Αφηρημένο

Η βορτεζομίμπη αναστολέας πρωτεασώματος (Velcade) είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα παράγοντας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης θεραπείας, αλλά επαγώγιμων κυτταροπροστατευτικών μηχανισμών μπορεί να περιορίσει την πιθανή αποτελεσματικότητα του. Χρησιμοποιήσαμε έκφραση ολόκληρο mRNA γονιδίωμα προφίλ να μελετηθούν τα αποτελέσματα της βορτεζομίμπης στη γονιδιακή έκφραση που επάγεται από άγχος σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου κύστης. Bortezomib που προκαλείται ισχυρή ρύθμιση προς τα πάνω του επαγόμενου HSP70 ισομορφών HSPA1A και HSPA1B ισομορφές της hsp72 σε 253J BV και SW780 (HSPA1A

υψηλή) κύτταρα, αλλά μόνο προκάλεσε την ισομορφή HSPA1B στο UM-UC10 και UM-UC13 (HSPA1A

χαμηλή) κύτταρα. Bortezomib τόνωσε τη δέσμευση του θερμικού σοκ παράγοντα-1 (HSF1) με τον υποκινητή HSPA1A σε 253JB-V, αλλά όχι σε UM-UC13 κύτταρα. Μεθυλίωσης-ειδική PCR αποκάλυψε ότι ο υποκινητής HSPA1A μεθυλιώθηκε στο HSPA1A

χαμηλές κυτταρικές σειρές (UM-UC10 και UM-UC13) και έκθεση στον παράγοντα απομεθυλίωσης χρωματίνη 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης αποκατασταθεί έκφραση HSPA1A. Η υπερέκφραση της hsp72 προωθούνται βορτεζομίμπης αντίσταση στα κύτταρα UM-UC10 και UM-UC13, ενώ παροδικές νοκ ντάουν της HSPA1B περαιτέρω ευαισθητοποιημένων αυτά τα κύτταρα στη βορτεζομίμπη, και η έκθεση σε αναστολέα HSF1 χημική ΚΝΚ-437 προωθείται ευαισθησία βορτεζομίμπη στα 253J Β-V κύτταρα. Τέλος, shRNA μεσολάβηση σταθερά νοκ ντάουν της hsp72 σε 253J Β-V προωθείται ευαισθησία σε βορτεζομίμπη

in vitro

και όγκου ξενομοσχεύματα

in vivo

. Μαζί, τα αποτελέσματά μας παρέχουν απόδειξη της ιδέας για τη χρήση αναστολέων Hsp72 για την προώθηση της ευαισθησίας βορτεζομίμπη σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης και προτείνει ότι η επιλεκτική στόχευση των HSPA1B θα μπορούσε να παράγει συνθετικά θνησιμότητας σε όγκους που εμφανίζουν μεθυλίωση HSPA1A υποστηρικτής

Παράθεση:. Qi W , Λευκό MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) Αναστολή της επαγώγιμοι πρωτεϊνών θερμικού σοκ-70 (Hsp72) Ενισχύει Bortezomib κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10.1371 /journal.pone.0069509

Συντάκτης: Kevin Robert Kozak, Πανεπιστήμιο του Wisconsin Σχολή Ιατρικής και Δημόσιας Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Δεκέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 10 Ιουν 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιούλ, 2013

Copyright: © 2013 Qi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το SPORE MD Anderson στο Ουρογεννητικό Καρκίνο (Ρ50 CA091846), Cancer Center Grant υποστήριξης (CA016672), και Proteasome αναστολή και ER στρες (R01 CA127494). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή perparation του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η αύξηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης (μετάφραση) είναι ζωτικής σημασίας για νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Ως συνέπεια αυτής της αύξησης, τα καρκινικά κύτταρα φαίνεται να είναι ιδιαίτερα ευάλωτα σε παράγοντες αναστολής της εξάλειψης των συγκεντρωτικών ή misfolded πρωτεϊνών που παράγονται ως ένα κανονικό υποπροϊόν της πρωτεϊνοσύνθεσης. Το πρωτεάσωμα παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην κάθαρση των κατεστραμμένων πρωτεϊνών, και αναστολείς πρωτεασώματος προκαλεί κυτταρικό θάνατο καρκινικών σε μεγάλο μέρος μέσω συσσωμάτωση πρωτεΐνης και proteotoxicity. Ωστόσο, οι μηχανισμοί κυτταροπροστατευτική ρυθμίζεται αυξητικά από την αναστολή πρωτεασώματος, περιορίζοντας τον αντίκτυπο στο θάνατο των καρκινικών κυττάρων [1], [2], [3]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι όγκοι που έχουν ελάττωμα (ες) σε αυτά τα κυτταροπροστατευτικών μηχανισμών θα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε αναστολείς πρωτεασώματος. Εάν δεν μπορεί να προσδιοριστεί οι σχετικές κυτταροπροστατευτικών μηχανισμών, μπορεί να είναι δυνατό να προσδιοριστούν αυτές οι όγκοι μελλοντικά. Εναλλακτικά, μπορεί να είναι δυνατό να αναπτυχθούν θεραπευτικές προσεγγίσεις που διαταράσσουν αυτές κυτταροπροστατευτικών μηχανισμών προωθώντας έτσι πρωτεασώματος ευαισθησία αναστολέα σε όγκους που διαφορετικά θα ήταν ανθεκτικά σε αυτή την κατηγορία φαρμάκων.

