Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες. Πολλαπλά στοιχεία δείχνουν ότι ο πληθυσμός του όγκου κίνησης, ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του καρκίνου και εξαιρετική αντοχή στα φάρμακα, που αντιπροσωπεύουν ένα ιδιαίτερα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε CSC-συγκεκριμένες αλλοιώσεις που προκαλούνται από τη νέα γενιά ταξοειδές SBT-1214 και ένα νέο polyenolic ψευδαργύρου-δεσμευτική κουρκουμινοειδή, CMC2.24, στο ΚΕΠ του προστάτη.

Κύρια Ευρήματα

Το CD133

υψηλή /CD44

υψηλή φαινότυπο απομονώθηκε από αυθόρμητα αθάνατα κύτταρα ΡΡΤ2 ασθενή που προέρχεται και άκρως μεταστατικά κύτταρα PC3MM2. Εβδομαδιαία θεραπεία των ποντικών NOD /SCID που φέρουν PPT2- και PC3MM3 επαγόμενη όγκων με το SBT-1214 οδήγησε σε δραματική καταστολή της ανάπτυξης του όγκου. Τέσσερις από έξι ΡΡΤ2 και 3 από 6 όγκων PC3MM2 έχουν δείξει την απουσία των βιώσιμων κυττάρων σε υπολειμματικό όγκους.

Σε

vitro

, SBT-1214 (100 nm-1 μΜ? Για 72 ώρες) που προκαλείται από περίπου 60% κυτταρικό θάνατο στο CD133

υψηλή /CD44

+ /υψηλής κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κολλαγόνου Ι σε μέσο βλαστοκυττάρων (σε αντίθεση, οι ίδιες δόσεις πακλιταξέλης αυξημένο πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων). Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα αυξήθηκαν όταν SBT-1214 ενώθηκε με το CMC2.24. Μία δοκιμασία PCR συστοιχία βλαστικών κυττάρων ειδικών αποκάλυψε ότι αυτός ο συνδυασμός φαρμάκων που επιτελείται μαζική αναστολή της πολλαπλά γονίδια ιδιοσυστατικά πάνω ρυθμισμένα βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται, συμπεριλαμβανομένων των βασικών παραγόντων μεταγραφής pluripotency. Είναι σημαντικό, αυτός ο συνδυασμός φαρμάκων που προκαλείται από την έκφραση του p21 και p53, η οποία ήταν απούσα στο CD133

υψηλή /CD44

υψηλής κύτταρα. Βιώσιμων κυττάρων που επιβίωσαν αυτό το θεραπευτικό σχήμα δεν ήταν πλέον σε θέση να προκαλέσουν δευτερογενή σφαιροειδή, παρουσίασαν σημαντικές μορφολογικές ανωμαλίες και πέθανε σε 2-5 ημέρες.

Συμπεράσματα

Αναφέρουμε εδώ ότι μόνη της η SBT-1214 , ή σε συνδυασμό με CMC2.24, κατέχει σημαντική δραστικότητα έναντι του προστάτη CD133

υψηλή /CD44

+ /υψηλής καρκινικά κύτταρα-κίνηση. Αυτός ο συνδυασμός αναστέλλει αποτελεσματικά φάρμακο έκφραση της πλειονότητας των γονιδίων των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με παράγοντες μεταγραφής και pluripotency. Επιπλέον, προκαλεί μια προηγουμένως απούσα έκφραση του p21 και p53 ( «γονίδιο wake-up»), η οποία μπορεί ενδεχομένως να αντιστρέψει την αντίσταση του φαρμάκου με την αύξηση της ευαισθησίας σε αντικαρκινικά φάρμακα

Παράθεση:. Botchkina GI, Zuniga ES , Rowehl RH, Πάρκο R, Bhalla R, Bialkowska AB, et al. (2013) του καρκίνου του προστάτη Stem Cell-Στοχευμένες αποτελεσματικότητα μιας νέας γενιάς Ταξοειδές, SBT-1214 και Novel Polyenolic σύνδεσης ψευδαργύρου κουρκουμινοειδή, CMC2.24. PLoS ONE 8 (9): e69884. doi: 10.1371 /journal.pone.0069884

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1η Μαΐου, 2013? Αποδεκτές: 13 Ιούν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 24 Σεπ 2013

