Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα στοιχεία συνδέει τον καρκίνο του προστάτη με υψηλά επίπεδα χοληστερόλης, με τη χοληστερόλη είναι σημαντικό; πρώτη ύλη για την κυτταρική ανάπτυξη. Εντός του κυττάρου, ομοιόσταση της χοληστερόλης διατηρείται από δύο παράγοντες μεταγραφής κύριο: στερόλη-ρυθμιστικό στοιχείο δέσμευσης πρωτεΐνης 2 (SREBP-2) και του υποδοχέα του ήπατος X (LXR). Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι ο υποδοχέας των ανδρογόνων, ένας σημαντικός παίκτης στο κελί του προστάτη φυσιολογία, εναλλαγή αυτών των παραγόντων μεταγραφής να προωθήσει τη συσσώρευση χοληστερόλης. Δεδομένου ότι η θεραπεία του καρκίνου του προστάτη στοχεύει τον υποδοχέα ανδρογόνων, επιλέγοντας για τα κύτταρα με δραστικότητα υποδοχέα ανδρογόνων αλλαγμένη, πώς αυτό θα επηρεάσει SREBP-2 και LXR δραστηριότητα; Χρησιμοποιώντας ένα νέο μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, θα διερευνηθεί το πώς αυτή η στιχομυθία μεταξύ του υποδοχέα ανδρογόνων και αλλαγές ομοιόσταση της χοληστερόλης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Πρώτον, χαρακτηρίζεται μοντέλο εξέλιξης μας, η οποία εμπλέκεται 1) καλλιέργεια κυττάρων LNCaP σε φυσιολογικά επίπεδα τεστοστερόνης για να δημιουργήσει ανδρογόνο ανεκτικός LNCaP-305 κύτταρα, και 2) την καλλιέργεια LNCaP-305 με το αντι-ανδρογόνο Casodex να δημιουργήσει ευνουχισμό ανθεκτικά LNCaP-364 κύτταρα. Αυτό εξέλιξη συνοδεύτηκε από έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά υποδοχέα ανδρογόνου, εμφανίζεται συνήθως κλινικά, και μια μείωση της δραστηριότητας του υποδοχέα ανδρογόνων. Αν και αυτό επηρέασε το πώς SREBP-2 και στόχος LXR γονίδια ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία των ανδρογόνων, κυτταρικά επίπεδα της χοληστερόλης και την ανταπόκρισή τους στις μεταβαλλόμενες κατάσταση στερολών ήταν παρόμοια σε όλες τις επιμέρους γραμμές LNCaP.

Συμπέρασμα /Σημασία

Συνολικά ομοιόσταση της χοληστερόλης δεν επηρεάζεται από την αλλαγή ανδρογόνων δραστικότητα υποδοχέα στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. Αυτό δεν αναιρεί τη σχέση μεταξύ ανδρογόνων και την ομοιόσταση της χοληστερόλης, αλλά μάλλον υποδηλώνει ότι και άλλοι παράγοντες αντισταθμίσει αλλαγμένη δραστικότητα υποδοχέα ανδρογόνων. Δεδομένου ότι η ρύθμιση της χοληστερίνης διατηρείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, αυτό υποστηρίζει την αυξανόμενη ιδέα ότι ο μεταβολισμός της χοληστερόλης είναι ένας κατάλληλος στόχος για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Krycer JR, Μπράουν AJ (2013) Μήπως Αλλαγή ανδρογόνων υποδοχέων Κατάσταση κατά τη διάρκεια του προστάτη την ανάπτυξη του καρκίνου Επιπτώσεις κατά την χοληστερόλη Ομοιόσταση; PLoS ONE 8 (1): e54007. doi: 10.1371 /journal.pone.0054007

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 17 του Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Krycer, Μπράουν. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Έρευνα AJB του υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη της Αυστραλίας (PG2710, https://www.prostate.org.au). JRK είναι ο αποδέκτης της υποτροφίας Petre Ίδρυμα (https://www.petrefoundation.org.au). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

από την ανακάλυψη των ανδρογόνων, οι ορμόνες αυτές έχουν στενό δεσμό με τον προστάτη. Τα φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη εξαρτάται από ανδρογόνα για πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και διατήρηση των εκκριτικών λειτουργιών. Αυτό προκαλείται από τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), τον παράγοντα μεταγραφής που ενεργοποιείται από αυτές τις ορμόνες.

Αυτή η έννοια της εξάρτησης ορμόνης ιδρύθηκε από νομπελίστα Charles Huggins [1], και αποτελεί τη βιολογική λογική για στέρηση ανδρογόνου θεραπείας (ADT), μια σημαντική σύγχρονη στρατηγική θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PCA). ADT περιλαμβάνει ιατρικό ευνουχισμό σε χαμηλότερα επίπεδα στο αίμα-ανδρογόνων (από -10 ηΜ τεστοστερόνη [2] – [3] για να ~ 0.7 βέλτιστα ηΜ) [4]. Αυτό είναι συχνά συμπληρώνεται από θεραπεία με αντι-ανδρογόνα (π.χ., Casodex /biculatimide), τα οποία ανταγωνίζονται με τυχόν υπόλοιπο ανδρογόνα για την AR, στοχεύοντας έτσι να αναστέλλουν πλήρως τη λειτουργία AR. Μαζί, αυτή η θεραπεία σε δύο μέρη που είναι γνωστό ως «συνδυασμένη αποκλεισμός ανδρογόνων» [5]. Παρά το γεγονός ότι το 80-90% των ασθενών που αρχικά ανταποκρίνονται καλά στην ADT, η ΣΕΣΣ υποτροπές τελικά μέσα σε μια μέση περίοδο 18 μηνών [6], προχωρούν σε μια κατάσταση «ευνουχισμός ανθεκτικά» που καθιστά ADT αναποτελεσματική.