σοκ θερμότητας προκαλεί επίσης συσσωμάτωση πρωτεΐνης και proteotoxicity με θερμικό σοκ πρωτεΐνες (HSPs) με την προαγωγή της ανεκτικότητας θερμότητα εμποδίζοντας ακατάλληλη στρες που προκαλείται από συσσωμάτωση πρωτεΐνης, βοηθώντας στην ορθή αναδίπλωση του μετουσιωμένες πρωτεΐνες, και, εάν είναι απαραίτητο, την προώθηση της αποδόμησης τους [4], [5], [6]. Μέλη της οικογένειας Hsp70 είναι μεταξύ των πιο υψηλώς διατηρημένων πρωτεϊνών σε εξέλιξη και παίζουν κρίσιμους ρόλους σε αυτές τις διαδικασίες [7]. Το μείζον στρες επαγόμενο μέλος της οικογένειας συνοδού Hsp70 αναφέρεται ως Hsp72 και κωδικοποιείται από δύο γονίδια, HSPA1A και HSPA1B, τα οποία παράγουν Hsp72 ισομορφές που μοιράζονται όλα εκτός από δύο αμινοξέα και πιστεύεται ότι είναι λειτουργικά περιττή [8]. έκφραση Hsp72 ελέγχεται μέσω ταχείας ενεργοποίησης του θερμικού σοκ παράγοντα-1 (HSF1), έναν παράγοντα μεταγραφής που συνδέεται προς διάφορα συγκεκριμένα στοιχεία απόκρισης που βρίσκονται εντός των ισομορφή υποκινητές Hsp72 και τους φορείς των άλλων κυτταροπροστατευτικών σαπερόνες θερμότητα που προκαλείται από [9]. Hsp72 είναι εξαιρετικά ομόλογο με την 78 kDa που ρυθμίζεται από γλυκόζη πρωτεΐνης (HSPA5, GRP78 /ΒίΡ), που παίζει κεντρικό ρόλο στον συντονισμό της ενεργοποίησης της ξεδιπλωμένης απόκρισης πρωτεΐνης (UPR) και επάγεται επίσης από τους αναστολείς πρωτεασώματος [10]. Hsp72 συστατικώς εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κακοήθεις όγκους διαφόρων προελεύσεων [11], [12], την προώθηση των καρκινικών κυττάρων επιβίωση [13], [14]. Σημαντικά, Hsp72 επίσης σθεναρά επάγεται από αναστολείς πρωτεασώματος [15], [16].

Σε προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε ότι περίπου το ήμισυ του ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα είναι ανθεκτικά στην κυτταροτοξική επίδραση του bortezomib

σε vitro

[17]. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε γονίδιο προφίλ έκφρασης για να εξετάσει κυτταροπροστατευτικών μηχανισμοί που συμβάλλουν στη βορτεζομίμπη αντίσταση, και διαπίστωσαν ότι Hsp72 είναι ένα από τα πιο δυναμικά επάγεται γονιδίων στο επίπεδο mRNA μετά από έκθεση βορτεζομίμπης. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η έκφραση Hsp72 είναι ισόμορφη-ειδική σε ένα υποσύνολο καρκινικών κυττάρων κύστης (UM-UC10 και UM-UC13), ως αποτέλεσμα της μεθυλίωσης υποκινητή της ισομορφής HSPA1A. Αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη έκφραση της ισομορφής HSPA1B τέτοια ώστε βασική και bortezomib επαγόμενη επίπεδα πρωτεΐνης Hsp72 είναι παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τόσο Α1Α και ισομορφές Α1Β (253JB-V και SW780). Έχουμε, επίσης, αναφέρουν ότι η καταστολή της επαγωγής Hsp72 ενισχυμένη κυτταρικού θανάτου βορτεζομίμπης που προκαλείται τόσο 235JB-V και UM-UC10, και η υπερέκφραση της hsp72 προστατεύεται UM-UC10 και UM-UC13 κύτταρα από βορτεζομίμπη-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Συνολικά, ανεξάρτητα από το ποια ισομορφή δημιουργεί η έκφραση της πρωτεΐνης Hsp72, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η καταστολή της επαγωγής Hsp72 ενισχύει Bortezomib ευαισθησία, και να υποστηρίξει την περαιτέρω ανάπτυξη των αναστολέων HSF1 και Hsp72 για την αύξηση βορτεζομίμπη ευαισθησία σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και Αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από την κυτταρική γραμμή MD Anderson Cancer SPORE ουροδόχου Repository και διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA). Η αυθεντικότητα όλων των κυτταρικών σειρών επιβεβαιώθηκε σε καταθέσεις από το DNA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων, καθώς και τις ταυτότητές τους επιβεβαιώθηκαν συνήθως κατά τη διάρκεια του πειραματισμού στο MD Anderson Χαρακτηρίζεται Κυτταρική Γραμμή πυρήνα [18]. Η κυτταρική γραμμή 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] και UMUC-13 [20] απομονώθηκαν από ασθενείς με καρκίνο ουροθηλιακό. SW780 αγοράστηκε αρχικά από την American Type Culture Collection (ATCC) σε Biocompare.com. Bortezomib αγοράστηκε από ChemieTek (IN, USA). Για

