Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Η χρήση μη τοξικών διαιτητικές φυτοχημικά μπορούν να θεωρηθούν ως χημειοθεραπευτικό στρατηγική για τη διαχείριση του NSCLC. Εδώ, αναφέρουμε ότι προανθοκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (GSPs) επάγουν την απόπτωση των κυττάρων NSCLC, Α549 και Η1299,

in vitro

η οποία μεσολαβείται μέσω της αυξημένης έκφρασης του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax, μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl2 και Bcl-XL, η διατάραξη του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, και την ενεργοποίηση των κασπασών 9, 3 και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP). Προ-επεξεργασία των Α549 και κυττάρων Η1299 με τον αναστολέα κασπάσης-3 (Ζ-DEVD-fmk) απέκλεισε σημαντικά την προκαλούμενη από τις GSP απόπτωση αυτών των κυττάρων επιβεβαίωσε ότι GSPs επαγόμενη απόπτωση προκαλείται μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών-3. Θεραπείες του Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στην G1 σύλληψη. G0 /G1 φάση του κυτταρικού κύκλου είναι γνωστό ότι ελέγχονται από εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών (Cdk), αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη (Cdki) και κυκλίνες. Οι αναλύσεις Western Blot μας έδειξαν ότι GSPs επαγόμενη διακοπή κύκλου G1 κυττάρου προκαλείται μέσω της αυξημένης έκφρασης των πρωτεϊνών Cdki (Cip1 /p21 και Kip1 /ρ27), με ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων της CDK2, CDK4, CDK6 και κυκλίνες. Περαιτέρω, η χορήγηση 50, 100 ή 200 mg GSPs /kg βάρους σώματος των ποντικών από του στόματος καθετηριασμό (5 d /εβδομάδα) σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη του

sc

Α549 και Η1299 πνεύμονα ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, τα οποία συνδέθηκε με την επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, αυξημένη έκφραση Bax, μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε κύτταρα ξενομοσχεύματος όγκου. Με βάση τα δεδομένα που λαμβάνονται στη μελέτη ζώων, την ανθρώπινη ισοδύναμη δόση GSPs υπολογίστηκε, η οποία φαίνεται προσιτή και εφικτή. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GSPs μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν δυνητικό θεραπευτικό παράγοντα για τη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Singh Τ, Sharma SD, Katiyar SK (2011) Σταφύλι προανθοκυανιδίνες επάγει απόπτωση από την απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό των ανθρώπινων κυττάρων μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10.1371 /journal.pone.0027444

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 17 Οκτώβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από την Merit Veterans Administration Award κριτική (SKK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία που σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε όλο τον κόσμο [1]. Ένας στους τρεις θανάτους από καρκίνο σχετίζονται οφείλεται σε καρκίνο του πνεύμονα, και η μελαγχολική ποσοστό επιβίωσης 5 ετών περίπου το 14% έχει δείξει καμία βελτίωση σε σχέση με τις τρεις τελευταίες δεκαετίες [2], [3]. καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων και τον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) αποτελούν το 90% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. NSCLC αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των τύπων καρκίνου του πνεύμονα και περιλαμβάνει καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκινώματα, και μεγάλου κυττάρου καρκινώματα [4], [5]. Παρά το γεγονός ότι ένας συνδυασμός χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών, οι περισσότεροι ασθενείς πεθαίνουν από την εξέλιξη της νόσου, που συχνά προκύπτουν από επίκτητο ή ενδογενή ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπευτικά [6] ναρκωτικά. Ως εκ τούτου, η εξερεύνηση και ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών παραγόντων και θεραπείες που μπορούν να στοχεύσουν τα μόρια που συνδέονται με την ανάπτυξη του όγκου και την αντίσταση απόπτωση θα οδηγήσει σε βελτιωμένα αποτελέσματα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Φυσικά φυτικά προϊόντα προσφέρουν πολλά υποσχόμενες νέες επιλογές για την η ανάπτυξη αποτελεσματικότερων χημειοθεραπευτικών στρατηγικών για καρκίνους των διαφόρων οργάνων. προανθοκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (GSPs) είναι πολλά υποσχόμενη φυτοχημικά που έχουν αντι-φλεγμονώδη [7] και αντιοξειδωτικές ιδιότητες [8] – [10], και φαίνεται να επιδεικνύουν ελάχιστη τοξικότητα σε πειραματόζωα [9], [10]. Οι GSPs εύκολα εξάγεται από σταφύλι-σπόρους, ένα υποπροϊόν του χυμού σταφυλιών και κρασί βιομηχανίες, και είναι ένα μείγμα διαφόρων πολυφαινολικών συστατικών, τα οποία αποτελούν διμερή, τριμερή, τετραμερή, και ολιγομερή /πολυμερή μονομερούς κατεχινών και /ή (-) -epicatechins, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [10]. Πιστεύουμε ότι τουλάχιστον ορισμένα από τα στοιχεία που υπάρχουν στο GSPs πράξη συνεργιστικά και μπορεί να παρέχει καλύτερα αποτελέσματα χημειοθεραπευτικά από ένα ενιαίο συστατικό.

