους προσδιορισμούς, S3I-201 χρησιμοποιήθηκε σε 100 μm και ένας ίσος όγκος DMSO χρησιμοποιήθηκε ως αραιωτικό ελέγχου. Για την ανίχνευση εισβολής, τα κύτταρα προ-αγωγή με S3I-201 ή DMSO για 48 ώρες πριν από την έναρξη της δοκιμασίας. Bars = μέσος όρος των 3 ή περισσότερα αντίγραφα +/- SD, και γραφική παράσταση είναι αντιπροσωπευτική 2 ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

αναστολή STAT3 μειώνει τον μετασχηματισμένο φαινότυπο των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος

Για να προσδιορίσετε αν μειωθεί η ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να είναι υπεύθυνη για μερικά από τα αποτελέσματα της ΡΚΟζ KD, αξιολογήσαμε η επίδραση μιας φαρμακολογικής αναστολέα του STAT3 στο μετασχηματισμένο φαινότυπο των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με S3I-201, ένα μικρό μόριο το οποίο διασπά STAT3 SH2-φωσφο-τυροσίνης αλληλεπιδράσεις [34], μειωμένη ενεργοποίηση STAT3 (σχήμα 5C και S3b) και μείωσε σημαντικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (Σχήματα 5ϋ) και κυτταρική εισβολή ( Σχήμα 5Ε και S3C), παρόμοια με την επίδραση της αναστολής ΡΚΟζ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ μειώνει δραστικότητα STAT3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, και ότι η έκφραση ΡΚΟζ και STAT3 δραστηριότητα ρυθμίζουν θετικά παγκρεατικών κυττάρων μετασχηματίζεται ανάπτυξη και εισβολή καρκίνου.

ουσιαστικά δραστική STAT3 μπορεί ανασυστήσει την μετασχηματισμένο φαινότυπο σε ΡΚΟζ RNAi καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι STAT3 είναι ένα κρίσιμο καθοδικός τελεστής του ΡΚΟζ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, αξιολογήσαμε εάν η έκφραση μιας συστατικώς δραστικής κατασκεύασμα STAT3 (STAT3-C) θα μπορούσε να σώσει τις επιδράσεις της αναστολή ΡΚΟζ σε κύτταρα Panc-1. κύτταρα Panc-1 και ΝΤ ΡΚΟζ RNAi μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει σημαία-tagged, STAT3-C ή ελέγχου (null) αδενοϊού (Σχήμα 6Α). Έκφραση των STAT3-C ανακτώνται σημαντικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των Panc-1 κύτταρα ΡΚΟζ RNAi, χωρίς να επηρεάζουν σημαντικά την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων ΝΤ RNAi (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, η μειωμένη φαινότυπος κυτταρικής εισβολής των κυττάρων ΡΚΟζ RNAi ήταν σημαντικά ανακτήθηκε με έκφραση του STAT3-C (Σχήμα 6C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η αυξημένη δραστικότητα κυτταρικής STAT3 μπορεί να διασώσει την αντι-ογκογόνο φαινότυπο των κυττάρων ΡΚΟζ RNAi, και αποδεικνύουν ότι ΡΚΟζ μεσολαβεί παγκρεατικού μετασχηματισμός των καρκινικών κυττάρων, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της ρύθμισης της δραστικότητας STAT3.

Panc-1 κύτταρα που εκφράζουν NT ή ΡΚΟζ RNAi μολύνθηκαν με αδενοϊικά κατασκευάσματα που εκφράζουν είτε null (έλεγχος), ή ιδιοσυστατικά ενεργό, FLAG-tagged STAT3 (STAT3-C). Α) ανάλυση ανοσοαποτύπωσης ρ-STAT3, STAT3, FLAG, ΡΚΟζ και έκφραση β-ακτίνης. Τα κύτταρα αξιολογήθηκαν για Β) ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ και C) την κυτταρική εισβολή μέσω Matrigel επικαλυμμένα θαλάμους. Για κάθε γράφημα: Γραμμές = μέσος όρος των 3 ή περισσότερα αντίγραφα ± SD και γραφική παράσταση είναι αντιπροσωπευτική 2 ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. * Σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με NT /null, σ & lt? 0,05? ** Σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με null-θεραπεία, σ & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Λειτουργικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο ρόλος της ΡΚΟζ στη ρύθμιση του φαινοτύπου του καρκίνου ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο του όγκου, το μοντέλο σύστημα και το στάδιο της νόσου. Για παράδειγμα, η αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή μειώνει τον πολλαπλασιασμό in vitro και καρκινικά μέγεθος in vivo? Ωστόσο, η γενετική αναστολή της ΡΚΟζ στο εντερικό επιθήλιο ποντίκι δεν επηρεάζει ογκογένεση στο μοντέλο APCmin /+ ποντικό της εντερικής έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου [7], [35]. Σε αντίθεση, η γενετική αναστολή της ΡΚΟζ σε ένα μοντέλο ποντικού της

Kras

G12D

επαγόμενη πνευμονική ογκογένεση αποκαλύπτει ένα ογκοκατασταλτικό ρόλο [4], ενώ η αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα δεν έχει επίδραση επί μετασχηματισμένα ανάπτυξη in vitro [20]. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τον ειδικό ρόλο του ΡΚΟζ στη βιολογία των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, με τη χρήση PKC ισότυπο ειδικού RNAi για αναστολή έκφρασης ΡΚΟζ. Έχουμε αποδείξει ότι ΡΚΟζ KD μειωμένη παγκρεατική πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την κυτταρική επιβίωση in vitro. Δείχνουμε επίσης ότι ΡΚΟζ KD σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μειώνονται σημαντικά μετασχηματίζονται ανάπτυξη in vitro, που αντιστοιχεί σε μια σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου in vivo. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι ΡΚΟζ απαιτείται για διατήρηση του μετασχηματισμένου φαινοτύπου των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

