Αφηρημένο

Σκοπός της μελέτης

Για να αξιολογηθεί η συχνότητα των MRE11 /RAD50 /NBS1 (MRN) σύμπλοκο απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης σε ενδομητρίου (ΕΚ) και να καθορίσει αν η απώλεια της MRE11 καθιστά τα καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα σε Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) Ανασταλτικό θεραπεία.

Μέθοδοι

έκφραση

MRN εξετάστηκε σε 521 δείγματα του ενδομητρίου καρκινώματα και σε 10 καρκινικών κυττάρων γραμμές. Μία υποτιθέμενη hotspot μετάλλαξη με τη μορφή ενός αλληλόμορφου εσωνίων πολυ (Τ) σε MRE11 αλληλουχήθηκε σε επιλεγμένες περιπτώσεις (n = 26). Ευαισθησία στην PARP-αναστολέα, BMN673 ελέγχθηκε σε δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας πριν και μετά σίγηση MRE11 χρησιμοποιώντας siRNA. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός επισκευή (HR) DNA εκτιμήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού RAD51-εστιών κατά την ακτινοβόληση και φάρμακο θεραπείας.

Αποτελέσματα

Απώλεια MRE11 πρωτεΐνης βρέθηκε στο 30,7% των όγκων ΕΚ και σχετίζεται σημαντικά με απώλεια RAD50, NBS1 και η έκφραση της πρωτεΐνης επισκευή ασυμφωνία. Ένα ενδομητρίου κυτταρική γραμμή παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη έκφραση MRE11 οφείλεται σε ομόζυγη πολυ (Τ) μετάλλαξη του MRE11, έτσι εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία σε BMN673. εξάντληση MRE11 ευαισθητοποιεί MRE11 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ΕΚ στη θεραπεία με BMN673. Η αυξημένη ευαισθησία σε PARP αναστολής συσχετίζεται με μειωμένο σχηματισμό εστιών RAD51 κατά την ιονίζουσα ακτινοβολία σε κύτταρα MRE11 εξαντλημένο.

Συμπέρασμα

Η απώλεια της πρωτεΐνης MRE11 προβλέπει ευαισθησία σε ευαισθησία PARP-αναστολέα in vitro, ορίζει ως πρόσθετο συνθετικό θνησιγόνου γονιδίου με PARP. Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης της απώλειας MRE11 σε ECs μπορεί ενδεχομένως να αξιοποιηθούν για θεραπεία PARP-αναστολέα. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης MRE11 χρήση ανοσοϊστοχημείας θα μπορούσε να διερευνηθεί ως προγνωστικό βιοδείκτη για τη θεραπεία PARP-αναστολέα

Παράθεση:. Koppensteiner R, Σαμαρτζής EP, Νόσκε Α, von Teichman Α, Δέδες Ι, Gwerder M, et al. (2014) Επίδραση της MRE11 Ζημιά από PARP-αναστολέα ευαισθησία στον καρκίνο του ενδομητρίου

In Vitro

. PLoS ONE 9 (6): e100041. doi: 10.1371 /journal.pone.0100041

Επιμέλεια: Sue Cotterill, Άγιος Γεώργιος Πανεπιστήμιο του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 10 του Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 21 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Koppensteiner et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Julius Müller και τη Ζυρίχη Cancer League. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ενδομητρίου (ΕΚ) είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες. Η πλειοψηφία των ΑΕΚ διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο και σχετίζονται με πολύ ευνοϊκές γενική πρόγνωση [1]. θεραπευτικές επιλογές, ωστόσο, για προχωρημένους, υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό ECs, είναι περιορισμένες και αποτελούνται κυρίως από κυτταροτοξική χημειοθεραπεία [1]. Πιθανοί στοχευμένες θεραπείες είναι σύμφωνα με κλινικές έρευνες, αλλά δεν έχουν ακόμη ενσωματωθεί στην κλινική χρήση ρουτίνας [2].

ΕΚ είναι μια ετερογενής νόσος με διακριτά ιστολογικά και μοριακά χαρακτηριστικά [2]. Μέχρι στιγμής, ΕΚ έχουν ταξινομηθεί σε τύπους Ι και II. Αυτό βασίζεται στις διαφορετικές ιστολογικές ιδιότητες (ενδομητριοειδές έναντι μη ενδομητριοειδές) και σχετικά με την κλινική πρόγνωση (ευνοϊκή έναντι φτωχών) [2], [3]. Επιπλέον, διακριτά μοριακές αλλαγές συμβαίνουν κατά προτίμηση σε είτε τύπου Ι ή τύπου II ΕΚ (που επισκοπείται στο [2]). Ενώ οι όγκοι του τύπου Ι που χαρακτηρίζεται από αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) και polymutations σε διαφορετικούς τύπους γονιδίων, σχεδόν όλοι οι όγκοι τύπου II φιλοξενούν μεταλλάξεις του γονιδίου καταστολής του όγκου

