Οι

Αφηρημένο

Τα τοπικά αναισθητικά που χρησιμοποιούνται συχνά σε λεπτή βελόνα αναρρόφηση των αλλοιώσεων του θυρεοειδούς και τοποπεριοχική έλεγχο των επίμονες ή υποτροπιάζουσες καρκίνο του θυρεοειδούς. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα τοπικά αναισθητικά έχουν ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων συμπεριλαμβανομένης της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης σε νευρωνικά και άλλους τύπους κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η θεραπεία με λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη προκάλεσε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών τόσο 8505C και Κ1 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η λιδοκαΐνη και επάγεται βουπιβακαΐνη απόπτωση, νέκρωση και σε υψηλές συγκεντρώσεις, όπως προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής. Η λιδοκαΐνη και μπουπιβακαϊνη προκάλεσε διάσπαση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, που συνοδεύεται από ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και 7, η διάσπαση PARP, και επαγωγή υψηλότερη αναλογία του Βαχ /Bcl-2. Με βάση την μικροσυστοιχιών και την ανάλυση οδό, απόπτωση είναι η εξέχουσα αλλαγή μεταγραφική κοινά σε λιδοκαΐνη και τη θεραπεία βουπιβακαΐνη. Επιπλέον, λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη εξασθενημένο εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη 1/2 (ERK1 /2) δραστηριότητας και επαγόμενη ενεργοποίηση της κινάσης ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης. Φαρμακολογική αναστολείς της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ κινάσης και p38 ΜΑΡΚ κατέστειλε κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας για πρώτη φορά αποδεικνύουν τις κυτταροτοξικές επιδράσεις των τοπικών αναισθητικών σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς και εμπλέκουν τις ΜΑΡΚ ως σημαντικό μηχανισμό. Τα ευρήματά μας έχουν πιθανή κλινική σημασία στο ότι η χρήση τοπικών αναισθητικών μπορεί να συνεννοηθεί προηγουμένως μη αναγνωρισμένα οφέλη στην αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Χου MC, Cheng SP (2014) τοπικά αναισθητικά προκαλούν απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου θυρεοειδούς καρκίνου μέσω της Μιτογόνο Activated Protein κινάσης. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10.1371 /journal.pone.0089563

Επιμέλεια: Yong Jiang, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα

Ελήφθη: 25 Σεπτεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 22 του Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν (NSC 100 – 2.314-B-195-001-my3), και από το Memorial Hospital Mackay (MMH-10206 και MMH-E-101-10). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο κοινή όλων των ενδοκρινών καρκίνων, και η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του θυρεοειδούς αυξάνεται σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Η πλειοψηφία των καρκίνων του θυρεοειδούς είναι καλά διαφοροποιημένα με θηλώδες και θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς είναι τα πιο κοινά είδη. Αν και καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς έχει γενικά ευνοϊκή πρόγνωση, τα συνολικά ποσοστά υποτροπής θα μπορούσε να είναι τόσο υψηλό όπως 35% [3]. Επίμονη ή υποτροπιάζουσα νόσος εμφανίζεται σε μεγάλο βαθμό στο λαιμό. Επιπλέον, η ανάπτυξη της υποτροπής συνδέεται με μια υψηλότερη θνησιμότητα. Τριάντα χρόνια τα ποσοστά θνησιμότητας από καρκίνο έχουν αναφερθεί να είναι περίπου 12% σε ασθενείς με τοπική υποτροπή και 43% σε εκείνους με απομακρυσμένη υποτροπή [3].

Οι θεραπευτικές επιλογές για επίμονη ή υποτροπιάζουσα νόσο περιλαμβάνουν επιπλέον χειρουργική επέμβαση και το ραδιενεργό ιώδιο θεραπεία. Διαμερισματική ανατομή λαιμό για τοποπεριοχική υποτροπής συνιστάται από τις κατευθυντήριες γραμμές American Thyroid Association [4]. Μια άλλη εναλλακτική θεραπεία με ελπιδοφόρα αποτελέσματα είναι υπερηχογραφικό ένεση διαδερμική αιθανόλη και η καυτηρίαση με ραδιοσυχνότητες [5] – [7]. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, λιδοκαΐνη διείσδυση στην θέση παρακέντησης και των μαλακών ιστών γύρω από το επαναλαμβανόμενο όγκου είναι μια απλή και αποτελεσματική μέθοδο ελέγχου του πόνου [8]. Δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες αναφέρθηκαν εκτός από το ποιότητα εικόνας υπερήχων μπορούν να διαρρεύσουν με μεγάλη ποσότητα λιδοκαΐνης [7].