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι η διαιτητική συμπλήρωση με τις GSP δίαιτα ελέγχου AIN76A οδήγησε σε μια δοσο εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης των Α549 και Η1299 NSCLC ξενομοσχεύματος όγκου σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, και η ανασταλτική της ανάπτυξης δράση των GSPs στις ξενομοσχεύματος όγκους NSCLC συνδέθηκε με την αύξηση των επιπέδων της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα δέσμευσης πρωτεΐνης-3 και αντι αγγειογονικά αποτελέσματα στα μικροπεριβάλλοντα του όγκου (11). Σε μια άλλη μελέτη, έχουμε επίσης αναφερθεί ότι GSPs αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση των κυττάρων NSCLC

in vitro

και

in vivo

ξενομοσχεύματα όγκου, η οποία συνδέθηκε με ανασταλτικές επιδράσεις τους στην cyclooxygenase- 2 έκφραση και την παραγωγή της προσταγλανδίνης μεταβολίτη της, PGE

2 (12). Αντίθετα, μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης σε φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα μετά από κατεργασία GSPs υπό ταυτόσημες συνθήκες δεν παρατηρήθηκε [11], [12]. Παρά αντι-καρκινογόνες επιδράσεις της GSPs επί κυττάρων NSCLC, ένας ακριβής μηχανισμός της ανασταλτικής επίδρασης στην ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC και απόπτωσης με τις GSP δεν είναι καλά κατανοητός. Στην παρούσα ανακοίνωση, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη έρευνα για το μηχανισμό που ευθύνεται για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα και της απόπτωσης χρησιμοποιώντας Α549 και κυτταρικές σειρές Η1299 ως

in vitro

μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων και

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. Για να μελετηθεί η

in vivo επίδραση της

GSPs στην ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου, GSPs δόθηκε σε ποντικούς από του στόματος καθετηριασμό 5 ημέρες /εβδομάδα. Αναφέρουμε ότι GSPs επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC προκαλείται μέσω διαμορφώσεων στα επίπεδα έκφρασης του προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και οδούς ενεργοποίηση της κασπάσης-3. GSPs ελέγχεται επίσης την απορυθμισμένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και των συναφών ρυθμιστικών πρωτεϊνών στα κύτταρα NSCLC. Έτσι οι μελέτες μας παρέχει τη διορατικότητα στο μηχανισμό με τον οποίο GSPs διεγείρει απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας παρέχουν μια πειστική σκεπτικό για την φαρμακολογική δράση του GSPs έναντι ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια, τα χημικά και τα αντισώματα

Οι GSPs χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από Kikkoman Corporation (Noda, Ιαπωνία). Ο JC-1 μιτοχονδριακή μεμβράνη Kit Δυναμικό Ανίχνευση και Anti-OxPhos υπομονάδα IV Complex IV (Cox IV) αγοράστηκαν από την Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). ΟβΙΙ Death Ανίχνευση ELISA Κιτ ελήφθησαν από την Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, ΙΝ). Τα πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν ως εξής: αντισώματα για Bcl-2, Bcl-XL, Bax, κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση-9 και -3, αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ)? αντισώματα για το κυτόχρωμα c, Smac /DIABLO, κυκλίνη D1, κυκλίνη D2, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6, Cip1 /p21, Kip1 /ρ27 και τα δευτερογενή αντισώματα, υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη ποντικού ανοσοσφαιρίνης G και ανοσοσφαιρίνη αντι-κουνελιού G ήταν που λαμβάνονται από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Caspase-3-ειδικό αναστολέα (Ζ-DEVD-fmk) αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA). ApoTarget Kit ειδικά για δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3 ελήφθη από BioSource International, Inc. (San Diego, CA). Ham F-12, RPMI 1640, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και θρυψίνη /ΕϋΤΑ ελήφθησαν από Cellgro (Herndon, VA). Οι κηλίδωση Western αντιδραστήρια ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας αγοράσθηκαν από την Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