Copyright: © 2013 Zuniga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ R21 CA150085, NYSTAR επιχορήγηση 1.072.170, και εν μέρει, από το Πανεπιστήμιο Stony Brook Ινστιτούτο χημικής Βιολογίας & amp? Drug Discovery (ICB & amp? DD)? Stony Brook University Cancer Center, Νέα Υόρκη? ChemMaster International, Νέα Υόρκη και SBU VP για την Έρευνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ο ρόλος του ChemMaster International, Inc., ως ο εφευρέτης του CMC2.24 ήταν για να συνθέσει και να παρέχει, σε είδος, το υλικό για την παρούσα μελέτη. Η εν λόγω εταιρεία είναι μια ημι-ακαδημαϊκή οντότητα (Πρόεδρος, Φράνσις Τζόνσον, PhD, είναι Καθηγητής του Τμήματος Χημείας και του Τμήματος Φαρμακολογικές Επιστημών στο SBU) που ειδικεύεται σε συνθέσεις πολλαπλών σταδίων για την ακαδημαϊκή και βιομηχανική ομάδες. Η εν λόγω εταιρεία δεν παρείχε καμία υποστήριξη σχετικά με την απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, ή τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία αυτά. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι η παροχή τρέχουσα έρευνα με CMC2.24 δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς δεν έχουν τυχόν οικονομικές ή μη οικονομικές, επαγγελματικές ή προσωπικές ανταγωνιστικών συμφερόντων.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (ΛΔΚ) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών στη Δυτική κοινωνία [1]. Είναι αρχικά ευαίσθητοι σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, αλλά περισσότερο από το 70% των ασθενών θα αντιμετωπίσει υποτροπή μετά τη θεραπεία και τη μετάβαση της ασθένειας σε μία ανίατη κατάσταση [2]. Για τους ασθενείς με διάγνωση ανεξάρτητου από ανδρογόνα PRC, σταθεροποιητές μικροσωληνίσκων όπως η πακλιταξέλη (Ptx? Ταξόλη) είναι μία στρατηγική θεραπείας πρώτης γραμμής που είναι αρχικά αποτελεσματική. Ωστόσο, οι προσεγγίσεις στη θεραπεία χημειοθεραπεία ΛΔΚ είναι σήμερα λείπουν [3]. Μετά την αρχική ανακάλυψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων, ΚΕΠ [4], έγινε ολοένα και πιο φανερό ότι οι όγκοι οργανώνονται ιεραρχικά, που περιέχει μια σχετικά μικρή (αλλά μεταβαλλόμενες) του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων, την έναρξη και ένα ετερογενές πλειοψηφία των χύμα καρκινικών κυττάρων σε διάφορα στάδια της ωρίμανση. Για την υποστήριξη της έννοιας CSC της καρκινογένεσης, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση αρκετών που χρησιμοποιούνται συνήθως δείκτες CSC, δηλαδή CD44, CD166 και ΑΙ_ϋΗ-1, καθώς και την αναλογία των κυττάρων που εκφράζουν αυτά τα γονίδια, αυξάνει με τη γήρανση [5] . Έχει αποδειχθεί ότι η γήρανση φαινόμενο συσχετίζεται με την απότομη αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης του προστάτη και πολλών άλλων μορφών καρκίνου [1]. Συσσωρευμένη γνώση δείχνει σαφώς ότι τα ΚΕΠ είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη των όγκων, τη συντήρηση και την ανθεκτικότητα στους συνήθεις τρόπους θεραπείας. Ετσι, έχει δειχθεί για πολλούς τύπους καρκίνου που τα ογκογόνα κύτταρα που εκφράζουν κοινούς μαρκαδόρους CSC, ιδίως CD133 και CD44, είναι εξαιρετικά ανθεκτικά σε συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα (όπως 5-FU, οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, docetaxel και άλλα). Επιπλέον, ο αριθμός των κυττάρων αυτών μπορούν να πολλαπλασιαστούν σημαντικά μετά από θεραπεία [6-13], η οποία συνήθως εκδηλώνεται ως περισσότερο ανθεκτικά στα φάρμακα και πιο επιθετική υποτροπιάζοντα και μεταστατική νόσο. Ως εκ τούτου, είναι κατανοητό ότι ΚΕΠ αντιπροσωπεύουν το πιο κρίσιμο στόχο για την ανάπτυξη μιας νέας γενιάς των αντικαρκινικών φαρμάκων.

Τα προκλινικά αξιολόγηση των αντικαρκινικών παραγόντων υποψήφιος είναι παραδοσιακά βασίζεται στη χρήση των καλλιεργειών μονοστιβάδας η συνολική, μη επιλεγμένα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, αυτή η in vitro μοντέλο αγνοεί σπάνιο αλλά λειτουργικά σημαντική, ογκογενή κύτταρα άκρως ανθεκτικών στα φάρμακα, και ως εκ τούτου έχει χαμηλή συνάφεια με την πολυπλοκότητα και την παθοφυσιολογία του

in vivo

ιστούς όγκων. Επιπλέον, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενη εγκατεστημένος καρκινικές κυτταρικές σειρές δεν έχουν καμία συσχέτιση με την αρχική κλινικά δείγματα, τα οποία μπορεί να οδηγήσει σε κρίσιμες misevaluation της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου [14]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει εν μέρει το υψηλό ποσοστό φθοράς των υποψήφιων αντικαρκινικών παραγόντων. Έτσι, μόνο το 5% των παραγόντων που έχουν αντικαρκινική δράση σε προκλινικές ανάπτυξη έχουν άδεια [15]. Επομένως, η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός των ΚΕΠ ασθενούς παραγώγων, η ανάπτυξη της βέλτιστης

in vivo

και

in vitro

προκλινικά μοντέλα, και CSC στοχευμένη αναλύσεις των που προκαλείται από φάρμακα μεταβολές αντιπροσωπεύουν κρίσιμα βήματα στην αξιολόγηση των νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Ωστόσο, είναι εξαιρετικά δύσκολο να καθοριστεί πρωτογενείς κυτταρικές σειρές από καρκινώματα του προστάτη, και αυτό το πεδίο εξακολουθεί να είναι ένα από τα πλέον αμφιλεγόμενα θέματα στην έρευνα του καρκίνου [16]. Πρώτα απ ‘όλα, PRC είναι ένας κακοήθεια με υψηλό βαθμό κυτταρικής και μοριακής ετερογένεια, ως εκ τούτου, υπάρχουν αντικειμενικές δυσκολίες στην απομόνωση καθαρών κυτταρικών πληθυσμών από ιστούς του προστάτη. Στο μοριακό επίπεδο, δεν υπάρχουν σήμερα οριστικά δείκτες για να αποδείξει την κακοήθη ή κακοήθη φύση των κυττάρων του προστάτη, και να διακρίνουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η ΚΕΠ θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μια ετερογενή υποπληθυσμό των κυττάρων του όγκου, την έναρξη [17-23]. Παρ ‘όλα αυτά, ένας συνδυασμός πολλαπλών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας για την αρχική διαλογή των κυττάρων που ακολουθείται από λεπτομερή λειτουργικό χαρακτηρισμό των απομονωμένων φαινοτύπων κυττάρου μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση του πλέον λειτουργικά σημαντική (δηλαδή από όγκο και μετάσταση-κίνησης, ή η πιο ανθεκτική στα φάρμακα) κύτταρο πληθυσμούς.