in vitro

πειράματα, bortezomib διαλύθηκε σε DMSO σε μία συγκέντρωση αποθέματος 10 mM, αποστειρώνεται με διήθηση μέσω ενός φίλτρου σύριγγας 0.22 μm, με κλάσματα αποθηκεύθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Πριν από τη χρήση, το απόθεμα αραιώθηκε σε μέσο στις επιθυμητές συγκεντρώσεις. Για ένεση των ποντικών, bortezomib διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα που περιέχει 10 mg /mL μαννιτόλη, λίγο πριν τη θεραπεία.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασίες

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε bortezomib, συλλέχθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία με θρυψινοποίηση, και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ PBS. Πενήντα μΙ PBS, ρΗ 7.4, που περιέχει 100 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκε στα επαναιωρημένα κύτταρα, και η πρόσληψη ΡΙ (ενδεικτική του κυτταρικού θανάτου) αναλύθηκε αμέσως με κυτταρομετρία ροής (FACS) επί Cytomics FC 500 με λογισμικό CXP (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA

Προς αποκλεισμό μπλε τρυπάνης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, χρωματίστηκαν με 0,4% trypan blue (Invitrogen), και τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

αναλύσεις Microarray

πειράματα μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] με μικρές τροποποιήσεις. RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ ), ακολουθούμενη από καθαρισμό με RNeasy Mini κιτ (Qiagen, Germantown, MD). RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση του επισημασμένου με βιοτίνη cRNA, το οποίο παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ενίσχυσης RNA Illumina (Ambion /Life Technologies), και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν με Illumina Ανθρώπινα-HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) τσιπ. πλυμένη chips σαρώθηκαν με BeadStation 500x (Illumina) και τις εντάσεις του σήματος ποσοτικά με BeadStudio (Illumina). Ο θερμικός χάρτης έγινε χρησιμοποιώντας Cluster 3.0 και Java Treeview από το εργαστήριο Eisen (https://www.eisenlab.org/eisen/). Το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχίας μπορεί να βρεθεί στην γονιδιακή έκφραση Omnibus, αριθμός πρόσβασης GSE46132.

mRNA Extraction, αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

εκχύλιση mRNA και αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22 ]. RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), και σύνθεση cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας SuperScript III First-Strand Synthesis System για RT-PCR (Invitrogen). Real-time PCR για HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1, και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) διεξήχθη χρησιμοποιώντας StepOne σύστημα PCR πραγματικό χρόνο (οι Applied Biosystems /Life Technologies). Τα σύνολα TaqMan αστάρι για HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), παν-HSPA1A & amp? HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), και για GAPDH (4333764F) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Το πρωτόκολλο ενισχύσεως αποτελούνταν από έναν κύκλο στους 50 ° C για 2 λεπτά, ένας κύκλος στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 60 s, και τα επίπεδα μεταγραφής ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας η συγκριτική C

μέθοδο Τ. Τα προκύπτοντα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό StepOne και εκφράζονται ως μέσος όρος των λόγων (σχετική έκφραση για τον έλεγχο) ± SE, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

επεξεργασία των κυττάρων με 5-αζα-2′ δεοξυκυτιδίνης (5-AzdC)

τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (~ 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε 5 μΜ 5-AzdC διαλύθηκε σε 50% οξικό οξύ για 5 ημέρες. Bortezomib (30 ηΜ) προστέθηκε στη συνέχεια σε κατάλληλα φρεάτια 6 ώρες πριν από την συγκομιδή την ημέρα 5, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την απομόνωση του RNA. 5-AzdC ελήφθη από την Sigma.

μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης γενωμικού DNA (Qiagen). DNA (1 μg) μετετράπη με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας την EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το όξινο θειώδες-τροποποιημένο DNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για MSP σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Methprimer. Ο εκκινητής που για τις ανηγμένες μεθυλιωμένο DNA ήταν 5′-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3′ (αντίστροφο)? Το αλφαβητάρι οριστεί για μετατροπή μη μεθυλιωμένου DNA ήταν 5’-TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3’ (reverse). Το PCR πρωτόκολλο συμπεριελάμβανε μία αρχική επώαση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 49 ° C για 30 s και 72 ° C για 40 s, που ακολουθείται από ένα κύκλο 72 ° C για 10 λεπτά. προϊόντα MSP PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Πλήρως μεθυλιωμένο DNA ελέγχου και μη μεθυλιωμένου DNA ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Να

3VO4, 1 μg /ml λευπεπτίνη και 1 mM PMSF. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων (20 μg συνολικής πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν είτε με πρώτα ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την Hsp72 (SPA-810, Stressgen /Enzo Life Sciences, Farmingdale, ΝΥ), HSF1 (SPA-901, Stressgen /Enzo) ή ανθρώπινο βήτα-ακτίνης (Sigma, St. Louis , Μο), και στη συνέχεια με την κατάλληλη δεύτερα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ). Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ECL (Amersham, Piscataway, NJ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) εκτελέστηκε με το κιτ ChIP-IT ™ Express Ενζυματική, και το chip Κιτ -IT ™ Ελέγχου (Active μοτίβο) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα ελέγχου και bortezomib επεξεργασμένο 253JB-V και UM-UC13 (1.5 × 10