Κυτταρική καλλιέργεια και κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος πνεύμονα, Α549 και Η1299, και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές Α549 και Η1299 καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε F-12 και RPMI 1640 μέσο καλλιέργειας του Ham, αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT), 100 μg /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C. Οι GSPs διαλύθηκαν σε μια μικρή ποσότητα διμεθυλοσουλφοξειδίου [DMSO, μέγιστη συγκέντρωση, 0,1% (ν /ν)], το οποίο στη συνέχεια προστέθηκε για να ολοκληρωθεί μέσο κυτταρικής καλλιέργειας πριν από την προσθήκη σε υποσυρρέοντα κύτταρα (60-70% συρροή). Κύτταρα κατεργασμένα με φορέα μόνο (DMSO, 0,1% σε μέσα) χρησίμευσαν ως μάρτυρες.

Ανάλυση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου με ELISA

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέγεται. GSPs απόπτωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρικό θάνατο Detection ELISA Kit (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), η οποία ποσοτικοποιεί κυτταροπλασματική DNA θραύσματα ιστόνης που σχετίζονται με τη μορφή mononucleosomes ή oligonucleosomes, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

caspase-3 δραστικότητα δοκιμασίας

Η δραστικότητα της κασπάσης-3 σε προϊόντα λύσης κυττάρου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία χρωματομετρικού πρωτεάσης ApoTarget Kit (BioSource International, Inc., CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, Α549 ή κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με τις GSP (20, 40, 60 και 80 μg /mL) για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τη χρήση μικρής θρυψινοποίηση και προϊόντα λύσης κυττάρου που παρασκευάζονται ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δείγματα των κυτταρικών λυμάτων (100 μα πρωτεΐνης ανά δείγμα) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης και 200 ​​μmol υποστρώματος /L (DEVD-ρΝΑ για κασπάση-3) και επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C στο σκοτάδι. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 405 nm και οι αναγνώσεις του δείγματος υπολογίζεται με αφαίρεση της απορρόφησης των τυφλών δειγμάτων.

DNA ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Υπο-συρρέοντα κύτταρα (50-60%) υπέστησαν κατεργασία με ποικίλες συγκεντρώσεις GSPs σε πλήρες μέσο για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [13], [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα (1 χ 10

5) επαναιωρήθηκαν σε 50 μι ψυχρό PBS στο οποίο 450 μL ψυχρή μεθανόλη προστέθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1100 rpm για 5 λεπτά? το σφαιρίδιο πλύθηκε με ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκαν σε 500 μL PBS, και επωάζονται με 5 μΙ ΚΝάσης (/mL τελική συγκέντρωση 20 μg) επί 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL) σε πάγο για 1 ώρα στο σκοτάδι. Η κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με τη χρήση FACSCalibur όργανο (BD Biosciences, San Jose, CA) εξοπλισμένο με CellQuest 3.3 του λογισμικού στη διαλογή (FACS) μηχάνημα το ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων στον πυρήνα διευκόλυνση του UAB Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου.

Ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση Western blot

Μετά την επεξεργασία των Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης, όπως λεπτομερή προηγουμένως [12], [13]. Για ανοσοκηλίδωση του κυτοχρώματος

γ

, Smac /DIABLO και Cox IV, μιτοχονδριακό και κυτοσολικά κλάσματα παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν επί 10% πηκτών Τρις-Γλυκίνης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης, η μεμβράνη επωάστηκε με το επιθυμητό πρωτεύον αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Κάθε μεμβράνη απογυμνώθηκε και επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών.