ΤΡ53

[4]. Πρόσφατα, νέα μοριακή υποομάδες έχουν περιγραφεί με έναν τρόπο παρόμοιο με τον καρκίνο του μαστού [5]. Με βάση το προφίλ μετάλλαξη και αντιγραφή-αριθμός αλλάζει ECs κατηγοριοποιούνται σε:. Το ultramutated, το hypermuted, τον αριθμό αντιγράφων χαμηλή και ο αριθμός αντιγράφων υψηλής υποομάδα [5]

Η υπερμεταλλαχθούν υποομάδα περιλαμβάνει ως επί το πλείστον ενδομητριοειδές ΕΚ, όλα τα υπόθαλψη αστάθεια μικροδορυφορικού (MSI). Αυτοί οι όγκοι είναι γνωστό ότι αναπτύσσουν μεταλλάξεις σε διάφορα άλλα γονίδια (υπερμεταλλαχθούν γονιδίωμα), αλλά και εκείνων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA μηχανήματα διπλό σπάσιμο κλώνου (DSB) [6]. Ένα από τα πιο κοινά επαναλαμβανόμενες μετάλλαξη βρίσκεται στο

γονίδιο MRE11

, του οποίου το προϊόν είναι ένα μέρος της MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) – συγκρότημα που εμπλέκεται στην ανίχνευση και επιδιόρθωση του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα (DSBs) [7], [8].

MRE11

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς που προκαλούν θανατηφόρο φαινότυπο σε ποντίκια [9] Τα σπάνια συναντώνται σε ανθρώπους και να οδηγήσει σε μια αταξία τηλαγγειεκτασία-όπως διαταραχή (ATLD) [10]. Σωματικές μεταλλάξεις σε

MRE11

, ωστόσο, συχνά ανιχνεύονται σε καρκίνους του παχέος με MSI και έχουν επίσης προταθεί για MSI-θετικών ECs [11]. Μεταλλάξεις της αλληλουχίας εσωνίου πολυ (Τ) του

MRE11

μεταξύ εξώνια 4 και 5 είναι συχνές εκδηλώσεις σε MSI θετικό παχέος und ECs [11], [12]. Στην ΕΚ, MSI είναι παρούσα σε περισσότερες από 20% των όγκων και προκαλείται κυρίως από επιγενετικές αποσιώπηση του γονιδίου MMR

MLH1

[13]. Αυτό οδηγεί σε αλλαγές στον αριθμό των επαναλήψεων νουκλεοτίδιο που βρίσκεται στην κωδικοποίηση και μη-κωδικοποίησης στοιχείων πολλών γονιδίων όπως

MRE11

[14].

Συνθετικό θνησιμότητα συμβαίνει όταν δύο χωριστά απαντώμενες μεταλλάξεις δεν έχουν επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων, αλλά προκαλούν κυτταρικό θάνατο σε συνδυασμό [15], [16]. Αναστολή ενός συνθετικού θανατηφόρου γονιδίου εταίρος σε καρκινικά κύτταρα που παρουσιάζουν ένα συνθετικό θανατηφόρο μετάλλαξη μπορεί να αποδειχθεί μία ελκυστική στρατηγική για την ανάπτυξη ειδικών αντικαρκινικών φαρμάκων με ελάχιστες παρενέργειες σε υγιή ιστό. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι καρκίνοι με απώλεια της λειτουργίας του

BRCA1

ή

BRCA2

δείχνουν εξαιρετική ευαισθησία σε Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) -inhibitors [17], [18]. Δεδομένου ότι MRE11 εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA DSB μέσω του MRN-συγκρότημα, απώλεια της λειτουργίας αυτού του συμπλόκου μέσω αδρανοποίησης μεταλλάξεων μπορεί να οδηγήσει σε ευαισθησία σε PARP αναστολείς [19]. PARP1, ένα ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA, έχει εμπλακεί στην επισκευή των DSBs. η αναστολή PARP οδηγεί σε απόπτωση ή γήρανση σε κύτταρα όπου είναι μειωμένη επιδιόρθωσης του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) (συνθετικό θνησιμότητα). Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήσαμε ένας ισχυρός, εκλεκτικός αναστολέας PARP1-BMN673, που έχει δείξει πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα στη φάση Ι /ΙΙ δοκιμές [20].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι MRN συχνά χάνεται στο ΕΚ, η οποία οδηγεί σε αυξημένη PARP ευαισθησία αναστολέα. Αυτό μπορεί να αξιοποιηθεί για τη θεραπεία ασθενών με απώλεια της απόκρυψης ΕΚ του MRN-συγκρότημα. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να δείξει τη συχνότητα της απώλειας της MRE11 και MRN-συγκρότημα στο ΕΚ και αν αυτό οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία σε PARP-αναστολείς αξιοποίηση