Εκτός από την καθιερωμένη δράση της αναλγησίας και της αρρυθμίας, μελέτες έχουν δείξει ότι τα τοπικά αναισθητικά έχουν ευρύ φάσμα επιδράσεων συμπεριλαμβανομένων των αντι-φλεγμονώδεις και αντιμικροβιακές ιδιότητες [9]. Πρόσφατες παρατηρήσεις της πρόσκλησης chondrotoxicity τους για προσοχή στην κλινική χρήση των ενδο-αρθρικές ενέσεις [10]. Επιπλέον, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι τα τοπικά αναισθητικά θα μπορούσε να ασκήσει ευεργετική δράσεις για τη θεραπεία του καρκίνου με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή, και τη μετανάστευση [11] – [13]. Αυτές οι επιδράσεις φαίνεται άσχετη με διαμόρφωση τους των διαύλων νατρίου [14]. Από αυτή την άποψη, έχουμε δείξει ότι η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στην τοπική κύτταρο τοξικότητα αναισθητικό που προκαλείται από κύτταρα καρκίνου του μαστού [15]. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν ότι η νευρωνική απόπτωση που επάγεται από τα τοπικά αναισθητικά διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [16], [17]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά αν παρόμοιους μηχανισμούς εφαρμόζονται σε τοπικό αναισθητικό που προκαλείται κυτταροτοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα.

Δεδομένου ότι τα τοπικά αναισθητικά που χρησιμοποιούνται συχνά σε λεπτή βελόνα αναρρόφηση του θυρεοειδούς βλαβών και τοποπεριοχική έλεγχο των επίμονη ή επαναλαμβανόμενη καρκίνο του θυρεοειδούς, θα ήταν ενδιαφέρον να μάθουμε αν τα τοπικά αναισθητικά έχουν αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Έχουμε αναφερθεί εδώ ότι χρησιμοποιούνται συνήθως τοπικά αναισθητικά, λιδοκαΐνη και μπουπιβακαΐνη, ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς σε κλινικά σχετικές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες και μικροσυστοιχιών και της οδού ανάλυσή μας, παρατηρήσαμε ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης ΜΑΡΚ ενεπλάκησαν.

Αποτελέσματα

Η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και το σχηματισμό αποικιών από τοπικά αναισθητικά

Κυτταρική βιωσιμότητα των 8505C και K1 κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς προσδιορίστηκε με επώαση με λιδοκαΐνη και μπουπιβακαϊνη σε σειριακά αραιωμένου συγκεντρώσεις για 24 και 48 ώρες. Η λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη ανέστειλε την ανάπτυξη των δύο θυρεοειδούς καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Α). Στις 24 ώρες, ο διάμεσος αποτελεσματική δόση (ED50) της λιδοκαΐνης ήταν 7,3 mM για κύτταρα 8505C και 6,8 mM για K1 κύτταρα, αντίστοιχα. Αυτά ήταν χαμηλότερη από την κοινώς χρησιμοποιείται συγκέντρωση 1% (w /v) λιδοκαΐνης (42.67 mM). Ομοίως, η ED50 σε 24 ώρες από την βουπιβακαΐνη ήταν 3,1 mM για κύτταρα 8505C και 1,3 mM για K1 κύτταρα. Και οι δύο ήταν πολύ χαμηλότερη από την κλινική συγκέντρωση 0,5% (w /v) βουπιβακαΐνης (17.34 mM).

(Α) και τα κύτταρα 8505C K1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σειριακές αραιώσεις λιδοκαΐνης και bupivacaine, μεμονωμένα ή σε συνδυασμούς, για 24 και 48 ώρες. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. (Β) Μια συντηρητική ισοβολόγραμμα αποδεικνύει ότι λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνη δρα ανταγωνιστικά να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων. ΕΔ δηλώνει αποτελεσματική δόση. Η ED50 (κόκκινο Χ), ED75 (πράσινο σταυροί), και ED90 (μπλε κύκλοι) είναι γράφημα. (Γ) Η θεραπεία με λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη οδήγησε σε μείωση του σχηματισμού αποικίας του 8505C και κυτταρικές σειρές Κ1. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. *, P & lt? 0,01

σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Για να εξεταστεί κατά πόσον η κυτταροτοξική δράση περιορίζεται σε αμίδιο τύπου τοπικά αναισθητικά, ο καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα, επίσης, αντιμετωπίζονται με έναν εστέρα τύπου σε τοπικό επίπεδο. αναισθητικά, προκαΐνη. Η ED50 ήταν 39,6 mM και 30,9 mM, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση συσχετίζεται με την ισχύ, αλλά όχι την τάξη, των τοπικών αναισθητικών. Επιπλέον, για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι οι αλλαγές στο ρΗ ή ωσμωτικότητας θα αντιπροσωπεύει την κυτταροτοξικά αποτελέσματα, το ρΗ και οσμοριαλικότητα του μέσου καλλιέργειας για προσδιορίστηκαν πειράματα. Δεν υπήρχαν σημαντικές μεταβολές του ρΗ ή ωσμωτικότητας (Εικ. S1), υποδεικνύοντας ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις ήταν φαρμακολογική στη φύση.