Για CDK αναστολέας (Cdki) -Cdk δοκιμασία πρόσδεσης, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 60 μg /mL GSPs για 48 ώρες, πλύθηκαν με παγωμένο PBS, και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Κλάσματα που περιέχουν 200 μα πρωτεΐνης καθαρίστηκαν με /G-συν σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α (Santa Cruz, CA). πρωτεΐνες Cip1 /p21 και Kip1 /ρ27 ανοσοκαταβυθίστηκαν από τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα μετά από επώαση για 8 ώρες ακολουθούμενη από την προσθήκη του /G-συν σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α (50 μί, Santa Cruz, CA) και συνεχίστηκε η επώαση επί μία νύκτα στους 4 ΝΤΟ. Ανοσοκαταβύθισης ξεπλένονται, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western χρησιμοποιώντας πηκτές Τπδ-Γλυκίνης ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας CDK2, CDK4 και CDK6 αντισώματα.

Δοκιμασία για μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

Η αλλαγή στη μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μετά από αγωγή με τις GSP προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το φθορίζον λιπόφιλη κατιονική ανιχνευτή JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδιούχο) Ανίχνευση Kit, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, και όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [13], [14]. JC-1 συσσωρεύεται επιλεκτικά μέσα σε άθικτα μιτοχόνδρια για να σχηματίσουν πολυμερές J-αδρανών υλικών που εκπέμπουν φως φθορισμού στα 590 nm. Η μονομερής μορφή εκπέμπει φως στα 527 nm μετά από διέγερση στα 490 nm. Έτσι, το χρώμα των αλλαγών χρώματος από πορτοκαλί σε πράσινο, ανάλογα με το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, και μπορούν να αναλυθούν με FACS με πράσινο φθορισμό στο κανάλι 1 (FL 1) και εκπομπής πορτοκάλι στο κανάλι 2 (FL2).

Ζώα και ξενομοσχεύματος όγκου μελέτη

Γυναίκα αθυμικά γυμνά ποντίκια (4-5 εβδομάδες ηλικίας) αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (Frederick, MD), που στεγάζεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης, και που παρέχονται με αποστειρωμένο διατροφή AIN76A και νερό

κατά βούληση

. Όλοι οι ποντικοί διατηρήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες ενός κύκλου φωτός σκοτάδι /12-h 12-h, μια θερμοκρασία 24 ± 2 ° C, και σχετική υγρασία 50 ± 10%. Το πρωτόκολλο των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, και ενέκρινε ζώων Αριθμός πρωτοκόλλου είναι: 101109267.

Για να προσδιορίσετε το

in vivo

αποτελεσματικότητα του GSPs έναντι ανθρώπινου πνεύμονα ανάπτυξη ξενομοσχεύματος καρκινικών όγκων, εκθετικά αυξανόμενη Α549 και Η1299 κύτταρα (2 χ 10

6) αναμείχθηκαν σε μια αναλογία 1:01 με Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, ΜΑ), και ένα 100 μι εναιώρημα που περιείχε 2 × 10

6 κυττάρων εγχύθηκε υποδορίως στο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού. Μετά από 24 ώρες, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (η = 10). Πειραματικά ζώα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με από του στόματος καθετηριασμό με 50, 100 ή 200 mg GSPs /kg σωματικού βάρους /ημέρα σε 100 μL PBS πέντε ημέρες την εβδομάδα (Δευτέρα έως Παρασκευή) αρχίζοντας μία ημέρα μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν ίσο όγκο PBS. Το πείραμα τερματίστηκε 58 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε 2-φορές την εβδομάδα. σωματικού βάρους /ποντίκι και τη διατροφή της κατανάλωσης /ποντίκι καταγράφηκαν τακτικά κατά τη διάρκεια του πειράματος. Τα ζώα παρακολουθούνται επίσης αν αρρωστήσετε ή πόνο (έλλειψη κανονικό καλλωπισμό και την αποφυγή συμπεριφορών) σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στο τέλος του πειράματος, η ολική μάζα του όγκου συλλέχθηκε, ζυγίστηκε, και ένα μέρος του όγκου χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των προϊόντων λύσεως του όγκου για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των διαφορετικών πρωτεϊνών που παρουσιάζουν ενδιαφέρον και το υπόλοιπο μέρος χρησιμοποιήθηκε για ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του PCNA-θετικών και TUNEL-θετικών κυττάρων