MRE11

ως πιθανή συνθετικό θανατηφόρου γονιδίου.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστικές μικροσυστοιχίες

μικροσυστοιχίες ιστών (TMAs) με φορμόλη-σταθερές και ενσωματωμένα σε παραφίνη ενδομητρίου καρκινώματα είχαν κατασκευαστεί στο παρελθόν [21]. Δύο ομάδες από τα Ινστιτούτα της Χειρουργικής Παθολογίας του Πανεπιστημίου Νοσοκομεία Βασιλεία και Ζυρίχη (Ελβετία) που περιέχουν 339 (Βασιλεία-ΤΜΑ) και 182 (Zurich-ΤΜΑ) δείγματα καρκίνου συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά λήφθηκαν από τις κλινικές βάσεις δεδομένων και τα αρχεία παθολογία. Ρουτίνας τμήματα αιματοξυλίνη και ηωσίνη διεξήχθησαν για ιστοπαθολογική αξιολόγηση. Το στάδιο των όγκων εκτιμήθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) και το σύστημα TNM στάσης. Η ιστολογική υποτύπου και του βαθμού του όγκου ορίστηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ το 2003. δεδομένα παρακολούθησης είναι γνωστά από 480 ασθενείς. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 31,5 μήνες (εύρος, 1-184) για την ομάδα της Βασιλείας, και 45 μήνες (εύρος, 1-124) για την ομάδα της Ζυρίχης. Οι ασθενείς με εντοπισμένη νόσο έλαβαν θεραπεία με υστερεκτομή και διμερείς σαλπιγγεκτομή (με ή χωρίς πυελική και paraaortic λεμφαδενεκτομή). Κολπική θεραπεία με ακτινοβολία μετεγχειρητικά χορηγείται όταν εισβολή του μυομητρίου ή βαθμού όγκου 3 ήταν εμφανής. Η μελέτη εγκρίθηκε και για τις δύο ομάδες από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας της επιστήμης (ΚΕΚ-ZH-NR: 2010 έως 0358). Τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΕΚ συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Ανοσοϊστοχημεία

Μετά την ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια επωάστηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: MRE11 (κλώνος 31H4, κυτταρική σηματοδότηση, δεν . 4847, 1:500), RAD50 (13B3 /2C6, Abcam περιορισμένη, όχι. ab89, 1:500), NBS1 (κυτταρική σηματοδότηση, αρ. 3002, 1:50), MLH1 (G168-15, PharMingen, Becton Dickinson , 1:100), MSH2 (25D12, Novocastra Lab. Ltd, 1:100), PMS2 (A16-4, PharMingen, Becton Dickinson, 1:300), και MSH6 (44, BD Biosciences, 1:500). Μετά από επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, η χρώση του MRE11, RAD50, και NBS1 διεξήχθη περαιτέρω με την Ventana Benchmark αυτοματοποιημένο σύστημα (Ventana Medical Systems, USA) χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Ventana καθώς και κιτ ανίχνευσης UltraMap DAB. Τα αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων επωάστηκαν για 30 λεπτά και η διαδικασία χρώσης εκτελέστηκε με το αυτοματοποιημένο σύστημα BOND Leica χρησιμοποιώντας Bond Polymer Σύνθετη Detection Kit (Leica Biosystems). Η ανάλυση της έκφρασης εκτελέστηκε από δύο παθολόγους (AN, ΚΙ). Η πυρηνική ανοσοδραστικότητα του MRE11, RAD50, και NBS1 βαθμολογήθηκε ως: αρνητικό (μηδέν), ασθενές (1), μέτρια (2) και ισχυρή (3). Η έκφραση της πρωτεΐνης των γονιδίων επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων θεωρήθηκε ως θετική όταν πυρηνική χρώση ήταν εμφανής. Στρωματικά κύτταρα δείχνοντας πυρηνική χρώση χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

