Αφηρημένο

Πολλά χημειοθεραπευτικά ασκούν ανοσοτροποποιητική δράση. Ένα από αυτά είναι το νουκλεοζιτικό ανάλογο gemcitabine, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο του μαστού, το μεσοθηλίωμα και διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, αλλά με περιορισμένη αποτελεσματικότητα. Υποθέσαμε ότι τα ανοσο αποτελέσματα αυτού του φαρμάκου είναι εν μέρει περιορίζεται από την ανασταλτική μόριο κυττάρων Τ CTLA-4 και έτσι θα μπορούσε να αυξηθεί μέσω του συνδυασμού του με ένα ανασταλτικό αντίσωμα έναντι CTLA-4, η οποία από μόνη της έχει δείξει πρόσφατα ευεργετικά κλινικά αποτελέσματα στην θεραπεία ασθενών με μεταστατικό μελάνωμα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε, με τη χρήση δύο μη ανοσογόνο μοντέλα ποντικού όγκου, ότι η αγωγή με gemcitabine χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με CTLA-4 δέσμευση έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή μιας ισχυρός αντι-όγκου ανοσοαπόκριση. Πειράματα έδειξαν ότι εξάντληση τόσο CD4

+ και CD8 είναι

+ Τ κυττάρων που απαιτείται για βέλτιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τον συνδυασμό παρουσίασαν υποχώρηση του όγκου και της μακροχρόνιας προστατευτικής ανοσίας. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η αποτελεσματικότητα του συνδυασμού μετριάζεται από τη χρονική στιγμή της χορήγησης των δύο παραγόντων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ανοσοποιητικό αποκλεισμός οδοφράγματος και κυτταροτοξική χημειοθεραπεία μπορεί να έχει μια συνεργική επίδραση στη θεραπεία του καρκίνου. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια βάση για να συνεχίσει συνδυασμό θεραπειών με αντι-CTLA-4 και ανοσο-χημειοθεραπεία και έχει σημαντικές συνέπειες για τις μελλοντικές μελέτες σε ασθενείς με καρκίνο. Δεδομένου ότι αμφότερα τα φάρμακα που έχουν εγκριθεί για χρήση σε ασθενείς δεδομένων μας μπορεί να μεταφραστεί άμεσα σε κλινικές δοκιμές

Παράθεση:. Lesterhuis WJ, Salmons J, Nowak AK, Rozali EN, Khong Α, Dick IM, et al. (2013) Synergistic Επίδραση του CTLA-4 και Cancer Chemotherapy στην επαγωγή του Anti-Tumor Immunity. PLoS ONE 8 (4): e61895. doi: 10.1371 /journal.pone.0061895

Επιμέλεια: Ramon Andrade de Mello, Πανεπιστήμιο του Πόρτο, Πορτογαλία

Ελήφθη: 20 Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: δέκατης τέταρτης Μάρτη 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Lesterhuis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας και της ασφάλισης της Επιτροπής, της Δυτικής Αυστραλίας. WJL υποστηρίζεται από μια μεταγραφική έρευνα υποτροφία της ολλανδικής Cancer Society. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και στο παρελθόν, ορθόδοξη κλινική πρακτική έκρινε ότι η χημειοθεραπεία και η ανοσοθεραπεία δεν θα μπορούσε να συνδυαστεί λόγω της μυελοκατασταλτικής φύση των περισσότερων κυτταροτοξικών φαρμάκων, η έννοια αυτή έχει αμφισβητηθεί τα τελευταία χρόνια από ένα μεγάλο σώμα των πειραματικών δεδομένων (αναθεωρούνται στο [1], [2]). Για παράδειγμα, η θεραπεία με ανθρακυκλίνες και τα αποτελέσματα οξαλιπλατίνη σε θάνατο ανοσογονικός όγκος κυττάρου και χημειοθεραπευτικά με βάση την πλατίνα μειορυθμίζουν την ανασταλτική STAT6 /PD-L2 μονοπάτι και ευαισθητοποιούν κύτταρα όγκου για τη μεσολάβηση κυττάρων Τ κυτταροτοξικότητα [3] – [5]. Η ομάδα μας έχει δείξει ότι η ανάλογο νουκλεοζίτη gemcitabine μπορεί να ενισχύσει αντιγόνο όγκου διασταυρούμενη παρουσίαση από δενδριτικά κύτταρα και άλλοι έχουν δείξει ότι αυτή η επεξεργασία οδηγεί σε προς τα πάνω ρύθμιση του όγκου MHC τάξης Ι έκφραση και η εξάντληση των δύο ρυθμιστικών Τ κύτταρα και μυελοειδή προερχόμενα κατασταλτικών κυττάρων [6 ] – [10]. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν μια ισχυρή λογική να εκμεταλλευτεί το αποτέλεσμα ανοσο γκεμσιταμπίνης συνδυάζοντας την με άλλες ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις.

Η ανοσοκατασταλτική δίκτυα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαφυγή της ανοσίας κατά του όγκου, και ως εκ τούτου θα μπορούσε να περιορίσει την επίδραση ανοσο της χημειοθεραπείας. Ένα από τα δυνητικά σχετικών οδών περιορισμού διαμεσολαβείται από το ανοσοποιητικό ανασταλτικό μόριο κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκυττάρων αντιγόνο 4 (CTLA-4). Η έκφραση του CTLA-4 ρυθμίζεται αυξητικά μετά την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και η οδός έχει δειχθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον καρκίνο ανοσοτροποποιητική. Θεραπευτικές αποκλεισμό των CTLA-4 έχει δειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για το μελάνωμα [11]. Η-CTLA-4 αντι ipilimumab μονοκλωνικό αντίσωμα είναι τώρα καταγραφεί από το FDA ως θεραπεία πρώτης που έχει δείξει ένα συνολικό όφελος επιβίωσης σε μια τυχαιοποιημένη μελέτη φάσης ΙΙΙ στον μεταστατικό μελάνωμα σε συνδυασμό με δακαρβαζίνη χημειοθεραπεία [12], [13]. Ωστόσο, αν και μερικοί ασθενείς πέτυχαν πλήρη ανταπόκριση και άλλοι πήγαν για τη μακροπρόθεσμη επιβίωση χωρίς εξέλιξη, η πλειοψηφία των ασθενών παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου.