συνεργία φαρμάκου προσδιορίστηκε από τον δείκτη συνδυασμού (CI) και αναλύσεις ισοβολόγραμμα σύμφωνα με τη μέση ισχύ μεθόδους (Σχ. 1Β). Η CI ήταν 1,17 ± 0,03 για τα κύτταρα 8505C και 1,14 ± 0,06 για τα κύτταρα Κ1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός της λιδοκαΐνης και bupivacaine απέδωσε ελαφρά ανταγωνισμός.

Επιπλέον, οι επιδράσεις των τοπικών αναισθητικών επί της ανάπτυξης των κυττάρων του όγκου προσδιορίστηκαν με κλωνογόνο προσδιορισμό. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 1C. Ένα σημαντικό δοσοεξαρτώμενη μείωση σε αποικίες παρατηρήθηκε σε 8505C και Κ1 κύτταρα. καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα δεν σχηματίζουν αποικίες μετά από θεραπεία με λιδοκαΐνη & gt? 4 mM ή βουπιβακαίνη & gt?. 0.8 mM

Η επαγωγή της απόπτωσης των τοπικών αναισθητικών

Για να προσδιοριστεί η βάση της μειωμένης κυτταρικής βιωσιμότητας, των κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανάλυση του κύκλου. Δεν υπήρξε καμία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς σε επεξεργασία με λιδοκαΐνη και bupivacaine για 6, 24, και 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στο κλάσμα υπο-G1 (υποδιπλοειδή) μετά από θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine (Εικ. 2Α). Χρησιμοποιήσαμε επίσης αννεξίνης V /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση για περαιτέρω επιβεβαίωση των τοπικών αναισθητικών απόπτωση στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η θεραπεία με λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη οδήγησε σε απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η νέκρωση παρατηρήθηκε επίσης σε υψηλές συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης και bupivacaine. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η καταστολή της ανάπτυξης των τοπικών αναισθητικών στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα περιλαμβάνει επαγωγή της απόπτωσης.

(Α) και τα κύτταρα 8505C K1 υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης και bupivacaine για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα DNA σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. (Β) κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine για 48 ώρες, και τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με φθορεσκεΐνη-συζευγμένη αννεξίνη V και ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. *, P & lt? 0,05

σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Η αξιολόγηση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας

Η μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι μία από τις πρώτες εκδηλώσεις στην απόπτωση.. ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την κατιοντική βαφή JC-1, ένα εξαιρετικά ειδικό ανιχνευτή για την ανίχνευση μεταβολών στη μιτοχονδριακή ΔΨ

m. JC-1 σχηματίζει συσσωματώματα κόκκινο σε άθικτα μιτοχόνδρια, ενώ ο πράσινος φθορισμός οφείλεται στο σχηματισμό JC-1 μονομερών σε χαμηλό δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη αύξησε σημαντικά το σχηματισμό JC-1 μονομερών σε 8505C και Κ1 κύτταρα σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το ποσοστό των κυττάρων με χαμηλή ΔΨ

m ήταν ελαφρώς χαμηλότερη από το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε επεξεργασία με τοπικά αναισθητικά στις ίδιες συγκεντρώσεις.

(Α) και 8505C K1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης και bupivacaine για 16 ώρες. ΔΨ

αλλαγή m παρακολουθήθηκε με φόρτωση με JC-1 και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. *, P & lt? 0,05

έναντι

ελέγχου. (Β) κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με λιδοκαΐνη (6 mm) και μπουπιβακαϊνη (2 mM) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Το κυτόχρωμα c απελευθέρωση από μιτοχόνδρια προς κυτοσόλιο προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και ανιχνεύθηκαν και πάλι με ένα αντίσωμα έναντι της ακτίνης για ίση φόρτωση.

Η

επόμενο επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε αν το κυτόχρωμα c απελευθερώθηκε από μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο. Όπως ήταν αναμενόμενο, ένα υψηλότερο επίπεδο του κυτοχρώματος c μετρήθηκε σε κυτταροδιάλυμα και στις δύο κυτταρικές γραμμές μετά από θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine (Σχ. 3Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς με τοπικά αναισθητικά οδηγεί στην ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι.

ενεργοποίηση κασπασών από τοπικών αναισθητικών

απελευθέρωση του κυτοχρώματος c έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν οι μεταγενέστεροι κασπάσες που τελικά απαιτείται για να επάγει απόπτωση. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε αν η ενεργοποίηση της κασπάσης συμμετείχε στην επαγωγή απόπτωσης με τοπικά αναισθητικά. Η θεραπεία με λιδοκαΐνη και μπουπιβακαϊνη ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και κασπάσης 7, και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε 8505C και Κ1 κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο (Σχ. 4Α). Επιπλέον, προσδιορισμός της κασπάσης χρωματομετρικό υπόστρωμα έδειξε ότι η δραστικότητα κασπάσης 3 αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο στα κύτταρα 8505C μετά από θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine (Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης παίζει σημαντικό ρόλο στην απόπτωση θυρεοειδούς καρκίνο κυττάρου που διεγείρεται από τοπικά αναισθητικά