Σε προηγούμενες μελέτες μας, έχουμε βρει ότι ένα ταξοειδές νέας γενιάς, SBT-1214, επάγει αποτελεσματική μακροπρόθεσμη καταστολή της ξενομοσχευμάτων όγκου κόλον [24] και δραματικά ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση πολλαπλών βλαστικών γονίδια κυτταρο-σχετικών [25]. Ψάχνοντας για την ασφαλή παραγόντων που μπορούν δυνητικά να μειώσει τη συστηματική τοξικότητα και την περαιτέρω βελτίωση των CSC-στοχευμένες δραστηριότητες της SBT-1214, που παρακινήθηκαν από τα πολυάριθμα χαρακτηριστικά γνωρίσματα αντι-καρκίνου του φυσικού φυτοχημικές κουρκουμίνη (diferuloylmethane). Σε ένα μεγάλο αριθμό μελετών, κουρκουμίνη έχει αναφερθεί για να ενισχύσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα που προκαλούνται από ποικίλες χημειοθεραπευτικά φάρμακα και, το σημαντικότερο, για την αναστολή της κλωνογόνο ικανότητα και επάγουν προ-αποπτωτικά αποτελέσματα σε κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο που εκφράζουν δείκτες αρχέγονων κυττάρων [26]. Ειδικότερα, η κουρκουμίνη μειώνει σημαντικά το πολλαπλασιαστικό δυναμικό και αυξάνει την απόπτωση και των δύο εξαρτώμενων από ανδρογόνα και μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [27,28]. Ωστόσο, η κουρκουμίνη έχει χαμηλή βιοδραστικότητα και βιοδιαθεσιμότητα, η οποία ενίσχυσε μας για την ανάπτυξη περίπου 30 δομικά ανάλογα της κουρκουμίνης (polyenolic παράγοντες ψευδαργύρου-δεσμευτική? PEZBINs), συμπεριλαμβανομένου του τρέχοντος ένωση μολύβδου, CMC2.24, η οποία έχει υψηλότερη βιοδραστικότητα, καλύτερη διαλυτότητα και καμία απόδειξη τοξικότητας ακόμη και σε υψηλές δόσεις [29]. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα της SBT-1214 ως μονοθεραπεία, και ο συνδυασμός της με αυτό το μυθιστόρημα κουρκουμινοειδή εναντίον πρωτογενών και μεταστατικών καρκινικών κυττάρων-έναρξη του προστάτη.

Αποτελέσματα

Καθιέρωση και χαρακτηρισμός του αυθόρμητα αθανατοποιημένη πρωτογενούς καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή, ΡΡΤ2

διαχωρισμένα κύτταρα βιοψιών βελόνας από 22 εκτομή καρκινώματα του προστάτη διαφόρων ιστολογικών βαθμών ελέγχθηκαν για κλωνογόνο και ογκογόνο δυναμικό

in vivo

και

in vitro

όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Είκοσι δείγματα περιείχαν έναν υποπληθυσμό των fast-προσκολλημένα κύτταρα (FA) προς το κολλαγόνο τύπου Ι, η οποία αρχικά πολλαπλασιάστηκαν σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό. Δεκατέσσερα από τα 22 δείγματα διεγειρόμενης κυμαινόμενο πολυκύτταρους αδρανών υλικών, και μόνο τρία δείγματα ήταν σε θέση να προκαλέσει πυκνή 3D σφαιροειδή χαρακτηριστικό των ΚΕΠ. Ωστόσο, η πλειονότητα των πρωτογενών κυττάρων που χάνονται κλωνογόνο και σχηματισμού σφαίρας των ικανοτήτων τους μετά από αρκετές διελεύσεις, πράγμα που είναι σύμφωνο με τις πολυάριθμες παρατηρήσεις ότι πρωτογενή κύτταρα καρκίνου προστάτη έχουν ένα πεπερασμένο χρόνο ζωής (5-6 περάσματα) [16]. Σε αντίθεση, τα καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από τον ασθενή με το στάδιο pT2c pNX ρΜΧ ΛΔΚ ήταν αυθόρμητα απαθανάτισε και συνέχισε μακροπρόθεσμη

in vitro

και

in vivo

ανάπτυξης (˃28 περάσματα, προς το παρόν). Με αύξοντα γύρους της μεταμόσχευσης και ανακαλλιέργειας σε ένα μέσο βλαστοκυττάρων, τριών διαφορετικών πληθυσμών κυττάρου έγινε εμφανής: τον κύριο πληθυσμό των επιμήκων κυττάρων, πολυάριθμες γύρος holoclones περιέχουν μικρά κύτταρα, και σπάνια, πολύ μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα (τα οποία συχνά παρατηρούμε σε αρκετές καθιερωθεί και πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές προστάτη και). Υποκλωνοποίηση των μικρών αυτών των κυττάρων που περιέχουν holoclones οδήγησε σε δραματική εμπλουτισμό των κυττάρων που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD133, CD44, CD44v6, EpCAM, CD49f και CD166 (Σχήμα 1Α). Αυτή η κυτταρική γραμμή (που ονομάζεται ΡΡΤ2) εν σειρά πολλαπλασιάζονται ως ξενομοσχεύματα NOD /SCID ποντίκια όγκου, επιπλέει 3D σφαιροειδή και πολιτισμών κολλαγόνο προσκολλημένη τύπου Ι. Σύμφωνα με την έκθεση ATCC (αριθμός ταυτότητας 002872), τα κύτταρα ΡΡΤ2 είναι μοναδικά ανθρώπινα κύτταρα χωρίς αντιστοιχία προς οποιοδήποτε προφίλ στη βάση δεδομένων ATCC STR, πράγμα που σημαίνει ότι δεν έχουν μολυνθεί με οποιαδήποτε γνωστά καθιερωμένες κυτταρικές σειρές. Αν και φαινότυπο των CSC-εμπλουτισμένες καλλιέργειες είναι δυναμική, λόγω του διττού χαρακτήρα των ΚΕΠ (δηλαδή, την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και να δημιουργήσει δεσμευτεί προγονικών κυττάρων), τα κύτταρα ΡΡΤ2 διατηρούν σχετικά σταθερή φαινοτύπων ακόμα μέχρι και 8 εβδομάδες μετά την τελευταία MACS- CD133