Castration- ανθεκτικά προστάτη (CR-PCA) είναι εξαιρετικά επιθετική, που σχετίζονται με τα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας από ΣΕΣΣ. Έτσι, υπάρχει η ανάγκη να κατανοήσουμε καλύτερα τις αλλαγές φαινοτυπική που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CR-προστάτη. Ένα τέτοιο χαρακτηριστικό πρόσφατα κερδίζει το ενδιαφέρον είναι το μεταβολισμό της χοληστερόλης (π.χ., [7]). Υψηλά επίπεδα χοληστερόλης έχουν συνδεθεί με προστάτη του κινδύνου σε επιδημιολογικές μελέτες [8] – [9], ενώ οι εργαστηριακές μελέτες έχουν προσδιορίσει ότι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα χοληστερόλης αυξάνονται όταν τα κύτταρα του προστάτη είναι καρκινικές [10]. Τέτοια συσσώρευση χοληστερόλης μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του προστάτη ως πρόδρομος για τη σύνθεση των μεμβρανών, ανδρογόνα, και άλλους παίκτες σε μονοπάτια σηματοδότησης [7], [11]. Έτσι, έχουν τα φάρμακα μείωσης της χοληστερόλης έχουν εξεταστεί για τη θεραπεία του προστάτη [7] – [9], [12]. Οι προσπάθειες αυτές θα πρέπει να ενισχυθεί με τη μελέτη των βαθύτερων αιτιών της συσσώρευσης χοληστερόλης στις προστάτη

Μέσα στο κύτταρο, τα επίπεδα χοληστερόλης ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από δύο παράγοντες κύριο μεταγραφής:. Στερόλη ρυθμιστικό στοιχείο πρωτεΐνης δέσμευσης ισομορφή 2 (SREBP-2) και του υποδοχέα του ήπατος Χ (LXR). SREBP-2 ρυθμίζει προς τα πάνω γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση της χοληστερόλης (π.χ.,

HMGCR

) και πρόσληψη (π.χ., χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών υποδοχέα,

LDLR

). Αυτό αυξάνει τα επίπεδα χοληστερόλης, η οποία μειώνει την δραστηριότητα SREBP-2 από τον κανονισμό ανατροφοδότηση. Σε αντίθεση, οξυγονωμένο παράγωγα της χοληστερόλης (οξυστερολών) ενεργοποιούν LXR, η οποία μειώνει την κυτταρική επίπεδα χοληστερόλης από πάνω ρύθμιση γονιδίων που εμπλέκονται στην εκροή χοληστερόλης, όπως ATP-δεσμευτική ισομορφές μεταφορέα κασέτας Α1 (

ΑΒΟΑ1

) και G1 (

ABCG1

)

Αυτές οι δύο παράγοντες μεταγραφής επηρεάζονται από τα ανδρογόνα: το AR ενεργοποιεί SREBP-2 από την προς τα πάνω ρύθμιση του ρυθμιστή της, Σκαπ [13] – [14], και αναστέλλει LXR από τον ανταγωνισμό συνενεργοποιητή [14].. Με τον τρόπο αυτό, το AR ρυθμίζει ομοιόσταση της χοληστερόλης κατά συντονισμένο τρόπο, παρέχοντας ένα μηχανισμό για το πώς τα ανδρογόνα προάγουν τη συσσώρευση χοληστερόλης στα κύτταρα του προστάτη (π.χ., [15]). Δεδομένου ότι το CR-προστάτη προκύπτει από την τροποποίηση των ανδρογόνων (AR και) την κατάσταση, εδώ έχουμε διερευνήσει πώς οι αλλαγές ομοιόσταση της χοληστερόλης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CR-προστάτη. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιούμε ένα νέο μοντέλο εξέλιξης CR-προστάτη

Για τη μελέτη CR-προστάτη

in vitro

, μοντέλα εξέλιξης (π.χ., [16] – [17]). Συνήθως παράγονται με ανδρογόνο στερεί από την κυτταρική σειρά LNCaP, μία εξαρτώμενη από ανδρογόνο, AR-θετικών προστάτη κυτταρική γραμμή [18]. Αυτά τα μοντέλα είναι πιο κατατοπιστική από ανδρογόνο-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές, όπως το PC-3, η οποία δεν εκφράζει AR [19], επειδή επιτρέπουν την άμεση σύγκριση μεταξύ των γονικών και ανδρογόνα-ανεξάρτητους κύτταρα.

Αν και τα προηγούμενα μοντέλα LNCaP-εξέλιξης έχουν δημιουργήσει έναν πλούτο των πληροφοριών σχετικά με ανδρογόνα-ανεξάρτητους προστάτη (αναθεωρούνται στο [20]), υπήρξαν δύο σημαντικές επιφυλάξεις. Πρώτον, τα κύτταρα LNCaP συνήθως καλλιεργούνται σε μέσα συμπληρωμένα με βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), το οποίο περιέχει τα επίπεδα ανδρογόνων ισοδύναμο με ένα ευνουχισμένο αρσενικό άνθρωπο [2]. Στη συνέχεια, η LNCaP κυτταρική σειρά έχει επιλεγεί για να αυξηθεί σε μια ανδρογόνο σπάνιο περιβάλλον, σε αντίθεση με την κλινική «ορμόνη αφελής» (προ-ADT) ΣΕΣΣ. Στην πραγματικότητα, φυσιολογικές, μη ευνουχισμένα επίπεδα τεστοστερόνης (~ 10 ηΜ [2] – [3]) αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP (π.χ., [21]), διότι το AR δρα ως «παράγοντας αδειοδότησης» που αποτρέπει κυτταρικού κύκλου εξέλιξης [ ,,,0],22] – [23]. Δεύτερον, τα κύτταρα LNCaP συνήθως ανδρογόνων στέρησε από μακροχρόνια καλλιέργεια σε μέσο συμπληρωμένο με απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS. Charcoal-stripping όχι μόνο αφαιρεί τα ανδρογόνα από FBS, αλλά και άλλες ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες, και ως εκ τούτου δεν μπορούν να αντιπροσωπεύουν επαρκώς κλινική ADT. Έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο εξέλιξης που ξεπερνά αυτά τα περιοριστικούς όρους [12].