ΡΚΟζ έχει ενοχοποιηθεί στην επεμβατική φαινότυπο ανθρώπινων καρκίνων [36], [37], [38]. Μεσολάβηση RNAi, ειδική αναστολή της ΡΚΟζ μειώνει τον καρκίνο του μαστού και γλοιοβλαστώματος κυτταρική εισβολή in vitro [37], [38] και μειώνει προστάτη εισβολή των καρκινικών κυττάρων in vitro και in vivo [36]. Είναι ενδιαφέρον ότι κάθε μία από αυτές τις εκθέσεις αποδίδει ΡΚΟζ σε μια ξεχωριστή επεμβατική μονοπάτι σηματοδότησης, υποδηλώνοντας μια ευρεία ρόλο για ΡΚΟζ σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή [36], [37], [38]. Συνεπής με τον φαινότυπο που παρατηρείται σε άλλους καρκίνους, διαπιστώσαμε ότι η αναστολή της έκφρασης ΡΚΟζ ανέστειλε όχι μόνο την ανάπτυξη μετασχηματισμένων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, αλλά καταστέλλεται επίσης διηθητικό τους δυναμικό σε χημικό περιβάλλον. Επιπλέον, ΡΚΟζ KD μείωσε σημαντικά παγκρεατικού μετάσταση όγκου, υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟζ ρυθμίζει παγκρεατικού εισβολή των καρκινικών κυττάρων in vivo, όπως επίσης και in vitro.

Η προγνωστική αξία της έκφρασης ΡΚΟζ στον καρκίνο δεν είναι καλά τεκμηριωμένη. Ωστόσο, πολλές πρόσφατες αναφορές έχουν ενοχοποιηθεί ΡΚΟζ ως προγνωστικό δείκτη κακής έκβασης για τους ασθενείς με καρκίνο. Υψηλή ΡΚΟζ προβλέπει φτωχή συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση των ασθενών με σάρκωμα μαλακών ιστών [39]. Παρομοίως, ΡΚΟζ είναι αυξημένη σε καρκίνο του προστάτη, και υψηλή έκφραση ΡΚΟζ προβλέπει φτωχή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [36]. Αξιολογήσαμε την έκφραση της ΡΚΟζ στον καρκίνο του παγκρέατος, και διαπίστωσε ότι ΡΚΟζ ήταν σαφώς αυξημένα σε ένα υποσύνολο των καρκίνων του παγκρέατος. Ωστόσο, το μικρό μέγεθος του δείγματος μας, σε συνδυασμό με την κακή γενική πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος αποκλείεται καθορισμός μιας πιθανής προγνωστικής ρόλο της έκφρασης ΡΚΟζ. Συνεχίζεται συλλογές ιστός θα διευκολύνει τη μελλοντική διερεύνηση της ικανότητας της έκφρασης ΡΚΟζ να προβλέψει το αποτέλεσμα σε ένα μεγαλύτερο κοόρτη ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Ενώ η έκφραση ΡΚΟζ έχει πρόσφατα χαρακτηριζόμενη να είναι αυξημένα και να προβλέψει κακή επιβίωση σε διάφορους καρκίνους [36 ], [39], λίγα είναι γνωστά για την ρύθμιση της έκφρασης ΡΚΟζ. Ωστόσο, ΡΚΟζ έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται από αρκετές οδούς σηματοδοτήσεως γνωστό ότι προάγει ογκογόνο σηματοδότηση σε καρκίνο του παγκρέατος. Φωσφατιδυλινοσιτολ-3,4-5-τριςφωσφορικής (PtdIns-3,4,5-P3), το προϊόν του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης, μπορεί άμεσα δεσμεύουν και ενεργοποιούν ΡΚΟζ, και επίσης ενεργοποιεί PtdIns-3,4,5-P3-ενεργοποιημένη κινάση 1 μεσολάβηση φωσφορυλίωση φωσφοϊνοσιτιδίου εξαρτώμενη και ενεργοποίηση ΡΚΟζ [40], [41], [42]. Στο κεφάλι και το λαιμό κύτταρα καρκινώματος πλακώδους, ΡΚΟζ είναι φωσφορυλιωμένη τυροσίνη και ενεργοποιείται από τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [31]. Οι μελλοντικές μελέτες θα ερευνήσει εάν οποιοδήποτε από αυτά τα μονοπάτια, τόσο συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνο του παγκρέατος, διαμορφώνει ΡΚΟζ σηματοδότηση σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Σε αντίθεση με την παρατήρησή μας ότι η αναστολή της ΡΚΟζ κατασταλεί παγκρεατικού ανάπτυξη και μετάσταση όγκου, αναστολή γενετική της ΡΚΟζ στο

Kras

G12D

επαγόμενη από όγκους του πνεύμονα προωθεί την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου [4]. Η κατασταλτική του όγκου ρόλος του ΡΚΟζ σε Κ-ras μεσολάβηση του πνεύμονα ογκογένεση προκαλείται από την καταστολή της ενεργοποίησης STAT3 στα καρκινικά κύτταρα [4].