7 το καθένα) σταθεροποιήθηκαν για 8 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και κουρεύεται με ενζυματική πέψη επί 10 λεπτά. Το διασπασμένο χρωματίνη απέδωσε ζώνες μεταξύ 200-1500 bp όπως οπτικοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. DNA συνδέεται προς HSF1 καταβυθίστηκε με ένα αντίσωμα αντι-HSF1 (Stressgen /Enzo, SPA-901). Για να ενισχυθεί το HSF1 δεσμευμένου υποκινητή HSPA1A, το κατακρημνισθέν DNA υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας την έκφραση TaqMan® Gene Master Mix με Προσαρμοσμένη TaqMan® Gene Expression Assay εκκινητές (ΑΒΙ) που αντιστοιχεί στην περιοχή HSF1 πρόσδεσης του προαγωγέα HSPA1A ( -10 να -180) [23], [24]. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ StepOne με ακόλουθους όρους: 5 λεπτά στους 50 ° C? 10 λεπτά στους 95 ° C? μετά 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα chip και ομαλοποιήθηκαν σε αντιδράσεις εκτελούνται με το 1% της εισόδου. Τελικό σημείο αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν επίσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] για να επιβεβαιώσει τα πραγματικού χρόνου PCR. Κανονική αντίσωμα IgG χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας.

Μοριακή Διαμόρφωση της hsp72 Έκφραση

Η λεντοϊού pLKO.1 με βάση τα κατασκευάσματα TRCN0000008762 και TRCN0000008757 που στοχεύουν ειδικά το γονίδιο Hsp72 αγοράστηκαν από Open Biosystems, Inc. Το κενό φορέα pLKO.1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ανασυνδυασμένοι ιοί παρήχθησαν με φωσφορικό ασβέστιο διαμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Την ημέρα 2-3 μετά την καλλιέργεια, τα κύτταρα 253J-BV επωάστηκαν με Τα siRNAs και πολυβρένιο (6 μg /ml) για 16~24 ώρες, και τα μεταδιηγερμένα κύτταρα επελέγησαν σε 1 μg /ml πουρομυκίνη. Για παροδική αποσιώπηση της hsp72 σε UM-UC10 κύτταρα, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 6 ή 24-φρεατίων για 72 ώρες με είτε μη-στόχευσης (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005168-00), ή HSPA1B (L-003501-00) siRNA κατασκευάζει από Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Lipofectamine RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει την παράδοση siRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την υπερέκφραση της hsp72, η ακρίβεια LentiORF ελέγχου RFP (OHS5832) και ακριβείας LentiORF επιμέρους κλώνος για HSPA1A (OHS5897-100998480) αγοράστηκαν από την Open Biosystems, Inc. κύτταρα μετατραπέντα επιλέχθηκαν σε 5 μg /ml βλαστισιδίνη και FACS διαλογή των GFP θετικών κυττάρων .

λυσοσωμικές Ακεραιότητα Δοκιμασίες

τα κύτταρα (περίπου 1-2 × 10

5) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται στη βορτεζομίμπη για 24 ώρες. Μετά φαρμακευτικές αγωγές, 100 ηΜ LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) προστέθηκε σε κύτταρα για 30 λεπτά πριν από τη συγκομιδή. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​PBS, και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια ροή Beckman Coulter FC500 κυτταρόμετρο.

ξενομοσχεύματος Μελέτες

Θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από National Cancer Ινστιτούτο (NCI-Frederick). Τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων και σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Υπουργείου Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών, του Υπουργείου Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των Ηνωμένων Πολιτειών. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Cancer Center Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης (ACUF Πρωτόκολλο # 11-00-12734). Οι ποντικοί παρακολουθούνται καθημερινά, και τα Σαββατοκύριακα και τις αργίες, με ευθανασία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση CO2, σε περίπτωση οποιοδήποτε από τα ακόλουθα: όγκο μεγαλύτερο από 1,5 cm, & gt? 20% απώλεια βάρους, λήθαργος, αδυναμία εξασφάλισης τροφίμων ή /και νερό, κοπιαστική αναπνοή, κυρτή στάση, διάταση της κοιλίας που ισοδυναμεί με μία έγκυο ποντικό, ή εξαρτώμενους ως αποτέλεσμα της αύξησης του όγκου.