(Α) και τα κύτταρα 8505C K1 υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης (L6, 6 mM?. L12, 12 mM) και μπουπιβακαϊνη (Β2, 2 mM? Β4, 4 mM) επί 16 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και δείγματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. C, έλεγχος. PARP, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση. (Β) Δράση της κασπάσης 3 σε προϊόντα λύσης κυττάρου από κύτταρα 8505C σε επεξεργασία με λιδοκαΐνη (12 mM) και μπουπιβακαϊνη (4 mM) για διαφορετικές χρονικές περιόδους προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία χρωματομετρικού πρωτεάσης. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 συμμετέχουν στην αποπτωτική διαδικασία λειτουργώντας ως υποκινητές (

π.χ.

, Bax) ή αναστολείς (

π.χ.

, Bcl-2). Για να ενεργοποιήσετε τη μιτοχονδριακή αποπτωτικό μονοπάτι, ενεργοποιημένα Βαχ σχηματίζει ολιγομερή πόρου και καταλήγει στην διαπερατότητας της μιτοχονδριακής εξωτερικής μεμβράνης. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με λιδοκαΐνη και βουπιβακαίνη οδηγήσει σε μείωση των επιπέδων Bcl-2 με ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων Βαχ (Σχ. 4Α). Ως εκ τούτου, τοπικά αναισθητικά μεταβάλλουν τα επίπεδα πρωτεΐνης των βασικών μελών της οικογένειας Bcl-2, κατά τρόπο που να ευνοεί την αύξηση της αναλογίας του Βαχ /Bcl-2, η οποία μπορεί να συνεισφέρει στην ευαισθησία του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων σε απόπτωση.

ανάλυση των υπογραφών γονιδιακής έκφρασης που επηρεάζονται από τα τοπικά αναισθητικά

για την αναγνώριση υπογραφών γονιδιακής έκφρασης που συνδέονται με βιολογικές λειτουργίες των τοπικών αναισθητικών, μικροσυστοιχιών και εμπλουτισμός μονοπάτι ανάλυση πραγματοποιήθηκε για σύγκριση σχήματα έκφρασης σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 8505C λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνη. Οι δέκα οδοί που προσδιορίζονται από την ανάλυση εμπλουτισμού μονοπάτι που παρατίθενται στους Πίνακες 1 και 2. Είναι αξιοσημείωτο ότι το πιο σημαντικό μεταγραφική αλλαγή στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα κατεργασμένα με τοπικά αναισθητικά είναι η απόπτωση. Άλλες οδοί κοινά σε λιδοκαΐνη και τη θεραπεία βουπιβακαΐνη περιλαμβάνουν κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση και μυελοειδή διαφοροποίηση. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε

in silico

εργαλεία από Ingenuity για τον εντοπισμό οδών με πληροφορίες που αφορούν μοριακό μηχανισμό του καρκίνου. Ενσωμάτωση δεδομένα μικροσυστοιχιών από κύτταρα επεξεργασμένα με λιδοκαΐνη και μπουπιβακαΐνη, ανάλυση μονοπάτι πρότεινε ότι εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) 1/2 και p38 ΜΑΡΚ είναι σημαντικά πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε απόκριση στη θεραπεία με τοπικά αναισθητικά (Εικ. S2).

η

Ρύθμιση του ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση σηματοδότησης

μικροσυστοιχιών και τον εμπλουτισμό της οδού ανάλυσή μας δείχνει ότι ΜΑΡΚ πιθανώς εμπλέκονται στους μηχανισμούς που μεσολαβούν δράση των τοπικών αναισθητικών για τον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Για να εξεταστεί αυτή πιθανή σχέση, συνολικό κυτταρικό πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από 8505C και Κ1 κύτταρα κατεργασμένα με λιδοκαΐνη (12 mM) και μπουπιβακαϊνη (4 mM) για διάφορες χρονικές περιόδους, και προϊόντα λύσης ανοσοστυπώθηκαν με ειδικά αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένων και συνολική ERK1 /2, p38 , και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, παρατηρήθηκε μειωμένη φωσφορυλίωση των ERK1 /2. Λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνη αυξηθεί σημαντικά φωσφορυλίωση της p38 και JNK. Η λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη δεν είχε καμία αξιοσημείωτη επίδραση στη συνολική ρ38 και επίπεδο πρωτεΐνης JNK.

8505C (Α) και K1 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λιδοκαϊνη (12 mM) και μπουπιβακαϊνη (4 mM) για διάφορες χρονικές περιόδους , και τις δραστηριότητες της ERK, ρ38, JNK και εξετάστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας φωσφο-εξειδικευμένα αντισώματα. Μετρήθηκαν επίσης τα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης ERK, p38 και JNK.