Πέντε μm πάχους τομές όγκων αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αλκοολών. Μετά ενυδάτωση, μια διαδικασία ανάκτησης αντιγόνου διεξήχθη τοποθετώντας τα πλακίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM κιτρικού νατρίου, ρΗ 6,0 στους 95 ° C για 20 λεπτά που ακολουθείται από 20 λεπτά ψύξης. Οι τομές πλύθηκαν σε PBS και μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με 1% BSA με 2% ορό κατσίκας σε PBS πριν από την επώαση με αντι-ΡΟΝΑ αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα για 45 λεπτά που ακολουθείται από συζευγμένο με HRP στρεπταβιδίνη, πλύση σε PBS, επώαση με υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνης και αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος σε ιστούς όγκων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τρανσφεράση μεσολάβηση dUTP nick-άκρο επισήμανση δοκιμασίες (TUNEL) τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλο. Οι αριθμοί των PCNA-θετικών και TUNEL θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων x 100 /συνολικό αριθμό των κυττάρων.

Η στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα από το

in vivo

μελέτες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 2-3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ του ελέγχου και τις GSP-αγωγή ομάδες υπολογίστηκαν με δοκιμασία t του Student (Sigma Stat 2.03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Όλα τα ποσοτικά στοιχεία παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Στη μελέτη ξενομόσχευμα όγκου, η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ του ελέγχου και τις GSP-αγωγή ομάδες προσδιορίστηκε με ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni t test, και σε κάθε περίπτωση P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

κύτταρα NSCLC είναι ευαίσθητα σε τις GSP-επαγόμενη απόπτωση

Έχουμε δείξει ότι η θεραπεία της Α549 και Η1299 NSCLC κυττάρων με διάφορες συγκεντρώσεις GSPs αναστέλλει το δυναμικό ανάπτυξης ή του πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη τρόπος. GSPs επάγεται επίσης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αυτών των κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο [11], [12]. Η απόπτωση GSPs επαγόμενη από Α549 και Η1299 κυττάρων μετά κατεργασία για 48 ώρες με χρήση ανάλυσης FACS συνοψίζεται στο Σχήμα 1Α. Ωστόσο, μια ακριβής μηχανισμός αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα των GSPs έναντι κυττάρων NSCLC δεν είναι απολύτως κατανοητή. Ως εκ τούτου, οι μελέτες διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η ακριβής μηχανισμός εμπλέκονται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC με την κατεργασία με τις GSP.

(Α)

In vitro

θεραπεία του Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP επάγει απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS, και το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε Α549 και Η1299 κύτταρα συνοψίζονται ως μέσος όρος ± SD, η = 3. έλεγχοι σημαντική διαφορά σε σχέση μη-GSPs επεξεργασμένα:

*

P

& lt? 0,05?

¶

P

& lt? 0,01?

†

P

& lt? 0.001. (Β) Επεξεργασία του Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP αποτέλεσμα μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Bcl-2 και Bcl-XL ενώ αυξάνεται η έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bax, όπως καθορίζεται από ανάλυση κηλίδας western. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

GSPs μειώσει την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-XL και Bcl-2, ενώ η αύξηση της έκφρασης των προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax σε Α549 και Η1299 κύτταρα

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης λειτουργώντας ως υποκινητές (

π.χ.

., Bax) ή αναστολείς (Bcl-2 ή ΒοΙ-χι ) του κυτταρικού θανάτου [15] – [17]. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση στυπώματος western, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία του Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-XL και Bcl-2, και μια αύξηση των επιπέδων η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bax, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 1 Β). Ετσι, η θεραπεία αυτών των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με τις GSP μπορεί να μεταβάλει τα επίπεδα πρωτεΐνης των βασικών μελών της οικογένειας Bcl-2, κατά τρόπο που να ευνοεί την αύξηση της αναλογίας του Bax: Bcl-2, η οποία μπορεί να συνεισφέρει στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε ΣΓΠ-επαγόμενη απόπτωση [15].