Γυμνά ποντίκια (ΝΙΗ, ηλικίας 6 εβδομάδων) εμβολιάσθηκαν υποδορίως (sc) με 2 × 10

6 253J BV κύτταρα που μετατρέπονται με το κατασκεύασμα HSPA1A shRNA (253JB-V.KDHsp72) ή ένα μόρφωμα ελέγχου μη-στόχευσης (253JB-V.NT) (10 ποντικοί /ομάδα). Όταν οι όγκοι έγιναν ψηλαφητοί (5~7 ημέρες), τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία για τον έλεγχο ή ομάδες θεραπείας. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδοφλεβίως (Μέσω της φλέβας της ουράς) δύο φορές την εβδομάδα με 1 mg kg bortezomib /μορφοποιούνται σε φυσιολογικό ορό που περιέχει 10 mg /mL μαννιτόλη σε έναν όγκο 100 μΙ ή 100 μΙ με αλατούχο διάλυμα που περιείχε 10 mg /mL μαννιτόλη ως έκδοχο αναφοράς. μετρήσεις πάχος του μακρύτερου διαμέτρων κάθετος όγκου διεξήχθησαν δύο φορές την εβδομάδα μετά την έναρξη της θεραπείας, και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: W * W * L /2 (όπου W και L που παριστάνεται εγκάρσια διάμετρο, και μακρύτερη διαμήκης) . Για την H & amp?. Ε ανάλυση, οι όγκοι συλλέχθηκαν από ποντικούς 24 ώρες μετά τη δεύτερη φαρμακευτική θεραπεία και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε OCT και 10% φορμόλης

UCSC γονιδίωμα Browser

Η UCSC γονιδίωμα Browser [26] χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της παρουσίας ενός νησιού CpG που περιβάλλει την περιοχή του υποκινητή HSPA1A, εντός του Browser Γονιδιώματος, η εγκυκλοπαίδεια των στοιχείων DNA κοινοπραξίας (ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ) βάση δεδομένων [27] χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της παρουσίας μεθυλίωσης σε άλλους τύπους κυττάρων. Το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα είναι στη διάθεση του κοινού στην ακόλουθη ιστοσελίδα:. https://genome.ucsc.edu/

Στατιστικά

Στατιστικά παρήχθησαν χρησιμοποιώντας

t

test του Student λειτουργίες που είναι διαθέσιμες στο GraphPad Prism 5 και το Microsoft Excel λογισμικού. P-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Διαφορικές Πρόκληση HSPA1A σε ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα

Έχουμε επιλέξει τέσσερα αντιπροσωπευτικά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (. 253J BV, SW780, UM-UC10, και UM-UC13) για το χαρακτηρισμό των μοριακών βιολογικών μηχανισμών που καθορίζουν την κυτταρική απόκριση στο βορτεζομίμπης αναστολέα πρωτεασώματος. Επιβεβαιώσαμε καταρχάς ότι οι κυτταρικές σειρές ήταν ετερογενή σε σχέση με τις ευαισθησίες τους να bortezomib-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας βαφή ιωδιούχου προπιδίου και ανάλυση FACS (PI-FACS) για να μετρηθεί η απώλεια ακεραιότητας μεμβράνης πλάσματος (Σχ. 1Α). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε ολόκληρο προφίλ έκφρασης mRNA γονιδιώματος (πλατφόρμα Illumina) για τον προσδιορισμό των προτύπων έκφρασης γονιδίου που σχετίζεται με ευαισθησία φαρμάκου ή /και την αντοχή. Bortezomib επαγόμενη ισχυρή ρύθμιση προς τα άνω του mRNA που κωδικοποιεί το μείζον επαγώγιμη ισομορφή της hsp72 (HSPA1A) στο πιο βορτεζομίμπη ανθεκτική κυτταρική γραμμή (253J Β-V), αλλά όχι με τον πιο ευαίσθητα σε φάρμακο γραμμής (UM-UC13) (Εικ. S1). Επιβεβαιώσαμε αυτά τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR, καταδεικνύοντας ότι HSPA1A mRNA έντονα που προκαλείται από τη βορτεζομίμπη σε 253JB-V και SW780 κύτταρα (~25-60 φορές πάνω ανεπεξέργαστων επίπεδα), ενώ η έκφραση αυξήθηκε ελαφρά επαγόμενη (~2- 4 φορές πάνω από ανεπεξέργαστων επίπεδα) στο UM-UC10 και τα κύτταρα UM-UC13 (Εικ. 1Β). Παρατηρήσαμε επίσης βασική έκφραση πολύ χαμηλή HSPA1A mRNA σε UM-UC10 και UM-UC13 κύτταρα (~50-250 φορές χαμηλότερες από 253JB-V και SW780) και οι διαφορές αυτές επιδεινώθηκαν κατά την έκθεση βορτεζομίμπης, έτσι ώστε τα επίπεδα έκφρασης HSPA1A ήταν ~1000-3000 φορές μικρότερη σε UM-UC10 και τα κύτταρα UM-UC13 σε σχέση με 253JB-V και SW780 (Εικ. 1Β). Ωστόσο, ανοσοαποτύπωση αποκάλυψε συγκρίσιμα επίπεδα πρωτεΐνης Hsp72 σε όλες τις 4 κυτταρικές σειρές (Εικ. 1Γ).