Εδώ, χαρακτηρίζουν αυτό το μοντέλο, το χρησιμοποιεί για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι οι αλλαγές στο AR σηματοδότησης και την ομοιόσταση της χοληστερόλης στα κύτταρα CR-προστάτη σχετίζονται. Δεδομένου ότι τα επίπεδα επιρροές AR χοληστερόλης, εξετάζοντας εάν αυτή η αλληλεπίδραση αλλάζει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CR-ΣΕΣΣ θα σας βοηθήσει να προσδιορίσετε τις δυνατότητες του μεταβολισμού της χοληστερόλης ως στόχο για CR-προστάτη.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός ο ευνουχισμός ανθεκτικό μοντέλο εξέλιξης PCa

LNCaP κύτταρα αρχικά καλλιεργήθηκαν σε FBS συμπληρωμένο με μία φυσιολογική συγκέντρωση τεστοστερόνης, που παράγει το 305-κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). Αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν εξαρτώμενων από ανδρογόνα PCa κύτταρα που μπορούν να αναπτυχθούν σε επίπεδα ορού ανδρογόνων-, ανέχεται υψηλότερες συγκεντρώσεις ανδρογόνων από τα γονικά κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1 C). Αυτή η προσέγγιση για την ανάπτυξη ανδρογόνου ανεκτική κυττάρων παρομοίως εκτελέστηκε προηγουμένως [17], εκτός αντικαταστήσαμε συνθετικό αγωνιστή AR R1881 με τεστοστερόνη. Είναι πιθανό ότι η επίδραση της τεστοστερόνης οφείλεται σε απευθείας ενεργοποίηση του AR ή μετατροπή στο ισχυρό ανδρογόνο, διυδροτεστοστερόνη, αντί αρωματοποίηση σε οιστρογόνα επειδή τεστοστερόνη και διυδροτεστοστερόνη έχουν παρόμοια αποτελέσματα επί της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα S1A).

(Α) Σχηματική περιγράφει την ανάπτυξη αυτών των υπο-γραμμές LNCaP, με τη συμμετοχή μακροπρόθεσμη καλλιέργεια σε παρουσία είτε τεστοστερόνης (Τ) ή Casodex (CDX). Λεπτομέρειες στο κείμενο. (Β-D) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10% (ν /ν) ορό και οι συγκεντρώσεις των φαρμάκων που υποδεικνύεται. Στο (Β), αυτό περιλαμβάνει FBS (LNCaP) ή FBS συμπληρωμένο με 10 ηΜ Τ (305) ή 10 μΜ CDX (364). Στο (C) και (D), αυτό περιλαμβάνει FBS ή CS-FBS, με Τ και CDX σε συγκεντρώσεις υποδεικνύονται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (Β-D) δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος + S.E., από τρία ξεχωριστά πειράματα ανά κυτταρική σειρά, το καθένα εκτελείται με φρεάτια εις τετραπλούν ανά συνθήκη. Στο (D), οι γραμμές σφάλματος που περιέχονται εντός των συμβόλων.

Η

Για την προσομοίωση ADT (συγκεκριμένα, σε συνδυασμό αποκλεισμός ανδρογόνων), 305 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε FBS (επίπεδα ευνουχισμού που περιέχουν ανδρογόνων) συμπληρωμένο με το αντι -androgen Casodex (Σχήμα 1Α). Αυτό δημιούργησε το 364 κυτταρική σειρά ανδρογόνο-ανεξάρτητες, η οποία έχει μικρή πολλαπλασιαστική απόκριση είτε ανδρογόνα (Εικόνα 1C) ή αντι-ανδρογόνα (Εικόνα 1D). Αυτός ο φαινότυπος ήταν σταθερό για τουλάχιστον 10 περάσματα (Σχέδιο S1B). Επιπλέον, ως θετικός μάρτυρας, κύτταρα PC-3 ήταν εξίσου αδιάφορη στα μέσα ενημέρωσης-ανδρογόνων κατάσταση (Σχήμα S1c).

Σε σύγκριση με 305 και γονικών κυττάρων LNCaP, τα κύτταρα 364 αυξήθηκαν πιο αργά (Εικόνες 1Β, S1D) και ανεξάρτητα από το καθεστώς των μέσων ενημέρωσης-ανδρογόνων (Σχήματα 1 C, D). Αυτό είναι διαφορετικό σε άλλες μελέτες (Πίνακας 1), πιθανώς λόγω της καλλιέργεια σε FBS αντί CS-FBS, εξασφαλίζοντας έτσι ότι μόνο δραστικότητα AR στοχεύεται σε μακροπρόθεσμη επιλογή μας 364 κυττάρων. Επιπλέον, η ανεξαρτησία των 364 κύτταρα από την κατάσταση των μέσων ενημέρωσης-ανδρογόνων που παρέχονται μικρό πλεονέκτημα στο CS-FBS (Εικόνα 1Β), υποδηλώνοντας ότι κάρβουνο-απογύμνωση δεν αφαιρεί μόνο τα ανδρόγυνα, αλλά και άλλοι παράγοντες που προάγουν την ανάπτυξη. Αυτό δικαιολογεί την προσέγγισή μας για την παραγωγή ενός ευνουχισμού ανθεκτική κυτταρική σειρά με κατεργασία Casodex σε FBS (Σχήμα 1Α).

Η

Στη συνέχεια, χαρακτηριζόμενη από το καθεστώς AR από αυτές τις κυτταρικές σειρές μέσω έκφρασης πρωτεΐνης Ar και Ar δραστηριότητα, η τελευταία αξιολογείται από έκφραση mRNA του κανονικού γονιδίου AR-στόχου,

PSA

(ειδικό προστατικό αντιγόνο). Η αυτορύθμιση των επιπέδων AR (π.χ., [24]) μπορεί να θεωρηθεί με την τεστοστερόνη και Casodex θεραπεία σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α,

λωρίδες

1-3). Σε σύγκριση με αυτά τα γονικά κύτταρα, 305 κύτταρα είχαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης AR στην βασική μέσων τους (Σχήμα 2Α,

λωρίδα

5 vs 1), αλλά παρόμοια δραστηριότητα AR (Σχήμα 2Β). Ομοίως, υπό συνθήκες ανδρογόνο-ανεπαρκή (CS-FBS), 305 κύτταρα είχαν μειωμένη απόκριση ορού σε διυδροτεστοστερόνη (Σχήμα 2C), που φαίνεται και από τα δύο

PSA

επίπεδα του mRNA (

πινάκιο κορυφής

) και

δραστηριότητας PSA

υποκινητή (

κάτω πίνακα

). Μαζί, αυτό αντανακλά την προσαρμογή τους σε υψηλότερα επίπεδα ορού ανδρογόνων από μειωμένη δραστηριότητα AR.

