Αφηρημένο

Ιστορικό

γαστρικού καρκίνου εξακολουθεί να είναι μία από τις πλέον θανατηφόρες των καρκίνων στον κόσμο και ως εκ τούτου, την αναγνώριση των νέων φαρμάκων που στοχεύουν αυτό το είδος καρκίνου είναι επομένως μεγάλης σημασίας. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστούν και να επικυρώσει ένα θεραπευτικό παράγοντα που θα μπορούσε να βελτιώσει τα αποτελέσματα για τους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου στο μέλλον.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών, δημιουργήσαμε ένα γονίδιο προφίλ έκφρασης του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ειδικά γονίδια από δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ιστό. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το προφίλ σε Συνδεσιμότητα Χάρτης ανάλυση του Ινστιτούτο Broad να εντοπίζει υποψήφιων θεραπευτικών ενώσεων για καρκίνο του στομάχου. Βρήκαμε τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης vorinostat ως κύριος ένωσης και έτσι μία πιθανή θεραπευτική φάρμακο για τον καρκίνο του στομάχου. Vorinostat επάγεται τόσο απόπτωση και αυτοφαγία σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Φαρμακολογικές και γενετική αναστολή της αυτοφαγία ωστόσο, αύξησε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του vorinostat, υποδεικνύοντας ότι ένας συνδυασμός με αναστολείς vorinostat autophagy μπορεί θεραπευτικώς να είναι πιο ευεργετικό. Επιπλέον, η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του στομάχου εντόπισε συλλογή των γονιδίων (

ITGB5, Tyms, ΜΥΒ, APOC1, CBX5, PLA2G2A,

και

KIF20A

) των οποίων η έκφραση ανυψώθηκε σε γαστρικό ιστό του όγκου και μειωτικά περισσότερο από 2 φορές με κατεργασία vorinostat σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Σε αντίθεση,

SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1,

και

NQO1

εκδηλώνεται μια αντιστραφεί μοτίβο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Δείξαμε ότι η ανάλυση της γονιδιακή υπογραφή της έκφρασης μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια αναδυόμενη προσέγγιση για να ανακαλύψετε θεραπευτικοί παράγοντες για καρκίνο του στομάχου, όπως vorinostat. Η παρατήρηση της τροποποιημένης γονιδιακής έκφρασης μετά τη θεραπεία vorinostat μπορεί να παρέχει την ένδειξη για τον προσδιορισμό του μοριακού μηχανισμού της vorinostat και εκείνους τους ασθενείς που ενδέχεται να ωφεληθούν από τη θεραπεία vorinostat

Παράθεση:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Πάρκο YY, Kim K, Kim SB, et al. (2011) έκφραση γονιδίων Υπογραφή ανάλυση εντοπίζει Vorinostat ως θεραπεία υποψήφια για τον καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10.1371 /journal.pone.0024662

Επιμέλεια: David L. McCormick, IIT Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Μάρτη 2011? Αποδεκτές: 16 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπ 2011

Copyright: © 2011 Claerhout et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση SC ως Οδύσσεια Fellow υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Οδύσσεια και τον Θεόδωρο Ν νόμου Κληροδότημα για επιστημονικό επίτευγμα στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από τα ταμεία από το 2009 Internal Medicine Ακαδημαϊκό Ταμείο Έρευνας και Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (Νο 2010-0024248). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1], με συνολική επιβίωση των 10 περίπου μηνών [2] – [4]. Η θεραπεία για καρκίνο του στομάχου μπορεί να περιλαμβάνει χημειοθεραπεία, χειρουργείο και θεραπεία ακτινοβολίας. Δυστυχώς, η τρέχουσα χημειοθεραπεία με βάση θεραπείες για τον προχωρημένο καρκίνο του στομάχου αποδείξει απογοητευτικά αποτελέσματα [2] – [4]. Πράγματι, πλήρεις υφέσεις είναι σπάνια ή μόνο διαρκέσει πολύ σύντομα.