Α. Επιδράσεις της βορτεζομίμπης σε κυτταρικό θάνατο. κυτταρικές γραμμές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (253JB-V, SW780, UM-UC10, UM-UC13) επωάστηκαν με ή χωρίς 100 ηΜ bortezomib για 24 ώρες και ΡΙ /FACS χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση κυτταρικού θανάτου. Η μέση ± SEM, η = 3. Β Επιδράσεις της βορτεζομίμπης στην έκφραση του mRNA της hsp72 ισομορφής HSPA1A. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 30 ηΜ bortezomib για 6 ώρες και HSPA1A μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR. RQ = Σχετική ποσότητα (GAPDH). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM (N≥3) Γ Επιδράσεις της βορτεζομίμπης στα επίπεδα της πρωτεΐνης Hsp72. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 16-18 ώρες με 30 ηΜ του bortezomib (ηΜ), και τα επίπεδα Hsp72 μετρήθηκαν σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου με ανοσοκηλίδωση. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικές των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

HSPA1B Ισόμορφης Αντισταθμίζει για την απώλεια των HSPA1A έκφραση σε UM-UC10 και UM-UC13 κύτταρα

Hsp72 κωδικοποιείται από δύο ανεξάρτητους γενετικούς τόπους (HSPA1A και HSPA1B) που παράγουν υψηλά ομόλογη προϊόντα πρωτεΐνης. Ως εκ τούτου, χαρακτηρίζεται έκφραση HSPA1B στα χαμηλά κύτταρα HSPA1A

. Χρησιμοποιήσαμε ειδικά για τα δύο ισομορφές της hsp72, HSPA1A και HSPA1B εκκινητές, καθώς επίσης και έναν εκκινητή που αναγνωρίζεται τόσο (PAN) ισομορφές για σύγκριση. Τα στοιχεία μας αποκάλυψε ότι οι HSPA1A

χαμηλή κύτταρα (UM-UC10, UM-UC13) είχαν υψηλότερη έκφραση της ισομορφής HSPA1B στη βασική γραμμή από ό, τι έκαναν οι HSPA1A-υψηλής κύτταρα (253JB-V, SW780) (Εικ. 2Α). Επιπλέον, η έκφραση HSPA1B ήταν πιο σθεναρά επάγεται μετά από έκθεση bortezomib στα HSPA1A

χαμηλές κυτταρικές σειρές που στερούνταν το Α1Α ισομορφή (Εικ. 2Β). Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση μετρήθηκε με την παν-εκκινητής ήταν παρόμοια σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές, που πιστοποιεί τα δεδομένα ανοσοκηλίδωσης (Εικ. 1 C). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αυξημένη έκφραση HSPA1B αποζημιώνονται για την έλλειψη HSPA1A και αντιπροσώπευε για την έκφραση της πρωτεΐνης Hsp72 στα κύτταρα UM-UC10 και UM-UC13.

Α. Βασική έκφραση HSPA1A και HSPA1B ισομορφών στους τέσσερις κυτταρικές σειρές. Β Bortezomib επαγόμενη έκφραση του HSPA1A και HSPA1B στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές. Ειδικοί εκκινητές για κάθε ισομορφή, καθώς και ένα παν-εκκινητή που αναγνωρίζονται δύο ισόμορφα, χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση με ποσοτική RT-PCR. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SE (η = 2). RQ = σχετική ποσότητα (GAPDH).

Η

Έλλειψη HSPA1A Η επαγωγή στο UM-UC10 και UM-UC13 κύτταρα οφείλεται στην Διοργανώτρια μεθυλίωση

θερμικού σοκ παράγοντα-1 (HSF1) ενεργοποίησης ελέγχει την παγκόσμια αντίδραση θερμικού σοκ και το στρες που προκαλείται από αυξητική ρύθμιση της hsp72 [28]. Για να ελέγξετε αν η έκφραση HSF1 ήταν που επηρεάζουν τις διαφορές στην έκφραση HSPA1A μεταξύ των κυτταρικών σειρών μας, μετρήσαμε HSF1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης στο 253JB-V (HSPA1A