Σας έθεσε ως στόχο να καθορίσει εάν η CTLA-4 σημείο ελέγχου περιορίζει τη δυνατότητα θεραπευτικής δραστικότητα της γεμσιταβίνης συνδυάζοντας το με ένα αντίσωμα μπλοκαρίσματος CTLA-4. Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά ότι δέσμευση CTLA-4 και ανοσο-χημειοθεραπείας σε θεραπευτική δόση έχουν μια συνεργική επίδραση, με αποτέλεσμα την επαγωγή μιας ισχυρός αντι-όγκου ανοσοαπόκριση και μακροχρόνιας προστατευτικής ανοσίας. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η συνολική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού σε ποντίκια εξαρτάται από την χρονική στιγμή της χορήγησης των μεμονωμένων συστατικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια

BALB /C (η-2

δ) και C57BL /6 (η-2

β) ποντίκια ελήφθησαν από το Κέντρο ζώων Πόρων (Canning Vale, Αυστραλία) και διατηρήθηκαν υπό κανονικές συνθήκες (διευκόλυνση M-Block ζώων, Ιατρικό Κέντρο Queen Elizabeth II, Το Πανεπιστήμιο της Δυτικής Αυστραλίας). Όλα τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες ήταν μεταξύ 8-12 εβδομάδων.

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο των εγκρίσεων Αυστραλία Επιτροπής Δεοντολογίας Δυτική Ζώων (πρωτόκολλο RA /3 /100/1016) και ο κώδικας δεοντολογίας της Εθνικής Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας. Η Αυστραλία Επιτροπής Δεοντολογίας Δυτική ζώων εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη.

τηλέφωνα Γραμμές

Το MHC τάξης Ι-θετικό, κατηγορίας ΙΙ-αρνητικό, ιδιαίτερα ογκογόνο και ανεπαρκώς ανοσογονική BALB /C που προέρχονται από αμίαντο που προκαλείται ποντίκι μεσοθηλίωμα κυτταρική γραμμή ΑΒ1, επιμολυσμένα με το γονίδιο της γρίπης ΗΑ (ΑΒ1-ΗΑ) έχει περιγραφεί πριν από [6], [7]. Για τα πειράματα επαναχορήγησης χρησιμοποιήθηκαν μη-HA-επιμολυσμένα κύτταρα ΑΒ1. Η ελάχιστα ανοσογόνος και άκρως ογκογονική Lewis καρκίνου του πνεύμονα (LLC) κυτταρική γραμμή ελήφθη από CellBank Αυστραλία (Westmead NSW, Australia), όπου ελέγχθηκε η ταυτότητα της κυτταρικής γραμμής. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Αυστραλία) συμπληρωμένο με 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη (CSL, Melbourne, Australia), 50 μg /mL γενταμυκίνη (David Bull Labs, Kewdale , Australia), και 10% FCS (Invitrogen). κύτταρα ΑΒ1-ΗΑ διατηρήθηκαν σε μέσα που περιέχουν το ανάλογο νεομυκίνης γενετικίνη (Invitrogen) σε τελική συγκέντρωση 400 μg /mL. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελέγχεται τακτικά και παρέμεινε αρνητικό για Mycoplasma spp.

πρόκληση όγκου και του πρωτοκόλλου Πειραματική

καρκινικά κύτταρα ABI-ΗΑ (1 × 10

6) ή LLC (2.5 × 10

5) σε 100 μl PBS εμβολιάστηκαν sc στο δεξί πλευρό του παραλήπτη ποντικών χαμηλότερη. Κλασική χημειοθεραπεία άρχισε 9 ημέρες αργότερα για ΑΒ 1-HA και 6 ημέρες αργότερα για LLC όταν ένα ψηλαφητό όγκο των περίπου 10 mm

2 ήταν εμφανής. Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με gemcitabine 120 μg /g βάρους σώματος κάθε τρίτη μέρα για πέντε δόσεις (Q3Dx5), μια αγωγή που είχε καθοριστεί προηγουμένως ως μέγιστη ανεκτή δόση για BALB /C ποντίκια (Σχήματα S1, S2 και S3) [6], [7]. Εναλλακτικά, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία μόνο δόση σισπλατίνης 6 μg /g την ημέρα 9 για ΑΒ 1-ΗΑ ή ημέρα 6 για LLC, το οποίο βρέθηκε να είναι η μέγιστη ανεκτή δόση σε αυτό το μοντέλο βασίζεται σε πειράματα τιτλοδότησης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν μόνο 100 μΐ PBS. Αντι-CTLA-4 χορηγήθηκε ε.π. κάθε τρίτη ημέρα για τέσσερις δόσεις (q3dx4). Αρχικά χρησιμοποιήσαμε 100 μg ανά δόση, αλλά μεταγενέστερες μελέτες τιτλοποίηση της δόσης έδειξε ότι με 75 μg ανά δόση ελήφθησαν ίσες αποτελέσματα και για το λόγο αυτό πήραμε αυτή τη δόση για τα επόμενα πειράματα (Σχήμα S4). Σε πειράματα συνδυασμού χρησιμοποιώντας ΑΒ1-HA με σισπλατίνη, χρησιμοποιήσαμε μία μόνο δόση των 200 μg αντι-CTLA-4 επί ημέρες 9, βασίζεται σε μια πρόσφατη έκθεση αποδεικνύει την σκοπιμότητα και την ισχύ του εν λόγω χρονοδιάγραμμα [14], και με βάση τη δική μας δεδομένα δείχνουν ισοδυναμία με το χρονοδιάγραμμα q3dx4 75 μg (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση μικρο-δαγκάνες τουλάχιστον τρεις φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια της θεραπείας και στη συνέχεια μέχρι το μέγεθος του όγκου φθάσει τα 100 mm