(Α-Β) Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Μέσο Α με 10 ηΜ τεστοστερόνης (Τ) ή 10 μΜ Casodex (CDX). (Α) Protein συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western εναντίον του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και α-τουμπουλίνης. (Β) RNA συλλέχθηκε και

PSA

mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν με qRT-PCR, κανονικοποιημένη προς τα κύτταρα LNCaP. (C)

Επάνω πίνακας

: Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός Μέσου Β για 24 ώρες, πριν από την κατεργασία με 1 ηΜ διυδροτεστοστερόνη (DHT) και /ή 10 μΜ CDX σε Μέσο Β για άλλες 24 ώρες. Μετά την αγωγή, το RNA συλλέχθηκε και

PSA

mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν με qRT-PCR, κανονικοποιημένη προς το όχημα-επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP.

Κάτω πάνελ

: Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε Μέσο Β Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ DHT και /ή 10 μΜ CDX σε Μέσο Β για άλλες 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης, έκανε σε σχέση με την κατάσταση του οχήματος μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά. (Δ) Περίληψη των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στο (Α-Γ). (Α) Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων χωριστών πειραμάτων. (Β-Ο) δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος + SE, από τρία ξεχωριστά πειράματα ανά κυτταρική σειρά, το καθένα εκτελείται με φρεάτια εις τριπλούν ανά συνθήκη.

Η

Επιπλέον, 364 κύτταρα έχουν ακόμη υψηλότερα επίπεδα AR (Σχήμα 2Α ), η οποία έχει παρατηρηθεί σε άλλες

in vitro

μελέτες (Πίνακας 1) και πολλά κλινικά δείγματα CR-PCa (π.χ., ~ 30% των κλινικών δειγμάτων CR-PCa έχουν AR γονιδιακή ενίσχυση η οποία έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει έκφραση AR [25] – [27]). Αν και η βασική δράση AR ήταν χαμηλότερη (Σχήμα 2Β), Casodex ενήργησε αγωνιστικώς (Σχήμα 2C), όπως φαίνεται σε άλλες μελέτες (Πίνακας 1). Συλλογικά, το μοντέλο μας αντανακλά ένα σημαντικό υποσύνολο του CR-προστάτη και δείχνει μια αλλαγή στη δραστηριότητα AR κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε ευνουχισμό-αντίσταση (Σχήμα 2D).

Μήπως η αλλαγή ομοιόσταση της χοληστερόλης σε αυτό το μοντέλο;

Δεδομένου ότι ο AR προάγει ενεργοποίηση SREBP-2 και αναστέλλει LXR [13] – [14] (Εικόνα 3Α), πώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις που επηρεάζονται από τον ευνουχισμό αντίστασης; Για να διερευνηθεί αυτό, εξετάσαμε την απόκριση του SREBP-2 και του στόχου LXR γονίδια (Σχήμα 3Α) για να ανδρογόνου χειραγώγηση.

(Α) Σχηματική περιγράφει τα αποτελέσματα του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σε βασικούς παράγοντες μεταγραφής σε χοληστερόλη ομοιόσταση. Λεπτομέρειες στο κείμενο. (Β-Ο) Κύτταρα στερήθηκαν τροφής σε Μέσο Β για 24 ώρες, πριν από την κατεργασία με 1 ηΜ διυδροτεστοστερόνη (DHT) και /ή 10 μΜ CDX σε Μέσο Β για άλλες 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία, το RNA συλλέχθηκε και (Β)

LDLR

και

HMGCR

, και (Γ)

ABCG1

και

ΑΒΟΑ1

, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mRNA από qRT-PCR, κανονικοποιημένη στην κατάσταση του οχήματος σε κάθε κυτταρική σειρά. (Β-Ο) δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE, από τρία ξεχωριστά πειράματα ανά κυτταρική σειρά, το καθένα εκτελείται με φρεάτια εις τριπλούν ανά συνθήκη.

Η

Όπως δείξαμε προηγουμένως [14], θεραπεία διυδροτεστοστερόνη αυξημένη SREBP-2 έκφραση γονιδίου στόχου (Σχήμα 3Β) και η μειωμένη έκφραση του γονιδίου-στόχου LXR (Σχήμα 3C) σε κύτταρα LNCaP, και αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν με Casodex. Τα κύτταρα 305 επέδειξαν μία παρόμοια αλλά αμβλύνθηκε τάση (Σχήματα 3Β, C), σύμφωνα με μειωμένη δραστικότητα AR σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2). Ομοίως, σε 364 κύτταρα, SREBP-2 και LXR δραστηριότητα ήταν ανταποκρίθηκαν σε θεραπεία διυδροτεστοστερόνη και Casodex ενήργησε αγωνιστικώς για τη μείωση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου LXR (Εικόνες 3Β, C). Έτσι, σε όλο το μοντέλο εξέλιξης, ανδρογόνο κατάσταση έχει διαφορετικό αποτέλεσμα επί SREBP-2 και LXR.

Κατά συνέπεια, αυτές οι δύο κύριους ρυθμιστές χοληστερόλης θα πρέπει να επηρεάζεται από την αλλαγή δραστηριότητας AR κατά την διάρκεια της εξέλιξης. Πράγματι, έχουμε βρει ένα παρόμοιο μοτίβο στο

PSA

έκφρασης. Πρώτον, υπήρξε μικρή διαφορά στην έκφραση του γονιδίου-στόχου μεταξύ LNCaP και 305 κύτταρα (Σχήματα 4). Δεύτερον, όπως

PSA

, SREBP-2 έκφραση γονιδίου-στόχου είναι μειωμένη σε 364 κύτταρα (Σχήμα 4Α). Δεδομένου AR ανταγωνίζεται LXR (Σχήμα 3C),

ABCG1

έκφραση είναι υψηλότερη σε 364 κύτταρα, όπως αναμενόταν, αλλά

ABCA1

έκφραση μειώνεται (Σχήμα 4Β).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε βασικά μέσα τους: Μέσον Α (LNCaP), συμπληρωμένο με 10 ηΜ τεστοστερόνη (305) ή 10 μΜ Casodex (364). RNA συλλέχθηκε και (Α)

LDLR

και

HMGCR

, και (Β)

ABCG1

και

ΑΒΟΑ1

, τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν από qRT- PCR, κανονικοποιημένη προς τα κύτταρα LNCaP. (Α-Β) Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος + SE, από τρία διαφορετικά πειράματα ανά κύτταρο-γραμμή, κάθε εκτελείται με τριπλά φρεάτια ανά συνθήκη.

Η

Παρά τις αλλαγές αυτές, επίπεδα σταθερής κατάστασης της χοληστερόλης ήταν παρόμοια μεταξύ των LNCaP, 305, και 364 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Από αυτό, -95% ήταν ελεύθερη χοληστερόλη (όπως διαπιστώθηκε προηγουμένως σε κύτταρα LNCaP [14]) σε όλες τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ιδιαίτερα δεδομένου ότι υπάρχει μια δύο φορές αύξηση στα επίπεδα χοληστερόλης όταν προστάτη επιθηλιακά κύτταρα να εξελιχθούν σε προστάτη [10], το γεγονός αυτό δείχνει ότι η βασική ομοιόσταση της χοληστερόλης διατηρείται παρά αλλαγμένη κατάσταση AR κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε ευνουχισμό-αντίσταση.

( Α) τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε βασικά μέσα τους: Μέσον Α (LNCaP), συμπληρωμένο με 10 ηΜ τεστοστερόνη (305) ή 10 μΜ Casodex (364). Τα επίπεδα χοληστερόλης προσδιορίσθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε βασικά μέσα τους, μετά από την οποία η πρόσληψη LDL προσδιορίσθηκε. (C) Τα κύτταρα τοποθετούνται σε βασικά μέσα τους, τότε νηστεία όλη τη νύχτα σε Μέσο C. Οι επόμενες ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 6 ώρες με ή χωρίς 10 μΜ 25-υδροξυχοληστερόλης (25-HC) σε Μέσο C, μετά την οποία η πρόσληψη της LDL ήταν αποφασισμένος. (Α-Γ) Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος + SE, από τρία διαφορετικά πειράματα ανά κύτταρο-γραμμή, κάθε εκτελείται με τριπλά φρεάτια ανά συνθήκη.

Η

Ωστόσο, αυτό το στιγμιότυπο δεν ρίξει φως σχετικά με το εάν castration- ανθεκτικά κύτταρα αντιδρούν διαφορετικά στην αλλαγή της κατάστασης των στερολών. Για παράδειγμα, μετά την εύρεση βασικής πρόσληψης LDL ήταν παρόμοια μεταξύ των κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Β), εξετάσαμε την απάντηση στην oxysterol, 25-hydroxcholesterol, η οποία μειώνει δραστικότητα SREBP-2 και έτσι LDLR δραστηριότητα [28]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ανταποκρίθηκαν παρομοίως με αγωγή 25-υδροξυχοληστερόλης (Σχήμα 5C). Να εξετάσει περαιτέρω ανταπόκριση των στερολών τους, επιστρέψαμε με μεταγραφικές ρύθμιση, χρησιμοποιώντας 25-υδροξυχοληστερόλης να αναστέλλει ταυτόχρονα SREBP-2 και ενεργοποιήστε LXR. Ενώ χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες λουσιφεράσης προηγουμένως για το σκοπό αυτό [12], αναλύσαμε την έκφραση του γονιδίου-στόχου εδώ για να μας δώσει τη δυνατότητα: 1) για να εξετάσει LXR και δραστικότητα SREBP-2 ταυτόχρονα στην ίδια κυτταρικούς πληθυσμούς, και 2) να έχουν μικρότερους χρόνους επεξεργασίας (mRNA επίπεδα συνήθως ανταποκρίνονται πιο γρήγορα από ό, τι υποκινητή με γνώμονα τα επίπεδα λουσιφεράσης), που μας επιτρέπει να εξετάσουμε μια οξεία απάντηση σε στερόλες. Ως απόδειξη της αρχής, η δοκιμασία αυτή επιβεβαίωσε ότι το PC-3 κύτταρα έχουν υψηλότερη δραστικότητα SREBP-2 από τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα S2A), όπως δείχνεται προηγουμένως [28]. Σε αντίθεση, SREBP-2 αντέδρασε παρομοίως σε 25-υδροξυχοληστερόλης σε LNCaP, 305, και 364 κύτταρα (Εικόνα 6,

πινάκια κορυφής

)

Τα κύτταρα τοποθετούνται σε βασικά μέσα τους:. Μέσον Α (LNCaP), συμπληρωμένο με 10 ηΜ τεστοστερόνη (305) ή 10 μΜ Casodex (364). Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής όλη τη νύχτα σε Μέσο C, και στη συνέχεια κατεργάζεται για 6 ώρες με 25-υδροξυχοληστερόλης (25-HC) σε Μέσο C, στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται. Μετά τη θεραπεία, το RNA συλλέχθηκε και

LDLR

,

HMGCR

, και

ABCG1

επίπεδα προσδιορίστηκαν από qRT-PCR, κανονικοποιημένη στην κατάσταση του οχήματος μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE, από τρία ξεχωριστά πειράματα ανά κυτταρική σειρά, το καθένα εκτελείται με φρεάτια εις τριπλούν ανά συνθήκη.

Η

Επιπλέον, αυτή η oxysterol είχε το ίδιο αποτέλεσμα στο γονίδιο LXR-στόχο (

ABCG1

) έκφραση σε αμφότερα LNCaP και 364 κύτταρα (Εικόνα 6,

κάτω πάνελ

). Αυτή η απόκριση ήταν ασθενέστερη σε 305 κύτταρα, αλλά ανακτήθηκαν όταν τα κύτταρα σπάρθηκαν σε FBS χωρίς συμπλήρωση της τεστοστερόνης (Σχήμα S2B). Εφαπτομενικά, βρήκαμε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα σε κύτταρα LNCaP (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να συσσωρεύεται ανδρογόνα πριν από τη θεραπεία σε μη συμπληρωμένα μέσα ενημέρωσης? Η εναπομένουσα ανδρογόνων θα μπορούσε με τη σειρά της διεγείρει AR και αναστέλλουν LXR με γνώμονα

ABCG1

έκφρασης (Σχήμα 3C). Παρ ‘όλα αυτά, το μοντέλο αυτό υποδηλώνει ότι αμβλεία δραστηριότητα AR σε ευνουχισμό-ανθεκτικά κύτταρα δεν επηρεάζει την ικανότητά τους να ανταποκριθούν στην κατάσταση κυτταρική στερολών.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χαρακτηρίζουν ένα

in vitro PCa μοντέλο

που αποτελείται από τρία στοιχεία (Εικόνα 1): (1) κύτταρα LNCaP, τα οποία είναι προσαρμοσμένα σε χαμηλά επίπεδα ορού ανδρογόνων, (2) 305 κύτταρα, προσαρμοσμένα σε υψηλά επίπεδα ορού ανδρογόνων, και (3 ) 364 κύτταρα, προσαρμοσμένα σε ανάπτυξη ανεξάρτητη από την κατάσταση ορού ανδρογόνων. Οι προσαρμογές αυτές συνοδεύτηκαν από μεταβολές στη δραστηριότητα AR (Σχήμα 2). Αν και το cross-talk μεταξύ AR και της χοληστερόλης ρύθμιση μειώνεται από LNCaP σε 305-364 κύτταρα (Σχήμα 3), διαπιστώσαμε ότι η συνολική ομοιόσταση της χοληστερόλης παραμένει ανεπηρέαστη (Σχήματα 4,5,6).

Στο μοντέλο μας προστάτη , τα 305 κύτταρα ανδρογόνο-ανεκτικές είχαν μειωμένη AR ανταπόκρισης σε σύγκριση με LNCaP κύτταρα (Σχήμα 2), αλλά ήταν εξίσου ευαίσθητα σε στέρηση ανδρογόνου (Σχήμα 1). Έτσι, Προσομοιώσαμε συνδυασμό αποκλεισμό των ανδρογόνων με αγωγή Casodex σε ανδρογόνα-φτωχών FBS. Τα προκύπτοντα 364 κύτταρα έχουν υψηλότερη έκφραση AR, το οποίο είναι μια συνεπής αλλαγή με την εξέλιξη σε CR-προστάτη

in vivo

[29] και παρατηρήθηκαν σε κλινικά δείγματα [25], [30]. Αυξημένη έκφραση AR μπορεί να προκαλέσει αντι-ανδρογόνα να δρουν ως αγωνιστές (π.χ. [16], [29], [31]), όπως παρατηρείται εδώ (Σχήμα 2) – αυτή βασίζεται στην περιοχή AF-1 του AR, υποδηλώνοντας αλλαγμένη στοιχειομετρία με μεταγραφική coregulators [31]. Αυξημένη έκφραση AR και Casodex συναγωνισμός είναι ένα κοινό θέμα κοινού με παλαιότερες μελέτες (Πίνακας 1) – Είναι ενδιαφέρον, CS-FBS χρησιμοποιήθηκε σε αυτές τις μελέτες (Πίνακας 1, Σχήμα 2), ενώ αυτό αγωνισμό Casodex χάθηκε σε FBS (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) , γεγονός που υποδηλώνει το φόντο του ορού μπορεί να επηρεάσει την στοιχειομετρία coregulator. Παρ ‘όλα αυτά, με την αξιοποίηση της χαμηλής περιεκτικότητας ανδρογόνων της FBS και την αποφυγή της μακροχρόνιας καλλιέργειας στο CS-FBS, έχουμε αποκτήσει τρεις LNCaP υπο-γραμμές που ποικίλουν σε AR δραστηριότητά τους.

Με δεδομένη την στιχομυθία μεταξύ AR, SREBP- 2 και LXR (Σχήμα 3), τα κύτταρα αυτά παρέχουν την ευκαιρία να εξετάσει την επίδραση των διαφορετικών κρατών AR σε προστάτη στην ομοιόσταση της χοληστερόλης (Εικόνες 4-5). Από τον άξονα LXR, παρατηρήσαμε μια αποκλίνουσα αντίδραση μεταξύ των στόχων του γονιδίου LXR: με μειωμένη δραστηριότητα AR σε 364 κύτταρα (Σχήμα 2), βασική

ABCG1

έκφραση ήταν αναμενόμενο αυξήθηκε, ενώ η

ΑΒΟΑ1

έκφραση ήταν μειώνεται (Σχήμα 4). Αυτό παρατηρήθηκε πριν σε ευνουχισμό ανθεκτικά κύτταρα επιλέγονται από μακροχρόνια καλλιέργεια σε CS-FBS [32], υποδηλώνοντας ότι ο AR μπορεί επίσης να επηρεάσει ABCA1 μέσω ενδιάμεσου που αντιτίθεται LXR. Αυτό το ίδιο το ενδιάμεσο μπορεί επίσης να επηρεάσει SR-BI, ένα άλλο γονίδιο στόχος LXR (π.χ., [33]) το οποίο μεσολαβεί πρόσληψη HDL και εκροή [34], αφού

SR-BI

mRNA έκφραση ήταν επίσης μειωμένη σε 364 κύτταρα ( Εικόνα S3). Περαιτέρω, τα προκαταρκτικά πειράματα δεν έδειξαν διαφορές στην εκροή χοληστερόλης στον ορό που εξαρτώνται μεταξύ LNCaP υπο-γραμμές μας (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εξετάσει συγκεκριμένες μεταφορείς χοληστερόλης σε τεμαχίσει την ανταλλαγή της χοληστερόλης με το εξωκυτταρικό περιβάλλον, προκειμένου να προσδιορίσουν τις συνέπειες αυτού διαφορετικές ρυθμίσεις μεταξύ των SR-BI, ABCA1 και ABCG1.

σε αντίθεση, μια άλλη ομάδα που καλλιεργούνται ξενομοσχευμάτων LNCaP σε ευνουχισμένα ποντίκια, εύρημα που

ΑΒΟΑ1

και

SR-BI

εκφράσεως είναι αυξημένο στα ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους [35], αλλά

ABCG1

έκφραση δεν διερευνήθηκε. Χρησιμοποιώντας αυτό το ίδιο μοντέλο,

SREBP-2

mRNA και ενεργοποιημένη πρωτεΐνη SREBP-2 ήταν υψηλότερα μετά από εξέλιξη σε CR-προστάτη [36], σε συνδυασμό με την αυξημένη σύνθεση της χοληστερόλης [35]. Αυτό συσχετίζεται με μελέτες προφίλ έκφρασης σε ασθενείς, βρίσκοντας αυξημένη έκφραση του SREBP-2 [37] και στερόλη βιοσυνθετικών [38] γονίδια. Μια άλλη μελέτη διαπίστωσε μειωμένη έκφραση [39], σύμφωνα με τη μείωση της SREBP-2 γονιδίων στόχων που παρατηρείται εδώ στην 364 κύτταρα, τα οποία με τη σειρά της συσχετίζεται με μειωμένη δραστηριότητα AR. Παρά τις αλλαγές αυτές, επίπεδα σταθερής κατάστασης χοληστερόλης ήταν παρόμοια μεταξύ των ανδρογόνων που εξαρτώνται προστάτη και CR-προστάτη κύτταρα, τόσο σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 5Α) και στο

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος [35]. Για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν υπάρχουν πληροφορίες για τα επίπεδα της χοληστερόλης του CR-προστάτη μεταστάσεις.

Ωστόσο, οι παρατηρήσεις αυτές δεν λαμβάνουν υπόψη τη δυναμική φύση της ομοιόστασης χοληστερόλης. Έτσι, εξετάσαμε την επίδραση της κατάστασης AR για την ανταπόκριση των κυττάρων στην αλλαγή καθεστώτος στερόλη – όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να συγκρίνει όπως ομοιόσταση της χοληστερόλης μεταξύ των γονέων και του ευνουχισμού-ανθεκτικά κύτταρα LNCaP. Ενώ SREBP-2 είναι κανονικά ανατροφοδότηση-ρυθμίζεται από στερόλες, τα στοιχεία δείχνουν ότι τα κύτταρα CR-προστάτη είναι στερόλη ανθεκτικά, με βάση την υψηλότερη ώριμη SREBP-2

in vivo

[36] και την υψηλότερη δραστηριότητα SREBP-2 στο AR -αρνητική PC-3 κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα LNCaP ([28], το Σχήμα S2A). Ωστόσο, βρήκαμε ότι SREBP-2 και LXR σε LNCaP, 305, και 364 κύτταρα αποκρίθηκαν παρομοίως να στερόλες (Σχήμα 6), με παρόμοια αποτελέσματα σε λειτουργικό επίπεδο με πρόσληψη LDL (Σχήμα 5). Όντας επιφυλακτικός, αυτό το μοντέλο εξέλιξης συνεπάγεται μακροχρόνια καλλιέργεια που μπορεί να παράγει άλλες αλλαγές εκτός από την κατάσταση AR. Έτσι, θα μπορούσε κανείς να υποστηρίξει ότι τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να υποστηριχθούν από την πιο άμεση γενετικούς χειρισμούς (π.χ., AR υπερέκφραση και νοκ ντάουν), αλλά η αύξηση της έκφρασης AR δεν μπορεί να ενισχύσει απαραίτητα δραστηριότητα AR (όπως φαίνεται στο 364 κύτταρα), παροδικές επιμολύνσεις θα επηρεάσει τη βιωσιμότητα (ομοίως για το χειρισμό δραστηριότητα AR στο Σχήμα 1), και σταθερές επιμολύνσεις συνεπάγεται μακροχρόνια καλλιέργεια και έτσι βιώνουν τις ίδιες επιφυλάξεις.

Ωστόσο, τα ευρήματα εδώ σημαίνει ότι υπάρχουν αντισταθμιστικών μηχανισμών για την αντιμετώπιση τυχόν αλλαγές στην ομοιόσταση της χοληστερόλης [ ,,,0],40], λόγω της απώλειας βασική δραστικότητα AR. Για παράδειγμα, ανδρογόνων συνοδεύεται από αύξηση της δραστικής Akt [41], μια κινάση σηματοδότησης το οποίο έχουμε βρει για να ενισχύσει SREBP-2 ενεργοποίησης [42]. Επιπλέον, ενώ η τρέχουσα

in vitro

μελέτη επιτρέπει σε μια απλουστευτική προσέγγιση και τους χειρισμούς, όπως αλλοιώνουν την κατάσταση της κυτταρικής στερολών, δεν λαμβάνει υπόψη τις αλλαγές που συμβαίνουν

in vivo

. Για παράδειγμα, ιστό του προστάτη είναι συνήθως υποξική, και αυτό ενισχύεται από ανδρογόνων [43] – δεδομένης της σχέσης μεταξύ των επιπέδων της ομοιόστασης των στερολών και οξυγόνο [44], τα μελλοντικά πειράματα θα πρέπει να διερευνήσει αυτό προστάτη

Σε γενικές γραμμές, μας. εργασία δεν αναιρεί τη σχέση μεταξύ ανδρογόνων και της ομοιόστασης χοληστερόλης στα κύτταρα προστάτη (Σχήμα 3), αλλά υποδηλώνει ότι και άλλοι παράγοντες μπορεί να αντισταθμίσει τις αλλαγές στην βασική δραστικότητα AR μεταξύ διαφορετικών κυττάρων PCa. Αυτά θα πρέπει να διευκρινιστεί σε μελλοντικά πειράματα. Αν ρύθμιση της χοληστερόλης είναι αμετάβλητη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε CR-ΣΕΣ, αυτό έχει δύο συνέπειες: πρώτον, ότι τα κύτταρα πρέπει να διατηρεί επαρκή περιεκτικότητα σε χοληστερόλη να στηρίξει την ανάπτυξη (ρυθμιστές μεσολάβηση αυτό πρέπει ακόμα να βρεθούν), και δεύτερο, ότι CR-ΣΕΣΣ θα είναι εξίσου ευαίσθητα ως αφελείς προστάτη σε φάρμακα που χειρίζονται το μεταβολισμό της χοληστερόλης. Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι LNCaP και 364 κύτταρα είναι τόσο ευαίσθητα σε φάρμακα που αναστέλλουν δραστικότητα SREBP-2 [12], υποστηρίζοντας την ιδέα ότι η αυξανόμενη μεταβολισμό της χοληστερόλης είναι ένας κατάλληλος στόχος για CR-PCa [7].

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά |

FBS λήφθηκε από Bovogen (Vic, AU) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη από την Life Technologies (Vic, AU). Όλα τα άλλα συστατικά του μέσου ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (NSW, AU). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, FBS έγινε ορμόνη ανεπάρκεια με παραγωγή ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο FBS (CS-FBS) [14], ή χοληστερόλη-ανεπαρκή δια της δημιουργίας λιποπρωτεϊνών ελλειμματικών FBS (FBLPDS) [28]. Με Dil-επισημασμένη LDL (με Dil-LDL) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Casodex (βικαλουταμίδη), Hoechst-33258, κομπακτίνη (μεβαστατίνη), μεβαλονικό οξύ, και 25-υδροξυχοληστερόλης ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich. Η τεστοστερόνη και διυδροτεστοστερόνη ήταν δώρα από τον Dr David Handelsman (ANZAC Research Institute, NSW, AU).

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές γραμμές προστάτη, LNCaP [18] και PC-3 [19] , ήταν ένα δώρο από τον Dr Pamela Russell (Αυστραλιανή προστάτη Κέντρο Ερευνών Καρκίνου, Qld, AU), και διατηρήθηκαν σε Μέσο α (RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη). Η παραγωγή LNCaP-305 ( «305») και LNCaP-364 ( «364») κύτταρα περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Ο αριθμός «305» και «364» δηλώνουν τον αριθμό ευρετηρίου του πειράματος. 305 και 364 κύτταρα διατηρήθηκαν και εμβολιάστηκαν σε μέσο επιλογής τους, όντας Μέσο Α συμπληρωμένο με 10 ηΜ τεστοστερόνη ή 10 μΜ Casodex αντίστοιχα. Πριν από την επίστρωση κυττάρων, οι πλάκες και τα πιάτα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πολυαιθυλενιμίνη (Sigma-Aldrich) για την ενίσχυση κυτταρικής συγκολλήσεως όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Όπως διευκρινίζεται σε πειράματα, τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε Μέσο Β (RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) CS-FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) για να απομακρυνθεί η επίδραση του εξωγενούς ανδρογόνα. Εναλλακτικά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε Μέσο C (RPMI, συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBLPDS, 5 μΜ κομπακτίνη, 50 μΜ μεβαλονικό οξύ, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) για να μειώσουν την κατάσταση κυτταρικής χοληστερόλης για επακόλουθη στερόλη αγωγή [12]

Hoechst προσδιορισμός για κυτταρικό πολλαπλασιασμό

τα κύτταρα σπάρθηκαν και κατεργάζεται όπως στο προσδιορισμούς βιωσιμότητας των κυττάρων που περιγράφηκε προηγουμένως από την ομάδα μας [12]. – εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο RPMI, συμπληρωμένο με 0,1% (ν /ν) αλβουμίνη βόειου ορού. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προσθήκη ίσου όγκου φαινόλης-ερυθρό RPMI χωρίς ορό που περιέχει και τα ναρκωτικά σε κάθε φρεάτιο, για να επιτευχθούν οι τελικές συγκεντρώσεις που ορίζονται στα σχήματα. Μετά την κατεργασία, η δοκιμασία WST-1 αποφεύχθηκε εδώ επειδή βρήκαμε ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις ανδρογόνων που διεγείρεται μείωση WST-1 και ταυτόχρονα τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων (Σχήμα SA), αποσυνδέοντας έτσι την υποτιθέμενη συσχέτιση μεταξύ μεταβολική δραστηριότητα και βιωσιμότητα στην δοκιμασία WST-1. Έτσι, η κυτταρική ανάπτυξη αντί ποσοτικά με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως λεκέ Hoechst [45], με κάποιες τροποποιήσεις: Το μέσο αναρροφήθηκε και η πλάκα καταψύχθηκε στους -80 ° C. Οι πλάκες εν συντομία αποψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και 100 μΐ νερού προστέθηκαν ανά φρεάτιο πριν από την κατάψυξη και πάλι στους -80 ° C. Οι πλάκες αποψύχθηκαν, ακολουθούμενο από την προσθήκη 100 μΙ διαλύματος Hoechst-33258, που περιέχει 10 μg /ml Hoechst-33258 σε ρυθμιστικό ΤΝΕ (10 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 2 Μ NaCl, 1 mM EDTA). Ο φθορισμός μετρήθηκε σε

F

Ex = 360 nm και

F

Em = 440 nm, χρησιμοποιώντας το φθορόμετρο Fluostar Galaxy (BMG Labtech, Vic, AU).

κηλίδωση Western

Μετά την αγωγή, κυτταρική πρωτεΐνη αναλύθηκε με κηλίδωση Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] – εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS ((1% [w /v] SDS, 10 mM