Αφηρημένο

Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας-όπως πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 7 (EGFL7) υπερεκφράζεται σε όγκους του επιθηλίου του ανθρώπου και έτσι είναι μια πιθανή βιοδείκτη για κακοήθεια. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση υψηλού EGFL7 προάγει διείσδυση και την μετάσταση του γαστρικού καρκινώματος. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) ξεκινά την μεταστατικού καταρράκτη και προικίζει τα καρκινικά κύτταρα με διεισδυτική και μεταναστευτική ικανότητα? Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν EGFL7 προωθεί μετάσταση πυροδοτώντας EMT. Βρήκαμε ότι EGFL7 υπερεκφράστηκε σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου (GC) και ότι η υπερέκφραση προωθείται κύτταρο εισβολή και τη μετανάστευση, όπως αποκαλύπτεται από το μηδέν πληγή και επικοινωνούντα προσδιορισμούς μετανάστευσης. Αντιστρόφως, shRNA μεσολάβηση EGFL7 knockdown μειωμένη εισβολή και τη μετανάστευση. Επιπλέον, EGFL7 υπερεκφράζουν κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μεγαλύτερες όγκων και ήταν πιο πιθανό να κάνουν μετάσταση στο ήπαρ σε σύγκριση με υποέκφραση κύτταρα CG μετά από υποδόρια ένεση σε ποντίκια. EGFL7 υπερέκφραση προστατεύεται κυτταρικές σειρές GC κατά anoikis, παρέχοντας ένα εύλογο μηχανισμό για αυτή την ενισχυμένη μεταστατική ικανότητα. Στην τομή ανθρώπινου γαστρικών όγκων, η έκφραση του EGFL7 συσχετίστηκε θετικά με τα επίπεδα έκφρασης του βιμεντίνη μεσεγχυματικών δείκτη και το ΕΜΤ-σχετίζεται μεταγραφή κατασταλτική σαλιγκάρι, και συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση του επιθηλιακού κυττάρου δείκτη Ε-καδερίνης. Σε κυτταρικές σειρές GC, EGFL7 νοκ ντάουν αντιστραφεί μορφολογικά σημάδια της EMT και μειώθηκε τόσο βιμεντίνης και της έκφρασης σαλιγκάρι. Επιπλέον, η υπερέκφραση EGFL7 προωθείται υποδοχέα EGF (EGFR) και πρωτεϊνική κινάση Β (ΑΚΤ) φωσφο-ενεργοποίηση, επιδράσεις αξιοσημείωτα κατέστειλε από τον αναστολέα τυροσίνης κινάσης του EGFR AG1478. Επιπλέον, AG1478 μείωσε επίσης την αυξημένη επεμβατική και μεταναστευτικών ικανότητα των κυττάρων GC γραμμές που υπερεκφράζουν EGFL7. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι EGFL7 προωθεί μετάσταση ενεργοποιώντας EMT μέσω ενός μονοπατιού σηματοδότησης EGFR-AKT-σαλιγκάρι. Η διακοπή της EGFL7-EGFR-AKT-σαλιγκάρι σηματοδότησης μπορεί μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Luo Β-Η, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong Μ, Liu Q-L, et al. (2014) του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα-Like που περιέχει την περιοχή Protein 7 (EGFL7) Ενισχύει EGF υποδοχέα-ΑΚΤ σηματοδότησης, μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος, και μετάσταση των κυττάρων γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

Συντάκτης: Claudia Δ andl, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Νοέμβρη 2013? Αποδεκτές: 19 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81001080) και το Ταμείο Open-End για την πολύτιμη και ακριβείας Όργανα της Κεντρικής Νοτίου Πανεπιστημίου (Αρ JJ3121). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθης όγκος και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2]. Περίπου οι μισές από όλες τις περιπτώσεις GC συμβαίνουν σε χώρες της Ανατολικής Ασίας, με ιδιαίτερα υψηλή συχνότητα εμφάνισης στην Ιαπωνία, την Κορέα και την Κίνα [3], [4]. Η πρόοδος στην συστημική θεραπεία GC έχει αυξηθεί σημαντικά βραχυπρόθεσμη επιβίωση? Ωστόσο, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των ασθενών GC παραμένει χαμηλή λόγω της υποτροπής και μετάσταση [5]. Επιπλέον, οι περισσότεροι ασθενείς με νεοδιαγνωσθέντες GC δείχνουν ήδη μεταστατική νόσο, η οποία αποτελεί μια σημαντική θεραπευτική πρόκληση για τους ογκολόγους [6].

Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας που ομοιάζει πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 7 (EGFL7), επίσης γνωστή ως αγγειακά ενδοθηλιακά στατίνη , είναι ένα ενδοθηλιακό κύτταρο που προέρχεται εκκρινόμενο παράγοντα που ρυθμίζει τον σχηματισμό αγγειακών σωλήνα. Parker et al. [7] κατέδειξε ότι EGFL7 είναι ζωτικής σημασίας για την αγγειογένεση κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης ζέβρα ψάρια [8]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένη έκφραση του EGFL7 σε διάφορες όγκους και καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του νεφρού, κακοήθη γλοιώματα, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και καρκίνους του παχέος εντέρου [7] – [10]. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι EGFL7 επίσης υπερεκφράζεται σε γαστρικό καρκίνωμα [11], και η έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με παθολογική χαρακτηριστικά, κλινική πρόοδο, κακή πρόγνωση και μετάσταση [10], [12]. Ως εκ τούτου, EGFL7 είναι υποψήφια προγνωστικός παράγοντας για την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση. Ωστόσο, οι μηχανισμοί βασίζονται οι ογκογόνο επιδράσεις της EGFL7 είναι ασαφείς.

Η μετάσταση είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει ένα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), στο οποίο πολώνεται τα επιθηλιακά κύτταρα μετατρέπονται σε μεσεγχυματικά κύτταρα [13], ένα φαινότυπο με μεγαλύτερη επεμβατική και μεταναστευτικών ικανότητας [14]. Η ΕΜΤ είναι επίσης μια αναστρέψιμη διαδικασία που συμβαίνει συχνά στο μεταναστευτικό μέτωπο πολλών μεταστατικών καρκίνων [15]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η EGF προάγει μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την ταυτόχρονη εισβολή με την ενεργοποίηση του EMT [16] – [18]. Σημαντικά, EGFL7 περιέχει δύο επικράτειες τύπου EGF, υποδηλώνοντας κάποια λειτουργική ομολογία [9], [12]. Ωστόσο, αν EGFL7 κάνει πραγματικά την ενίσχυση της EMT και να προωθήσει τη μετάσταση καρκίνου του στομάχου έχει ακόμη προσδιοριστεί. Επιπλέον, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους EMT ρυθμίζεται σε GC παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Το δάκτυλο ψευδαργύρου μεταγραφικός καταστολέας σαλιγκάρι είναι κρίσιμη για τον επαναπρογραμματισμό γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, κυρίως για την καταστολή της πρωτεΐνης προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ενδοθηλιακών (Ε) -cadherin, η απώλεια του οποίου θεωρείται ένα σημαντικό πρώιμο γεγονός στην EMT και απαιτείται για τη μεταγενέστερη μετάσταση [ ,,,0],19].

Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να καθορίσει εάν EGFL7 προωθεί μετάσταση πυροδοτώντας EMT. Βρήκαμε ότι EGFL7 υπερέκφραση ενεργοποιεί τον EGFR-AKT οδό, προκαλεί EMT, και προωθεί την εισβολή των κυττάρων GC

in vitro

και μετάσταση

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και συλλογή ιστών

η γαστρική ιστούς καρκινώματος ελήφθησαν από 79 ασθενείς GC (58 άνδρες και 21 γυναίκες) αντιμετωπίζονται με χειρουργική εκτομή στο Τμήμα χειρουργικής, Xiangya Νοσοκομείο, Κεντρική Νότια Πανεπιστήμιο (Κίνα). Χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκαν από τον Ιανουάριο 2010 έως το Δεκέμβριο του 2012. Οι ασθενείς ήταν 54,7 χρόνια παλιά, κατά μέσο όρο (εύρος: 28-82 έτη). Και έλαβε ούτε χημειοθεραπεία ούτε ακτινοβολία πριν από τη χειρουργική επέμβαση

Οι ασθενείς ενημερώθηκαν ότι χειρουργικά δείγματα θα να χρησιμοποιηθεί για συμβατικά παθολογική διάγνωση και ότι οι υπόλοιπες ιστοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα. Τα προσωπικά δεδομένα των ασθενών απαιτήθηκε για τη μελέτη αυτή και τα πρωτόκολλα πραγματοποιηθεί κανένα κίνδυνο, έτσι ώστε μόνο λεκτική συγκατάθεση απαιτήθηκε από τους ασθενείς. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Xiangya Νοσοκομείο, Κεντρική Νότια Πανεπιστήμιο (Αριθμός Άδειας: 201311389).

σταδιοποίηση της νόσου ορίστηκε σύμφωνα με την έκτη έκδοση του συστήματος ΤΝΜ σταδιοποίηση της μεικτής επιτροπής Αμερικής για τον καρκίνο [ ,,,0],20], [21]. Οι όγκοι ήταν καλά διαφοροποιημένα γαστρικό αδενοκαρκίνωμα σε 12 περιπτώσεις, μέτρια διαφοροποιούνται σε 34 περιπτώσεις, και κακώς διαφοροποιούνται σε 33 περιπτώσεις. Όλα τα δείγματα αμέσως σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη, αφυδατωμένα, και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Ακριβής κλινικές πληροφορίες και παθολογική διάγνωση ήταν διαθέσιμα για όλους τους ασθενείς.