Γραμμές Cancer Cell και Συνθήκες Ανάπτυξης

Το κύτταρο ΕΟΚ γραμμές Hec-108 [22] και Hec-116 [22] αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ, HEC 1Α (ATCC) σε McCoy, το EFE-184 (DSMZ) σε RPMI, AN3CA (ATCC) σε DMEM, ARK-II [23] σε DMEM, SNG-II [24] σε DMEM, ECC-1 [25] σε RPMI 1640, και ήταν ένα δώρο από τον Uwe Schirmer, DKFZ. HEC6-ST3 [22], που καλλιεργούνται σε ΜΕΜ, και KLE (ATCC), αναπτύχθηκαν σε DMEM /F-12, ήταν ένα δώρο από Jaqueline Galeas, UCSF. Τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% (μέσο για ECC-1 με 5%) (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου και είτε με πενικιλλίνη (100 U /ml) /στρεπτομυκίνη (60 mg /ml) ή αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό, και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα σε 5% CO2. Όλο το υλικό της κυτταρικής καλλιέργειας αγοράστηκε από την Gibco από LifeTechnologies.

ανοσοαποτύπωσης

εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν από κύτταρα λύονται με SDS ρυθμιστικού λύσης. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια MRE11 (D151, δώρο από τον Steve Jackson, Cambridge), RAD51 (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, Santa Cruz Biotechnology), NBS1 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, GeneTex), βήτα-τουμπουλίνης (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Sigma) . Η επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα ακολουθούμενο από επώαση με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (αντι-ποντικού και HRP αντι-κουνελιού από την Sigma, αντι-προβάτου HRP από SantaCruz) και χημειοφωταύγειας ανίχνευση πρωτεϊνών (Amersham).

MRE11 μετάλλαξη ανάλυση

Δεκατρείς MRE11 ανοσοϊστοχημεία (IHC) θετικά και 13 αρνητικά δείγματα IHC επιλέχθηκαν από την ομάδα της Ζυρίχης για

MRE11

ανάλυση μετάλλαξης. Τρεις κύλινδροι ιστού (διαμέτρου 0,6 χιλιοστών), αποκόπηκαν από κάθε μπλοκ παραφίνης για την εκχύλιση του DNA. Γονιδιωματικό ϋΝΑ εξήχθη χρησιμοποιώντας το DNeasy Blood & amp? Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Οι συγκεντρώσεις των λαμβανόμενων νουκλεϊνικών οξέων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Grannini et al., 2002) με μία ελαφρά τροποποίηση. Μόνο το 50 ng γενωμικού ϋΝΑ ενισχύθηκαν με PCR. αλληλουχίας DNA διεξήχθη με τη χρήση του BigDye Terminator Cycle Κιτ v1.1 Sequencing (Applied Biosystems). Τα ληφθέντα αλληλουχίες αναλύθηκαν για μεταλλάξεις στο πολυ (Τ) 11 περιοχή επανάληψης μέσα στο ανθρώπινο

MRE11

ιντρονίου 4 (Πίνακας 2).

Η

Αποικίας Δοκιμασίες Σχηματισμού

δοκιμασίες Μακροχρόνια επιβίωση διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων εις τριπλούν σε μία συγκέντρωση 300-2000 κύτταρα ανά φρεάτιο και κατεργάστηκαν με τον αναστολέα μετά από 24 ώρες, συνεχώς εκτίθεται στο φάρμακο (10-11 έως 10-6 Μ) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (έλεγχος: DMSO). Μέσα και φάρμακο αντικαταστάθηκαν κάθε 3 έως 5 ημέρες. Μετά από 10 έως 15 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με TCA 10% και χρωματίστηκαν με σουλφοροδαμίνη Β (SRB) (Sigma) και μία χρωματομετρική δοκιμασία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ο αναστολέας PARP BMN673 ήταν ένα δώρο από τον BioMarin Pharmaceuticals, USA. Mirin αγοράστηκε από την Calbiochem.

siRNA Και Οι επιμολύνσεις

Για να γκρεμίσουμε τα ανθρώπινα

MRE11

χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά siRNAs (Microsynth, Ελβετία) χρησιμοποιώντας RNAimax (Gibco από LifeTechnologies) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες στόχου (με νόημα) ήταν: GCUAAUGACUCUGAUGAUATT [27], GAGCAUAACUCCAUAAGUATT [28], και GAUGCCAUUGAGGAAUUAGTT [29]. Ως έλεγχος, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι λουσιφεράσης (με νόημα): CGUACGCGGAAUACUUCGATT. Τα κύτταρα σπάρθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και η θεραπεία άρχισε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (αναστολέας PARP, ακτινοβολία).