GSPs να προκαλέσει απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και την επακόλουθη ενίσχυση της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c και Smac /DIABLO στα κύτταρα NSCLC

η απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης έχει συνδεθεί με την έναρξη και την ενεργοποίηση των αποπτωτικών διαδικασίας στα κύτταρα [15], [16]. Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και Smac /DIABLO από μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο συμβάλλει στην ενεργοποίηση των κασπασών και στη συνέχεια οδηγεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις των GSPs σε αυτή τη διαδικασία στο Α549 και Η1299 κύτταρα, κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με τις GSP για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η θεραπευτική αγωγή GSPs είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στην κυτοχρώματος c και αποδέσμευσης Smac /DIABLO στο κυτταρόπλασμα και αντίστοιχη μείωση στα επίπεδα του κυτοχρώματος c και Smac /DIABLO στα μιτοχονδριακά κλάσματα τόσο Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχ. 2Α και 2Β), υποδηλώνοντας έτσι την απώλεια του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης για την επεξεργασία των GSPs σε αυτά τα κύτταρα. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντι-COX IV αντίσωμα να αποκλείσει το ενδεχόμενο διασταυρούμενης μόλυνσης των μιτοχονδριακών και κυτοσολικά κλάσματα. Η παρουσία των COX IV δεν ανιχνεύθηκε σε κυτοσολικά κλάσματα

(Α & amp? Β). Ανοσοκηλίδωση για το κυτόχρωμα

γ

και Smac /DIABLO χρησιμοποιώντας κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα που παρασκευάζονται από Α549 και Η1299 κύτταρα μετά θεραπεία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις GSPs για 48 ώρες. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντι-COX IV αντίσωμα να εξασφαλιστεί ίση μιτοχονδριακή πρωτεΐνη φόρτωσης καθώς και να αποκλείσει τη διασταυρούμενη μόλυνση των μιτοχονδριακών και κυτοσολικά κλάσματα. (Γ) Κατεργασία του Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP προκαλεί απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις του GSPs για 48 ώρες. JC-1 κυττάρων χρωστικής-χρώση αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ξεχωριστά πειράματα με τις ίδιες παρατηρήσεις.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι GSPS να προκαλέσει απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, χρησιμοποιήσαμε την κατιονικές λιπόφιλη βαφή, JC-1, η οποία συσσωρεύεται στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων σε ένα δυναμικό-εξαρτώμενο τρόπο. Στη διάσπαση του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, η εκπομπή φθορισμού του JC-1 μεταβολές χρώματος από κόκκινο σε πράσινο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την προσθήκη των GSPs, το Α549 και Η1299 κύτταρα συλλέχθηκαν, επωάστηκαν με JC-1 βαφή και την εκπομπή φθορισμού αναλύθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, θεραπεία GSP των Α549 και κυττάρων Η1299 είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στον αριθμό των κυττάρων πράσινου-φθορισμός-θετικά, όπως φαίνεται στο τεταρτημόριο κάτω δεξιά (LR) του ιστογράμματος FACS. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η θεραπεία GSPs διεγείρουν απόπτωση και των δύο κυττάρων καρκινώματος πνεύμονα Α549 και Η1299 μέσω διακοπής του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης.

GSPs επάγουν την ενεργοποίηση των κασπασών και PARP τόσο Α549 και κύτταρα Η1299

Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

και Smac /DIABLO σε κυτοσόλιο ενεργοποιεί προκασπάσης 9 στο αποπτωσώματος και οδηγεί σε δραστική διάσπαση της κασπάσης-9 και διάσπαση της κασπάσης-3 [18] – [20]. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 οδηγεί στη συνέχεια σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω διάσπασης ενός ευρέως φάσματος πρωτεϊνών στόχων, συμπεριλαμβανομένων PARP. Επομένως, προσδιορίσαμε το εάν η επαγωγή της απόπτωσης των Α549 κυττάρων και Η1299 με τις GSP διαμεσολαβείται μέσω της ενεργοποίησης του procaspase-9, κασπάσης-3 και PARP πρωτεΐνες. Θεραπεία της Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στα επίπεδα της κασπάσης-9 ενώ αυξάνεται η διάσπαση των κασπασών-9, κασπάσης-3 και των πρωτεϊνών ΡΑΚΡ σε σχέση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 3Α ). Οι GSPs επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε Α549 και Η1299 κύτταρα επίσης προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας μία χρωματομετρική δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3. Θεραπεία των δύο Α549 και Η1299 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με τις GSP για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά υψηλότερη (ρ & lt? 0,05? Ρ & lt? 0.001) κασπάσης-3 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο από αυτή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 3Β).