Ανοσοϊστοχημεία

Για ανοσοϊστοχημεία, παρασκευάζονται δείγματα επωάστηκαν στους 60 ° C για 15 ώρες και κόπηκαν σε 4 μm πάχους τομές, αποπαραφινοποιήθηκαν σε νέφτι, ξηραίνονται και επανυδατώνονται σε αιθανόλη φθίνουσα: απεσταγμένο νερό κλίση. Η ενδογενής δραστηριότητα υπεροξειδάσης απενεργοποιήθηκε με επώαση για 30 λεπτά σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% σε 0,01 Μ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Οι φέτες στη συνέχεια επωάστηκαν για 15-20 λεπτά σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) στους 95 ° C για ανάκτηση αντιγόνου, αποκλείστηκαν με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε 0,01 Μ PBS για 15 λεπτά στους 37 ° C, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε διαλύματος αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντισώματα αντι-EGFL7 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Abcam, ΗΠΑ, 1:400) και μονοκλωνικά κουνελιού που εγείρεται εναντίον E-cadherin (ΚΣΑ, ΗΠΑ, 1:1000), βιμεντίνη (ΚΣΑ, ΗΠΑ, 1:1000 ), σαλιγκάρι (Proteintech, ΗΠΑ, 1:1000) και CD34 (Boster, Κίνα, 1:500). Μετά την πλύση, τα δείγματα διαδοχικά επωάζονται με βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα και στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση ραφανίδας (HRP) διαλύματος εργασίας αβιδίνη. Ανοσοεπισήμανση οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ υποστρώματος DAB από Zhongshan Χρυσή Γέφυρα Company (Κίνα) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τέλος, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (Vector Laboratories, USA), αφυδατωμένη σε αιθανόλη αύξουσα: απεσταγμένο νερό κλίση, και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια με τη χρήση Permount μέσα στερέωσης (Fisher Scientific, USA)

Ποσοτικοποίηση των Ανοσοϊστοχημική Σημάτων.

Όλα GC και γύρω μη νεοπλασματικών γαστρικού ιστοί επιβεβαιώθηκε ιστοπαθολογικά από δύο ανεξάρτητους παθολόγους (Κ-ΝΔ και J.-HL) τυφλοί στην αρχική διάγνωση. Η ανοσοχρώση βαθμολογήθηκε με μια ημι-ποσοτική μέθοδος που θεωρείται τόσο την ένταση και την κατανομή της χρώσης [22]. Εν συντομία, πέντε τομείς επιλέχθηκαν τυχαία σύμφωνα με χαμηλή μεγέθυνση (100 ×, η Olympus BX51, Τόκιο, Ιαπωνία) και 200 ​​καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν από κάθε πεδίο. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, καμία χρώση? 1, αδύναμη κίτρινη χρώση? 2, η κίτρινη χρώση? 3, καφέ χρώση. Θετικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από σαφή σύνορα και κίτρινο ή καφέ χρώση διακρίνεται από το φόντο. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων (ΡΡ) βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, 0%? 1, 1% -25%? 2, 26% -50%? 3, 51% -75%? 4, 76% -100%. Οι δύο βαθμολογίες συνδυάστηκαν για να ληφθεί η ακόλουθη ταξινόμηση: αρνητική χρώση, δείγματα με ανοσοαντιδραστικές σκορ (IRS) από 0 έως 2? ασθενώς θετική χρώση, δείγματα με IRS από 3 έως 5? έντονα θετική χρώση, τα δείγματα με την IRS από 6 έως 7. Τα δείγματα που έδειξε ασθενώς και ισχυρώς θετική χρώση συμπεριλήφθηκαν στη στατιστική ανάλυση.

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου GC SGC7901 (μέτρια διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα), BGC823 (ελάχιστα διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα), ΜΚΝ28 (καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα), και ΜΚΝ45 (ελάχιστα διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα), καθώς και η κανονική γαστρικό βλεννογόνο επιθηλιακά GES-1 κύτταρα αγοράστηκαν από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco Biocult, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Short φουρκέτας RNA (shRNA) και Recombinant Expression πλασμίδιο Pex-2-EGFL7

Για να δημιουργηθούν κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν ή υποέκφραση EGFL7, η μητρική κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν σταθερώς με έναν φορέα έκφρασης ή στοχευμένη shRNA. Οι ακολουθίες shRNA της ανθρώπινης EGFL7 σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την ακολουθία των ανθρωπίνων EGFL7 DNA (GenBank ΟΧΙ NM_016215.3.) Από Designer 3,0 λογισμικού (Genepharma, https://www.genepharma.com) και αναζητήσεις BLAST (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Οι αλληλουχίες στόχοι συγκρίθηκαν με τη βάση δεδομένων του ανθρώπινου γονιδιώματος με την αναζήτηση BLAST να διασφαλιστεί ότι δεν υψηλή ομολογία με άλλες ακολουθίες κωδικοποίησης. Οι ακολουθίες EGFL7-homo-333 και EGFL7-homo-887 προσδιορίστηκαν ως θέσεις στόχους για μια συγκεκριμένη EGFL7 shRNA. Επιπλέον, ένας μη ειδική ακολουθία (σκαρφάλωμα shRNA) σχεδιάστηκε ως αρνητικός έλεγχος, και η αλληλουχία GAPDH σχεδιάστηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Οι ακολουθίες shRNA είχαν ως εξής:

EGFL7-shRNA1 κατά EGFL7-homo-333: νόημα, 5′-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 ‘? αντινόημα, 5’-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 ‘? EGFL7-shRNA2 κατά EGFL7-homo-887: νόημα, 5’-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 ‘? αντινόημα, 5’-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 ‘? μη ειδική αίσθηση, 5’-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 ‘? αντινόημα, 5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 ‘? GAPDH sense, 5’-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 ‘? αντινόημα, 5’-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 ‘. Η pGPU6 /GFP /Neo (πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, νεομυκίνη) φορέα (Genepharma Εταιρείας, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του πλασμιδίου. Τα νουκλεοτίδια ανασυνδέθηκαν και εισήχθη εντός των θέσεων BamHI και HindIII και μεταμορφώθηκε σε DH5a-ικανά Ε coli. Επελέγησαν Διπλή καναμυκίνη /νεομυκίνη αποικίες ανθεκτικές και οι αλληλουχίες φορέα επιβεβαιώθηκε με πέψη περιορισμού και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.

Το cDNA EGFL7 που κωδικοποιεί την ακολουθία αμινοξέων 533 – 1353 υποκλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακό φορέα ρΕΧ-2 (Genepharma, Σαγκάη, Κίνα) με BglII /EcoRI διπλή πέψη και έχει οριστεί ρΕΧ-2-EGFL7. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ενισχύθηκε σε DH5a-ικανά Ε coli και την ακολουθία του φορέα ενισχύθηκε με PCR. της αλληλουχίας του DNA επιβεβαίωσε ότι το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιείχε ένα θραύσμα του γονιδίου EGFL7 ταυτόσημη με εκείνη στην GenBank (GenBank αρ. NM_016215.3). Καναμυκίνη /επελέγησαν αποικίες ανθεκτικές στη νεομυκίνη και η αλληλουχία επιβεβαιώθηκε με πέψη περιορισμού και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Genepharma (Σαγκάη, Κίνα).

Σταθερή Επιμόλυνση και G418 επιλογή

Για να δημιουργήσετε μια EGFL7-υποέκφραση κλώνος (και κατάλληλο έλεγχο), BGC823 κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι -Καλά πλάκες καλλιέργειας σε 1 × 10

6 /φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα διατηρείται στους 37 ° C. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 4 μg pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-μη ειδική-shRNA, ή pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε G418 (Sigma, ΗΠΑ, 600 μg /ml) για την αρχική επιλογή, αραιωμένα, επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (~ 1 κύτταρο /φρεάτιο) και διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με G418 στο ήμισυ της αρχικής συγκέντρωσης επιλογή για επιπλέον 3 εβδομάδες. Οι προκύπτουσες σταθερές κυτταρικές σειρές ονομάστηκαν BGC2-13 (κυτταρική σειρά που προκύπτει από pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 σταθερή διαμόλυνση) και BGC-NC, και επεκτάθηκαν για μεταγενέστερες μελέτες. Το επίπεδο έκφρασης του EGFL7 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Για τη δημιουργία ενός υπερεκφράζουν γραμμή και συμφωνημένα ελέγχου, τα κύτταρα ΜΚΝ28 ήταν seeded, επιμολυσμένα με 4 μg του ρΕΧ-2-EGFL7 ή ρΕΧ-2 πλασμιδίων, και επιλέγονται όπως περιγράφεται για BGC823 κύτταρα εκτός του ότι 500 μg /ml G418 χρησιμοποιήθηκε για την αρχική επιλογή. Οι προκύπτουσες σταθερές κυτταρικές σειρές ονομάστηκαν ΜΚΝ28-EGFL7 και ΜΚΝ28-NC. Τα επίπεδα έκφρασης του EGFL7 σε G418 ανθεκτικοί κλώνοι αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR).

Ανάλυση Western Blot

Αφού τα κύτταρα έφθασαν το 80% -95% συρροή, συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό εκχύλισης κυτταρολύματος (Beyotime, Κίνα) που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης (1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο). Κυτταρόλυμα συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών δικιγχονινικού οξέος (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (25 μg) από κάθε ομάδα θεραπείας διαχωρίστηκαν ανά λωρίδα πηκτής με 8% νάτριο δωδεκυλ θειικό ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν διαδοχικά με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού αποτελούμενο από ρυθμισμένο με Tris φυσιολογικό ορό (TBS) που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε αυτό το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα με ένα από τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι EGFL7 (1:500? Abcam Cambridge Science, UK). αντι-Ε-καδερίνης, αντι-βιμεντίνη, αντι-Σαλιγκάρι (όλα σε 1:1000? Cell Signaling Technology, CST, USA), αντι-GAPDH (1:10000, Protech), αντι-ΕΟΡΚ, αντι-φωσφο-ΕΟΡΚ, αντι-ΑΚΤ, αντι-φωσφο-ΑΚΤ, αντι-ERK, και αντι-φωσφο-ΕΚΚ (όλα 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Ανοσοσημασμένων μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., USA) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με TBST, πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση του ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση του GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και πρωτεΐνες ποσοτικά χρησιμοποιώντας UTHSCSA εικόνας Εργαλείο 3.0. έκφραση πρωτεΐνης στόχου υπολογίστηκε ως η αναλογία έντασης ζώνη της πρωτεΐνης-στόχου για GAPDH.

RNA Εκχύλιση και PCR ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και ολικό RNA παρασκευάσθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. CDNA πρώτου στελέχους συντέθηκαν με τη PrimeScript RT Kit αντιδραστηρίου με gDNA γόμα (Takara, Otsu, Japan) και ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους ειδικούς εκκινητές: EGFL7 νόημα, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ‘? αντινόημα, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ‘. Το cDNA του GAPDH ενισχύθηκαν για να ελεγχθεί η ποσότητα του cDNA που υπάρχει σε κάθε δείγμα (sense, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘? Αντινόημα, 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’). PCR ενίσχυση διεξήχθη στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 κύκλους των 94 ° C για 30 s, 57 ° C για 30 s, και 72 ° C για 40 s. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1.0% και η έκφραση του γονιδίου-στόχου ποσοτικοποιείται ως η αναλογία της έντασης ζώνης γονίδιο στόχο με εκείνη του GAPDH χρησιμοποιώντας Image Εργαλείο 3.0 (Το Πανεπιστήμιο του Science Center Texas Health, San Antonio, Texas, USA).

real-time PCR

Το μίγμα της αντίδρασης για PCR πραγματικού χρόνου αποτελείται από 10 μΙ Premix Εχ Taq (Probe qPCR), 0.2 μΜ του κάθε EGFL7 και GAPDH εκκινητή (παρακάτω), 0.2 pmol /ανιχνευτές ml TaqMan (EGFL7 ή GAPDH), και 0,4 μl ROX (tetrapropano-6-καρβοξυροδαμίνη) Αναφορά Dye II (Takara Bio, Shiga, Ιαπωνία). Το μίγμα συνδυάσθηκε με 2 cDNA μΙ σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων μικροαμπέρ (Applied Biosystems, CA, USA) και απεσταγμένο νερό χρησιμοποιήθηκε για να προσαρμοστούν σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Οι ακόλουθοι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το Primer Premier πακέτο 6,0 λογισμικού (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: προς τα εμπρός, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ‘? GAPDH: προς τα εμπρός, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘? αντίστροφη, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘. Όλες οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν σε 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). συνθήκες Thermocycle ήταν αρχική μετουσίωση στους 95,8 ° C για 30 s που ακολουθείται από 40 κύκλους ενίσχυσης στους 95,8 ° C για 6 s και 60,8 ° C για 30 s.

παρόμοιες πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η έκφραση άλλων γονίδια με τους ακόλουθους εκκινητές: Ε-καδερίνης: προς τα εμπρός, 5′-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 ‘? αντίστροφη, 5’-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 ‘? βιμεντίνη: προς τα εμπρός, 5’-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 ‘? αντίστροφη, 5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 ‘? Σαλιγκάρι: προς τα εμπρός, 5’-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 ‘? GAPDH: προς τα εμπρός, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘? αντίστροφη, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘. Το μίγμα της αντίδρασης για PCR πραγματικού χρόνου αποτελούνταν από 10 μΐ SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 μΙ εκάστου εκκινητή (0,4 μΜ), 0.4 μΙ ROX Dye Αναφοράς, 2 μΙ cDNA template, και 6 μΐ επεξεργασμένου με πυροανθρακικό διαιθύλιο νερό. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) με τις ακόλουθες συνθήκες thermocycle: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 34 s.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε από το [4,5-διμεθυλο 2-υλο-] τετραζόλιο 3- -2,5 διφαινυλαιθέρες (ΜΤΤ) βιώσιμων κυττάρων. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 2000 /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 12, 24, 48, 72, και 96 ώρες. Στη συνέχεια, 20 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (Sigma) υλικού (5 mg /ml) προστέθηκαν σε 200 μΐ μέσου σε κάθε φρεάτιο, και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες στους 37 ° C. Μετά από προσεκτική αναρρόφηση του μέσου καλλιέργειας, 150 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε εκβάθυνση για να διαλυθεί κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίζεται από ΜΤΤ από βιώσιμα κύτταρα. Οι πλάκες ανακινήθηκαν σε ένα περιστροφικό πλατφόρμα για 10 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

Plate Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 200 /φρεάτιο στην ίδια έξι- φρεατίων όπως χρησιμοποιήθηκε για άλλες αναλύσεις για την αξιολόγηση σχηματισμού αποικίας υπό κυττάρου-προσκολλημένα συνθήκες. Μετά από 10 ημέρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1% Giemsa, και ο αριθμός των ορατών αποικιών μετρήθηκε. Ο δείκτης σχετική σχηματισμό κλώνος υπολογίζεται ως μέσος αριθμός των αποικιών /αριθμός σπαρμένα κύτταρα × 100%.

Ξυστό πληγή Healing Αναλύσεις

Για την ανίχνευση της κυτταρικής μετανάστευσης, 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων επικαλύφθηκαν με 10 μg /ml ινονεκτίνης (FN) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Η μονοστιβάδα στη συνέχεια διακόπτεται από μια ενιαία αρχή χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl. Μικρογραφίες ελήφθησαν στις 0, 12, 24, 36, 48, και 72 ώρες μετά το μηδέν με ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus BX51, Ιαπωνία). Ο αριθμός των κυττάρων εντός του γδαρμένο (άγονη) περιοχή της μικροπλάκας μετρήθηκε σε πέντε πεδία (Μεγέθυνση: χ 200). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν.

In vitro

εισβολή και Μετανάστευση Δοκιμασία

Κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους (Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). δοκιμασίες Εισβολή διεξήχθησαν σε επικοινωνούντα δοχεία που διαχωρίζονται από ένθετα φίλτρο μεμβράνης πολυανθρακικού (8 μm πόρους) για πλάκες 24-φρεατίων. Κάθε θάλαμος επικαλύφθηκε με 100 μΙ 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) σε κρύο RPMI 1640 για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Ακολούθως, τα κύτταρα (5 × 10

4 /ml χ 200 μΙ) σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο σε μέσο χωρίς ορό. Περίπου 800 μΙ μέσου ρυθμισμένο με 10 μg /ml ινονηκτίνης τοποθετήθηκε στο κάτω διαμέρισμα του θαλάμου transwell ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση για 24 ώρες στους 37 ° C, τα υπόλοιπα κύτταρα όγκου επί της άνω επιφάνειας του θαλάμου απομακρύνθηκαν με σκούπισμα με υγρό μπατονέτες. Εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus, Japan) σε 200 χ. Τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν για όλες τις συνθήκες θεραπείας.

In vitro

δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν υπό τους ίδιους όρους με τους προσδιορισμούς εισβολής, αλλά με μη επικαλυμμένα κάτω θαλάμους και χρησιμοποιώντας 1 × 10

5 κύτταρα /ml (200 μλ).

Anoikis Δοκιμασία

πολυ-υδροξυαιθυλ μεθακρυλικό (πολυ-ΗΕΜΑ, Sigma-Aldrich), η οποία αναστέλλει κυτταρική πρόσφυση σε πλάκες καλλιέργειας και άλλες επιφάνειες ανάπτυξη, επανασυστάθηκε σε 95% αιθανόλη σε μια τελική συγκέντρωση των 12 mg /ml. Για την παρασκευή πολυ-ΗΕΜΑ-επικαλυμμένες πλάκες, 2 ml αυτού του διαλύματος προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων και αφέθηκαν να στεγνώσουν όλη τη νύχτα κάτω από μια στρωτή ροή κουκούλα καλλιέργειας ιστού. Στη συνέχεια, 5 × 10

4 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε κάθε πολυ-ΗΕΜΑ επικαλυμμένα καλά με το κανονικό μέσο καλλιέργειας. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν GC, ξεπλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης από ένα αννεξίνης V-ΡΕ /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Τα επαναιωρημένα κύτταρα από κάθε δείγμα δειγματίστηκαν (100 μl) σε τέσσερις σωλήνες. Τρεις σωλήνες σημάνθηκαν είτε με αννεξίνης V-ΡΕ, 7-AAD, ή και τα δύο, ενώ το τέταρτο χρησιμοποιήθηκε ως μη επισημασμένο ελέγχου. Κάθε παρτίδα στη συνέχεια αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ένα Beckman Coulter FC 500 μετρητή (Beckman Coulter, Inc.). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προήλθε ως το άθροισμα των κλασμάτων των κυττάρων που εμφανίζουν πρώιμη απόπτωση (αννεξίνη V-θετικά) και αργά απόπτωση (7-AAD-θετικό).

Ξενομοσχεύματος μοντέλο γυμνού ποντικού

ξενομεταμόσχευση κυτταρικών σειρών GC διεξήχθη σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου (δημοσίευση αρ. 86-23, αναθεωρήθηκε το 1985), εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων και Χρήση του τρίτου Xiangya Νοσοκομείο, Κεντρική Νότια Πανεπιστήμιο ( Κοι.Σ.Π.Ε. [LA] 2013-0010), και ήταν σύμφωνα με σημερινή κινεζική νομοθεσία για την προστασία των ζώων (Κοι.Σ.Π.Ε. [LA] 2013-0010). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί ο αριθμός των ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν και τα βάσανά τους.

Τριάντα-πέντε θηλυκά Balb /c γυμνών ηλικία ποντίκια 4 έως 6 εβδομάδες αγοράστηκαν από Slac Laboratory Animal ΣΙΑ Ε.Π.Ε. (Σαγκάη, Κίνα) και στεγάζονται σε χωριστά αεριζόμενα κλουβιά. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε BGC823, BGC-NC, BGC2-13, ΜΚΝ28, ΜΚΝ28-NC, ΜΚΝ28-EGFL7, και τον έλεγχο των ομάδων PBS (η = 5 ποντικοί /ομάδα). Καλλιεργημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS σε 1 × 10

8 κύτταρα /0.2 ml. Το εναιώρημα εγχύθηκε υποδόρια στο αριστερό άνω άκρο του κάθε γυμνού ποντικού, εκτός από εκείνες στην ομάδα ελέγχου, τα οποία έλαβαν ένεση με 0,2 ml PBS. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε κάθε 3 ημέρες με μέτρηση διαμέτρων του όγκου με καλίμπρες Vernier. Ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: Τηλεόραση (mm

3) = d

2 × D /2, όπου d και D είναι η συντομότερη και τις μεγαλύτερες διαμέτρους, αντίστοιχα. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν σε 4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων, και οι όγκοι εκχυλίστηκαν και ζυγίστηκαν. Όλα τα συκώτια εξετάστηκαν για τη μετάσταση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση. Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και κόπηκαν σε 4 μm πάχους τομές. EGFL7 έκφραση προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) για Windows. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. μέσα Ομάδα συγκρίθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) με Student-Newman-Keuls (SNK) ή ελάχιστη σημαντική διαφορά (LSD) δοκιμασίες για post hoc συγκρίσεις κατά ζεύγη. Ο συντελεστής συσχέτισης Spearman Rank χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των συσχετισμών μεταξύ EGFL7 και EMT σχετίζονται επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε χειρουργικά με εκτομή γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Ένα

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Έκφραση EGFL7 ανυψώθηκε σε ανθρώπινο γαστρικό Καρκίνο Γραμμές κυττάρων

κηλίδος Western και ΚΤ-. PCR πραγματοποιήθηκαν για σύγκριση EGFL7 έκφραση στις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου GC SGC7901, BGC823, ΜΚΝ45, και ΜΚΝ28 με αυτό στο κανονικό γαστρικό βλεννογόνο επιθηλιακά GES-1 κύτταρα. Αυξημένα επίπεδα EGFL7 βρέθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές τέσσερα GC σύγκριση με GES-1, με BGC823 και ΜΚΝ28 εμφάνιση της υψηλότερης και χαμηλότερης έκφραση EGFL7, αντίστοιχα, τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA (Σχήματα 1Α και 1Β). Ως εκ τούτου, BGC823 και ΜΚΝ28 χρησιμοποιήθηκαν σε επόμενα πειράματα για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της έκφρασης EGFL7 στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και μεταστατικό δυναμικό. Εμείς που απασχολούνται σταθερή επιμόλυνση shRNA για να καταστείλει την έκφραση EGFL7 στην BGC823 κύτταρα και σχεδίασε ένα ανθρώπινο EGFL7 πλασμιδίου υψηλής έκφρασης (ρΕΧ-2-EGFL7) για την αύξηση της έκφρασης EGFL7 στο ΜΚΝ28 κύτταρα.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης EGFL7 στις κυτταρικές σειρές GC SGC7901, BGC823, ΜΚΝ45, και ΜΚΝ28, και η κανονική κυτταρική γραμμή γαστρικού GES-1 αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. Οι κυτταρικές σειρές GC έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης EGFL7 από κύτταρα GES-1, με BGC823 κύτταρα που έχουν τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης EGFL7. (Β) qRT-PCR αποκάλυψε ότι BGC823 είχε την υψηλότερη έκφραση EGFL7 mRNA. πειράματα κηλίδος και PCR Western διεξήχθησαν εις τριπλούν, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (C) qRT-PCR έδειξε ότι η αλληλουχία shRNA1 είχε ως αποτέλεσμα 75% αναστολή της έκφρασης EGFL7 mRNA, ενώ η ακολουθία shRNA2 είχε σαν αποτέλεσμα μόνο 30% αναστολή. (D) BGC823 κυτταρικές σειρές σταθερά διαμολυσμένες με pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ή pGPU6 /GFP /Neo-μη ειδική-shRNA χαρακτηρίζονται BGC2-13 και BGC-NC, αντίστοιχα. κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ28 επιμολυσμένα με ρΕΧ-2-EGFL7 ή ρΕΧ-2-μη ειδική χαρακτηρίζονται ΜΚΝ28-EGFL7 και ΜΚΝ28-NC, αντίστοιχα. Έκφραση της πρωτεΐνης EGFL7 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε BGC2-13 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα BGC823 και BGC-NC, και σημαντικά υψηλότερο σε κύτταρα ΜΚΝ28-EGFL7 σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ28 και ΜΚΝ28-NC. επίπεδα (Ε) EGFL7 έκφραση αναλύθηκαν επίσης με qRT-PCR, και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα δεδομένα κηλίδος Western. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερικού ελέγχου τόσο για qRT-PCR και Western blot. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD πειραμάτων εις τριπλούν (*

P

& lt? 0,05).

Η

Κατασκευάσαμε δύο φορείς πλασμιδίου shRNA στόχευση EGFL7 mRNA και διεξάγεται qRT-PCR για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των αυτά τα υποψήφια shRNA ακολουθίες για να καταστείλει EGFL7 σε σύγκριση με μη ειδικές ακολουθίες. Οι αλληλουχίες shRNA1 και shRNA2 επιτευχθεί το 75% και 30% αναστολή της EGFL7, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C), έτσι ώστε η πιο αποτελεσματική shRNA1 χρησιμοποιήθηκε για όλα τα επόμενα πειράματα. Οι γραμμές BGC823 σταθερά επιμολυσμένα με pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ή pGPU6 /GFP /Neo-μη ειδική-shRNA ορίστηκαν BGC2-13 και BGC-NC, αντίστοιχα. Οι γραμμές ΜΚΝ28 σταθερά επιμολυσμένα με ρΕΧ-2-EGFL7 και ρΕΧ-2-μη ειδικές ορίστηκαν ΜΚΝ28-EGFL7 και ΜΚΝ28-NC, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης EGFL7 και mRNA σε G418 ανθεκτικοί κλώνοι αξιολογήθηκαν επίσης με στύπωμα Western (Σχήμα 1 D) και πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 1 Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν αξιοσημείωτα μειωμένη EGFL7 έκφραση σε BGC2-13 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα BGC-NC και σημαντικά αυξημένη έκφραση σε κύτταρα ΜΚΝ28-EGFL7 σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ28-NC (όλα

P

& lt? 0,05). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης μεταξύ των κυττάρων BGC-NC και BGC ή μεταξύ των κυττάρων ΜΚΝ28-NC και ΜΚΝ28 (όλα

P

& gt? 0,05).

EGFL7 Προωθείται GC κυττάρων Εισβολή και μετανάστευση, αλλά δεν επηρέασε GC

κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Για να διερευνήσουν το ρόλο της EGFL7 στην εξέλιξη GC, εξετάσαμε πρώτα αν EGFL7 σιγαστήρα ή υπερέκφραση αλλάξει την πολλαπλασιαστική, επεμβατικές και μεταναστευτικά ικανότητες των κυττάρων GC. επούλωση πληγών Scratch χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η μετανάστευση των σταθερώς επιμολυσμένων κυττάρων. Μια πληγή δημιουργήθηκε σε GC μονοστοιβάδες κυττάρων από ένα μόνο μηδέν και ο αριθμός των κυττάρων στην ζώνη μηδέν σύγκριση σε 0 και 48 ώρες. Το κλείσιμο της πληγής ήταν σημαντικά πιο αργή σε BGC2-13 καλλιέργειες (υποέκφραση EGFL7) σε σύγκριση με μητρική BGC823 και πολιτισμών BGC-NC (32%

vs.

100% και 98%, και τα δύο

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, κλείσιμο ήταν σημαντικά πιο γρήγορα σε ΜΚΝ28-EGFL7 καλλιέργειες (που υπερεκφράζουν EGFL7) σε σύγκριση με ΜΚΝ28 και ΜΚΝ28-NC καλλιέργειες (99%

vs.

49% και 50%, και τα δύο

P

& lt ? 0,05) (Σχήμα 2Β). Wu et al.