Ανάλυση του RAD51 Εστίες Σχηματισμός

Πυρηνική RAD51 εστίες έγιναν ορατές και ποσοτικοποιείται όπως περιγράφεται προηγουμένως [26 ] και χρησιμοποιήθηκε ως υποκατάστατοι δείκτες για την επαγωγή του DNA DSBs και των αρμόδιων επισκευή HR DNA, αντίστοιχα. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων (12 mM, Thermo Scientific) και εκτέθηκαν σε 10 Gy IR του. Μετά την ανάκτηση από 4-6 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά, και ανοσοχρώση με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια RAD51 (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, Santa Cruz) και ανιχνεύθηκαν με Alexa αλεύρι 488 (Invitrogen). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2- φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Η παρουσία του RAD51 εστιών αξιολογήθηκε σε ένα ελάχιστο 100 κυττάρων σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με ένα αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο ανεστραμμένου φθορισμού (LEICA-DMI6000 Β).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική αξιολόγηση διεξήχθη με το λογισμικό SPSS έκδοση 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Τα δεδομένα βαθμολόγησης του MRE11, RAD50, και NBS1 διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε «αρνητική» (χωρίς έκφραση) και «θετικά» (ασθενής, μέτρια ή έντονη έκφραση). Η στατιστική σημαντικότητα της σχέσης μεταξύ αυτών των μορίων, και την έκφραση της πρωτεΐνης επισκευή ασυμφωνία, καθώς και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων εκτιμήθηκε από Chi

2 τεστ για τις τάσεις και την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Επιπλέον, η συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη σύνδεση μεταξύ MRE11, RAD50, NBS1 και αναντιστοιχία πρωτεΐνες επισκευής. Η πιθανότητα της συνολικής επιβίωσης ως συνάρτηση του χρόνου προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Οι διαφορές στις καμπύλες επιβίωσης συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log rank. καμπύλες ευαισθησίας υπολογίστηκαν σε GraphPad Prism Version 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA) και στατιστικές διαφορές μεταξύ των τιμών IC50 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας F-tests. Σε γενικές γραμμές, οι τιμές ρ μικρότερες 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

MRN-σύνθετη έκφραση και η Ένωση με Ασυμφωνία Επισκευή Πρωτεΐνη Κατάσταση και κλινικοπαθολογοανατομικές Παράγοντες

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των MRE11 , RAD50, και NBS1 ήταν επιτυχής σε 456, 466, και 458 του ενδομητρίου καρκινώματα, αντίστοιχα, λόγω της έλλειψης του καρκινικού ιστού σε ορισμένα σημεία ΤΜΑ. Όλα τα μόρια έδειξε ένα πρότυπο πυρηνική χρώση. Μεταξύ των 521 ασθενών ενδομητρίου καρκινώματα 30,7% (132/430) έδειξε πλήρη απώλεια του MRE11 (Εικ. 1Α, και Πίνακας 1). απώλεια της έκφρασης της MRE11 συσχετίζεται σημαντικά με απώλεια πρωτεϊνών από τα άλλα MRN-συγκρότημα μέλη RAD50 και NBS1. Η απώλεια οποιασδήποτε MRN-σύμπλεγμα πρωτεΐνης επίσης σημαντική συσχέτιση με την έκφραση της πρωτεΐνης αναντιστοιχία επισκευή, καθώς και με το στάδιο της νόσου και ιστολογική βαθμολόγηση (Πίνακας 3). Στην ανάλυση Kaplan-Meier, το στάδιο της νόσου, ιστολογική υποτύπου, τη διαλογή και την ηλικία των ασθενών ήταν προγνωστικοί παράγοντες (log rank, p-value & lt? 0,0001 για όλες τις παραμέτρους). Ωστόσο, η πρωτεΐνη έκφραση MRE11 (log rank p = 0.867), Rad50 (log rank p = 0,986) και NBS1 (log rank p = 0,991) ήταν που δεν συνδέονται με τη συνολική επιβίωση. Επιπλέον, προσδιορισμός της αλληλουχίας του πολυ (Τ) 11 αλληλόμορφο του

MRE11

σε γονιδιωματικό DNA από όγκους ΕΚ (n = 26? Πίνακας 2) έδειξε ότι οι μεταλλάξεις ήταν πιο συχνές σε όγκους με απώλεια MRE11 σε σύγκριση με αυτούς που εκφράζουν MRE11 , αλλά η κατάσταση της μετάλλαξης δεν ήταν πολύ έξυπνη για το καθεστώς πρωτεΐνη MRE11

Α, αρνητικό (πλήρη απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης MRE11).? Β + (ασθενής πυρηνική έκφραση)? C ++ (ενδιάμεσο πυρηνική έκφραση)? D, +++ (ισχυρή πυρηνική έκφραση).