Πολλά στοχευμένων παραγόντων που προσδίδουν πλεονεκτήματα επιβίωσης σε άλλους τύπους καρκίνου ήταν υπό έρευνα για τον καρκίνο του στομάχου. Ενώ ορισμένες πρώιμες κλινικές μελέτες με χρήση υποδοχέα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR) και επιθηλιακά υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR) -1 αναστολείς, όπως cetuximab και bevacizumab, έδειξαν κάπως δραστηριότητα, υπάρχει σπάνια πραγματικό πλεονέκτημα επιβίωσης για τους ασθενείς [5] , [6]. Ένας από τους λόγους μπορεί να είναι ότι οι μελέτες αυτές δεν επιλέξετε τους ασθενείς ανάλογα με την παρουσία των βιοδεικτών. Πρόσφατα, η τραστουζουμάμπη για Γαστρικό Καρκίνο (ToGA) δίκη σημειωθεί ότι η προσθήκη της τραστουζουμάμπης στη χημειοθεραπεία οδήγησε σε στατιστικά σημαντική βελτίωση στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) του 20% περίπου των ασθενών με διάχυτη γαστρική και γαστροοισοφαγική (GE) όγκους που υπερεκφράζουν HER2 διασταύρωση [7]. Αυτό υπογραμμίζει την ανάγκη για στοχευμένη βιολογική θεραπεία και την αναζήτηση για βιοδείκτες για την επιλογή ασθενών για τις κλινικές δοκιμές που μπορεί να ωφελήσει την επιβίωση. Παρά την απόδειξη πιθανών στόχων, συμπεριλαμβανομένων των HER2 [8], [9], η αποτελεσματικότητα αυτών των βιολογικώς στοχευμένες θεραπείες δεν είναι γνωστή και υπάρχει έλλειψη ενός προτύπου στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του στομάχου. Λόγω της βιολογικής ετερογένεια των γαστρικών καρκίνων, είναι απίθανο ότι υπάρχει ένας μόνο θεραπεία »μαγική σφαίρα». Μοριακοί δείκτες θα είναι επομένως σημαντικό στο μέλλον να προβλέψει τα αποτελέσματα των ασθενών και την προσαρμογή θεραπείες ανάλογα με τις ατομικές βιολογία.

Στην αναζήτηση για βιοδείκτες, η ανάλυση του γονιδίου υπογραφή έκφραση έχει χρησιμοποιηθεί σε ποικίλες εφαρμογές, όπως για την αποσαφήνιση της μηχανισμούς των βιολογικών οδών [10], ταξινόμησης υπότυποι της νόσου [11], η πρόβλεψη πρόγνωση του καρκίνου του [12] και προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση προς ειδικά φάρμακα [13], [14]. Γονιδιακή ανάλυση υπογραφή της έκφρασης μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας την ευρεία Ινστιτούτου Συνδεσιμότητα Χάρτης (https://www.broadinstitute.org/cmap). Η Χάρτης Συνδεσιμότητα έχει ως στόχο να δημιουργήσει ένα χάρτη που συνδέει τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που συνδέονται με την ασθένεια προς αντίστοιχες μοτίβα που παράγονται από υποψήφια φάρμακα και γενετικούς χειρισμούς [15], [16]. Αυτή η προσέγγιση συστημάτων επιτρέπει ενώσεις που θα εξεταστούν κατά υπογραφές ασθένεια γονιδιώματος σε επίπεδο, αντί για μία προεπιλεγμένη σειρά των γονιδίων στόχων. Τα φάρμακα σε συνδυασμό με τις ασθένειες, χρησιμοποιώντας εξελιγμένες μεθόδους μοτίβο αντιστοίχισης με υψηλό επίπεδο ανάλυσης και εξειδίκευσης. Παρά το γεγονός ότι αφήνει πολλά αναπάντητα ερωτήματα, ο χάρτης Συνδεσιμότητα έχει δείξει ότι η γονιδιωματική ανάλυση υπογραφή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αναγνωρίσει τα ναρκωτικά με κοινούς μηχανισμούς των δράσεων, να ανακαλύψουν άγνωστες μηχανισμούς δράσης και τον εντοπισμό δυνητικών νέων θεραπευτικών [15], [16].

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστούν πιθανές νέες θεραπευτικές ουσίες για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. Για να γίνει αυτό, αναλύσαμε πρώτα την γενωμική υπογραφή του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. Η προκύπτουσα γαστρική γονίδιο του καρκίνου του υπογραφή στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε

in silico

χρησιμοποιώντας Συνδεσιμότητα Χάρτης ανάλυση για τον προσδιορισμό θεραπευτικών παραγόντων που θα μπορούσαν ενδεχομένως να είναι αποτελεσματικό ενάντια σε αυτόν τον τύπο καρκίνου. Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω την κορυφή στόχευση φαρμάκων για την αποτελεσματικότητά της στην γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Βρήκαμε ότι η vorinostat, ως δυνητικό νέο φάρμακο, που επάγεται τόσο απόπτωση και αυτοφαγία στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Μαζί, η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι η ανάλυση Συνδεσιμότητα χάρτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση θεραπευτικών παραγόντων που μπορεί να είναι επιτυχής στην θεραπευτική αγωγή ενός υποσυνόλου των γαστρικών καρκίνων.

Μέθοδοι

Ανάλυση των στοιχείων μικροσυστοιχιών

Για την ανάλυση Συνδεσιμότητα Χάρτης, χρησιμοποιήσαμε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών 65 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των 65 καρκίνων και 19 κανονικό γαστρικό ιστούς, τα οποία ελήφθησαν από την προηγούμενη εργασία μας, τα δεδομένα Yonsei [17]. δείγματα όγκων συλλέχθηκαν από ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε γαστρεκτομή ως κύρια θεραπεία. Δείγματα ιστών εξετάστηκαν από παθολόγους κατά τη στιγμή της συλλογής και αποθηκεύονται σε -80 ° C στην τράπεζα ιστών μέχρι την έναρξη του πειράματος. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα φρέσκα-κατεψυγμένα ιστών με τη χρήση ενός mirVana RNA kit επισήμανσης απομόνωση (Ambion, Inc.). Πρωτογενή δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμο στο Gene Expression NCBI του Omnibus δημόσια βάση δεδομένων (πλατφόρμα μικροσυστοιχιών, GPL6884? Δεδομένων μικροσυστοιχιών, GSE 13861). Ένα άλλο προφίλ γονιδιακής έκφρασης αποκτήθηκε από 69 δείγματα γαστρικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων 38 καρκίνου και 31 μη καρκίνο του στρώματος, της βάσης δεδομένων του Στάνφορντ Microarray (https://smd.stanford.edu, GSE13911), τα δεδομένα του Στάνφορντ. Γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένα γονίδια επιλέχθηκαν με BRB-ArrayTools έκδοση 3.6.1 (βιομετρικά Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). σύγκριση τάξη με τη χρήση δύο δειγμάτων t-test (σημασία & lt? 0.001, 10.000 τυχαία μετάθεση) προσδιορίζονται γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένα γονίδια και τα γονίδια των οποίων η έκφραση σημαίνει εντάσεις τροποποιήθηκαν από τουλάχιστον δύο φορές-σε σύγκριση με μέση φυσιολογική έκφραση του γονιδίου ιστό επελέγησαν

.

Συνδεσιμότητα Χάρτης ανάλυση

Για τον εντοπισμό δυνητικών φάρμακα που στοχεύουν γαστρικό καρκίνο, τις λίστες γονιδίων των κορυφαίων 500 έως ρυθμιζόμενη και η κορυφή 500 προς τα κάτω γονιδίων που ρυθμίζονται από τις γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένα γονίδια χρησιμοποιήθηκαν (Πίνακας S1). Η ανάλυση Συνδεσιμότητα Χάρτης διεξήχθη μέσω του Web Interface (https://www.broadinstitute.org/cmap) χρησιμοποιείτε την έκδοση, την κατασκευή 02, το οποίο περιέχει περισσότερα από 7.000 προφίλ έκφρασης που εκπροσωπούν αποτελέσματα των 1.309 ενώσεων σε διάφορα καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα [15], [16]. Ο χάρτης δείχνει Συνδεσιμότητα λειτουργικές συνδέσεις μεταξύ των φαρμάκων, τα γονίδια και την ασθένεια. Φάρμακα που παράγουν ασθένεια που μιμείται υπογραφές γονιδίου μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό οδών που αποτελούν πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για την εν λόγω νόσο. Αντιστρόφως, τα φάρμακα που επάγουν μια «αντίστροφη» υπογραφή, δηλ αλλαγές στην έκφραση γονιδίων σε κατεύθυνση αντίθετη με αυτή που παρατηρήθηκε στην κατάσταση ασθένειας, θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν νέα θεραπευτικά μέσα. Υποψήφιοι παράγοντες έναντι μιας συγκεκριμένης ασθένειας μπορεί να αναγνωριστεί από την εφαρμογή της νόσου συγκεκριμένο προφίλ γονιδιακής έκφρασης με την ανάλυση σύνδεσης χάρτη. Έχουμε επιλέξει υποψήφια φάρμακα για την επικύρωση

in vitro

βάσει της βαθμολογίας συνδεσιμότητας, η συσχέτιση και P-αξίας.