(Α) Κατεργασία Α549 και Η1299 κυττάρων με τις GSP μειώνει το επίπεδο της κασπάσης-9 ενώ αυξάνει την ενεργοποίηση /διάσπαση της κασπάσης-9, κασπάσης-3 και PARP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις GSPs (0, 20, 40, 60 και 80 μg /mL) για 48 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για την ανίχνευση των επιπέδων της κασπάσης-9, διασπασμένη κασπάσης-9, κασπάσης-3 και PARP. Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα δείχνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Η δραστηριότητα της κασπάσης-3 σε κυτταρικά λύματα από τα δείγματα του Πίνακα Α μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία χρωματομετρικού πρωτεάσης (ApoTarget Kit). θεραπεία GSPs να Α549 και κύτταρα Η1299 αυξάνει τη δραστικότητα της κασπάσης-3 δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα θεραπείας μη GSPs,

¶

P

& lt? 0,01 και

*

P

& lt? 0.001. (Γ) Η επίδραση του GSPs (60 και 80 μg /mL) επί της απόπτωσης των Α549 και Η1299 κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 48 ώρες εν απουσία ή παρουσία 60 μmol /L του αναστολέα κασπάσης-3 (Ζ-DEVD-fmk) . Το περιεχόμενο των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανίχνευση κυτταρικού θανάτου κιτ ELISA, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα κατεργασμένα με z-DEVD-fmk μπλόκαρε την GSPs επαγόμενη απόπτωση σε Α549 και κύτταρα Η1299. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας συνοψίστηκε και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από δύο επαναλαμβανόμενες πειράματα. Σημαντική αναστολή από αναστολέα της κασπάσης-3 σε σχέση με τις GSP κύτταρα και μόνο θεραπεία,

*

P

& lt? 0.001. CI = κασπάσης-3 αναστολέα, C = έλεγχος, χωρίς καμία επεξεργασία.

Η

Η θεραπεία με τον αναστολέα της κασπάσης-3 (Ζ-DEVD-fmk) δεσμεύει τις GSP-επαγόμενη απόπτωση τόσο Α549 και Η1299 κύτταρα

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι GSPS επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3 εμπλέκεται στην επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου των Α549 και Η1299 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, προσδιορίσαμε αν η GSPs απόπτωση που επάγεται από Α549 και Η1299 κυττάρων επηρεάστηκε με την προσθήκη του αναστολέα κασπάσης-3-ειδικό (Ζ-DEVD-fmk). Α549 και κύτταρα Η1299 είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με τις GSP με ή χωρίς z-DEVD-fmk (60 μmol /L) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και θάνατο των κυττάρων αναλύθηκε με χρήση κυττάρων κιτ Death Detection ELISA, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C (αριστερό πάνελ), κατεργασία των κυττάρων Α549 με τις GSP στις συγκεντρώσεις των 60 και 80 μg /mL οδήγησε σε 31% και 49% απόπτωση ή κυτταρικό θάνατο, αντίστοιχα σε σύγκριση με 6,5% σε μη GSPs επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου . Η θεραπεία των κυττάρων Α549 με τις GSP (60 ή 80 μg /mL) υπό την παρουσία Ζ-DEVD-fmk είχε σαν αποτέλεσμα μόνο 14% και 17% απόπτωση, αντίστοιχα, η οποία αναφέρεται σαφώς ότι η παρουσία του αναστολέα της κασπάσης-3-ειδικό σημαντικά μπλοκάρει τις GSP που προκαλείται από αποπτωτικά κύτταρα θάνατο (

P

& lt? 0.001) σε κύτταρα Α549. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν όταν Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP παρουσία ή απουσία z-DEVD-fmk, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C (δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι GSPs επαγόμενη απόπτωση τόσο Α549 και Η1299 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα σχετίζεται με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3.