Η

Απώλεια MRE11 συνδέεται με υψηλή ευαισθησία σε PARP Αναστολή

Μεταξύ ενός πάνελ κυτταρικών σειρών ΕΚ, AN3CA εκτίθενται σχεδόν πλήρη απώλεια πρωτεΐνης MRE11 καθώς και σημαντικά μειωμένα επίπεδα RAD50 και NBS1 (Εικ. 2Α). Αλληλούχιση του ιντρονικού περιοχής MRE11 σε αυτή την κυτταρική σειρά επιβεβαίωσε την προηγουμένως περιγραφείσα ομόζυγο πολυ (Τ) 9 μετάλλαξη σε AN3CA (Εικ. 2Β) [11]. Κατά την επεξεργασία PARP-αναστολέα με BMN673, AN3CA δείχνει την υψηλότερη ευαισθησία ανάμεσα στον πίνακα των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του ενδομητρίου που δοκιμάστηκαν (Σχ. 3C).

Α, κηλίδα Western που αποδεικνύουν την κατάσταση έκφρασης του MRE11, NBS1 και RAD50 σε 10 ενδομητρίου κυτταρικές σειρές καρκινώματος. Μόνο η κυτταρική γραμμή AN3CA φιλοξενεί μια μετάλλαξη του MRE11, γεγονός που οδηγεί σε δραματικά μειωμένη έκφραση του MRE11. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β, δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας αποδεικνύοντας την ευαισθησία στον αναστολέα PARP (BMN673) σε 10 ενδομητρίου κυτταρικές γραμμές καρκινώματος: Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία εις τριπλούν για 14 ημέρες. Επιβίωση εκπροσωπείται στο ποσοστό του ελέγχου (αγωγή DMSO). Οι αποικίες κυττάρων ποσοτικά με χρωματομετρική μέθοδο (SRB).

Η

Α, απόδοση των siRNAs σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση φαίνεται από western αποτύπωση. Β, δοκιμασία ευαισθησίας (χρωματομετρική με SRB): Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολέα PARP (BMN673) εις τριπλούν για 14 ημέρες. Επιβίωση εκπροσωπείται στο ποσοστό του ελέγχου (αγωγή DMSO). Γκρεμίζω του MRE11 με τρία διαφορετικά σύνολα siRNAs να οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία προς την αναστολή της PARP στη ενδομητρίου κυτταρικές γραμμές καρκινώματος HEC1A (8-πλάσια αύξηση, ρ & lt? 0,0001) και HEC-116 (6-πλάσια αύξηση, ρ = 0.0006). C, Οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το mirin MRE11-αναστολέα σε μία τελική συγκέντρωση 30 μΜ εις τριπλούν για 10 ημέρες. Η επιβίωση αξιολογήθηκε με δοκιμασία χρωματομετρικού ευαισθησίας (SRB) και δείχνεται στο ποσοστό του ελέγχου (αγωγή DMSO). Η θεραπεία με το MRE11 αναστολέα mirin οδηγούν σε αυξημένη ευαισθησία σε αναστολή ΡΑΚΡ σε αμφότερα, HEC1A (2,6-φορές αύξηση, ρ = 0,001) και HEC-116 (17-πλάσια αύξηση, ρ & lt? 0,0001)

Η

Νοκ-κάτω και αναστολή MRE11 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα να BMN673 οφείλεται σε διαταραχή της ΥΕ

Δεδομένου ότι η απώλεια της έκφρασης MRE11 σε AN3CA συσχετίστηκε με σημαντική ευαισθησία στην αναστολή PARP, ρωτήσαμε αν η εξάντληση των MRE11 από siRNA θα οδηγούσε σε γενικές γραμμές σε αυξημένη ευαισθησία στο PARP-αναστολέα BMN673. Για να ελεγχθεί αυτό χρησιμοποιήσαμε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών που εκφράζουν ΕΚ κανονικά επίπεδα MRE11 (Εικ. 2Α) και ήταν επίσης ανθεκτική στην αναστολή PARP (Σχ. 2C). Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας siRNA αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, επιμόλυνση με MRE11 siRNA εξαντλημένο αποτελεσματικά ενδογενή MRE11 (Εικ. 3Α). Εμείς επόμενη αξιολογείται PARP ευαισθησία αναστολέα στο MRE11-εξαντλημένο κυττάρων με σχηματισμό αποικιών. Μετά την εξάντληση των MRE11, παρατηρήσαμε με συνέπεια μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία του BMN673 (Σχ. 3Β). Προκειμένου να δοκιμαστεί εάν MRE11 νουκλεάσης δραστηριότητα είναι απαραίτητη για την αντίσταση αναστολέα PARP, καλλιεργήσαμε δύο κυτταρικές σειρές με την παρουσία του αναστολέα mirin MRE11 και τους αντιμετωπίζονται με BMN673 (Σχ. 3C). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις mirin είχε αρνητικό αντίκτυπο στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση προς την αναστολή της PARP, υποδεικνύοντας έντονα ότι MRE11 νουκλεάσης δραστηριότητα είναι απαραίτητη για την αντίσταση αναστολέα PARP. Για να επιβεβαιώσετε ότι γκρεμίσουμε της MRE11 οδηγεί σε μειωμένη ΥΕ, προσδιορίσαμε την ικανότητα των κυττάρων να σχηματίσουν RAD51 εστίες σε απάντηση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) (βλέπε Σχ. 4Α). Πράγματι, κατά την αποσιώπηση του

MRE11,

λιγότερες RAD51 εστίες ανά κύτταρο θα μπορούσε να παρατηρηθεί (Εικ. 4Β). Η παγκρεατική κυτταρική γραμμή Capan-1 είναι γνωστό ότι είναι HR-ανεπάρκεια οφείλεται σε μετάλλαξη του

BRCA2

χρησίμευσε ως έλεγχος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α, εικόνες ανοσοφθορισμού δεικνύουσαι ϋΑΡΙ-χρωματισμένων πυρήνων (μπλε) και RAD51 εστίες (πράσινο) σε αντιπροσωπευτικά πεδία της HEC-1A και HEC-116 κύτταρα καρκινώματος του ενδομητρίου. Αμφότερες MRE11 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν άγριου τύπου είτε σε επεξεργασία με τρία διαφορετικά σύνολα siRNAs για MRE11 ή με siRNA για λουσιφεράση (siLuc) ως έλεγχο. Τα επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε 10 Gy ακτινοβολίας ή δεν εκτίθενται, όπως υποδεικνύεται. Β, RAD51 εστίες σχηματισμός εμφανίζεται ως ποσοστό του RAD51 εστιών θετικών κυττάρων (πάνω από 5 εστίες ανά κύτταρο αξιολογήθηκαν ως θετικοί) χωρίς θεραπεία και 6 ώρες μετά την 10 Gy ακτινοβολίας. Ένα ελάχιστο 100 κυττάρων μετρήθηκε για να προσδιοριστεί η συχνότητα σχηματισμού RAD51 εστιών σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Η

Συζήτηση

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να δείξει ότι δεν είναι μόνο η πρωτεΐνη έκφραση MRE11, αλλά και την έκφραση του άλλα μέλη του MRN-συγκρότημα, RAD50 και NBS1, χάνονται σε ένα σημαντικό ποσοστό των ΕΚ. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της απώλειας πρωτεΐνης όλων των μελών MRN καθώς και το καθεστώς αναντιστοιχία πρωτεΐνη επισκευής σε αυτό το μεγάλο σύνολο δεδομένων. Πρωτεΐνη έκφραση του MRN-συγκρότημα δεν έχει μελετηθεί ακόμη σε όγκους ΕΚ. Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, MRE11 έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν προγνωστική ιδιότητες για θεραπεία ακτινοθεραπείας [30]. Επιπλέον, η πλήρης απώλεια του MRN-συγκρότημα στην MSI θετική του παχέος εντέρου είναι μια συχνή περίπτωση [31], ενώ η απώλεια MRE11 σε όγκους του μαστού βρίσκεται μόνο στο 9% των περιπτώσεων [32].

Παρά το γεγονός ότι μια σαφής συσχέτιση μεταξύ κατάστασης μεταλλάξεων και την απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης δεν θα μπορούσε να βρεθεί σε αυτή τη μελέτη, είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι μια υψηλή συσχέτιση της απώλειας πρωτεϊνών όλων των μελών MRN καθώς και το καθεστώς MSI βρέθηκε σε αυτό το μεγάλο σύνολο δεδομένων. Συγχυτικοί αποτελέσματα για μεταλλακτική κατάσταση του MRE11 ροΙγΤ (11) αλληλόμορφο μπορεί να σχετίζεται με τις γνωστές δυσκολίες στην αλληλούχιση του MRE11 ροΙγΤ (11) αλληλόμορφο λόγω κακό ταίριασμα των βάσεων του ενζύμου πολυμεράσης [33].

Μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε υψηλή συχνότητα των μεταβολών των γονιδίων επιδιόρθωσης DSB σε MSI θετική ECs, όπου MRE11 και RAD50 εκτίθενται ομόζυγα και ετερόζυγα μεταλλάξεις σε 51% και 17%, αντίστοιχα, χωρίς να εξετάσει τον αντίκτυπο της απώλειας των πρωτεϊνών [6]. Μεταλλάξεις του MRE11 ροΙγΤ (11) αλληλόμορφο είναι κυρίως ετερόζυγες μεταλλάξεις και έχει προταθεί ότι μόνο εκείνοι με μεταλλάξεις του δύο και περισσοτέρων νουκλεοτιδίων, καθώς και ομόζυγη μεταλλάξεις ένα λειτουργικό αντίκτυπο όσον αφορά την απώλεια της λειτουργίας του [11], [12] , [34], [35]. Στην έκθεση αυτή, δεν μπορούμε να επιβεβαιώσει την υψηλή συχνότητα των εσωνίων μεταλλάξεων, αλλά παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία ότι MRE11 πρωτεΐνη χάνεται σε ένα σημαντικό ποσοστό των ΑΕΚ. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ολόκληρο αλληλούχιση εξόνιο του MRE11 αποκάλυψε μεταλλάξεις σε 1,9% (2 από 107) των όγκων ΕΚ εντός των εξονίων [36]. Ωστόσο, ιντρονικές μεταλλάξεις δεν έχουν αξιολογηθεί, εξηγώντας γιατί η συχνότητα του

MRE11

μεταλλάξεις φέρεται να είναι χαμηλή, όχι μόνο στη μελέτη της Price et al. [36], αλλά και σε μια πρόσφατη ένα από τα καρκινικά Genome Atlas Δίκτυο Έρευνας [5].

Οι αναστολείς PARP έχουν δείξει αξιοσημείωτη ευαισθησία στην /2-ανεπαρκή μοντέλα όγκων BRCA1

in vitro

καθώς και όπως σε κλινικές δοκιμές στις οποίες συμμετείχαν φορείς του

BRCA1 /2

μεταλλάξεις βλαστικής. Περαιτέρω εξέλιξη στοιχεία, ωστόσο, δείχνουν τις δυνατότητες για ένα ευρύτερο πεδίο για δραστηριότητα αναστολέα PARP [16]. Στην πραγματικότητα, για ΕΚ έχουμε προτείνει στο παρελθόν απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ ως δυνητικό βιοδείκτη για τη θεραπεία με αναστολείς PARP-με βάση προκλινικά δεδομένα [26], καθώς και σε μια έκθεση κλινική περίπτωση [37]. Οι άλλες μελέτες, ωστόσο, έχουν αμφισβητούν το ρόλο του

PTEN

στο HR, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό μπορεί να είναι μια κυτταρική γραμμή ειδική φαινόμενο [38], [39]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ακριβής μηχανισμός της συμμετοχής των

PTEN

στην επιδιόρθωση του DNA HR μένει να διευκρινιστεί.

Η απώλεια της έκφρασης MRE11 έχει προταθεί για την ευαισθητοποίηση του παχέος εντέρου [35], [38], [ ,,,0],40], του μαστού [41] και αιματολογικών [42] καρκινικές κυτταρικές σειρές σε PARP αναστολείς, λόγω εξασθενημένη επιδιόρθωση HR DNA. Η έκθεσή μας προτείνει, για πρώτη φορά, την πιθανή χρήση των αναστολέων PARP στη θεραπεία του καρκίνου του ενδομητρίου με βάση προκλινικά ευρήματα. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του ενδομητρίου και δεν εκφράζουν MRE11 θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με BMN673. Αυτό υποστηρίζει τη χρήση MRE11 ως προγνωστικό βιοδείκτη για τη θεραπεία PARP.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι i) πλήρης απώλεια του συγκροτήματος MRN είναι ένα συχνό γεγονός στην ΕΚ, ii) απώλεια της έκφρασης MRE11 καθώς και ως γονιδιακή σίγηση και φαρμακολογική αναστολή της δραστικότητας νουκλεάσης οδηγεί σε ευαισθησία σε PARP αναστολής

in vitro

, και iii) η απώλεια MRE11 συνδέεται με ανεπάρκεια επιδιόρθωσης HR DNA απέδειξαν κατά την ακτινοβολία. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι η έκφραση MRE11 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή προγνωστική βιοδείκτη για την αποτελεσματικότητα της θεραπείας αναστολέα PARP σε ενδομητρίου καρκίνων με MSI.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Martina Storz, André Fitsche και Sonja Brun-Schmid για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια, και Markus Rechsteiner για τις χρήσιμες συζητήσεις. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τον Steve Τζάκσον για την παροχή δημοσιεύονται αντιδραστήρια και BioMarin Pharmaceuticals για το δώρο της τους PARP-αναστολέα BMN673.