2, στο οποίο τα ποντίκια σημείο υποβλήθηκαν σε ευθανασία ακόλουθες κατευθυντήριες γραμμές περιφερειακών ζώων ηθική. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας βάρη ποντίκια παρακολουθείται και να σφάζονται αν (& gt? 15%) σημαντική απώλεια βάρους. Παρατηρήθηκε ή τοξικότητα

Για ορισμένα πειράματα ποντίκια που είχαν δείξει πλήρη υποχώρηση των όγκων υποβλήθηκαν σε νέα πρόκληση με μη-HA επιμολυσμένα κύτταρα μεσοθηλιώματος ΑΒ1 στο κάτω αριστερό πλευρό (Εικόνα S5). Αν τουλάχιστον δύο μήνες μετά την επαναχορήγηση του φαρμάκου δεν παρατηρήθηκαν όγκοι ήταν προφανής, τα ποντίκια θεωρούνται ότι είναι το ανοσοποιητικό. Tumor-αποστράγγιση λεμφαδένες στη συνέχεια συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν για δείκτες Τ κυττάρων μνήμης (βλέπε παρακάτω). Μη φέρουν όγκο αφελή ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Αντισώματα και Χημειοθεραπεία

Γεμσιταβίνη (Gemzar, Eli Lilly) δόθηκε από το τμήμα φαρμακείου του Sir Charles Γκάιρντνερ Νοσοκομείο. Η (κλώνος 9Η10) μονοκλωνικό αντίσωμα-CTLA-4 αντι παρασκευάστηκε και καθαρίστηκε στην Εγκατάσταση μονοκλωνικό αντίσωμα, WAIMR (Perth, Australia). Το CTLA-4 υβριδώματος ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή JP Allison (Memorial Sloan Kettering Cancer Centre, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ)

Για τα πειράματα εξάντληση, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:. Αντι-ΝΚ1.1 (κλώνος ΡΚ136), αντι-CD4 (κλώνος GK1.5) και αντι-CD8 (κλώνος YTS169.4), όλα από το Μηχανισμό μονοκλωνικό αντίσωμα, WAIMR (Περθ, Αυστραλία). Αντι-CD4 και CD8 χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως 150 μg, μία ημέρα πριν από gemcitabine /αντι-ΟΤΙ_Α4, ακολουθούμενο από 100 μg ε.π. κάθε 3 ημέρες, τελευταία δόση την ημέρα 27. Αντι-NK1.1 χορηγήθηκε 200 μg ip την ημέρα 6, 9 και 12. Μείωση επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής του περιφερικού αίματος από την ουρά αιμορραγίες (Σχήμα S6).

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για κυτταρομετρία ροής: CD3 FITC, CD4-PECy7, CD4 Pac μπλε, CD8 PerCpCy5.5, CD3 ΡΕ και ICOS APC, CD44-ΡΕ, CD49b FITC, CD62L-FITC, (όλα Biolegend), Κί67 AF488 , Ki 67 PE και CD4 APCH7 (όλα BD Bioscience), CD3 PeCy7 FoxP3-PerCPCy5.5 και CD8 PECy7, CD8 ef780 (eBioscience).

τηλέφωνα Χρώση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

περιφερικού αίματος δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε μέσω ουράς αιμορραγεί κατά την ημέρα 29. Ένας όγκος & lt? 100 μΙ αίματος συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα με ηπαρίνη. Αντίσωμα κοκτέιλ των επιφανειακών κηλίδων (CD3, CD4, CD8 και ICOS) παρασκευάστηκαν και 20 μΙ προστίθενται σε 30 μΙ αίματος για 1 ώρα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε λύση (BD FACS διάλυμα λύσης) και διαπερατά (eBioscience Καθήλωση /Perm Buffer), το αντίσωμα για ενδοκυττάρια χρώση (Ki-67) παρασκευάστηκε και 20 μΙ προστίθενται για 45 λεπτά. Τα δείγματα επανααιωρήθηκαν σε 200 μλ σταθεροποίηση στερεωτικό (BD) και 50000 λεμφοκυττάρων περίφραξη εκδηλώσεις αποκτήθηκαν στη ροή FACS Canto II κυτταρομετρητή (BD Biosciences) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo.

Για ορισμένα πειράματα, με τη συμμετοχή ποντίκια που είχε θεραπευτεί με τη θεραπεία και στη συνέχεια αντιστάθηκαν επαναπρόκληση κυττάρων όγκου στο ετερόπλευρο πλευρό, από όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης (TDLN) συλλέχθηκαν (βλέπε παραπάνω) για την ανάλυση των υποσυνόλων κυττάρων μνήμης Τ. Λεμφαδένων από αμφότερες τις πλευρές συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν και χρωματίστηκαν για CD4, CD8, CD44 και CD62L, σύμφωνα με το ίδιο πρωτόκολλο όπως η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής περιφερικού αίματος (βλέπε παραπάνω και το Σχήμα S5).