+ διαλογή κυττάρων και καλλιέργεια με τον τύπο Ι επιφάνειες επικαλυμμένες με κολλαγόνο σε μεσεγχυματικά μέσο ανάπτυξης βλαστοκυττάρων χωρίς ορό, MSCGM (Lonza? Πίνακας 1? Εικόνα 1). Έτσι, σχεδόν το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων ΡΡΤ2 ήταν αδιαφοροποίητα (μόνο 3-5% εξέφρασε δείκτης των διαφοροποιημένων κυττάρων, παν-κερατίνη), θετική για EpCAM, CD49f, πρότυπο ισομορφή του CD44 (98-99%? Κλώνος ΜΕΜ-85? Invitrogen), και μέχρι 72% εκφράζουν παραλλαγή ισομορφή, CD44v6 (κλώνος 2F10? Ε & amp? D). Μετά ˃ 27 περάσματα, περίπου το 90% των κυττάρων ΡΡΤ2 εξακολουθούν να εκφράζουν μέτρια έως υψηλά επίπεδα CD133 και έχουν πολύ υψηλή ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε 3D καλλιέργειας που περιέχει 1: 4 κολλαγόνου τύπου Ι /Stemline Πολυδύναμα Πολιτισμού Medium (SPCM? Sigma-Aldrich ). Δώδεκα-δεκαέξι τοις εκατό των κυττάρων ΡΡΤ2 ήταν θετικά για τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR

+), και 8-10% ήταν θετικά για CXCR4 (Σχήμα 1Α). Σε αντίθεση με την αρχική ιστό του όγκου, καθαρισμένη CD133

+ κύτταρα δεν εκφράζουν PSA, η οποία εμφανίστηκε και πάλι στα NOD /SCID ποντίκια όγκους μετά την μεταμόσχευση του CD133

+ κύτταρα (Εικόνα 1Β). Η συντριπτική πλειοψηφία του CD133

+ ΡΡΤ2 κύτταρα εξέφρασαν υψηλά κυτταροπλασματικά επίπεδα βιμεντίνη και νεστίνης, χαρακτηριστικό των νευρικών και των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Η έκφραση αυτών των δύο δεικτών ήταν υψηλότερη σε γιγαντιαία πολυπύρηνα κύτταρα (ΤΜΧ? Σχήμα 1C). Αμφότερα τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα των κυττάρων ΡΡΤ2 εκφράζονται c-myc, ενώ άλλοι δείκτες πλειοδυναμίας (Oct-4 και Sox-2) ανιχνεύθηκαν μόνο σε πυρηνικό κλάσμα (Εικόνα 1D). Σημαντικά, τα κύτταρα ΡΡΤ2 ήταν αρνητικά για πρωτεΐνες κατασταλτικό προ-αποπτωτικά /όγκου, ρ53 και ρ21, και εξαιρετικά ανθεκτικό σε πρότυπο αντικαρκινικά φάρμακα. Με την παρούσα στιγμή, μετά από περίπου 2,5 χρόνο συντήρησης, η συντριπτική πλειοψηφία των κυττάρων ΡΡΤ2 παραμένει σε ανώριμη κατάσταση, συνεχίζει να εκφράζει υψηλές αναλογίες και τα υψηλά επίπεδα που χρησιμοποιούνται συνήθως βλαστική ικανότητα και πλειοδυναμία δείκτες που αναφέρονται παραπάνω και διατηρεί πολύ υψηλό όγκο κίνηση, κλωνογονικού και σχηματισμού σφαίρας ικανότητες κατά τη διάρκεια της σειριακής μεταμοσχεύσεις από τους αριθμούς σχετικά χαμηλό κυττάρων. Όλα τα παραπάνω κίνητρο ομάδα μας για να δοκιμαστούν οι δύο ιδιόκτητα φάρμακα, SBT-1214 και CMC2.24 κατά αυτής της άκρως ανθεκτικά στα φάρμακα, CSC εμπλουτισμένο πρωτογενούς καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή και για τη σύγκριση, κατά καθιερώθηκε ένα έντονα μεταστατική παράγωγο της PC-3 κυτταρική γραμμή, κύτταρα PC3MM2, που χαρακτηρίζεται από το γεγονός προηγούμενη μελέτη μας [30].

(Α) Εκπρόσωπος FACS αναλύσεις των διαφόρων έκφραση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας σε μη ταξινομημένα κύτταρα ΡΡΤ2 καλλιεργούνται για 4 εβδομάδες σε κολλαγόνο τύπου Ι σε MSGB μέσον. Κάθε διακεκομμένη τετράγωνο αντιπροσωπεύει τον πληθυσμό των κυττάρων που εκφράζουν μέτρια /υψηλά επίπεδα ενός συγκεκριμένου δείκτη συζευγμένο με διαφορετικές φθορίζουσες ετικέτες. Σημείωση μακροπρόθεσμη διατήρηση του CD133-APC, πρότυπο (CD44-PE) και παραλλαγή (CD44v6-FITC) CD44 και CD49f-APC. Σε αντίθεση, μόνο μικρές κλάσματα των κυττάρων ΡΡΤ2 εξέφρασαν δείκτης βασικών κυττάρων, ρ63, ενός δείκτη των διαφοροποιημένων κυττάρων, παν-κερατίνη, CK18, AR και CXCR4. (Β) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση δείχνει ότι, σε αντίθεση με τη γονική ιστό του όγκου, καθαρισμένα CD133

+ ΡΡΤ2 κύτταρα δεν εκφράζουν PSA

στο

vitro

? Ωστόσο, ΡΡΤ2 που προκαλείται από NOD /SCID ξενομοσχεύματα όγκου είναι ασθενώς PSA-θετική. (Γ) Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση δείχνει ομοιόμορφη έκφραση της βιμεντίνης και νεστίνης, με ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα αυτών των δεικτών των νευρικών βλαστικών κυττάρων σε μεγάλες ΤΜΧ. (D) ανάλυση στυπώματος Western δείχνει την έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας πυρηνικών και κυτταροπλασματικά κλάσματα της CD133

+ ΡΡΤ2 κύτταρα. Τόσο τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα εκφράζονται c-Myc και ήταν αρνητικά για ρ53 και ρ21? μόνο το πυρηνικό κλάσμα εκφράζεται Oct-4 και Sox-2.

Η

κύτταρα ΡΡΤ2 **

PC3MM2 κύτταρα ***

δείκτης

Πηγή

Expr. επίπεδο

% των κυττάρων

Expr. επίπεδο

% των κυττάρων

CD133Miltenyi Bio +++ 75 ± 15 ++ /+++ 3 ± 1CD44Invitrogen ΜΕΜ-85 +++ 99,5 ± 0,5 ++ /+++ 7.5 ± 2.5CD44v6R & amp?. Δ κλώνος 2F10 +++ 56 ± 16CD49fBioLegends +++ 99,5 ± 0,5 +++ 94 ± 2CD166BD Biosci. +++ 99,3 ± 0,5 ++ /+++ 86 ± 8EpCAMMiltenyi Bio. +++ 98 ± 0,5 ++ /+++ 83 ± 5Pan-KeratCell Signal. ++ 4 ± 1CK5Santa Cruz + 7 ± 1 + 3 ± 1CK18Santa Cruz + 5,5 ± 2,5 + 3,5 ± 0.5CK5 /CK18Santa Cruz + 4,5 ± 0,5 + 2,5 ± 0.5p63Santa Cruz + 5 ± 2,5 + 7 ± 1ARSanta Cruz + 14 ± 2 ++ /+++ 5 ± 2CXCR4R & amp?. Δ ++ 10,5 ± 1 +++ 12 ± 2Table 1. Η φαινοτυπική προφίλ των κυττάρων ΡΡΤ2 και PC3MM2 με ανάλυση FACS *

* Η μέση ποσοστιαία των κυττάρων που εκφράζουν συγκεκριμένο δείκτη επιφάνειας κυττάρου υπολογίστηκε με βάση τις τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις FACS. ** κύτταρα ΡΡΤ2 (αδιαχώριστα πριν από την ανάλυση, αλλά διαπιστωθεί με τις προηγούμενες επαναλαμβανόμενες MACS-CD133

+ διαλογής κυττάρων) καλλιεργήθηκαν με τον τύπο Ι πιάτα επικαλυμμένες με κολλαγόνο σε μέσο MSCB για 2, 4 και 8 εβδομάδων. *** κύτταρα Αξεδιάλεχτα PC3MM2 καλλιεργήθηκαν επί κολλαγόνου τύπου Ι επικαλυμμένα πιάτα σε μέσο MSCB για 1-2 εβδομάδες. + ++ και +++ αντιπροσωπεύει χαμηλή, μέτρια και υψηλή έκφραση. CSV Λήψη CSV

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των SBT-1214 έναντι CSC-εμπλουτισμένα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

in vitro

Η

Η θεραπεία με SBT-1214 και, για σύγκριση, με τον παράγοντα που χρησιμοποιούνται συνήθως σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων paclitaxel (Ptx? Taxol) αύξησε τις αναλογίες των κυττάρων με υψηλότερη έκφραση του CD133 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (από 10 ηΜ έως 10 μΜ? για 24 ώρες) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ΡΡΤ2 και PC3MM2 (εκπρόσωπος FACS παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Α, Β) . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα δύο φάρμακα που επηρεάζονται κατά προτίμηση κυττάρων με χαμηλή έκφραση CD133, και αρχικά δεν επηρέασε ούτε καν διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων υψηλής CD133

. Ωστόσο, μια πλέον θεραπεία (για 48-72 ώρες) αποκάλυψε μια βαθιά διαφορά μεταξύ των κυτταροτοξικά αποτελέσματα του SBT-1214 και Ptx: ενώ Ptx κατεργασμένα κύτταρα διατηρούνται βιωσιμότητα και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων ήταν ακόμη αυξάνονται, μέχρι το 60% της SBT-1214-αγωγή CD133

+ κύτταρα θανατώθηκαν με τις ίδιες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (τα δεδομένα ΜΤΤ δοκιμασία φαίνεται στο Σχήμα 2C, D? Σχήμα 3Α). Παραδόξως, χαμηλότερες συγκεντρώσεις SBT-1214 (100 nm-1 μΜ) προκάλεσε υψηλότερη κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα ΡΡΤ2 σε σύγκριση με τη συγκέντρωση του φαρμάκου 10μΜ. Η πακλιταξέλη στα 10 μΜ ήταν κυτταροτοξική και επάγεται περίπου 40% κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 2C, D). Σε αυτό το χρονικό σημείο, μια αυξημένη αναλογία των πολύ μεγάλων ΤΜΧ (συχνά ≥200 μm) ήταν εμφανής σε αμφότερες τις κύτταρα ΡΡΤ2 και PC3MM2 (Σχήμα 3Α, Β). Για να ελεγχθεί αν ή όχι η θεραπεία με SBT-1214 επηρεάζει την κλωνογόνο δυναμικό του CD133

+ κύτταρα, ΡΡΤ2 και PC3MM2 επιπλέοντα σφαιροειδή υπέστησαν αγωγή με 1 μΜ του φαρμάκου για 24 ώρες, προκειμένου να επιφέρει μεταβολές, αλλά αποφύγετε βαθιά κυτταρικό θάνατο. Βρήκαμε ότι, σε αντίθεση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία σφαιροειδή, κύτταρα επεξεργασμένα SBT-1214 έχασαν την ικανότητά τους να επάγουν τόσο δευτερεύον σφαιροειδή 3D (Σχήμα 3C) ή κολλαγόνο-προσκολλημένα αποικίες (δεν φαίνεται). Αμφότερες ΡΡΤ2 και PC3MM2 κύτταρα-θεραπεία-επιζώντων που ασκείται βαθιά κυτταρικό θάνατο σε 2-5 ημέρες μετά την αγωγή με SBT-1214 (Σχήμα 3D).

ανάλυση Αντιπροσωπευτικά FACS δείχνει μία δοσο-εξαρτώμενη αύξηση των λόγων του CD133

υψηλή ΡΡΤ2 (Α) και PC3MM2 (Β) κύτταρα 24 ώρες μετά την αγωγή με SBT-1214 και Ptx. Μεγαλύτερη θεραπείας (για 72 ώρες) με SBT-1214 (10 ηΜ-10 μΜ) προκάλεσε μέχρι 65% κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα ΡΡΤ2 (C) και έως 60% στα κύτταρα PC3MM2 (D? Κατώτερη γραμμή). Σε αντίθεση, η αγωγή με τις ίδιες δόσεις ΡΤΧ δεν καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ογκογόνων καρκινικών κυττάρων του προστάτη (C, D? Ανώτερη γραμμή). Τα κύτταρα επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις φαρμάκου, και τα δεδομένα που ελήφθησαν με πρότυπη δοκιμασία ΜΜΤ βασίζεται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με τέσσερα επαναλήψεις σε κάθε ομάδα θεραπείας. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD.

Η

(Α, Β) μικροφωτογραφίες αντίθεσης φάσεων δείχνουν ότι μια μοναδική θεραπεία με 1 μΜ SBT-1214 για 48 ώρες επαγόμενη θάνατο των κυττάρων ΡΡΤ2 και PC3MM2 με εμπλουτισμό του μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα (βέλη). (Γ) απώλεια μετά τη θεραπεία της ικανότητας σχηματισμού σφαίρας των επιζώντων-κυττάρων σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα αυτά. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD για 3 ανεξάρτητες επαναλήψεις. (D) Ριζική θάνατο των επεξεργασμένων ΡΡΤ2 και PC3MM2 κύτταρα κατά τη διάρκεια των επόμενων ημερών στον πολιτισμό.

Η

In vivo

αποτελεσματικότητα της SBT-1214 εναντίον ξενομοσχευμάτων καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από CD133

+ κυτταρικών πληθυσμών

Μετά τη μεταμόσχευση του CD133

+ ΡΡΤ2 και PC3MM2 κυττάρων, τα ποντίκια NOD /SCID χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες για κάθε κυτταρικό τύπο: ένα ως μάρτυρας χωρίς θεραπεία (η = 4), μια δεύτερη ομάδα για SBT-1214 αγωγή με 40, 40, 40 mg /kg εβδομαδιαίως αγωγή (n = 4), και μια τρίτη ομάδα για θεραπεία με 40, 20, 20, 20 mg /kg εβδομαδιαίως αγωγή (n = 6). Η θεραπεία ξεκίνησε 2-3 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση των κυττάρων του όγκου, όταν ξενομοσχεύματα όγκου έφθασε ˃100 mm

3? ανάπτυξη του όγκου παρακολουθείται εβδομαδιαία. Παρά το γεγονός ότι και οι τέσσερις όγκους σε επεξεργασία με 40, 40, 40 mg /kg εβδομαδιαίως αγωγή είχε συρρικνωθεί δραματικά από την τρίτη αγωγή, όλοι οι ποντικοί εξέφρασαν την κοινή ενδείξεις συστηματικής τοξικότητας και υποβλήθηκαν σε ευθανασία (τα δεδομένα δεν δείχνονται). Η θεραπεία με 40, 20, 20, 20 mg /kg εβδομαδιαίως επάγεται αγωγή περισσότερο σημαντική υποχώρηση του όγκου (Σχήμα 4Α-Δ), με πολύ χαμηλότερη συστηματική τοξικότητα. Μία εβδομάδα μετά την τελευταία θεραπεία, κάθε υπολειμματική όγκοι συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν ιστοπαθολογικά και για

ex vivo

κλωνογόνο ικανότητα. Ανεπεξέργαστα όγκους ελέγχου αφαιρέθηκαν φτάνοντας ~ 2 εκατοστά σε διάμετρο μεγαλύτερη, σύμφωνα με τις απαιτήσεις IRB.

NOD /SCID ποντίκια είχαν εκτοπικά εμφυτεύθηκαν με 3.000 του CD133

+ ΡΡΤ2 και PC3MM2 κύτταρα στα πλευρά. Τρεις εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με εβδομαδιαίες ί.ν. ενέσεις SBT-1214 (x4: 40, 20, 20, 20 mg /kg). Αυτή η μέθοδος θεραπείας που προκαλείται δραματική μείωση στο μέγεθος του όγκου στην πλειονότητα των PPT2- και PC3MM2 επαγόμενη όγκους (Α-Δ). Αντιπροσωπευτικά περιπτώσεις εμφανίζονται στο Β και D. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD?

σ

≤0.0009 για ΡΡΤ2 επαγόμενη όγκους (SBT-κατεργασμένων έναντι μη επεξεργασμένων ελέγχων? N = 6), και

σ

≤0.0018 για PC3MM2 επαγόμενη όγκους (n = 6). Ιστοπαθολογική ανάλυση των υπολειμματικών όγκων έδειξε την παρουσία βιώσιμων κυττάρων και η συσσώρευση μεγάλων πολυπύρηνων κυττάρων σε 2 από 6 ΡΡΤ2 όγκων και 3 από 6 PC3MM2 όγκων (εκπρόσωπος Η &? Ε χρώση των μη επεξεργασμένων και SBT-1214-αγωγή ιστών όγκου ΡΡΤ2 εμφανίζεται E, F).

Ex

vivo

θάνατο των κυττάρων αγωγή με το φάρμακο στον πολιτισμό (G). Ελέγχου χωρίς θεραπεία καρκινικά κύτταρα διατηρούνται βαθιά κλωνογονικού και σχηματισμού σφαίρας ικανότητες κατά τη διάρκεια σειριακό πέρασμα (H).

Η

Η ιστοπαθολογική ανάλυση.

Η αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές ιστού του ελέγχου ανεπεξέργαστων τον ασθενή προέρχεται CD133

+ κυττάρων που προκαλείται από NOD /SCID ποντίκια ξενομοσχευμάτων όγκου έδειξε εξαιρετικά άτυπα επιθηλιακά κύτταρα που σχηματίζουν φωλιές και τις δομές που μοιάζουν με αδένες, σύμφωνα με ελάχιστα διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (Σχήμα 4Ε). Πολυάριθμες στοιχεία άτυπα μιτωτική και κεντρική νέκρωση ήταν συνήθως παρόντες. Οι δύο μεγαλύτερες ΡΡΤ2 επαγόμενη SBT-1214 αγωγή υπολειμματική όγκοι ήταν επίσης διαγνωστικός κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, αλλά διέθετε ένα μεγαλύτερο βαθμό πυρηνική ατυπία, και μόνο λίγοι μιτωτικά σχήματα. Επιπλέον, το SB-1214 αγωγή όγκων έδειξε εστιακές υαλοειδοποίηση αλλά καμία ένδειξη νέκρωσης. Μικρότερο υπόλοιπο όγκους (n = 4) έδειξε ένα υψηλότερο επίπεδο υάλωση και την έλλειψη βιώσιμων κυττάρων.

μεταβολές μετά τη θεραπεία σε κλωνογενείς και σχηματισμού σφαίρας ικανότητες.

Σύνολο αιωρήματα κυττάρων από το ελέγχου και SBT-1214-αγωγή υπολειμματικού όγκοι σπάρθηκαν με τον τύπο Ι πιάτα επικαλυμμένες με κολλαγόνο και πλάκες ULA για τη δοκιμή για την παρουσία του ΚΕΠ και την ικανότητά τους να επάγουν δευτερογενή σφαιροειδή ή αποικίες προσκολλημένων κυττάρων. Τέσσερα από έξι ΡΡΤ2 που προκαλείται και τρεις από τους έξι αντιμετωπίζονται υπολειμματική όγκους PC3MM2 που προκαλείται SBT-1214 αποτελούνταν από μαύρισμα ή σκούρο κόκκινο μάζες που δεν δείχνουν την παρουσία των βιώσιμων κυττάρων, και δεν παράγουν είτε προσκολλημένα ή κυμαινόμενο αποικίες στον πολιτισμό. Δύο από τις ΡΡΤ2 επαγόμενης υπολειμματική όγκους μετά την αγωγή και τρεις από τις PC3MM2 επαγόμενης όγκους περιείχαν βιώσιμα αργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Οι δύο ΡΡΤ2 υπολειμματικό όγκους έδειξαν επίσης συστάδες γιγαντιαία πολυπύρηνα-θεραπεία-επιζώντων (βέλη στο Σχήμα 4F) παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται συχνά μετά από θεραπεία των CSC-πληθυσμοί εμπλουτισμένοι με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

in vitro

(Σχήμα 3Β) . Ωστόσο, αυτά τα κύτταρα δεν προκάλεσε καμία συμπαγή σφαιροειδή σε συνθήκες μη-προσκολλημένα πολιτισμό, παράγουν μόνο χαλαρά πολυκύτταρων αδρανών υλικών, η οποία υπέστη βαθιά κυτταρικό θάνατο σε αρκετές ημέρες

ex vivo

καλλιέργεια (Σχήμα 4G). Σε αντίθεση, διαχωρισμένα κύτταρα από μη επεξεργασμένα ξενομοσχεύματα όγκου σειριακά

in vivo

και

in vitro

(Εικόνα 4Η δείχνει τύπου Ι κολλαγόνου προσκολλημένα holoclone και πλωτά σφαιροειδή που προκαλείται κατά την διάρκεια σειριακού περάσματος του μη επεξεργασμένου ΡΡΤ2 ποντίκια καρκινικά κύτταρα ξενομόσχευμα).

Συνδυασμός SBT-1214 με CMC2.24 αυξάνει CSC στοχευμένες κυτταροτοξική και βλαστικών κυττάρων δραστηριότητες διαμόρφωσης

Για να μελετήσουν τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των SBT-1214 και Ptx με μία νέα συνθετική κουρκουμινοειδή, CMC2.24, η αποτελεσματικότητα διαφόρων συγκεντρώσεων του φαρμάκου και ο συνδυασμός τους με CMC2.24 αξιολογήθηκε στα κλάσματα ογκογενή των κυτταρικών γραμμών ΡΡΤ2 και PC3MM2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ και ανάλυση FACS. Βρήκαμε ότι η CMC2.24 (καθώς και η κουρκουμίνη? Δεν φαίνεται) ασκείται συχνά διφασικά αποτελέσματα επί του προστάτη CD133

+ κύτταρα. Έτσι, η θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις CMC (έως 10 μΜ) για 72 ώρες πολλαπλασιασμού κυττάρων που διεγείρεται, ενώ υψηλότερες δόσεις (10-40μM) ήταν όλο και περισσότερο κυτταροτοξικά (Εικόνα 5Α, Β). ανάλυση FACS αποκάλυψε ότι σε αντίθεση με SBT-1214 και Ptx, CMC2.24 δεν προκάλεσε αύξηση των αναλογιών των κυττάρων με υψηλότερη έκφραση του CD133 (Σχήμα 5C? μαύρη διάστικτη περιοχή), αλλά οδήγησε σε σημαντική μετατόπιση ολόκληρου του κυττάρου του πληθυσμού προς διαφοροποίηση (C? περιοχή με κόκκινο αστερίσκο) και κάποια αύξηση στα κύτταρα με την υψηλότερη έκφραση της παν-κερατίνης (C? κόκκινη διάστικτη περιοχή). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις CMC2.24 αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων μη-βλαστικών παρά ΚΕΠ. Είναι σημαντικό, ο συνδυασμός των 30μΜ CMC2.24 (το οποίο δεν είναι τοξικό, ακόμη και σε πολύ μεγαλύτερες δόσεις [29]) με χαμηλές συγκεντρώσεις SBT-1214 ή Ptx (10 ηΜ-1 μΜ) που ασκείται πιο βαθιά θάνατο του CD133

+ κύτταρα από κάθε ένωση ως μοναδικός παράγοντας (Σχήμα 5D, E). Μετά την προσωρινή συσσώρευση μετεπεξεργασία των μεγάλων πολυπύρηνων, έχασαν την ικανότητα να επάγουν επιπλέει 3D σφαιροειδή και υπέστη ριζικές κυτταρικό θάνατο παρόμοιο με τα SBT-1214-επεξεργασμένα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 3.

(Α, Β ) Η CMC2.24 ως μοναδικός παράγοντας που προκαλείται από διφασικά επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη: χαμηλότερες συγκεντρώσεις προώθησε τον πολλαπλασιασμό, ενώ οι υψηλότερες αυτές ήταν κυτταροτοξικά. (C) Σε αντίθεση με SBT-1214, η θεραπεία με CMC2.24 δεν προκάλεσε αύξηση της αναλογίας του CD133

+ κύτταρα (μαύρο διακεκομμένη περιοχές), αλλά παρόμοια με SBT-1214, αυξημένη έκφραση του τηγανιού δείκτης διαφοροποίησης α-κερατίνης (κόκκινη διακεκομμένη περιοχές) και μετατόπισε το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων προς διαφοροποίηση (περιοχές με αστερίσκους). Ένας συνδυασμός των δύο παραγόντων που επάγεται περισσότερο σημαντική κυτταρικό θάνατο των κυττάρων PC3MM2 (Ε) CD133

+ ΡΡΤ2 (D) και σε σύγκριση με κάθε ένωση ως μονοθεραπεία. Τα δεδομένα ελήφθησαν με πρότυπη δοκιμασία ΜΜΤ (A, B, D, E). Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με 4 επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση φαρμάκου.