GSPs επάγουν φάση G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα NSCLC

Based σχετικά με τις προκαταρκτικές μελέτες όπου παρατηρήσαμε μια ισχυρή ανασταλτική της ανάπτυξης δράση του GSPs σε κύτταρα NSCLC, μπορούμε στη συνέχεια προσδιορίζεται ο πιθανός μηχανισμός αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα GSPs που μπορεί να οδηγήσει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Για το σκοπό αυτό η επίδραση του GSPs στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε Α549 και κύτταρα Η1299 προσδιορίστηκε μετά την αγωγή με τις GSP για 48 ώρες. Όπως συνοψίζεται στο Σχήμα 4, (Πλαίσια Α-D), η επεξεργασία των Α549 κυττάρων με τις GSP οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων στην φάση G1 καθόλου χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις: 20 μg /mL (58,3%,

P

& lt? 0.05), 40 μg /mL (67,9%,

P

& lt? 0.001) και 60 μg /mL (75,5%,

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με τη μη -GSPs θεραπεία ελέγχου (52,7%). Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4 (Αριστερό πάνελ Α-D), η δόση-εξαρτώμενο αποτέλεσμα GSPs επί G1 σύλληψη σε κύτταρα Α549 ήταν σε μεγάλο βαθμό σε βάρος των κυττάρων στην φάση S με μία ελάχιστη αλλαγή στον πληθυσμό των κυττάρων G2-M σε σύγκριση με το μη -GSPs-επεξεργασμένα κύτταρα μάρτυρες (Πίνακας Α). Παρόμοια επίδραση του GSPs κατά τη σύλληψη φάση G1 βρέθηκε επίσης σε Η1299 κύτταρα (Σχήμα 4, δεξιά πάνελ Α-Δ). Τα αποτελέσματα της κατανομής του κυτταρικού κύκλου σε κάθε δόση του GSPs συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα Ε, που έδειξε την σημαντική σύλληψη του Α549 και Η1299 κυττάρων σε Ο0-G1 φάση μετά τη θεραπεία GSPs.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με φορέα ( 0,1% DMSO εντός μέσου) ή 20, 40 και δόσεις GSPs σε πλήρες μέσο 60 μg /mL. Μετά από 48 ώρες αγωγής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υπέστησαν πέψη με RNase. Cellular DNA χρωματίστηκε με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να αναλυθεί η κατανομή του κυτταρικού κύκλου, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα Υλικά και Μέθοδοι. (Α-ϋ) κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε Α549 (αριστερά πάνελ) και Η1299 (δεξιά πάνελ) κύτταρα με τη θεραπεία των διαφόρων συγκεντρώσεων GSPs. (Ε) Στοιχεία από τον κυτταρικό κύκλο διανομής συνοψίστηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Στατιστικά σημαντική έναντι μη GSPs θεραπεία ομάδα ελέγχου,

¶

P

& lt? 0,05 και

*

P

& lt?. 0.01

Η

GSPs μειώνουν τις εκφράσεις των ρυθμιστικών πρωτεϊνών G1 των CDK και των κυκλινών σε κύτταρα NSCLC

Μελέτες έχουν δείξει ότι Cdks και κυκλίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου [21], επομένως προσδιορίσαμε την επίδραση της GSPs για την τα επίπεδα πρωτεΐνης των Cdks και κυκλίνες οι οποίες ρυθμίζονται από αρνητικά Cdki (Cip1 /p21 και Kip1 /ρ27) κατά τη διάρκεια εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου G1 φάση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 (πίνακας Α), η επεξεργασία των Α549 κυττάρων με τις GSP οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση στην έκφραση των CDK2, CDK4 και CDK6 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία GSPs. Μια ισχυρή μείωση στην Cdks παρατηρήθηκε στις δόσεις των 40-80 συγκεντρώσεων μg /mL του GSPs. Ομοίως, μια σημαντική μείωση στην έκφραση των κυκλινών D1, D2 και Ε παρατηρήθηκε σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Όμοια επίδραση του GSPs βρέθηκε επίσης όταν τα κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με τις GSP και υπό τις ίδιες συνθήκες (Σχήμα 5Α, δεξιά πάνελ).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο (0.1% DMSO εντός μέσου) ή τις GSP (20 , 40, 60 και 80 μg /mL) για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται, κυτταρολύματα παρασκευάζονται και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι.