Αφηρημένο

Ιστορικό

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες, γεγονός που υποδηλώνει ότι νέες στρατηγικές για την πρόληψη και τη θεραπεία των PDAC είναι χρειάζεται επειγόντως. Οι μεταλλάξεις K-ras παρατηρείται σε & gt? 90% του καρκίνου του παγκρέατος, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο της στην έναρξη και αναπτυξιακά στάδια PDAC. Για να αποκτήσετε μηχανιστική αντίληψη για το ρόλο των μεταλλαγμένων K-ras, έχουν διάφορα μοντέλα ποντικών έχουν αναπτυχθεί στοχεύοντας ένα υπό όρους μεταλλαγμένο K-ras

G12D για ανακεφαλαιώνοντας PDAC. Ένα σημαντικό ύπαρξη συνεργασίας έχει δειχθεί στην ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε ένα μοντέλο ποντικού ένωση με ενεργοποιημένο K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός (ες) με την οποία K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια συμβάλλουν στην PDAC δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για την εκτίμηση του μοριακού μηχανισμού (s ) που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του PDAC στην ένωση διαγονιδιακά ποντίκια με ενεργοποιημένο K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια, χρησιμοποιήσαμε πολλαπλές μεθόδους, όπως σε πραγματικό χρόνο RT-PCR, κηλίδωση Western δοκιμασία, ανοσοϊστοχημεία, ΜΤΤ δοκιμασία, εισβολή, EMSA και ELISA. Βρήκαμε ότι η διαγραφή του ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ στο K-ras

G12D εκφράζοντας ποντίκια οδηγεί σε PDAC, η οποία εν μέρει διαμεσολαβείται μέσω της ενεργοποίησης του Notch και NF-κΒ μονοπάτια σηματοδότησης. Επιπλέον, βρήκαμε κάτω ρύθμιση του miR-200 οικογένεια, η οποία θα μπορούσε επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την εξέλιξη των PDAC στις σύνθετες διαγονιδιακά ποντίκια.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του Notch και NF-κΒ σε συνδυασμό με την απώλεια του miR-200 οικογένεια μηχανιστικά συνδέεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των PDAC στις σύνθετες K-ras

G12D και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια διαγονιδιακά ποντίκια.

Παράθεση: Wang Ζ, Banerjee S, Ahmad A, Li Υ, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) Ενεργός K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ Ανεπάρκεια Συνεργάζονται κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος με την ενεργοποίηση του Notch και NF-κΒ μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 6 (6): e20537. doi: 10.1371 /journal.pone.0020537

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Απριλίου, 2011? Δεκτές: 2, Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 του Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, και 5R01CA132794 (FH Sarkar) και CA-075 059 με Μ Korc. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Puschelberg και Guido θεμέλια για τη γενναιόδωρη οικονομική συνεισφορά τους. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι μια ιδιαίτερα επιθετική κακοήθη νόσο, η οποία κατατάσσεται ως η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με διάμεση επιβίωση 6 μηνών, ενώ με περίπου 43.140 νέα κρούσματα και περίπου 36.800 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2010 [1]. Έχει γίνει αποδεκτό ότι η ανάπτυξη του PDAC συμβαίνει μέσω της εξέλιξης των πρόδρομων αλλοιώσεων όπως παγκρεατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN), που κυμαίνονται από χαμηλού βαθμού PanINs (PanIN-1A, PanIN-1Β) για υψηλής ποιότητας PanINs (PanIN-2, PanIN-3) [2], [3]. PDAC έχει αποδειχθεί ότι έχει πολλών σταδίων μοριακής εξέλιξης συμπεριλαμβανομένων των υψηλών συχνοτήτων του ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις K-ras και επακόλουθη απενεργοποίηση του ρ16

ΙΝΚ4 &, ρ53, καταστολείς όγκων Smad4, p14ARF και άλλα πρόσθετα γενετικές ανωμαλίες σε μοντέλα ποντικών [4] – [ ,,,0],6], και στην ανθρώπινη [7]. Η πιο κοινή μετάλλαξη K-ras σε ανθρώπινο PDAC είναι κωδικόνιο 12 (Kras

G12D), η οποία σχετίζεται με την ενεργοποίηση της δραστικότητας ΟΤΡάσης. Ως εκ τούτου, διάφορα μοντέλα ποντικών PDAC έχουν δημιουργηθεί με στόχο μια υπό όρους μεταλλαγμένο K-ras

G12D να ανακεφαλαιώνουν την εξέλιξη της PDAC [8] – [12]. Ένα μοντέλο ποντικού ένωση που περιέχει ενεργοποιημένο K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια έδειξε να συνεργαστούν στην παραγωγή μεταστατικό PDAC [13], [14]. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός (ες) με την οποία ενεργοποιείται K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια συμβάλλουν στην PDAC επιθετικότητα δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί.

Τα τελευταία χρόνια, πολλά μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων μονοπάτι Notch έχουν ερευνηθεί και βρήκε να παίζουν σημαντικούς ρόλους στην PDAC [15]. σηματοδότηση Notch έχει κρίσιμες λειτουργίες για τον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, της απόπτωσης, η μετανάστευση, εισβολή, και μετάσταση σε PDAC [16]. γονίδια Notch κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες μπορούν να ενεργοποιηθούν από την αλληλεπίδραση με μια οικογένεια συνδετών του. Μέχρι σήμερα, έχουν τέσσερις υποδοχείς Notch (Notch1-4) και πέντε συνδέτες (DLL-1, Dll-3, Dll-4, Jagged-1, Jagged-2) έχουν ταυτοποιηθεί [17]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι η λειτουργία της Notch σηματοδότηση στην ογκογένεση μπορεί να είναι είτε ογκογόνο ή ογκοκατασταλτικά, και η λειτουργία εξαρτάται επίσης σε PDAC [18] το πλαίσιο, [19]. σηματοδότηση Notch συχνά απορυθμισμένη με τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση των υποδοχέων Notch και τους συνδέτες τους σε PDAC [20]. Δείξαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Notch-1 χρησιμοποιώντας ειδικό siRNA συσχετίστηκε με μειωμένη πολλαπλασιαστική τιμές, αυξημένη απόπτωση, μειωμένη μετανάστευση, και μειωμένη επεμβατική ιδιότητες των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [21], [22]. Πρόσφατα, έχει βρεθεί ότι η ενεργός σηματοδότηση Notch μπορούν συνεργούν με K-ras σε κίνηση PanIN και εξέλιξης σε διηθητικό αδενοκαρκίνωμα [8], [23]. Η αναστολή της οδού σηματοδότησης Notch είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της εξέλιξης του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού (K-ras, ρ53 L /+ ποντικοί) του PDAC [24]. Πιο πρόσφατα, Mazur et al. διαπίστωσε ότι η ανεπάρκεια των Notch-2 στάσεις PanIN εξέλιξη, να παρατείνει την επιβίωση μέσω της αναστολής της Myc σηματοδότησης στο K-ras με γνώμονα παγκρέατος καρκινογένεση [25]. Παραδόξως, Notch-1 βρέθηκε πρόσφατα ως καταστολέας όγκου σε ένα μοντέλο του K-ras-επαγόμενη PDAC [18], υποδηλώνοντας ότι οι πρόσθετες μελέτες για να προσδιοριστεί ο ρόλος της σηματοδότησης Notch σε PDAC.

μονοπάτι Notch έχει αναφερθεί ότι η cross-talk με ΝΡ-κΒ, ένα από τα μείζονα παράγοντα μεταγραφής που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και αποπτωτικών ρυθμιστικές οδούς σε καρκίνο του παγκρέατος. Μελέτες από την ομάδα μας έδειξε ότι η σηματοδότηση Notch θα μπορούσε να επάγουν τη δράση του NF-κΒ στον καρκίνο του παγκρέατος [21]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι ο ΝΡ-κΒ μονοπάτι απαιτείται για την ανάπτυξη των όγκων σε ένα μοντέλο ποντικού (K-ras, ρ53 L /L ποντικοί) του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [26]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η γενετική διαγραφή της p65 υπομονάδας ΝΡ-κΒ σε ένα K-ras επαγόμενης μοντέλο ποντικού καρκίνου του πνεύμονα μειωμένη πνευμονική ογκογένεση με την παρουσία και απουσία του καταστολέα όγκου ρ53 [27]. Ωστόσο, είναι σε μεγάλο βαθμό αβέβαιο αν ΝΡ-κΒ είναι απαραίτητος για K-ras-επαγόμενη εξέλιξη PDAC.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τα μοριακά αλλοιώσεις σε όγκους ποντικού που αναπτύχθηκε στην ένωση διαγονιδιακά ποντίκια με ενεργοποιημένο Κ- ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά, ότι η διαγραφή του ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ σε K-ras εκφράζουν ποντικούς οδηγεί σε PDAC, η οποία είναι εν μέρει προκαλούνται μέσω της ενεργοποίησης του Notch και NF-κΒ μονοπατιών σηματοδότησης. Επιπλέον, βρήκαμε μεταβολές στην έκφραση της οικογένειας miR-200, το οποίο θα μπορούσε επίσης να παίξει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και την πρόοδο της PDAC στην ένωση διαγονιδιακά ποντίκια με ενεργοποιημένο K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια.

Αποτελέσματα

σηματοδοτικό μονοπάτι Notch εκφράζεται έντονα σε Pdx1-Cre? LSL-K-ras

G12D? ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

ποντίκι

Για να οριοθετηθούν το μηχανιστικό ρόλο των μεταλλαγμένων K-ras για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του PDAC, εκτιμήσαμε την έκφραση του μονοπατιού Notch στο μοντέλο ποντικού. Σε αυτό το μοντέλο, ογκογόνο Κ-ras (Kras

G12D) είναι νοκ-in στο δικό του τόπο και μεταγραφικά σιγήσει λόγω της εισαγωγής ενός στοιχείου ΙοχΡ-Stop-ΙοχΡ (LSL). Όταν LSL- Kras

Οι ποντικοί G12D εκτρέφονται με διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία εκφράζουν την ανασυνδυάση Cre υπό τον έλεγχο του υποκινητή Pdx1, η έκφραση της Cre ρεκομπινάσης σε παγκρεατικά προγονικά κύτταρα επιτρέπει την απομάκρυνση της floxed μεταγραφική κασέτα STOP, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της ογκογόνο Κ-ras αλληλόμορφο. Σε αυτό το μοντέλο, δεν υπήρχε όγκοι εύκολα βρεθεί έως 30 εβδομάδων σε LSL- K-ras

G12D? Pdx1-Cre (καλέσαμε KC σε αυτό το χειρόγραφο) ποντίκια, σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη [13]. Βρήκαμε επίσης καμία ένδειξη PDAC στο ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ? Pdx1-Cre (που ονομάζεται IC σε αυτό το χειρόγραφο) ζώα μέχρι την ηλικία των 24 εβδομάδων, παρόμοια με την παρατήρηση τεκμηριώνεται και από άλλες ομάδες [13]. Ωστόσο, τα 25 ποντίκια από LSL- K-ras

G12D? Pdx1-Cre? ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ (ζητήσαμε KCI για αυτό το χειρόγραφο) ομάδα βρέθηκαν να έχουν παγκρεατικών όγκων που κυμαίνονται σε διάμετρο από 4 έως 10 mm μεταξύ 45 έως 80 ημέρες (σχ. 1Α). Η ένωση ΚΟ ποντίκια με όγκους έγιναν ετοιμοθάνατα (Εικ. 1Α, καμπύλη επιβίωσης). Οι όγκοι επιβεβαιώθηκαν με ιστοπαθολογική εξέταση (Σχ. 1Β). Το Ki-67, ενός γνωστού δείκτη πολλαπλασιασμού, ήταν εντόνως εκφρασμένο σε KCI παγκρεατικών όγκων (Σχ. 1Β). Έχει αναφερθεί ότι σηματοδοτικό μονοπάτι Notch έχει κρίσιμους ρόλους στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την έκφραση των γονιδίων Notch σε αυτούς τους διαγονιδιακούς ιστούς ποντικών. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι εστιάσαμε τις μελέτες μας επί του διασπασμένου Notch, διότι είναι η ενεργή λειτουργική μορφή του Notch. Ως εκ τούτου, Notch σε όλους τους μύθους εικόνα μας σημαίνει ενεργό διασπασμένα Notch. Βρήκαμε ότι η σηματοδότηση Notch ενεργοποιήθηκε στους όγκους των ποντικών ΚΟ σε σύγκριση με την παγκρέατα της KC ​​και IC ποντίκια, αντίστοιχα (Σχ. 1C, D). Η έκφραση του Notch-2 και Notch-4 ήταν επάνω ρυθμισμένη τόσο στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε ποντίκια KCI. Ωστόσο, Notch-1 έκφρασης δεν έδειξε αλλαγή και Notch-3 εκφράσεως είναι αυξημένο μόνο στο επίπεδο του mRNA στους όγκους των ποντικών KCI, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι ρόλοι του Notch-2, και Notch-4 θα μπορούσε να είναι πιο σημαντική στην πρόοδο του καρκίνου του παγκρέατος. Βρήκαμε επίσης ότι και οι πέντε συνδέτες Notch ήταν πάνω ρυθμισμένα στους όγκους που προέρχονται από ποντίκια KCI (Σχ. 2Α, Β). Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, αξιολογήσαμε την έκφραση του Notch κατάντη γονίδια όπως Hes-1 και Hey-1. Βρήκαμε ότι η έκφραση του ΗΕδ-1 και Hey-1 αυξήθηκε στους όγκους των ποντικών KCI (Εικ. 2Α, Β), η οποία αναμενόταν με βάση τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση των Notch-2, Notch-4 και τους συνδέτες τους.

Ένα, Top αριστερό πάνελ: Tumor επίπτωση στην ΚΟ ποντίκια (Ν & gt? 25). ποντίκια ελέγχου: KC και IC ποντίκια. Πάνω δεξιά πίνακα: Μέσο μήκος των όγκων σε ποντίκια ΚΟ (Ν & gt? 20). Κάτω πίνακα: Kaplan-Meier του παγκρέατος καμπύλη επιβίωσης άνευ όγκου για ποντίκια ΚΟΙ και τα ζώα ελέγχου. ποντίκια ελέγχου: συνδυασμοί των KC και IC ποντίκια. Β, Top πίνακα: Η μικροσκοπική εξέταση των όγκων που προέρχονται από ποντίκια KCI αποτελείται από κύτταρα τα οποία σχηματίζουν αγωγούς σε σημεία (κόκκινα βέλη). καρκινικά κύτταρα εστιακά είναι σε φύλλα. Τα κύτταρα είναι μεγάλα, πολύ άτυπα, με μεγάλα, πλειομορφικές πυρήνες και εμφανή 2-3 πυρηνίσκοι (κίτρινα βέλη) ανά κύτταρο. Κυτταρόπλασμα είναι ηωσινοφιλική με χλωμό ηωσινοφιλική εγκλείσματα (πράσινα βέλη) σε μερικά κύτταρα δίνοντας μια ραβδοειδή χαρακτηριστικό στα κύτταρα. Γύρω στρώμα δείχνει spindled κύτταρα με επιμήκεις πυρήνες (μαύρα βέλη) και διάσπαρτα φλεγμονώδες διήθημα που αποτελείται από ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα και λίγα κύτταρα του πλάσματος. Κάτω πίνακας: Ki-67 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε όγκους που λαμβάνονται από τους ποντικούς ΚΟΙ όπως εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. C, μονοπάτι σηματοδότησης Notch ήταν ρυθμισμένη σε επίπεδο mRNA όπως αξιολογείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ. D, μονοπάτι Notch ήταν εντόνως εκφρασμένο σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ όπως εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση και ανοσοϊστοχημεία, αντίστοιχα.

Η

Α, η έκφραση προσδεμάτων Notch και Notch κατάντη γονιδίων αυξήθηκε στο επίπεδο του mRNA όπως αξιολογείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ. Β, η έκφραση προσδεμάτων Notch και Notch κατάντη γονιδίων υψηλής έκφρασης σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ όπως εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση. C, η δραστικότητα ρ65 ΝΡ-κΒ αυξήθηκε σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια KCI με ELISA. Α, αριστερό πλαίσιο, δραστικότητα δέσμευσης DNA ρ65 ΝΡ-κΒ αυξάνεται σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ όπως αξιολογείται με EMSA. Δεξιά πάνελ, φωσφο-ρ65 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε όγκους που λαμβάνονται από τους ποντικούς ΚΟΙ όπως εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία.

Η

δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA ενεργοποιήθηκε σε KCI ποντικούς ιστό

ΝΡ κΒ έχει αναφερθεί σε cross-talk με Notch μονοπατιού [28]. Έχουμε αναφέρει προηγούμενα ότι τα Notch-1 μπορεί να ρυθμίζουν δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA σε καρκίνο του παγκρέατος [22]. Συνεπώς, διερευνήσαμε κατά πόσον η κατάντη επίδραση του Notch πάνω ρύθμιση θα μπορούσε να συσχετιστεί μηχανιστικά με την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μονοπάτι στους όγκους των ζώων αυτών. Είναι γνωστό ότι η οικογένεια ΝΡ-κΒ αποτελείται από ομο- και ετεροδιμερή των πρωτεϊνών Rel? NF-κB1 (P50)? ΝΡ-κΒ (ρ52), ΚεΙΑ (ρ65), RelB, και c-Rel (rel). ΝΡ-κΒ (ρ50 /ρ65) είναι ένα πανταχού παρόν, ιδιοσυστατικούς και επαγώγιμους ετεροδιμερούς. Σε γενικές γραμμές, η δραστικότητα δέσμευσης του DNA του ΝΡ-κΒ αναφέρεται παραδοσιακά στην ρ50 /ρ65 (ρ50 /ΚεΙΑ) ετεροδιμερές μεσολάβηση δέσμευση στο DNA, και αυτό είναι ένα γνωστό ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης και σηματοδότηση αντι-απόπτωσης. Στο πυρήνα, η ρ65 ΝΡ-κΒ υπομονάδα είναι μια ισχυρή ενεργοποιητής μιας ευρείας ποικιλίας γονιδίων? Ως εκ τούτου, εκτιμήσαμε την πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης ρ65 με ανοσοϊστοχημεία. Πυρηνικές πρωτεΐνες από τους όγκους που λαμβάνονται από τα διαγονιδιακά ποντίκια υποβλήθηκαν επίσης σε ΝΡ-κΒ ρ65 ELISA, και η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ρ65 δέσμευσης DNA, όπως μετράται με EMSA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα ρ65 ΝΡ-κΒ, όπως αξιολογείται με ELISA, και η δραστικότητα δέσμευσης DNA ρ65 ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται σε όγκους που προέρχονται από την ένωση ποντικούς KCI (Σχ. 2C, D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη πυρηνική συσσώρευση της ρ65 στους όγκους των ποντικών KCI, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο η ενεργοποίηση του Κ-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκειας απαιτούνται για ενισχυμένη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Επιπλέον, ανοσοχρώση έδειξε επίσης ότι φωσφο-ρ65 ήταν εντόνως εκφρασμένο στον πυρηνικό διαμέρισμα στους ιστούς του όγκου των ποντικών KCI (Σχ. 2D).

Οι ΝΡ-κΒ κατάντη γονίδια ενεργοποιούνται σε KCI ποντικούς

έχει αναφερθεί ότι μονοπατιού Notch διεγείρει δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε κύτταρα καρκίνου του τραχήλου συσχετίζοντας με την σηματοσώματος ΙΚΚ μέσω ΙΚΚα [29]. Προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι μονοπατιού Notch ρυθμίζει την έκφραση ΙΚΚα σε παγκρεατικού καρκίνου [30]. Έτσι, ερευνήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΙΚΚ στους όγκους των ποντικών KCI. Βρήκαμε ότι όλα τα μέλη της οικογένειας όπως ΙΚΚ ΙΚΚα, ΙΚΚβ και IKKγ ενεργοποιήθηκαν στους όγκους του KCI ποντικών (Σχ. 3Α). Για να διερευνηθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων γονιδίων-στόχων NF-κΒ συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων COX-2, η κυκλίνη D1, ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-2, Bcl-2, c-myc, και survivin με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κηλίδωση Western, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας τους ιστούς του όγκου που λαμβάνεται από την ένωση KCI διαγονιδιακών ζώων. Real-time RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων ενεργοποιήθηκε στους όγκους του KCI ποντικών (Σχ. 3Α, Β). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του Stat3 ενεργοποιήθηκε στους όγκους σχηματίζουν ποντίκια ΚΟΙ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι γνωστό ότι αυτά τα γονίδια παίζουν κρίσιμους ρόλους στην κυτταρική ανάπτυξη, την εισβολή και τη μετάσταση. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω το ρόλο του ΝΡ-κΒ στην ανάπτυξη του όγκου και της εξέλιξης στις σύνθετες ποντικούς ΚΟΙ.

Α, ανάλυση κηλίδος Western που δείχνει την επάνω ρυθμισμένη έκφραση του ΙΚΚ, ρ65, και NF-κΒ κατάντη γονιδίων σε όγκους που προέρχονται από ποντικούς ΚΟΙ. Β, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR που δείχνουν αυξημένη έκφραση του ΝΡ-κΒ κατάντη γονιδίων όπως survivin, κυκλίνη D1, Bcl-2, C-myc, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στους όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ. C, Η έκφραση της οικογένειας miR-200 ρυθμισμένα προς τα κάτω στους όγκους των ποντικών KCI όπως αξιολογείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR. D, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνει μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, και αυξημένη έκφραση βιμεντίνη, και μια μέτρια αύξηση στην έκφραση του ZEB1 ενώ ένα 30-φορές αυξημένη έκφραση ZEB2 σε όγκους που προέρχονται από ποντίκια ΚΟΙ.

Η οικογένεια miRNA-200 ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε ΚΟΙ ποντίκια

Η οικογένεια miR-200 έχουν βρεθεί να ρυθμίζει σηματοδοτικό μονοπάτι Notch [31]. Η οικογένεια miR-200 έχει πέντε μέλη: miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 και miR-429. Βρήκαμε ότι Notch-1 θα μπορούσε να είναι ένα από τα γονίδια-στόχους της οικογένειας miR-200 (MIR-200b, miR-200c), επειδή η υπερβολική έκφραση αυτών των miRNAs αναστέλλει σημαντικά Notch-1 σε καρκίνο του προστάτη [31] και του καρκίνου του παγκρέατος ( αδημοσίευτα δεδομένα). Για την αντιμετώπιση είτε οικογένεια miR-200 εμπλέκεται στους όγκους των ποντικών ΚΟ η οποία έδειξε υψηλή έκφραση του Notch (Notch-2 και 4) οδό σηματοδότησης, ερευνήσαμε την έκφραση του miR-200 οικογένεια. Όπως αναμενόταν, η έκφραση του miR-200A, miR-200b και miR-200c μειώθηκε σημαντικά στους όγκους του KCI ποντικών (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι οι όγκοι που αναπτύσσονται στα ένωση ποντικούς θα μπορούσε να δείξει επιθετική συμπεριφορά, όπως την απόκτηση επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινότυπο, και ως εκ τούτου έχουμε διερευνήθηκε περαιτέρω την μοριακή μακιγιάζ των όγκων που προέρχονται από την ένωση KCI διαγονιδιακό ποντίκια όπως περιγράφεται κατωτέρω.

Απόδειξη της ΕΜΤ φαινοτύπου στους όγκους που προέρχονται από την ένωση KCI διαγονιδιακών ποντικών

Πρόσφατα πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η οικογένεια miR-200 ρυθμίζει ΕΜΤ με στοχοθέτηση ψευδαργύρου-δακτύλου E -κουτί δεσμευτική ομοιοκυτίου 1 (ZEB1) και ZEB2. EMT είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται αξιοσημείωτες μορφολογικές αλλαγές που χαρακτηρίζεται από μια μετάβαση από επιθηλιακά φαινότυπο λιθόστρωτα να επίμηκες ινοβλαστική φαινότυπο. προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι το miR-200a, miR-200b, και miR-200c ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γεμσιταβίνης-ανθεκτικά, συνεπής με την παρατηρούμενη φαινότυπο EMT [32], [33]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι miR-200 οικογένεια ρυθμίζει την έκφραση ZEB1, γυμνοσάλιαγκα, Ε-καδερίνης, και βιμεντίνη, και ως εκ τούτου προτείνεται η επανέκφραση του miR-200 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την αναστροφή της ΕΜΤ φαινοτύπου προς μεσεγχυματικά-to- επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ), η οποία έχει εν μέρει τεκμηριωθεί σε πρόσφατη δημοσίευση μας [34]. Επειδή βρήκαμε χαμηλή έκφραση της οικογένειας miR-200 στους όγκους των ποντικών KCI, αξιολογήσαμε τους δείκτες EMT να διερευνηθεί κατά πόσο οι όγκοι στα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε KCI ΕΜΤ ή όχι. Βρήκαμε απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του βιμεντίνη και ZEB2 στους όγκους των ποντικών KCI αν και η έκφραση του ZEB1 έδειξε μέτρια αύξηση (Εικ. 3D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση αυτών των παραγόντων μπορεί να είναι σημαντικό για την επαγωγή EMT φαινότυπο σε οι όγκοι των ποντικών KCI, το οποίο φαίνεται να είναι συνεπής με την επιθετική συμπεριφορά των όγκων που αναπτύσσονται στην ένωση KCI διαγονιδιακών ποντικών.

Αναστολή της οδού Notch προκάλεσε μειωμένη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε μία κυτταρική γραμμή ποντικού PDAC

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω ο πιθανός ρόλος του μονοπατιού Notch σε καρκίνο του παγκρέατος, χρησιμοποιήσαμε Rink-1 κυτταρική γραμμή η οποία προέρχεται από τα παγκρεατικά ιστούς KCI και μελέτησαν τις επιδράσεις των αναστολέων του μονοπατιού Notch. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα Rink-1 παρουσίασε ταχεία ανάπτυξη

in vitro

και σχημάτισαν όγκους σε γυμνούς ποντικούς [14]. Από σηματοδότηση Notch είναι ενεργοποιημένη

μέσω

της δραστηριότητας της γ-σεκρετάσης, έχουν διάφορες μορφές της γ-σεκρετάσης αναστολέων συμπεριλαμβανομένων DAPT και L-685,458 έχουν χρησιμοποιηθεί για την αδρανοποίηση μονοπάτι Notch. Επομένως, προσδιορίσαμε την κυτταρική βιωσιμότητα του Rink-1 κύτταρα κατεργασμένα με GSI με τη δοκιμασία ΜΤΤ, και τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην Εικόνα 4Α. Η επεξεργασία των κυττάρων Rink-1 για 72 ώρες με DAPT, και L-685,458 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Για να καθοριστεί ποια υποδοχέα Notch θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του παγκρέατος, εξετάστηκε η επίδραση του Notch 1-4 siRNA στην κυτταρική ανάπτυξη των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Η αποτελεσματικότητα του GSI και Notch siRNA για την εξουδετέρωση της πρωτεΐνης Notch επιβεβαιώθηκε μέσω western αποτύπωση. Παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης Notch ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε GSI θεραπεύονται ή Notch siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Πολύ ενδιαφέροντα, μόνο αδρανοποίηση του ενιαίου υποδοχέα Notch δεν αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχ. 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η απενεργοποίηση των πολλαπλών υποδοχέων Notch με GSI είναι καλός τρόπος για τη θεραπεία PDAC. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το συμπέρασμα, εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων στόχων Notch σε Rink-1 κύτταρα επεξεργασμένα με GSI ή Notch siRNA. Επειδή μόνο Notch-2 και Notch-4 siRNA ελαφρώς ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, ανιχνεύσαμε την έκφραση των γονιδίων στόχων Notch σε Rink-1 κύτταρα επεξεργασμένα με αυτά τα δύο siRNAs. Όπως περιμέναμε, έχουμε βρει ότι GSI ανέστειλε την έκφραση των γονιδίων στόχων Notch συμπεριλαμβανομένων ΗΕδ-1, Survivin, Bcl-2, c-myc, υΡΑ σε πιο βαθμό, σε σύγκριση με Notch-2 siRNA ή Notch-4 siRNA διαμόλυνση (Σχ. 4C). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε GSI στα ακόλουθα πειράματα. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της αγωγής επί της βιωσιμότητας των κυττάρων με κλωνογόνο προσδιορισμό. θεραπεία GSI είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αναστολή του σχηματισμού αποικίας των κυττάρων Rink-1 σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 5Α). Συνολικά, τα αποτελέσματα από κλωνογονική δοκιμασία ήταν σύμφωνα με τα δεδομένα ΜΤΤ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αδρανοποίηση του μονοπατιού Notch θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων των κυττάρων Rink-1.

Α, αριστερό πλαίσιο, Αναστολή της Rink-1 κυτταρική ανάπτυξη από Notch 1-4 siRNA ελεγχθεί με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα χαράσσονται ως μέσο ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα που έχει έξι προσδιορισμούς ανά πείραμα για κάθε πειραματική συνθήκη. Μέση και δεξιό πάνελ: L-685,458 και DAPT ήταν αναστολείς γ-σεκρετάσης (GSI), τα οποία εμποδίζουν τη διάσπαση του υποδοχέα Notch, μπλοκάροντας μεταγωγή σήματος Notch. GSI ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων Ρολ-1. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο και κατεργάστηκαν με GSI για 72 ώρες. Μετά τη θεραπεία, οι πυκνότητες των κυττάρων προσδιορίστηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SD (η = 6) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Β, η έκφραση του μονοπατιού Notch ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε Rink 1-κύτταρα επεξεργασμένα με GSI ή επιμολυσμένα με Notch 1-4 siRNA όπως εκτιμάται με κηλίδωση Western ανάλυση. C, η έκφραση των γονιδίων στόχων Notch ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε Rink 1-κύτταρα επεξεργασμένα με GSI ή επιμολυσμένα με Notch-2 siRNA ή Notch-4 siRNA όπως αξιολογείται με όπως αξιολογείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

Α, επάνω, αριστερά πάνελ: κυττάρων επιβίωση Ρολ-1 κύτταρα επεξεργασμένα με GSI. Κύτταρα κατεργασμένα με GSI για 72 ώρες αξιολογήθηκαν από την κλωνογόνο προσδιορισμό. Φωτομικρογραφίας διαφορά στο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων με GSI. Δεξιό πλαίσιο: Υπήρξε σημαντική μείωση στον σχηματισμό αποικίας σε Rink-1 κύτταρα που κατεργάζονται με GSI σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

P

τιμές αντιπροσωπεύουν τις συγκρίσεις μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με GSI και ελέγχου με τη χρήση του σε συνδυασμό

t

τεστ. Κάτω, αριστερά πίνακας: Χαρακτηρισμός της απόπτωσης διεξήχθη μετά ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και χρώση Annexin V-FITC με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά από 48 ώρες θεραπείας GSI κυττάρων Rink-1. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 10% στον έλεγχο σε 28-33% σε GSI επεξεργασμένα κύτταρα. Δεξιό πλαίσιο: GSI επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Rink-1. κύτταρα Rink-1 εκτέθηκαν σε GSI για 72 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με ιστόνης DNA ELISA. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Β, επάνω, αριστερά πάνελ, εισβολή δοκιμασία χρησιμοποιώντας GSI επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν χαμηλή διείσδυση των κυττάρων μέσω της Matrigel επικαλυμμένο με μεμβράνη, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Δεξιά πίνακα: Οι γραφικές παραστάσεις που δείχνουν την αξία του φθορισμού από τα εισέβαλαν κύτταρα Ρολ-1. Οι τιμές δείχνουν τη συγκριτική ποσό των εισέβαλε κύτταρα Ρολ-1. Bottom, τραύματος δοκιμασία επούλωση διεξήχθη για να εκτιμηθεί η ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης. θεραπεία GSI μείωσε την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα Rink-1. C, GSI ανέστειλε την δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA σε κύτταρα Rink-1 όπως αξιολογείται με EMSA. D, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η L-685.458 ανέστειλε την έκφραση Σουρβιβίνης, c-myc, Bcl-2, και τα γονίδια υΡΑ.

Η

Αναστολή της οδού Notch προκαλείται αποπτωτικά κυτταρικό θάνατο σε Ρολ-1 κυτταρική γραμμή

στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν η συνολική αύξηση ανασταλτικές επιδράσεις της GSI είναι εν μέρει οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης, η οποία εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ELISA που βασίζεται. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχονται πειστικά στοιχεία που GSI επαγόμενη απόπτωση σε Rink-1 κυτταρική γραμμή (Σχ. 5Α). Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, χρησιμοποιήσαμε επίσης αννεξίνη μέθοδο V-FITC για να ανιχνευθεί η απόπτωση που επάγεται από GSI για την οποία τα κύτταρα Rink-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GSI για 48 ώρες. Με χρώση των κυττάρων με αννεξίνη V-FITC και ΡΙ, ανάλυση FACS χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση και ποσοτικά προσδιορισμό του ποσοστού των νεκρών, βιώσιμων και αποπτωτικών κυττάρων μετά τη θεραπεία. Βρήκαμε ότι το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 10% στον έλεγχο σε 28-33% σε κύτταρα Rink-1 μετά από αγωγή GSI (Εικ. 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχονται πειστικά στοιχεία που δείχνουν ότι η απενεργοποίηση του μονοπατιού Notch θα μπορούσε να διεγείρει απόπτωση σε Rink-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα.

Αναστολή της οδού Notch μειώθηκε καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και εισβολή

μονοπάτι Notch πιστεύεται ότι είναι κριτικά εμπλέκονται με τις διεργασίες του κυττάρου όγκου εισβολή και μετάσταση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι παγκρεατικών όγκων που προκύπτουν στην ένωση KCI ποντίκια έχουν εκτεταμένη εισβολή των παρακείμενων οργάνων, συμπεριλαμβανομένων του δωδεκαδάκτυλου, του στομάχου, του ήπατος, της σπλήνας και [13]. Για να κατανοήσουμε καλύτερα αν μονοπάτι Notch έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην εισβολή, εξετάσαμε τις επιδράσεις της αδρανοποίησης της οδού Notch επί καρκινικών κυττάρων εισβολή. Βρήκαμε ότι GSI επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν ένα χαμηλότερο επίπεδο διείσδυσης μέσω της μεμβράνης Matrigel επικαλυμμένα σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η αξία του φθορισμού από τις εισέβαλαν Rink-1 καρκινικών κυττάρων μειώθηκε περίπου 5-7 φορές σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 5Β). Προκειμένου να εξετάσει περαιτέρω την επίδραση της GSI για τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, πραγματοποιήσαμε ανάλυση επούλωση των πληγών στα κύτταρα Ρολ-1. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία GSI ανέστειλε την ικανότητα επούλωσης πληγών σε κύτταρα Rink-1 (Εικ. 5Β), υποδηλώνοντας ότι GSI μπορούν να αναστείλουν τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν έναν άμεσο ρόλο της σηματοδότησης Notch στη μετανάστευση Rink-1 καρκινικών κυττάρων και εισβολή, και αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την επιθετικότητα των όγκων που αναπτύσσονται στην ένωση KCI διαγονιδιακό ζώο.

Αναστολή της οδού Notch μειώθηκε ΝΡ-κΒ DNA-δεσμευτική δραστικότητα

Ερευνήσαμε αν η κατάντη επίδραση του Notch-1 ρύθμιση προς τα κάτω ήταν μηχανιστικά σχετίζεται με μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Πυρηνικές πρωτεΐνες από GSI επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση για δραστικότητα ΝΡ-κΒ ρ65 δέσμευσης DNA, όπως μετράται με EMSA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα του GSI ανέστειλε σημαντικά ΝΡ-κΒ ρ65 σύνδεσης DNA σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχ. 5C). Τα αποτελέσματα αυτά προσκόμισαν αποδεικτικά στοιχεία για την υποστήριξη μιας μηχανιστικής στιχομυθία μεταξύ του Notch και NF-κΒ στον καρκίνο του παγκρέατος. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι GSI ανέστειλε ΝΡ-κΒ κατάντη γονιδιακή έκφραση, όπως Survivin, Bcl-2, c-myc, και υΡΑ (Σχ. 5D).

Υπερ-έκφραση του miR-200b αναστέλλεται η την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω Jagged συνδετήρες

Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η miR-200 μέλη της οικογένειας στοχεύουν συστατικά μονοπάτι Notch, όπως Jagged-1 [35], [36]. Προκειμένου να εξετάσει κατά πόσον miR-200 οικογένεια ρυθμίζουν μονοπάτι Notch, εμείς επιμολυσμένα miR-200b πρόδρομα κύτταρα σε Ρολ-1. Επιβεβαιώσαμε ότι η διαμόλυνση των πρόδρομων miR-200b αύξησε το σχετικό επίπεδο miR-200b σε κύτταρα Rink-1 (Σχ. 6Α). Υπερ-έκφραση του miR-200b μείωσε τα σχετικά επίπεδα mRNA του Jagged-1, Jagged-2 και γονίδια στόχους τους σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση RT-PCR (Σχ. 6Α). Τα δεδομένα από την ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι η υπερ-έκφραση του miR-200b μείωσε τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του Jagged-1 και του γονιδίου-στόχου του, όπως Hes-1, Hey-1, και Bcl-2 (Σχ. 6Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-200b ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα Rink-1 (Σχ. 6Β). Στη συνέχεια, ανιχνεύεται το εάν η αναστολή της Jagged-1 θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων. Jagged-1 siRNA μείωσε σημαντικά την έκφραση του Jagged-1 και το στόχο της ΗΕδ-1 και Hey-1 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 6C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η αναστολή της Jagged-1 με Jagged-1 siRNA ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Rink-1 (Σχ. 6C), υποδηλώνοντας ότι Jagged-1 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Α, Αριστερό πλαίσιο, επανέκφραση του miR-200b ιδρύθηκε σε κύτταρα Rink-1 με επιμόλυνση με τον πρόδρομο του. Μέση πάνελ, επανέκφραση του miR-200b δεν ρυθμίζουν την έκφραση των υποδοχέων Notch σε κύτταρα Rink-1. Δεξιό πίνακα, Re-έκφραση του miR-200b ρυθμίζεται η έκφραση του Jagged-1 και Jagged-2 mRNAs στα κύτταρα Ρολ-1. Β, Αριστερά και το μεσαίο πάνελ, επανέκφραση του miR-200b ανέστειλε την έκφραση του Jagged-1 γονιδίων στόχων σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα Rink-1. Δεξιό πίνακα, Re-έκφραση του miR-200b ανέστειλε την δοκιμασία ανάπτυξης Ρολ-1 κυττάρων με δοκιμή ΜΤΤ. C, Αριστερά και το μεσαίο πάνελ, Jagged-1 siRNA ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου Jagged-1 στόχος Hes-1 και Hey-1 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα Rink-1. Δεξιό πίνακα, Jagged-1 siRNA ανέστειλε Ρολ-1 τεστ ανάπτυξη των κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

Συζήτηση

PDAC είναι η τέταρτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες [ ,,,0],1]. Αν και κάποια πρόοδος στη χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και χειρουργική τεχνική, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης για πέντε χρόνια είναι μικρότερη του 4% του συνόλου των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με PDAC [1]. Τα απογοητευτικά αυτά αποτελέσματα δείχνουν ότι οι νέες και εναλλακτικές προσεγγίσεις για την κατανόηση των μηχανισμών της εξέλιξης PDAC είναι αυστηρά απαραίτητη. Τα διαγονιδιακά ποντίκια είναι καλά μοντέλα για τον προσδιορισμό του παθογόνο ρόλο των ειδικών γονιδιακών μεταλλάξεων και των βασικών μονοπατιών σηματοδότησης που σχετίζονται με τον καρκίνο του παγκρέατος.

Είναι γνωστό ότι οι μεταλλάξεις K-ras παρατηρείται σε 80% -90% του καρκίνου του παγκρέατος. Οι ογκογόνοι K-ras εμπλέκεται στην έναρξη ή πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του PDAC. Ως εκ τούτου, οι υπό αίρεση ποντίκια KC θεωρούνται καλά εργαλεία για μηχανιστικές μελέτες του παγκρέατος εξέλιξης του καρκίνου. Από KC ποντίκια μιμούνται αργή εξέλιξη από PanIN σε διηθητικό καρκίνο σε περίπου 12-15 μήνες [6], [37], αλλά τα ποντίκια KC εκτρέφονται με πολλά άλλα διαγονιδιακά ποντίκια έδειξαν ταχεία ανάπτυξη της PDAC. Για παράδειγμα, Smad4 /Dpc4 απλοανεπάρκεια μείωσε τη διάρκεια ζωής των ποντικών KC για διάμεση επιβίωση των περίπου 8 μηνών [10]. LSL- K-ras

G12D? Pdx1-Cre? Trp53R ποντίκια έχουν ένα σημαντικά μικρότερο μέση επιβίωση 5 περίπου μήνες [6]. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ποντικών με KC LKB1 ετεροζυγωτία ήταν 4,5 μήνες [11]. PTEN απλοανεπάρκεια μειωθεί σημαντικά η διάρκεια ζωής των ποντικών ΚΚ σε μια μέση επιβίωση της τάξης του 3,5 μηνών [9]. Η ετεροζυγωτία p21 έκανε τα ποντίκια KC με διάμεση επιβίωση 2,5 μήνες [11]. Ένα μοντέλο ποντικού που έχει ενεργοποιηθεί K-ras και ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ανεπάρκεια είχαν διάμεση επιβίωση σε 2 μήνες [13].