Για την ανάλυση της Τ κυτταρικές αποκρίσεις στον όγκο, TDLN (σύστοιχο μασχαλιαία και βουβωνική κόμβους) και τη σπλήνα, τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 15 και τα όργανα συλλέχθηκαν. Ημέρα 15 επιλέχθηκε ως χρονικό σημείο αφού από περίπου την 12η ημέρα οι καμπύλες αύξησης μεταξύ των ομάδων άρχισαν να διαιρέσει, επιτρέποντας επαρκή αξιολόγηση των απαντήσεων των Τ κυττάρων. Οι σπλήνες και LNs είχαν πουρέ μεταξύ γυάλινες διαφάνειες, επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα κυτταρικής λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων (eBioscience) και διηθείται μέσω ενός φίλτρου 40 μm (BD), και χρωματίστηκαν με τις σχετικές αντισώματα. Οι όγκοι κιμάς λεπτά και μεταφέρθηκαν σε διάλυμα πέψης που αποτελείται από ΚΡΜΙ /2% FCS με 10 mg /ml κολλαγενάση και 1 mg /ml ϋΝΑση Ι (Sigma-Aldrich) και επωάστηκε για 1 ώρα σε ένα κύλινδρο τράπεζας. Κατά τα τελευταία 10 λεπτά EDTA προστέθηκε σε ένα τελικό διάλυμα από 5 mM. Τα δείγματα πλύθηκαν με RPMI /2% FCS και διηθείται διαμέσου ενός φίλτρου 40 μm και βάφτηκαν με τις σχετικές αντισώματα.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc.) . Η ανάπτυξη του όγκου δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση του PASW στατιστικές έκδοση 18 ΜΙΚΤΗ διαδικασία (IBM SPSS, Chicago IL). Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων θεραπείας σε κάθε χρονικό σημείο ρυθμίστηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις μέσω της μεθόδου Sidak. Δεδομένα για την επιβίωση του όγκου αναλύθηκαν σύμφωνα με την μέθοδο και την επιβίωση αναλογίες Kaplan Meier συγκρίθηκαν μεταξύ ομάδων με τη χρήση ενός αρχείου καταγραφής Test Rank. Δεδομένα από υποσύνολα κυττάρων Τ συγκρίθηκαν με δοκιμασία t του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν η τιμή Ρ ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Anti-CTLA-4 και Γεμσιταβίνη Συνδυάστε σε θεραπευτικά συνεργιστικό τρόπο

Με βάση την προηγούμενη αποδεικνύουν δεδομένων gemcitabine ως ένα ανοσογόνο κυτταροτοξικό φάρμακο [7], υποθέσαμε ότι η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της γεμσιταβίνης θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με το συνδυασμό του με ένα ανασταλτικό αντίσωμα έναντι CTLA-4. ΑΒ1-HA-εμβολιάσθηκαν BALB /C ποντικοί υπέστησαν αγωγή με αντι-CTLA-4 σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη (Σχήμα S1 και Σχήμα 1). Η αγωγή με gemcitabine μόνος είχε σαν αποτέλεσμα καλό έλεγχο της ανάπτυξη όγκου όταν χορηγήθηκε το φάρμακο, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ωστόσο όγκου προχώρησε σε διακοπή της θεραπείας στην πλειονότητα των ποντικών [15]. Η θεραπεία με αντι-CTLA-4 μειώνεται μόνο τα το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου, αλλά ήταν λιγότερο αποτελεσματική από γεμσιταβίνη ως μονοθεραπεία (Σχήμα 1Α). Ωστόσο, όταν αντι-CTLA-4 και gemcitabine συνδυάστηκαν, παρατηρήθηκε μια σαφής προσθετική επίδραση και των δύο θεραπειών με σημαντική καθυστέρηση έκφυση του όγκου. Ο αριθμός των ζώων που επιτεύχθηκε πλήρης υποχώρηση ήταν υπερπροσθετική (-60% στην ομάδα συνδυασμού έναντι -13% για τα αντι-CTLA-4 και ~ 8% για gemcitabine μόνο του στο μοντέλο ΑΒ1-ΗΑ, τα Σχ. 1Α και Β). Βρήκαμε επίσης αυξημένο έλεγχο όγκου στο μοντέλο LLC, αν και το αποτέλεσμα ήταν λιγότερο έντονη (σχήμα S7). Αυτό συμφωνεί με μελέτες σε ανθρώπους που χρησιμοποιούν το ανοσοποιητικό αντισώματα αποκλεισμού, επιδεικνύοντας σημαντικές διαφορές στην αποτελεσματικότητα μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου [16] οδοφράγματος. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν αντιμετωπίζονται τα ποντίκια με τη μη ανοσογόνο σισπλατίνη χημειοθεραπευτικό φάρμακο [17], δεν υπήρχε σαφής συνεργιστική δράση σε κάθε μοντέλο (Σχήμα 1 C και D και Σχήμα S7).

(Α) επιφάνεια του όγκου σε mm

2 (μέση τιμή ± SD) όγκων ΑΒ1-ΗΑ που εγχύθηκαν την ημέρα 0, τα ποντίκια (η = 87) υποβλήθηκαν σε αγωγή την ημέρα 9/12/15/18 με 75 μg αντι-CTLA-4 και με 120 μg /g γεμσιταβίνη την ημέρα 9/12/15/18/21, ή με PBS (συγκεντρωτικά δεδομένα από 5 ξεχωριστά πειράματα φαίνονται). (Β) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier του ίδιου πειράματος. (C) επιφάνεια του όγκου σε mm

2 (μέση τιμή ± SD) όγκων ΑΒ1-ΗΑ που εγχύθηκαν την ημέρα 0, τα ποντίκια (η = 65) υποβλήθηκαν σε αγωγή την ημέρα 9 με 200 μg αντι-CTLA-4 και 6 μg /g σισπλατίνη, ή με PBS (συγκεντρωτικά δεδομένα από 3 ξεχωριστά πειράματα δείχνονται). (D) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier του ίδιου πειράματος.

Η

Προηγούμενες μελέτες σε ασθενείς με καρκίνο και τα ζώα έχουν υποδείξει ότι ICOS

+ Τ κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στη δράση του αντι-CTLA -4, καθώς επίσης και έχοντας προγνωστική σημασία [18], [19]. Αναλύσαμε έκφραση ICOS και πολλαπλασιαστική κατάσταση των κυκλοφορούντων Τ κυττάρων στα ποντίκια και διαπίστωσαν ότι ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τη θεραπεία συνδυασμού παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε CD4

+ ICOS

+ Τ κύτταρα στο περιφερικό αίμα, καθώς και μια σαφής αύξηση CD4

+ πολλαπλασιαστικών Τ κυττάρων όπως προσδιορίζεται με Ki-67 χρώση (Σχήμα 2Α-D, ρ & lt? 0.001).