Η

SBT-1214 που προκαλείται από μεταβολές στην έκφραση γονιδίου βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με το προφίλ

μας προηγούμενες μελέτες, με τη χρήση γονιδιώματος κλίμακα και μονοπάτι-ειδική προφίλ γονιδιακής έκφρασης, έχουμε βρει ότι οι ογκογόνα πληθυσμοί κυττάρων που απομονώνονται από τις καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές προστάτη και του καρκίνου του παχέος εντέρου που εκφράζονται ρυθμίζεται προς τα πάνω επίπεδα των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, οι μεταφορείς ABC και την πλειοψηφία των βλαστικών γονίδια των κυττάρων που σχετίζονται με [25,30,31]. μελέτη πρωτεομική μας πραγματοποιείται σε συνεργασία με το Harvard Πρωτεομική Δυναμικού για την CSC εμπλουτισμένο σε σχέση με διαφοροποιημένα κύτταρα PC3MM2 αποκάλυψε 198 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών από 600 αναλύονται αυτά (αδημοσίευτα δεδομένα). Μεταξύ αυτών ήταν πολλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην λειτουργία των βλαστικών κυττάρων, κυτταρική κινητικότητα, εισβολή, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση, συμπεριλαμβανομένων βιμεντίνη, νεστίνη, S100, πρωτεΐνες θερμικού σοκ HS90A και HS90B, μοεσίνη, γαλεκτίνη και πολλά άλλα. Για τον προσδιορισμό πιθανών φάρμακο που προκαλείται από μεταβολές στην βλαστική ικανότητα έκφρασης των γονιδίων, αναλύσαμε CD133

+ ΡΡΤ2 κύτταρα πριν και μετά τη θεραπεία με το /CMC 2.24 συνδυασμό SBT-1214. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία συστοιχία PCR (PAHS 501? SA

Biosciences

) με κριτήρια φιλτραρίσματος αλλαγής 1,5- ή greater- φορές στην έκφραση, έχουμε βρει ότι περίπου το 50% των αναλυθέντων παραγόντων μεταγραφής 84 βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με ( ΤΡ) ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε CD133

+ σε σχέση με διαφοροποιημένα κύτταρα ΛΔΚ (Σχήμα 6Α). Μεταξύ αυτών ήταν CDX2, DLX2, DNMT3B, EGR, FoxP3, GLI2, οικογένεια HOX TFs, IRX4, ΙΟΥΝ, KLF2, NFATC1, NR2F2, PCNA, PITX3, POU4F1, SIX2, SOX2, SOX9, τ, WT1 και άλλα. Ενιαία αγωγή με SB-1214 (1 μΜ) και CMC2.24 (10 μΜ) για 24 ώρες προκάλεσε σημαντικές προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των υπερ-εκφρασμένων γονιδίων (Σχήμα 6Β). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι SBT-1214 και CMC2.24 σαν απλούς παράγοντες που προκαλείται από μέτρια ρύθμιση προς τα κάτω του c-myc και Sox2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα τόσο του CD133

+ και χύμα κύτταρα ΡΡΤ2, ενώ συνδυασμένη χορήγηση του φαρμάκου οδήγησε σε σχεδόν πλήρη αναστολή της έκφρασης τους (Σχήμα 6C). Είναι σημαντικό ότι, η πυρηνική κλάσματα τόσο CD133

+ και χύδην κύτταρα ΡΡΤ2 δεν εκφράζουν τους δύο όγκων καταστολείς /ρυθμιστές της απόπτωσης, ρ53 και ρ21 (Εικόνα 7Α), τα οποία εν μέρει μπορεί να εξηγήσει ακραία αντοχή τους σε αντικαρκινικά φάρμακα. Τόσο SBT-1214 και CMC2.24, και ιδιαίτερα ο συνδυασμός τους επαγόμενη έκφραση του p21 και p53. Τέτοια «γονίδιο αφύπνισης» που επάγεται από προεπεξεργασία με το συνδυασμό φαρμάκου (SB-1214? 1 μΜ και CMC2.24? 10μΜ) για 24 ώρες δραματικά αυξηθεί περαιτέρω η ευαισθησία αυτών των πολύ ανθεκτικών στα φάρμακα κυττάρων στο δεύτερο θεραπεία, οδηγώντας σε ουσιαστικά πλήρη θάνατο των CSC-εμπλουτισμένα κύτταρα (Σχήμα 7Β, C).

(Α) Πολλαπλές κύτταρο-σχετικούς παράγοντες μεταγραφής στέλεχος είναι πάνω ρυθμισμένα στον πληθυσμό CD133 + κυττάρων σε σύγκριση με διαφοροποιημένες αντίστοιχά τους. (Β) προς τα κάτω ρύθμιση των up-ρύθμιση μεταγραφικών παραγόντων μετά τη θεραπεία με 1 μΜ SBT-1214 και 10 μΜ CMC2.24 για 24 ώρες (δοκιμασία σειρά PCR? SABiosciences? ΠΑΥ 501). ανάλυση Western blot επιβεβαίωσε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των βασικών μεταγραφικών παραγόντων πλειοδυναμίας, c-Myc και Sox-2 στο CD133

+ κύτταρα (C). Χίστον H1 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

(Α) Προηγουμένως απουσιάζει κατασταλτικών πρωτεϊνών προ-αποπτωτικών /όγκου, p21 και p53 προκλήθηκαν με ενιαία θεραπεία με SBT-1214 /CMC2.24 συνδυασμός για 24 hr τόσο CD133 χύμα κύτταρα ΡΡΤ2

+ και. Τέτοια «γονίδιο αφύπνισης» οδήγησε σε σημαντική αύξηση της ευαισθησίας του CD133

+ κύτταρα σε αυτό το συνδυασμό των φαρμάκων (Β, C). Προκατεργασία [SBT-1214 (1 μΜ) + CMC2.24 (10 μΜ)]?