Η

Συνέπειες της αναστολής της μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται

Στη συνέχεια, θα θέλαμε να γνωρίζουμε εάν οι διακυμάνσεις της μονοπάτια ERK1 /2, p38 ΜΑΡΚ, και JNK σηματοδότησης αντιπροσωπεύουν απόπτωση που διεγείρεται από τοπικά αναισθητικά. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε τις επιδράσεις των ειδικών αναστολέων στην ενεργοποίηση κασπάσης και διάσπαση PARP. PD98059 είναι ένας αναστολέας της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ κινάσης (ΜΕΚ), αναστέλλοντας έτσι τη φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ. SB203580 είναι ένας εκλεκτικός, αναστρέψιμος, και ΑΤΡ-ανταγωνιστικός αναστολέας της p38 ΜΑΡΚ, ενώ SP600125 είναι ένας αναστολέας JNK anthrapyrazolone που ανταγωνίζεται με ΑΤΡ για να αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του c-Jun. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α και 6Β, PD98059 και SB203580, αλλά όχι SP600125, μείωσε την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και διάσπαση της PARP. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με κασπάσης 3 δοκιμασία δραστικότητας (Σχ. 6C). Ταυτόχρονης θεραπείας με PD98059 ή SB203580 καταστέλλεται δράση της κασπάσης 3, ενώ SP600125 παραδόξως αυξημένη δραστικότητα κασπάσης 3 μετά από θεραπεία με τοπικά αναισθητικά. Αυτά τα δεδομένα σύμφωνος με τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμπλουτισμού οδού (Εικ. S2) ότι ERK1 /2 και p38 ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται από τοπικά αναισθητικά.

κύτταρα 8505C (Α) και Κ1 (Β) ήταν συν-επεξεργάζονται με 30 μΜ PD98059 (PD), 30 μΜ SB203580 (SB), ή 30 μΜ SP600125 (SP) εκτός από 12 mM λιδοκαΐνη (L) ή 4 mM βουπιβακαίνη (Β) για 16 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και δείγματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. C, έλεγχος. C3, κασπάση 3. PARP, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση. (C) Δράση της κασπάσης 3 σε προϊόντα λύσης κυττάρου από κύτταρα 8505C σε επεξεργασία με λιδοκαΐνη (12 mM) και μπουπιβακαϊνη (4 mM), με ή χωρίς ειδικούς αναστολείς για 24 ώρες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία χρωματομετρικού πρωτεάσης. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. *, P & lt? 0,01

σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Έχει περισσότερο από έναν αιώνα από την πρώτη συνθετική τοπικό αναισθητικό εισήχθη στις αρχές του 1900.. Τα τοπικά αναισθητικά δεσμεύουν αναστρέψιμα σε μια συγκεκριμένη θέση υποδοχέα εντός των καναλιών νατρίου και ιόντος μπλοκ κίνηση. Πίστευαν ότι οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες με ανάκτηση της λειτουργίας των νεύρων και χωρίς βλάβη των νευρωνικών κυττάρων. Ωστόσο, οι εκθέσεις των μόνιμων νευρολογική βλάβη έχουν προκαλέσει ανησυχίες για την νευροτοξικότητα των τοπικών αναισθητικών [18]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι τα τοπικά αναισθητικά μπορεί να προκαλέσει ταχεία θάνατο των νευρώνων μέσω της ενεργοποίησης της απόπτωσης και νέκρωσης [19], [20]. Επιπλέον, ένας αριθμός από μελέτες έχουν αναφέρει τοπικό αναισθητικό τοξικότητα σε άλλους τύπους κυττάρων [21] – [23]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε πρώτον το άμεσο αποτέλεσμα της λιδοκαΐνης και αναστέλλοντας την ανάπτυξη των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων bupivacaine.

Οι μηχανισμοί της κυτταρικής τοξικότητας από τοπικά αναισθητικά δεν έχουν πλήρως καθορισθεί. Σε κύτταρα U937 ιστιοκυτταρικό λέμφωμα, λιδοκαΐνη επαγόμενη απόπτωση σε συγκεντρώσεις κάτω των 12 mM και προκαλούμενη νέκρωση σε συγκεντρώσεις άνω των 15 mM [24]. Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν αναφερθεί από άλλους [19], [20], [25]. Σε αυτή τη μελέτη, τόσο η απόπτωση και νέκρωση συμμετέχουν σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από τοπικά αναισθητικά. Περιέργως, μια μικρή ανταγωνισμός ταυτίστηκε με συνδυασμό της λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνης. Φαίνεται πιθανό ότι η λιδοκαΐνη και βουπιβακαίνη προκαλεί κυτταρικό θάνατο με έναν παρόμοιο μηχανισμό. Όταν ένα κύτταρο δεν είναι σε θέση να πεθάνει με απόπτωση, μπορεί να υποβληθούν σε νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Είναι γνωστό ότι τα επίπεδα του ΑΤΡ είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της εκδήλωσης του κυτταρικού θανάτου [26], [27]. Η λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη δείχθηκαν να μειώνουν τα επίπεδα ΑΤΡ και η βιωσιμότητα των κυττάρων μελανώματος [28]. Ο τρόπος θανάτου κυττάρου εξαρτάται πιθανότατα από τη διάρκεια της έκθεσης και συγκεντρώσεων τοπικών αναισθητικών.