Μια σύγκριση παρουσιάζεται των δεικτών ενεργοποίησης Τ κυττάρου και του πολλαπλασιασμού του περιφερειακού αίματος κατά την ημέρα 29 μετά τον εμβολιασμό για τις διαφορετικές ομάδες θεραπείας (* p ≤ 0,05? ** ρ & lt? 0,01 *** ρ & lt? 0.001). ICOS

+ /CD4

+ Th κύτταρα (Α)? Ki-67

+ /CD4

+ Th κύτταρα (Β)? CD8

+ /ICOS

+ CTLs (C) και CD8

+ /Ki-67

+ CTLs (D). (Ε και F) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των πολλαπλασιαζόμενων CD8

+ Τ κύτταρα και Treg σε όγκο, όγκο αποστράγγιση λεμφαδένων και σπλήνα την ημέρα 15. Απεικονίζονται το ποσοστό των Ki-67

+ CD8

+ των CD3

+ κύτταρα και Foxp3

+ CD4

+ των CD3

+ κύτταρα (F). Έξι ποντικοί ανά ομάδα ελέγχθηκαν για τον έλεγχο και την αντι-CTLA-4, 12 ποντίκια ανά ομάδα για καθεστώτα gemcitabine που περιέχουν ομαδοποιημένα ανά 2 ποντίκια, λόγω του μικρού μεγέθους του όγκου σε αυτές τις ομάδες. Μέσα με τα SEMs εμφανίζονται (n = 36). (G) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier των όγκων ΑΒ1-ΗΑ που εγχύθηκαν την ημέρα 0, τα ποντίκια (η = 57) υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-CTLA-4 και /ή γεμσιταβίνη, ή με PBS σε συνδυασμό με καταστρέφουν αντισώματα έναντι CD4 ή CD8 (συγκεντρωτικά δεδομένα από 2 ξεχωριστά πειράματα φαίνεται).

η

Για να αποκτήσουν περισσότερες γνώσεις στη σύνθεση των καρκινικών κυττάρων που διηθούν τη διάρκεια της θεραπείας, θα υπολογίζεται η συχνότητα των Foxp3 + CD4 + Tregs, CD49b

+ CD3

– ΝΚ κυττάρων και ICOS

+ CD4

+ ενεργοποιημένα Th κύτταρα και Ki-67

+ CD8

+ πολλαπλασιάζονται τα CTL σε όγκο, από όγκο λεμφαδένες (TDLN) και σπλήνα την ημέρα 15 (Σχήμα 2Ε-F, Εικόνα S8). Το ποσοστό των CD8

+ CTLs δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Σχήμα S8), αλλά η ικανότητά τους πολλαπλασιασμού, όπως μετράται με το Ki-67 αυξήθηκαν πράγματι όταν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-CTLA4, τόσο στον όγκο και TDLN. Είναι ενδιαφέρον ότι η σχετική απώλεια του πολλαπλασιασμού που διηθούν όγκο CD8

+ Τ κυττάρων σε γεμσιταβίνη ποντίκια με αγωγή εν μέρει διασώθηκε από αντι-CTLA-4 (Σχήμα 2Ε). Tumor διήθηση CD4 + Τ κυττάρων δεν μετεβλήθη σημαντικά με είτε gemcitabine ή αντι-CTLA-4, αν και η έκφραση ICOS ως δείκτης της ενεργοποίησης ήταν μειωμένη σε όλα τα ποντίκια που έλαβαν γεμσιταβίνη, είτε με είτε χωρίς αντι-ΟΤΙ_Α4 (Σχήμα S8). Το ποσοστό των ογκο-διηθητικά Foxp3

+ CD4

+ Τ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με γεμσιταβίνη, αντι-CTLA-4 ή η θεραπεία συνδυασμού (Σχήμα 2F), εύρημα συμβατό με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα [10 ]. Δεν σαφείς διαφορές παρατηρήθηκαν σε αριθμούς κυττάρων ΝΚ μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Σχήμα S8).

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η αυξημένη ανταπόκριση στη θεραπεία συνδυασμού που εμπλέκονται κατά κύριο λόγο CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα εκτελέσαμε καταστρέφουν πειράματα χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι CD4, CD8 (μοντέλο ΑΒ1-ΗΑ) και ΝΚ1.1 (LLC μοντέλο, δεδομένου ότι BALB /C ποντικοί δεν εκφράζουν ΝΚ1.1). Βρήκαμε ότι το θεραπευτικό αποτέλεσμα της γεμσιταβίνης συν αντι-ΟΤΙ_Α4 πλήρως καταργείται όταν είτε CD4

+ ή CD8

+ κύτταρα αφαιρέθηκαν (Σχήμα 2G), ενώ η εξάντληση των κυττάρων ΝΚ δεν επηρέασε την αποτελεσματικότητα της θεραπείας ( Εικόνα S9). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το αντι-CTLA-4 και χημειοθεραπεία synergize στην επαγωγή ενός ισχυρού κατά του όγκου ανοσοαπόκριση, με σημαντικό ρόλο τόσο για CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρων για βέλτιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα .

Anti-CTLA-4 και Τζεμσιταμπίνη θεραπεία συνδυασμού Προκαλεί μακράς διάρκειας Προστατευτικά Anti-όγκου μνήμης Ανοσολογικό

Ένα από τα σημαντικά θεωρητικά πλεονεκτήματα της ανοσοθεραπείας πάνω από χημειοθεραπεία είναι ότι η πρώτη έχει τη δυνατότητα να επάγουν ανοσολογική μνήμη και συνεπώς τη δυνατότητα να επιτύχουν διαρκή απαντήσεις. Δοκιμάσαμε αν η συνδυασμένη αγωγή με αντι-CTLA-4 και gemcitabine σαν αποτέλεσμα κατά του όγκου ανοσολογικής μνήμης. Εμείς επανεμβολιάζεται ποντίκια που απέρριψαν εντελώς όγκους τους μετά από θεραπεία συνδυασμού και βρέθηκε ότι το 93% (13 από 14 ποντικούς) αυτών των ποντικών ήταν πλήρως ανθεκτικά στην επαναπρόκληση όγκου (Σχήμα 3Α). Είναι σημαντικό ότι, για τα πειράματα επαναπρόκληση χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ΑΒ1 που δεν επιμολύνθηκαν με ΗΑ, υποδεικνύοντας ότι η επαγόμενη ανοσία έναντι αντιγόνων ήταν κοινόχρηστα όγκου επί των κυττάρων ΑΒ1 μεσοθηλιώματος και όχι μόνο εναντίον του αντιγόνου επιμολυσμένα ΗΑ. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των υποσυνόλων κυττάρων Τ στους λεμφαδένες παροχέτευσης των ποντικών αυτών έδειξαν αυξημένα επίπεδα τόσο της κεντρικής μνήμης και τελεστή μνήμης CD4

+ Τ κύτταρα, και σε μικρότερο βαθμό CD8

+ κύτταρα μνήμης (Σχήμα 3Β-Ε , p & lt? 0.001). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα αποτελέσματα θεραπείας συνδυασμού σε μια αύξηση της μνήμης Τ κυττάρων και την επαγωγή της προστατευτικής ανοσίας.

(Α) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier των ποντικών που είχαν θεραπευτεί με είτε αντι-CTLA- 4 μόνη της ή συνδυασμένη θεραπεία και ότι στη συνέχεια σε νέα πρόκληση με κύτταρα ΑΒ1 μεσοθηλίωμα, που δείχνει προστατευτική ανοσία σε 80% και 92% αντίστοιχα. Τ ανάλυση κυττάρων υποσύνολο σε όγκο λεμφαδένες σε αυτά τα ποντίκια (* ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01 *** ρ & lt? 0.001): CD44

+ /CD62L

+ /CD4

+ T κύτταρα κεντρική μνήμη (Β)? CD44

+ /CD62L

– /CD4

+ Τ κύτταρα μνήμης τελεστές (C)? CD44

+ /CD62L

+ /CD8

+ Τ κύτταρα κεντρική μνήμη (D)? CD44

+ /CD62L

– /CD8

+ Τ κύτταρα μνήμης τελεστές (Ε)

Η

Η αποτελεσματικότητα των αντι-CTLA-4 /Γεμσιταβίνη Εξαρτάται από Timing

προκειμένου να προσδιοριστεί η βέλτιστη πρόγραμμα θεραπείας όσον αφορά το χρονοδιάγραμμα των δύο αντι-CTLA-4 και gemcitabine, υποβάλλαμε σε αγωγή ΑΒ1-HA ποντικών που φέρουν όγκο με τρία διαφορετικά καθεστώτα: gemcitabine που ακολουθείται από αντι-CTLA-4, η ταυτόχρονη θεραπεία συνδυασμού και αντι-CTLA-4 που ακολουθείται από gemcitabine (Σχήμα S3? Σχήμα 4). Ένα ζώο στην αντι-CTLA-4 που ακολουθείται από ομάδα γεμσιταβίνης θανατώθηκαν εξαιτίας της απώλειας βάρους μεγαλύτερη από 15%, διαφορετικά δεν υπήρχε εμφανής τοξικότητα. Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στο έκφυση του όγκου μεταξύ των ομάδων αυτών (Σχήμα 4). Δεν υπήρχε σημαντική αξία πρόσθετο της θεραπείας συνδυασμού επί είτε αντι-CTLA-4 ή γεμκιταβίνη μόνο του όταν το χημειοθεραπευτικό φάρμακο χορηγήθηκε ξεχωριστά από αντι-CTLA-4. Η συνεργική δράση κατά του όγκου παρατηρήθηκε μόνο όταν δόθηκαν ταυτόχρονα τα δύο φάρμακα. Απροσδόκητα, όταν μόνο η πρώτη δόση της γεμσιταβίνης παραλείφθηκε (όπως στην «αντι-CTLA-4 πρώτα ‘βραχίονα έναντι της ταυτόχρονης βραχίονα), το αποτέλεσμα κατά του όγκου μειώθηκε δραματικά (Σχήμα 4). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η κατάλληλη προγραμματισμός των ξεχωριστών ενώσεων είναι κρίσιμος για τη βέλτιστη αποτελεσματικότητα.

(Α) περιοχή του όγκου σε mm

2 (μέση τιμή ± SD) όγκων ΑΒ1-ΗΑ που εγχύθηκαν την ημέρα 0, ποντικών (η = 86) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικά σχήματα των αντι-CTLA4 και γεμσιταβίνη (βλέπε σχήμα S2), ή με PBS (συγκεντρωτικά δεδομένα από 3 ξεχωριστά πειράματα δείχνονται). (Β) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier του ίδιου πειράματος.

Η

Συζήτηση

Ο συνδυασμός της χημειοθεραπείας και ανοσοθεραπείας στη θεραπεία του καρκίνου κατέχει απραγματοποίητα υπόσχεση [1]. Το πρόσφατα εγκεκριμένο από την FDA αντίσωμα αντι-CTLA-4 είναι ένα λογικό και μετασχηματίζεται εύκολα προσέγγιση ανοσοθεραπευτικά για να συνδυαστεί με χημειοθεραπεία. Υποθέσαμε ότι θα βρούμε μια συνεργιστική αλληλεπίδραση με ένα συνδυασμό αντι-CTLA-4 αποκλεισμός και ένα ανοσο-κυτταροτοξικό φάρμακο. Αναμέναμε ότι η χημειοθεραπεία θα προκαλέσει συρρίκνωση του όγκου και ανοσογόνα απελευθέρωσης αντιγόνου ενώ τα αντι-CTLA-4 θα ενισχύσει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και την επέκταση. Πριν δεδομένα για να υποστηρίξουν αυτή την υπόθεση ήταν περιορισμένες. Μια μεγάλη μελέτη φάσης ΙΙΙ στον μεταστατικό μελάνωμα σύγκριση αντι-CTLA-4 συν DTIC έναντι DTIC μόνη βρήκε ένα όφελος επιβίωσης για τη θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με μόνη DTIC χημειοθεραπεία [13]. Αλλά επειδή δεν υπήρχε σύγκριση με αντι-CTLA-4 μόνο, η σχετική συμβολή της χημειοθεραπείας στην παρατηρούμενη επίδραση δεν μπορούσε να εκτιμηθεί με ακρίβεια. Ομοίως, μια μελέτη φάσης ΙΙ σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, βρέθηκε βελτιωμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη για το συνδυασμό του ipilimumab και χημειοθεραπεία συγκριτικά με χημειοθεραπεία μόνο? και πάλι εδώ ipilimumab από μόνη της δεν ήταν ένα συγκριτικό [20]. Σε μια μελέτη φάσης ΙΙ, που συνέκρινε το ipilimumab και μόνο σε σχέση με το ipilimumab συν DTIC, αλλά χρησιμοποιώντας χαμηλότερες δόσεις του φαρμάκου της μελέτης, υπήρχε μια τάση προς καλύτερη τιμή Ελέγχου Νόσων για το σκέλος συνδυασμού, αλλά αυτό δεν έφθασε σημασία [21]. Με βάση αυτές τις μελέτες σε ανθρώπους που δημοσιεύθηκε, κανένα οριστικό συμπέρασμα μπορεί να εξαχθεί σχετικά με την ενδεχόμενη συνεργιστική δράση των αντι-CTLA-4 και χημειοθεραπεία. Αν και μια προηγούμενη μελέτη σε ζώα βρήκε ενισχυμένη αποτελεσματικότητα κατά του όγκου όταν αντι-ΟΤΙ_Α4 προστέθηκε σε μελφαλάνη χημειοθεραπεία, αυτό το πείραμα χρησιμοποιήθηκε ένα υποθεραπευτική δόση της μελφαλάνης, που προορίζεται να παραποιήσει αποκρίσεις Τ κυττάρου προς έναν φαινότυπο Th1 [22]. Πρόσφατα, Wu και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι το αντι-CTLA-4 θεραπεία σε συνδυασμό με σισπλατίνη είχε ως αποτέλεσμα τον καλύτερο έλεγχο της νόσου σε ένα μυϊκό μοντέλο μεσοθηλίωμα, όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία όγκοι πριν ήταν ψηλαφητοί, προφανώς λόγω ανέστειλε καρκινικών κυττάρων εμπλουτισμού πληθυσμών [23]. Εμείς Δεν βρέθηκαν δημοσιευμένα στοιχεία ζώο που σχετίζονται με την υπόθεσή μας, με τη χρήση θεραπευτικών δόσεων χημειοθεραπείας στον καρκίνο εμφανείς.

Όπως gemcitabine χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου μεσοθηλίωμα, ελέγξαμε το συνδυασμό σε καλά ιδρύθηκε μη ανοσογονικό μοντέλο ποντικού του μεσοθηλιώματος. Θεραπεία της ΑΒ1-ΗΑ με γεμσιταβίνη αποτέλεσμα μέτρια μείωση του όγκου ή καθυστερεί την ανάπτυξη όγκων σε αυτό το μοντέλο, μιμούμενη έτσι την κλινική κατάσταση στην χημειοθεραπευτική αγωγή των περισσότερων μεταστατικών καρκίνων.

Βρήκαμε εδώ ότι η θεραπεία συνδυασμού γεμκιταβίνης και αντι -CTLA-4 που ασκείται πολύ μεγαλύτερη επίδραση κατά του όγκου από ό, τι είτε από τους παράγοντες μόνο του, δρώντας έτσι κατά συνεργικό τρόπο (Σχήμα 1). Αυτό συσχετίζεται με μια έντονη αύξηση των CD4

+ ICOS

+ Τ κύτταρα στο περιφερικό αίμα, καθώς και μια σαφή αύξηση των πολλαπλασιαζόμενων CD4

+ Τ κυττάρων όπως προσδιορίζεται με χρώση Κί-67, αν και δεν ανιχνεύσει αυτή την αύξηση στον όγκο καθώς και (Σχήμα 2). CD4

+ διήθηση Τ κυττάρων στον όγκο ενισχύθηκε από τη θεραπεία συνδυασμού, και μια gemcitabine σχετιζόμενη μείωση στην πολλαπλασιαζόμενα διηθούν όγκο CD8

+ Τ κύτταρα εν μέρει διασώθηκε από δέσμευση CTLA-4. Είναι σημαντικό, δεν βρήκαμε καμία μείωση στην ανάπτυξη του όγκου όταν αντι-CTLA-4 συνδυάστηκε με σισπλατίνη. Η σισπλατίνη έχει αποδειχθεί ότι επάγουν μία μη ανοσογόνο μορφή κυτταρικού θανάτου [17], και παρόλο που δεν ρυθμίζουν προς τα κάτω την ανασταλτική μόριο PD-L2 [5], το μοντέλο όγκου που χρησιμοποιούμε εκφράζει μόνο πολύ χαμηλά επίπεδα του PD-L2 (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι η σισπλατίνη είναι μια μορφή μη-ανοσο-χημειοθεραπείας σε αυτό το μοντέλο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία συνδυασμού με αντι-CTLA-4 θα είναι πιο ισχυρή όταν συνδυάζεται με ανοσο χημειοθεραπεία.

Επειδή ένας από τους θεωρητικά πλεονεκτήματα του συνδυασμού χημειοθεραπείας με ανοσοθεραπεία είναι η επαγωγή μιας μακροχρόνιας ανοσολογικής μνήμης, ερευνήσαμε την μνήμη Τ κυτταρική απόκριση σε ποντίκια με όγκους που είχαν υποχωρήσει κατά την κατεργασία (Σχήμα 3). Βρήκαμε ότι αυτοί οι ποντικοί είχαν αυξημένα επίπεδα και των δύο CD4

+ και CD8

+ μνήμης τελεστών και κεντρική μνήμη Τ κύτταρα στον όγκο-λεμφαδένες παροχέτευσης, συσχετίζοντας με προστατευτική ανοσία σε νέα πρόκληση με κύτταρα όγκου. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με μελέτες σε μυϊκό OVA εκφράζουν

Listeria monocytogenes

μοντέλο, στο οποίο CD8

μνήμη + Τ κυττάρων ενισχύεται από μία μόνο δόση των αντι-CTLA-4 [14]. Σημαντικά, στο μοντέλο μας, ούτε το σχηματισμό των CD4

+ ούτε CD8

+ Τ κυττάρων μνήμης παρεμποδίστηκε από gemcitabine.

τρίτος στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η βέλτιστη ακολουθία της χημειοθεραπείας και αντι-CTLA -4 θεραπεία. Δεδομένου ότι είναι γνωστό από αρκετές μελέτες σε ζώα ότι ο συγχρονισμός είναι ζωτικής σημασίας για τη χρήση των αντι-CTLA-4 σε συνδυασμό με προσεγγίσεις εμβολιασμού [24], [25], υποθέσαμε ότι η βέλτιστη χρονική στιγμή /προγραμματισμός σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία θα ήταν επίσης κρίσιμη για την αντι-CTLA-4 αποτελεσματικότητα. Βρήκαμε ότι η αποτελεσματικότητα του συνδυασμού πράγματι εξαρτάται από τον προγραμματισμό: αν gemcitabine χορηγήθηκε πριν ή μετά την αντι-CTLA-4, δεν υπήρχε αξία πρόσθετο παραπάνω είτε μόνη θεραπεία, ενώ η ταυτόχρονη θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα τον έλεγχο των ασθενειών στην πλειονότητα των ποντικών ( Σχήμα 4).

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αντι-CTLA-4 θεραπεία και κυτταροτοξική χημειοθεραπεία μπορεί να έχει μια σαφή συνεργιστική επίδραση στη θεραπεία του καρκίνου. Τα δεδομένα μας παρέχει μια λογική για περαιτέρω ανάπτυξη οι συνδυασμοί κυτταροτοξικών φαρμάκων και αντι-CTLA-4 στην κλινική. Ωστόσο, με βάση τα στοιχεία μας δείχνουν ότι για διαφορετικές ομάδες κυτταροτοξικών αντικαρκινικές ενώσεις, βέλτιστο χρονοδιάγραμμα και την ανοσογονικότητα τους θα πρέπει πρώτα να καθοριστεί προσεκτικά σε προ-κλινικά μοντέλα και μικρές κλινικές μελέτες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. χρονοδιάγραμμα

Θεραπεία της γεμσιταβίνης και αντι-CTLA-4 στο μοντέλο ΑΒ1-ΗΑ. ποντικούς Balb /c εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 ΑΒ1-HA κύτταρα ποντικού μεσοθηλίωμα την ημέρα 0 και στη συνέχεια με ένεση ίρ με PBS, 120 μg /g γεμσιταβίνη βάρους σώματος κάθε τρίτη μέρα για πέντε δόσεις (Q3Dx5) τις ημέρες 9- 12-15-18-21 ή 75 μg αντι-CTLA-4 (q3dx4) είτε μόνο του ή σε συνδυασμό ημέρα 9-12-15-18, όπως αναφέρεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895. S001

(PDF)

Εικόνα S2. χρονοδιάγραμμα

Θεραπεία της γεμσιταβίνης και αντι-CTLA-4 στο μοντέλο LLC. C57BL 6 ποντίκια /εμβολιάστηκαν με 2.5 × 10

5 LLC καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα ποντικού την ημέρα 0 και στη συνέχεια με ένεση ίρ με PBS, 120 μg /g γεμσιταβίνη βάρους σώματος κάθε τρίτη μέρα για πέντε δόσεις (Q3Dx5) τις ημέρες 6-9 -12-15-18 ή 75 μg αντι-CTLA-4 (q3dx4) τις ημέρες 6-9-12-15, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, όπως υποδεικνύεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895.s002

(PDF)

Εικόνα S3. χρονοδιάγραμμα

Θεραπεία της θεραπείας συνδυασμού της γεμσιταβίνης και αντι-CTLA-4 στο μοντέλο ΑΒ1-ΗΑ συγκρίνοντας διαφορετικά σχήματα αγωγής. ποντικούς Balb /c εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 ΑΒ1-HA κύτταρα ποντικού μεσοθηλίωμα την ημέρα 0 και στη συνέχεια γίνεται ένεση ΙΡ με 120 μg /g γεμσιταβίνη σωματικού βάρους (Q3Dx5) και 75 μg αντι-CTLA-4 (q3dx4) διαιρούμενο πάνω από τρεις ομάδες, «συντρέχουσα» (αντι-CTLA-4 επί ημέρες 9-12-15-18? gemcitabine τις ημέρες 9-12-15-18-21), «αντι-CTLA-4 πρώτα» (αντι-CTLA- 4 επί ημέρες 9-12-15-18? gemcitabine τις ημέρες 12-15-18-21-24) και «γεμσιταβίνη πρώτος» (gemcitabine τις ημέρες 9-12-15-18-21? αντι-CTLA-4 επί ημέρες . 24-27-30-33)

doi: 10.1371 /journal.pone.0061895.s003

(PDF)

Εικόνα S4.

βελτιστοποίησης της δόσης μελέτη της αντι-CTLA4 στο μοντέλο ΑΒ 1-HA. επιφάνεια του όγκου σε mm

2 (μέση τιμή ± SD) όγκων ΑΒ1-ΗΑ που εγχύθηκαν την ημέρα 0, τα ποντίκια (η = 40) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 75 μg αντι-CTLA-4 ε.π. κατά τις ημέρες 9-12-15-18 στις ενδεικνυόμενες δόσεις και με γεμσιταβίνη 120 μg /g σωματικού βάρους κατά τις ημέρες 12-15-18-21-24

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895.s004

(PDF)

Εικόνα S5. στρατηγική

Gating για τον προσδιορισμό των υποσυνόλων κυττάρων Τ μνήμης σε όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης, χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Tumor-αποστράγγιση λεμφαδένες συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται στο τμήμα υλικών και μεθόδων.