υψηλή) και (χαμηλή HSPA1A

) κύτταρα UM-UC13. Παρατηρήσαμε μέτριες διαφορές στη βασική και BZ-που προκαλείται από τα επίπεδα HSF1 mRNA μεταξύ 253JB-V και τα κύτταρα UM-UC13? Ειδικότερα, 253JB-V έδειξε μία 2-φορές αύξηση στα επίπεδα HSF1 κατά την έκθεση του φαρμάκου, ενώ UM-UC13 έδειξε μόνο ~ 1,3 φορές αύξηση, αλλά είχε 2 φορές υψηλότερη έκφραση HSF1 mRNA στη βασική γραμμή από ό, τι 253JB-V (Σχ. 3Α, αριστερό πάνελ). Ωστόσο, τα επίπεδα της πρωτεΐνης εμφανίστηκε ουσιαστικά ίσες μεταξύ τους δύο τύπους κυττάρων (Σχ. 3Α, δεξί πάνελ). Επιπλέον, άλλοι στόχοι HSF1 έντονα προκαλούνται, συμπεριλαμβανομένης της προαναφερθείσας HSPA1B (Σχ. 2) και DNAJB1 (Hsp40) (Εικ. S2) στα κύτταρα UM-UC10 και UM-UC13 υποδηλώνοντας ότι δεν υπήρχε γενικευμένη ελάττωμα στην ενδογενή ενεργοποίηση HSF1 σε Αυτά τα κύτταρα. Ως εκ τούτου, σκέφθηκαν ότι τα κύτταρα UM-UC10 και UM-UC13 ενδέχεται να διαθέτουν ειδικές ελάττωμα (ες) σε HSF1-μεσολαβητική ενεργοποίηση του υποκινητή HSPA1A. Συνεπής με αυτή την ιδέα, χρωματίνη immunoprecipiation (μάρκας) αποκάλυψε ότι κύτταρα 253J BV κατείχαν υψηλότερα επίπεδα HSF1 δέσμευση στον προαγωγό HSPA1A στη βασική γραμμή και μετά από έκθεση bortezomib από ό, τι UM-UC13 (~ 2 φορές και ~ 5 φορές υψηλότερη, αντίστοιχα) (Σχ. 3Β). Η πολλαπλάσια επαγωγή της δέσμευσης HSF1 από τη βορτεζομίμπη ήταν -9 φορές εναντίον ~ 4-φορές σε 253JB-V και UM-UC13, αντίστοιχα. Ανάλυση του υποκινητή HSPA1A χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης UCSC Genome αποκάλυψε ότι κείται εντός νησί CpG που μεθυλιώνεται σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχ. S3). Χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης-ειδική PCR, επιβεβαιώσαμε ότι ο υποκινητής HSPA1A ήταν έντονα μεθυλιωμένα στο UM-UC10 και UM-UC13 αλλά όχι στα 253J Β-V ή SW780 κύτταρα (Σχ. 3C), η οποία πιθανώς αντιπροσώπευαν ελαττωματικών επαγωγή HSPA1A bortezomib επαγόμενη. Για να εξεταστεί άμεσα αυτή η πιθανότητα, εξετάσαμε τις επιδράσεις του αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης ιστόνης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη επί της βασικής και bortezomib επαγόμενη επίπεδα HSPA1A mRNA στο UM-UC10 και UM-UC13 κύτταρα. Ο αναστολέας που προκαλείται μεγάλες αυξήσεις στις δύο αναστολέα προκαλούμενη επίπεδα βασικής και πρωτεασώματος HSPA1A στις δύο κυτταρικές σειρές bortezomib ευαίσθητα (Σχ. 3D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι χρωματίνης μεθυλίωση είναι υπεύθυνη για το ελαττωματικό επαγωγή HSPA1A παρατηρηθεί σε κύτταρα UM-UC10 και UM-UC13.

Α. Έκφραση των HSF1. 253J κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως UM-UC13 Β-V και εκτέθηκαν σε βορτεζομίμπη για 12 ώρες και mRNA HSF1 (αριστερό πάνελ) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (δεξιό πλαίσιο) μετρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και ανοσοαποτύπωση, αντίστοιχα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SE (η = 2)? κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Β χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) ανάλυση των HSF1 σύνδεση με τον υποκινητή HSPA1A. Σημειώστε ότι η βασική και δεσμευτική bortezomib που προκαλείται HSF1 ήταν σημαντικά μειωμένη στα βορτεζομίμπη-ευαίσθητα κύτταρα UM-UC13. Η μέση ± SEM, η = 3. * Ρ & lt? 0,05 C. επιλεκτική μεθυλίωση του υποκινητή HSPA1A σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κύστης bortezomib ευαίσθητα. Μεθυλίωσης-ειδική PCR χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της χρωματίνης μεθυλίωσης ευαίσθητα σε φάρμακο (UM-UC10, UM-UC13) και ανθεκτικά σε φάρμακο (253J Β-V, SW780) κυτταρικές γραμμές, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. m, μετουσιωμένες? u, μεθυλιωμένη. αναλογίες m /u υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας πυκνομετρία. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. D. Το DNA αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης αποκαθιστά έκφραση HSPA1A σε bortezomib-ευαίσθητα κύτταρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ 5-AzdC για 5 ημέρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς 30 ηΜ bortezomib για 6 ώρες, και η έκφραση HSPA1A μετρήθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM, n = 3. RQ = σχετική ποσότητα (GAPDH).

Η

Διαμόρφωση των HSPA1A και HSPA1B έκφραση στο HSPA1A

χαμηλή κύτταρα

Από UM -UC10 και UM-UC13 έλειπε έκφραση HSPA1A, εξετάσαμε αν η αντικατάσταση της ισομορφής HSPA1A θα προωθήσει βορτεζομίμπης αντίσταση. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, έχουμε σταθερά υπερεκφράζεται HSPA1A τόσο UM-UC10 και -UC13 κύτταρα χρησιμοποιώντας φορέα λεντοϊού. έκφραση HSPA1A mRNA επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR και Hsp72 συνολικής πρωτεΐνης αυξάνεται με ανοσοκηλίδωση (Σχ. 4Α). HSPA1A κύτταρα που υπερεκφράζουν και άδειο φορέα μεταχθέντα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε bortezomib και ανακαλύψαμε ότι η υπερέκφραση μείωσε σημαντικά bortezomib-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Σχ. 4Β). Αντίστροφα, επειδή UM-UC10 και -UC13 κύτταρα φαίνεται να βασίζονται αποκλειστικά στις HSPA1B mRNA για έκφραση πρωτεΐνης Hsp72, υποθέσαμε ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην στόχευση του HSPA1B. Για να δοκιμάσετε αυτό, χρησιμοποιείται siRNA να φιμώσουν παροδικά HSPA1B στα κύτταρα UM-UC10. Ανάλυση knockdown αποτελεσματικότητας αποκάλυψε ότι το εμπορικά διαθέσιμο siRNAs δεν μπορούν να στοχεύσουν ειδικά μεμονωμένες ισομορφές (δηλ siHSPA1A σιγήσει HSPA1B) (Σχ. 4C). Παρ ‘όλα αυτά, ένας συνδυασμός siHSPA1A και siHSPA1B αλληλουχίες έδωσε το καλύτερο (αν και όχι πλήρης) συνολική knockdown της ισομορφής Α1Β τόσο σε RNA και πρωτεΐνης επίπεδο (Σχ. 4C). Χρησιμοποιώντας αυτή τη στρατηγική, επιβεβαιώσαμε ότι ο αποκλεισμός της επαγωγής HSPA1B ευαισθητοποιημένων UM-UC10 κύτταρα να bortezomib (Εικ. 4D).