μιτοχονδριακού energetics επηρεαστεί από τοπικά αναισθητικά μπορεί να ευθύνεται για την μείωση των επιπέδων ΑΤΡ. Τα τοπικά αναισθητικά μπορούν να φτάσουν τα μιτοχόνδρια και αυτή η επίδραση εξαρτάται από τη λιπιδική διαλυτότητα του τοπικού αναισθητικού [29] υψηλά. Κλινική και πειραματική μυοπάθεια που προκαλείται από βουπιβακαϊνη έχει αναφερθεί ότι προκύπτει από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και το μεταβολισμό μειωμένη οξειδωτική ενέργεια [30], [31]. Συγκεκριμένα, βουπιβακαΐνη κατέστειλε κυτταρική αναπνοή μέσω της αναστολής των συμπλοκών Ι και III, η οποία συνοδεύεται με παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [32]. Irwin

et al.

Έχουν δείξει ότι μυοτοξικότητα βουπιβακαΐνης στηρίχθηκε στην ενεργό οξειδωτικό μεταβολισμό, επειδή πολύ γλυκολυτικό εκτείνοντα μακρού ήταν ανθεκτικά σε βουπιβακαΐνη που προκαλείται από την τοξικότητα [30]. Παρ ‘όλα αυτά, τα καρκινικά κύτταρα παράγουν κυρίως ενέργειας μέσω γλυκόλυσης (φαινόμενο Warburg) [33]. Τα ευρήματά μας συμφωνούν με εκείνα των λίγων εκθέσεις που αποδεικνύουν ότι μιτοχονδριακή δυσλειτουργία θα μπορούσε επίσης να προκαλείται από τοπικά αναισθητικά σε κακοήθη κύτταρα όγκου [24], [25], [34].

Τα μιτοχόνδρια είναι απαραίτητα ρυθμιστές της απόπτωσης , νέκρωση και αυτοφαγία [27]. Η εγγενής (μιτοχονδριακό) μονοπάτι της απόπτωσης προκαλείται από την απελευθέρωση της προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων κυτοχρώματος c. Στα πειράματά μας, τοπικά αναισθητικά αυξημένη προ-αποπτωτικών έκφραση Bax και ρυθμίζεται προς τα κάτω την έκφραση Bcl-2, που οδηγεί σε μια υψηλότερη αναλογία μεταξύ προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών. Αυτό αυξημένη αναλογία Bax /Bcl-2 διευκολύνει την απελευθέρωση του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c, η οποία στη συνέχεια προκαλεί ενεργοποιήσεων του καταρράκτη κασπάσης που διασπούν PARP σε ανενεργούς θραυσμάτων. Ωστόσο, λιδοκαΐνη και βουπιβακαΐνη προωθούνται μιτοχονδριακή ζημία σε βαθμό μικρότερο από εκείνο της απόπτωσης που επάγεται από τις ίδιες συγκεντρώσεις του τοπικού αναισθητικού. Αυτό υποδηλώνει ότι μία διαδικασία μιτοχόνδρια ανεξάρτητη μπορεί επίσης να παίζει κάποιο ρόλο. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμπλουτισμού οδού (Εικ. S2), στην οποία συμμετείχαν μεταγραφική μεταβολές στα συστατικά οδού του υποδοχέα θανάτου.

Cellular μικροσυστοιχίες είναι ισχυρά εργαλεία για την πειραματική ταυτοποίηση νέων φαρμακευτικών στόχων και φαρμακογονιδιωματική . UNAMI και οι συνεργάτες ανέφεραν ότι κατ ‘αρχάς τα γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση μεταγραφικώς ρυθμίστηκαν με βουπιβακαϊνη σύμφωνα με την ανάλυση μικροσυστοιχιών [34]. Πρόσφατα, Lucchinetti

et al.

Έδειξαν ότι πολλαπλά μεταγραφικά προγράμματα που σχετίζονται με την κυτταρική διαφοροποίηση, ογκογένεση και μετάσταση επηρεάστηκαν αρνητικά από ροπιβακαϊνη [35]. Οι συγγραφείς υποθέτουν ότι αυτό σημαίνει νέα λογικές για την περιεγχειρητική χρήση των τοπικών αναισθητικών σε ασθενείς με καρκίνο. Τα δεδομένα μας είναι σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα και έδειξε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των τοπικών αναισθητικών που προκαλείται από μεταβολές στην έκφραση γονιδίου και την απόπτωση. Επιπλέον, έχουμε προσδιορίσει ότι ΜΑΡΚ μονοπάτι εμπλέκεται σε μοριακούς μηχανισμούς της απόπτωσης που επάγεται από τοπικά αναισθητικά.

Σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων, βουπιβακαΐνης και ροπιβακαϊνη βρέθηκαν να ενεργοποιούν ρ38 ΜΑΡΚ και JNK, αλλά δεν ERK1 /2 [16] . Περαιτέρω, η φαρμακολογική αναστολή αυτών των κινασών εξασθενίζει νευροτοξικότητα

in vitro

. Οι συγγραφείς παρατήρησαν ότι αξονικό εκφυλισμό που προκαλείται από λιδοκαΐνη παρεμποδίζεται από αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ αλλά όχι με αναστολή κασπάσης [36]. Harato

et al.

Επίσης έδειξαν ότι η θεραπεία αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ εξασθένησε την δραστικότητα κασπάσης 3 και του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από βουπιβακαϊνη [37]. Σε μια άλλη μελέτη, μονοπάτι ρ38 ΜΑΡΚ εμπλέκεται στην βουπιβακαΐνη-επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y [17]. Σύμφωνα με τα ευρήματα στη νευρωνική απόπτωση, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην τοπικά αναισθητικά απόπτωση στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Αρνητική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού είναι μία εντόνως διατηρημένη και σημαντική λειτουργία της ρ38α σε διάφορους τύπους κυττάρων [38]. Είναι ενδιαφέρον, αυξορρυθμίζεται δραστηριότητα ρ38α έχει αναφερθεί σε θηλώδη και θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς [39]. Η έννοια υποστηρίζεται από την βασική έκφραση των πρωτεϊνών φωσφο-ρ38 σε αυτή τη μελέτη (Εικ. 5). Ο διπλός ρόλος για ρ38 ΜΑΡΚ στη βιολογία του καρκίνου του θυρεοειδούς παραμένει ουσιαστικά ανεκμετάλλευτο περιοχή παρά οδού Ras-Raf-ΕΚΚ έχουν εκτεταμένα μελετηθεί στον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Στην παρούσα μελέτη, η δραστηριότητα ERK1 /2 καταστάλθηκε από λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνη. Joo

et al.

Απέδειξαν ότι η λιδοκαΐνη κατέστειλε σημαντικά την αυξημένη απόκριση ERK1 /2 σε ένα μοντέλο αρουραίου του νευροπαθητικού πόνου [40]. Πιο πρόσφατα, λίθιο δείχθηκε να προστατεύει έναντι βουπιβακαΐνη επαγόμενη νευρωνική κάκωση μέσω αντιστρέφοντας την καταστολή της ERK1 /2 σηματοδότηση [41]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για μια στιχομυθία μεταξύ ΜΑΡΚ. Για παράδειγμα, ρ38 και ενεργοποίηση μονοπατιού JNK στην επαγωγή της απόπτωσης μπορεί να ρυθμίζει αρνητικά την ERK μονοπάτι [42]. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι υπάρχει μια παράδοξη μείωση της ενεργοποίησης της κασπάσης μετά τη θεραπεία PD98059. Πολλές γενετικές αλλοιώσεις έχουν ενοχοποιηθεί στον καρκίνο του θυρεοειδούς, και η ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού Ras-Raf-ΕΚΚ είναι πιο συχνή [43]. Η αναστολή των ΜΑΡΚ οδού καρκίνο του θυρεοειδούς συλλήψεις κυττάρων σε φάση G1 [44]. Ως εκ τούτου, μια πιθανή εξήγηση για τα αποτελέσματα μας είναι ότι ERK1 /2 αναστολή αυξημένη ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς σε άλλους μηχανισμούς αναστολής της ανάπτυξης, όπως αναστολή του κυτταρικού κύκλου και νέκρωση, οι οποίες δεν περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση της κασπάσης.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας αποκρυπτογραφηθεί των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τοπικά αναισθητικά στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, παρουσιάζοντας τη συμμετοχή της MPAK οδών σηματοδότησης και προτείνοντας πιθανά οφέλη από τη χρήση των τοπικών αναισθητικών στην κλινική πράξη.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

το ανθρώπινο καρκίνωμα του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές 8505C και Κ1 είχαν αγοραστεί από την γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία) και η Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (ECACC, Salisbury, Ηνωμένο Βασίλειο), αντίστοιχα. κύτταρα 8505C καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen /Gibco, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Κ1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Gibco) αναμίχθηκαν με F12 του Ham (Gibco) και MCDB 105 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) μέσο σε 2:01:01 αναλογίες, συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 mM L- γλουταμίνη. Τόσο 8505C και Κ1 έχουν επικυρωθεί να είναι μοναδικό καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές [45]. Λιδοκαΐνη, βουπιβακαΐνη, προκαϊνη, PD98059, SB203580, και SP600125 ελήφθησαν από τη Sigma. Ωσμωτικότητα του μέσου καλλιέργειας για πειράματα αναλύθηκε με τη μέθοδο της κατάθλιψης σημείο πήξης χρησιμοποιώντας ένα προηγμένο 3320 Micro Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, ΜΑ).