Χημικά και καλλιέργεια κυττάρων

Vorinostat λήφθηκε από τη Merck και παρασκευάζεται ως διάλυμα αποθέματος εντός διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO). Χλωροκίνη και βαφιλομυκίνης Α1 (Sigma) διαλύθηκαν σε αντίστοιχα νερό και DMSO. Ανθρώπινα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS, ΝΟΙ-Ν87, και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις τους. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε

2.

Η κυτταρική ανάπτυξη, τη βιωσιμότητα και τον κυτταρικό κύκλο 5% CO δοκιμασίες

τετραζολίου δοκιμασία -2,5-διφαινυλ βρωμιούχο (ΜΤΤ)

Για την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ), ΜΤΤ διαλύθηκε σε PBS στα 5 mg /ml. Περίπου 5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις vorinostat ή DMSO. Μετά από 72 ώρες, προστέθηκαν 20 μΙ διαλύματος ΜΤΤ και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Μετά την επώαση, 100 μΐ DMSO προστέθηκαν για να διαλυθεί το φορμαζάνης, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρικό αναγνώστη μικροπλακός (Vmax κινητική συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών, Molecular Devices). Τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Για κρύσταλλο ιώδες χρώση, τα κύτταρα κατεργάστηκαν για 12 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες (σε 20% μεθανόλη και 80% διπλά απεσταγμένο νερό). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Το υπόλοιπο ιώδες κρύσταλλο εκχυλίζεται σε οξικό οξύ για 5 λεπτά, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρικό αναγνώστη μικροπλακός.

Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με vorinostat για 72 ώρες. Τα προσκολλημένα κύτταρα στη συνέχεια αποσπάστηκαν από τα τρυβλία καλλιέργειας με θρυψινοποίηση και συνδυάζεται με επιπλέοντα κύτταρα, φυγοκεντρήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 500 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) -αποκλειστικός διάλυμα (δεν διείσδυσης κυττάρων μεμβράνη) για 15 λεπτά στους 4 ° C. Χρωματισμένα κύτταρα παρακολουθήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα επωάστηκαν με vorinostat για 24 ώρες, συλλέχθηκαν και αιωρήθηκαν σε 500 μΙ υποτονικού διαλύματος (0,1% κιτρικό νάτριο, 0,1% Triton Χ-100, 100 μg /ml RNase και 50 μg /ml ΡΙ) για 15 λεπτά στους 4 ° C. ΡΙ-χρώση κυττάρων παρακολουθήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με λογισμικό multicycle AV.

πειράματα

απομόνωση RNA και μικροσυστοιχιών

απομόνωση RNA και τα πειράματα μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, με ή χωρίς θεραπεία vorinostat χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης mirVana RNA (Ambion, ΤΧ, USA). Η ακεραιότητα του μεγάλου κλάσματος RNA προσδιορίσθηκε με μία Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) ως υποκατάστατο για τον έλεγχο της ποιότητας του mRNA. Ολικό RNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε με BeadChips έκφραση V.3 ανθρώπινη HT12 σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Illumina, CA, USA). Μετά τα BeadChips σαρώθηκαν με Illumina BeadArray Reader, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο quantile εξομάλυνση στα μοντέλα Γραμμική για το πακέτο μικροσυστοιχιών δεδομένων στον τομέα της Ε γλωσσικό περιβάλλον [18]. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε γονιδίου μετατράπηκε σε ένα ημερολόγιο

2 βάσης πριν από την περαιτέρω ανάλυση. ανάλυση Cluster έγινε με Cluster και Treeview [19].

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα αποξέστηκαν σε μέσο και περιδινήθηκαν, και οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA και 10 mM πυροφωσφορικού νατρίου (ρΗ 7.4)) που περιέχει 100 mM NaF, 10% γλυκερίνη, 1.5 mM MgCl