Α. Επιδράσεις της αναγκαστικής HSPA1A υπερέκφραση σε HSPA1A mRNA και τα συνολικά επίπεδα της πρωτεΐνης Hsp72 στο UM-UC10 και τα κύτταρα UM-UC13. Τα κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με ένα κατασκεύασμα έκφρασης βραδέος ιού HSPA1A, και τα επίπεδα HSPA1A μετρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR. Η μέση ± SEM, η = 3. RQ = σχετική ποσότητα (GAPDH). Τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν μέσω ανοσοστύπωσης. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. B. Επιπτώσεις της HSPA1A υπερέκφραση σε βορτεζομίμπης που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Κύτταρα μεταχθέντα με κενό φορέα (ΝΤ) ή με την κατασκευή έκφρασης HSPA1A εκτέθηκαν σε 30 ηΜ bortezomib για 24 ώρες και την ακεραιότητα της μεμβράνης του πλάσματος μετρήθηκε με trypan blue πρόσληψη. (Η παρουσία του RFP στο κατασκεύασμα έκφρασης εμπόδισε χρήση μας του /FACS δοκιμασία κυτταρικού θανάτου ΡΙ.) Η μέση ± SEM, η = 3. *, Ρ & lt? 0,02. Γ εξόντωση HSPA1B στα κύτταρα UM-UC10. Αριστερό πλαίσιο, knockdown αποδόσεις siRNA κατά HSPA1A, HSPA1B, ή και τα δύο ισόμορφα όπως μετράται με ποσοτική RT-PCR μετά από έκθεση σε 30 ηΜ bortezomib για 6 ώρες. RQ = Σχετική ποσότητα (GAPDH). Δεξιά πάνελ, αντίστοιχα knockdown των επιπέδων της πρωτεΐνης Hsp72 από τη διαφορά siRNA αλληλουχίες μετά από έκθεση σε 30 ηΜ ΒΖ επί 14 ώρες. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Δ Επίδραση της HSPA1B νοκ ντάουν για βορτεζομίμπης που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα UM-UC10. Μετά από 72 ώρες knockdown, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 30 ηΜ bortezomib για 24 ώρες και ο κυτταρικός θάνατος μετρήθηκε με ανάλυση PI /FACS. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SE (η = 3). * P & lt?. 0.01

Η

Hsp72 επαγωγής Αναστέλλει Bortezomib που προκαλείται κυττάρων

Death

Για να προσδιορίσετε πιο άμεσα αν βορτεζομίμπη-επαγόμενης hsp72 προς τα πάνω ρύθμιση προωθείται η αντίσταση, είμαστε σταθερά γκρέμισε Hsp72 σε 253JB-V bortezomib-ανθεκτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα φορέα λεντοϊού shRNA (Εικ. 5Α). Τα βασικά επίπεδα HSPA1A mRNA μειώθηκαν κατά περισσότερο από 75% στα κύτταρα, αλλά shRNA μεσολάβηση καταστολή της HSPA1A mRNA (σχ. 5Α. άνω πάνελ) και Hsp72 πρωτεΐνη (Εικ. 5Α, κάτω πάνελ) ήταν λιγότερο εντυπωσιακά μετά από έκθεση σε bortezomib, προφανώς επειδή ο αναστολέας πρωτεασώματος που παράγεται μια τέτοια ισχυρή ρύθμιση προς τα πάνω της hsp72. Παρ ‘όλα αυτά, σταθερή Hsp72 knockdown ενίσχυσε σημαντικά bortezomib επαγόμενη απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης πλάσματος, όπως μετράται με πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου (Εικ. 5Β). Προηγούμενες μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η επαγωγή Hsp72 σερβίρει κυτταροπροστατευτική λειτουργία υπό την ολοκληρωμένη αντιμετώπιση του στρες (ISR), σταθεροποιώντας λυσοσώματα [29]. Ως εκ τούτου, συγκρίναμε τα αποτελέσματα της βορτεζομίμπης στην ακεραιότητα λυσοσωμικού στα 253JB-V κύτταρα μετάγονται με τον φορέα ελέγχου (253JB-V NT) ή το KD9 HSPA1A ειδικό κατασκεύασμα shRNA.