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας και ο συνδυασμός φαρμάκων ανάλυση

τηλέφωνα δοκιμασία βιωσιμότητας έγινε εις τριπλούν για κάθε πείραμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46]. Εν συντομία, 8505C και Κ1 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων μία ημέρα πριν προστέθηκε λιδοκαϊνη και βουπιβακαΐνης (μεμονωμένα ή σε συνδυασμούς) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Για την θειαζολυλο μπλε βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ) χρωματομετρική δοκιμασία, 100 μΐ αντιδραστηρίου ΜΤΤ (5 mg /ml? Sigma) προστέθηκε στην κυτταρική καλλιέργεια και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης μετατρέπονται από τετραζολίου άλατα από βιώσιμα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν με οξυνισμένη ισοπροπανόλη. Η απορρόφηση μετρήθηκε με Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) σε μήκος κύματος 570 nm. Η απορρόφηση των κυττάρων ελέγχου (επωάστηκαν χωρίς φάρμακα) ορίσθηκε ως 100%.

συνεργία φαρμάκου προσδιορίστηκε από την CI και ισοβολόγραμμα αναλύσεις σύμφωνα με τις μεθόδους του μέσου αποτελέσματος που περιγράφεται από τους Chou και Talalay [47]. Με βάση τις καμπύλες δόσης-απόκρισης από προσδιορισμούς ΜΤΤ, υπολογίστηκαν οι τιμές CI. Συνέργεια, προσθετική και ανταγωνισμού ορίζονται ως CI & lt? 1, CI = 1 και CI & gt? 1, αντίστοιχα. Στο γράφημα ισοβολόγραμμα, σημεία συνδυασμό στοιχείων που εμπίπτουν στο πάνω και κάτω από την πλάγια γραμμή αντιπροσωπεύουν ένα πρόσθετο, ανταγωνιστική και συνεργική επίδραση, αντίστοιχα.

Colony σχηματισμό δοκιμασία

Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας , 400 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης και βουπιβακαίνης από την ημέρα 2. Μετά από 8 έως 15 ημέρες, οι αποικίες χρώθηκαν με 3% κρυσταλλικό ιώδες και οι αποικίες που περιέχουν & gt?. 50 κύτταρα μετρήθηκαν

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η επίδραση της λιδοκαΐνης και βουπιβακαΐνης επί του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με χρώση ΡΙ και κυτταρομετρία ροής [48]. Μετά τη θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine για 6, 24, και 48 ώρες, ο καρκίνος του θυρεοειδούς τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν απαλά, και μονιμοποιήθηκαν σε 70% ψυχρή αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα (1 χ 10

6) επωάστηκαν με RNase Α για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και χρωματίστηκαν με διάλυμα ΡΙ χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου DNA BD Cycletest Plus (BD Biosciences, San Jose, CA) στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο FASCalibur ροής (BD Biosciences) εφοδιασμένο με λογισμικό CellQuest Pro. Η κατανομή των κυττάρων σε G0 /G1, S και G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ΜΕ). Ως εκτίμηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων, το ποσοστό των κυττάρων που υποδιπλοειδή υπολογίστηκε στο ιστόγραμμα του DNA.

Ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης

κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την αννεξίνη V-ισοθειοκυανικό φλουορεσκεΐνης ( FITC) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. τα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις λιδοκαΐνης και bupivacaine για 24 έως 72 ώρες. Αμφότερα τα επιπλέοντα και συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν, που ακολουθείται από επώαση με 5 μΐ αννεξίνης V-FITC και 5 μΙ ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, προστέθηκαν 400 μΙ δέσμευσης ρυθμιστικού διαλύματος, και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε ανάλυση.

Προσδιορισμός του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ

m)

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκε με κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση του ΔΨ

m-εξαρτώμενη φθορίζουσα χρωστική JC-1 (CS0390? Sigma). JC-1 είναι μία λιπόφιλη, κατιονική χρωστική ότι αυτό μπορεί επιλεκτικά να τεθεί σε μιτοχόνδρια, και υποβάλλεται σε μια αντιστρεπτή μεταβολή της εκπομπής φθορισμού, ανάλογα με το ΔΨ

m. Υγιή κύτταρα με υψηλή ΔΨ

m θα αποτελέσουν JC-1 αδρανών υλικών και φθορίζουν κόκκινα, ενώ εκείνα αποπτωτικά κύτταρα με χαμηλές ΔΨ

m θα περιέχουν μονομερή JC-1 και φθορίζουν πράσινο. Μετά τη θεραπεία με λιδοκαΐνη και bupivacaine για τον αναφερόμενο χρόνο, τα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με JC-1 για 20 λεπτά στους 37 ° C σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα στη συνέχεια υπόκεινται σε κυτταρομετρία ροής.

Western ανάλυση κηλίδος

Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, ποσοτικοποιούνται, και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49].