2, 1% Triton Χ-100 και αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Τα εκχυλίσματα επωάστηκαν σε πάγο για 20 λεπτά και στροβιλίστηκαν σε 20.800 g για 20 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BCA αντιδραστηρίου ανάλυσης πρωτεΐνης (Pierce). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση μέσω SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Hybond-C Σούπερ (Amersham Pharmacia Biotech). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween-20 και 5% άπαχο ξηρό γάλα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA σε 1 χ Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα συν 0,1% Tween-20. χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα για LC3 (Novus Biologicals), ενεργό κασπάσης-3 (Epitomics) και Ρ62 (BD Biosciences). Αντισώματα προς α-τουμπουλίνης και Beclin-1 ήταν από την Cell Signaling Technology? αντισώματος προς β-ακτίνη ήταν από τη Sigma. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Cell Signaling Technology). πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (GE Healthcare).

siRNA επιμόλυνση

Η αλληλουχία στόχος siRNA για Beclin-1, nontargeting siRNA (Risc δωρεάν) και Dharmafect 1 ήταν αγοράζονται από Dharmacon. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους των 10 cm και επιμολύνθηκαν με siRNA 24 ώρες αργότερα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και εμβολιάστηκαν σε 6-cm ή 96 φρεατίων για να ληφθεί η ίδια απόδοση διαμολύνσεως. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης καθορίστηκαν με ανάλυση στυπώματος western.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 3% γλουταραλδεϋδη συν 2% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού, ρΗ 7,3, για 1 ώρα. Μετά τη σταθεροποίηση, τα δείγματα πλύθηκαν και κατεργάστηκαν με 0,1% Millipore-φιλτράρεται κακοδυλικό ρυθμιστικό ταννικό οξύ, μετασταθεροποιήθηκε με 1% τετροξείδιο του οσμίου ρυθμιστικό για 30 λεπτά, και χρωματίστηκαν en bloc με 1% Millipore-φιλτράρεται οξικό ουρανύλιο. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, διεισδύσει, και ενσωματωμένο σε μέσο LX-112. Τα δείγματα πολυμερίζονται σε ένα φούρνο 70 ° C για 2 ημέρες. Εξαιρετικά λεπτές τομές κόβονται σε μικροτόμο Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο σε ένα χρώσης Leica ΕΜ, και εξετάστηκαν σε ένα JEM 1010 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEOL, USA, Inc., Peabody, ΜΑ ) σε μία επιταχυνόμενη τάση των 80 kV. Ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ΑΜΤ Σύστημα Απεικόνισης (Advanced Μικροσκοπία Τεχνικές Corp, Danvers, ΜΑ).

Αποτελέσματα

υπογραφή γονιδιακή έκφραση του γαστρικού καρκίνου

Ο Πίνακας 1 παρουσιάζει τα χαρακτηριστικά της οι ασθενείς από τα δεδομένα Yonsei [17]. Γαστρικών καρκίνων ήταν ως επί το πλείστον βρίσκονται στην άπω στομάχου και του σταδίου III /IV. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης αυτών των ασθενών, βρήκαμε 3360 γονίδια όγκου-ειδικά των οποίων σημαίνει έκφραση εντάσεις τροποποιήθηκαν από τουλάχιστον δύο φορές σε σύγκριση με μέση φυσιολογική έκφραση γονιδίου ιστού (

P

& lt? 0.001, Εικόνα S1 ). Αυτό το σύνολο των 3.360 γονιδίων (π.χ. γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένη υπογραφή) χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω

in silico

έλεγχο για πιθανά θεραπευτικά φάρμακα για τον καρκίνο του στομάχου.

Η

ανάλυση Συνδεσιμότητα Χάρτης εντοπίζει πιθανούς φάρμακα που στοχεύουν γαστρικό καρκίνο

Για τον εντοπισμό δυνητικών φάρμακα που στοχεύουν καρκίνο του στομάχου, το γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένη υπογραφή χρησιμοποιήθηκε ως ερώτημα εισόδου σε Συνδεσιμότητα χάρτη, όπως περιγράφεται στην ενότητα «μέθοδος». Ψάξαμε ειδικά για ενώσεις που είχαν μια υπογραφή αντιστρόφως ανάλογη με το γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένη υπογραφή και προσδιόρισε πολλαπλά φάρμακα τα οποία συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Η κατάταξη των υποψήφιων παραγόντων καθορίστηκε με βάση την αντίστροφη τιμή συσχέτισης και p-value. Πίνακας 2 (στήλες 2-4) δείχνει την υψηλότερη κατάταξη ενώσεων από τα δεδομένα Yonsei. ανάλυση συνδεσιμότητα Χάρτης αποκάλυψε ότι δεακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολείς, συμπεριλαμβανομένων vorinostat και τριχοστατίνη Α αντιπροσωπεύουν εν δυνάμει υποψήφιες χώρες για τη στόχευση του καρκίνου του στομάχου. Η LY294002 αναστολέα φωσφατιδυλινισιτολο-3 κινάσης, ο τριφλουοπεραζίνη φαινοθειαζίνη και ο αναστολέας πρωτεΐνης θερμικού σοκ tanespimycin ταυτοποιήθηκαν επίσης ως παράγοντες υποψήφιος στόχος για καρκίνο του στομάχου. Στη συνέχεια, επικυρώνονται τα ευρήματά μας χρησιμοποιώντας ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων προφίλ γονιδιακής έκφρασης από το Stanford Microarray Database (Πίνακας 2? Stanford Data? Στήλες 5-7). Συνδεσιμότητα ανάλυση Χάρτης αυτού του συνόλου δεδομένων επιβεβαίωσε vorinostat ως κορυφαία υποψήφιος. Εν κατακλείδι, Συνδεσιμότητα Χάρτης ανάλυση εντόπισε vorinostat ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τον καρκίνο του στομάχου.

Η

Vorinostat παρουσιάζει θεραπευτική αποτελεσματικότητα

in vitro

σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του στομάχου

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του vorinostat, εκτιμήσαμε την ανάπτυξη καθιερωμένων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (AGS, ΚΑΤΟ-ΙΙΙ, και NCI-Ν87) μετά τη θεραπεία vorinostat 72 h με ΜΤΤ δοκιμασία. Σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα, vorinostat ανέστειλε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε όλες τις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (Σχήμα 1Α). Επιβεβαιώσαμε τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων με ανάλυση κυτταρικού κύκλου του AGS και ΚΑΤΩ-III καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε ότι η θεραπεία με vorinostat (5 μΜ) για 24 ώρες προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση στην υπο-G1 αναλογία των κυττάρων σε σύγκριση με το AGS ελέγχου (2.3 ± 0.07% έναντι 39,2 ± 0,99%, αντίστοιχα?

P

& lt ? 0,01), υποδεικνύοντας την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 1Β). Αντίθετα, η υπο-G1 ποσοστό των vorinostat επεξεργασμένων κυττάρων ΚΑΤΩ-III δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 1Β), ενώ το ποσοστό των κυττάρων G2 /M αυξήθηκαν σημαντικά (21,4 ± 1,91% έναντι 29,3 ± 0,35%?

P

= 0,044), ενδεικτική για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου. Δοκιμάσαμε την περαιτέρω βιωσιμότητα των κυττάρων με τη χρήση PI-αποκλεισμού. Εμείς αντιμετωπίζονται AGS και κυττάρων ΚΑΤΟ-ΙΙΙ με 5 μΜ vorinostat για 72 ώρες και τους αξιολογείται με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 1 C). Η ποσότητα των νεκρών κυττάρων, τα οποία έχουν χαμηλή εμπρόσθια σκέδαση και υψηλή πλευρική σκέδαση, ήταν σημαντικά αυξημένη σε AGS κύτταρα (12.4 ± 4.3% έναντι 79.4 ± 5.7%), και επίσης σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (8.7 ± 0,6% έναντι 46,8 ± 2,1%). Αναλύσαμε τελικά την επαγωγή απόπτωσης μετά τη θεραπεία vorinostat σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ με χρήση ανοσοαποτύπωσης. Vorinostat αυξημένη απόπτωση, όπως αξιολογείται με κασπάση-3 διάσπαση, σε AGS κύτταρα και σε μικρότερο βαθμό σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ (Σχήμα 1 D).

(Α) προσδιορισμοί ΜΤΤ Διεξήχθησαν μετά από επώαση του AGS, KATO- III, και NCI-Ν87 με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις vorinostat για 72 ώρες. (Β) Μεταβολή του κυτταρικού κύκλου με vorinostat αξιολογήθηκε με ενεργοποιούμενη με φθορισμό κυτταρική διαλογή (FACS) του ΡΙ χρώση κυττάρων σε επεξεργασία με 5 μΜ vorinostat για 24 ώρες. (C) τεστ βιωσιμότητας χρησιμοποιώντας PI αποκλειστική λύση. AGS και ΚΑΤΩ-ΙΙΙ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ vorinostat για 72 ώρες και αξιολογήθηκε με FACS. Στο αντιπροσωπευτικό οικόπεδο, τα νεκρά κύτταρα εκδηλώνεται ως κουκίδες με χαμηλή εμπρόσθια σκέδαση και υψηλή πλευρική σκέδαση. (D) ανάλυση κηλίδας Western των δραστικής κασπάσης-3 από AGS και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ γαστρικό καρκίνο κύτταρα χωρίς ή με 5 μΜ θεραπεία vorinostat. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. *,

P

& lt? 0,05. Στο γράφημα ράβδων, δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή + SD (τυπική απόκλιση).

Η

Εν περιλήψει, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι vorinostat έχει αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα επί κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου με την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα AGS και G2 /M κελί σύλληψη του κύκλου σε κύτταρα ΚΑΤΩ-III.

Παγκόσμια ανάλυση γονιδιακής έκφρασης του γαστρικού γραμμές AGS καρκινικών κυττάρων και ΚΑΤΩ-ΙΙΙ μετά τη θεραπεία vorinostat

για να αναλυθεί η επίδραση της vorinostat στην παγκόσμια έκφραση των γονιδίων, AGS και ΚΑΤΩ-III γαστρικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ vorinostat για 48 ώρες και η ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε. Χωρίς επίβλεψη ανάλυση διασποράς των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μετά τη θεραπεία vorinostat έδειξε ότι AGS και ΚΑΤΩ-III κυττάρων συγκεντρωμένα με την ίδια κυτταρική σειρά, ανεξάρτητα από τη θεραπεία vorinostat (Εικόνα 2Α). Επειδή autophagy έχει αναφερθεί ότι έχει ένα ρόλο στην προκαλούμενη από vorinostat επιδράσεις σε άλλους καρκίνους [20], [21], πραγματοποιήσαμε εποπτευόμενη ανάλυση του συνόλου γονιδίου autophagy σχετίζονται (80 γονίδια και 149 ιχνηλάτες? Πίνακας S2). Vorinostat επεξεργασμένο κυτταρικές σειρές καρκίνου του στομάχου ήταν συγκεντρωμένα (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι η επαγωγή της αυτοφαγία είναι μια σημαντική ιδιότητα της vorinostat στο γαστρικό γραμμές καρκίνου.

(Α) Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από AGS και ΚΑΤΩ III πριν και μετά τη θεραπεία vorinostat 5 μΜ για 48 ώρες. Επελέγησαν γονιδίων με ένα επίπεδο έκφρασης που έχει τουλάχιστον 2-πλάσια διαφορά σε σχέση με την μέση τιμή κατά μήκος των κυτταρικών γραμμών σε τουλάχιστον 2 συστοιχίες για ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (3646 χαρακτηριστικά γονίδιο). (Β) επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση με γονίδια που σχετίζονται με την αυτοφαγία (149 ανιχνευτές) της ΕΕΑ και ΚΑΤΩ ΙΙΙ μετά τη θεραπεία vorinostat.

Η

Η αναστολή της αυτοφαγία ενισχύει την αποτελεσματικότητα vorinostat στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Δεδομένου ότι autophagy μπορεί να έχει ένα ρόλο τόσο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και του καρκίνου κυτταρικό θάνατο μετά από τη θεραπεία του φαρμάκου [22], [23], αξιολογήσαμε περαιτέρω τη συμβολή της διαδικασίας αυτής για την επίδραση της vorinostat επί κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου. Αξιολογήσαμε λειτουργικά αυτή τη διαδικασία με ανάλυση ανοσοαποτυπώματος του δείκτη αυτοφαγία μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1 ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3). Vorinostat-επεξεργασμένα κύτταρα ΚΑΤΩ-III, και σε μικρότερο βαθμό AGS κύτταρα, έδειξε σαφή συσσώρευση της ταχύτερης-μεταναστεύουν λιπιδιωμένη μορφή LC3 (LC3-II) (Εικόνα 3Α). Συσσώρευση LC3-ΙΙ μπορεί να προκύψει από είτε προς τα πάνω ρύθμιση του autophagosome σχηματισμού ή απόφραξη του αυτοφαγικά αποικοδόμησης του LC3-II [24], [25]. Ως εκ τούτου, αναλύθηκε κύτταρα vorinostat επεξεργασμένα για την αποδόμηση ρ62, ενός δείκτη της αυτοφαγικά ροής [24], και παρατηρήσαμε μια μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης ρ62 σε κύτταρα κατεργασμένα vorinostat σύγκριση με το χρόνο συμφωνημένα χωρίς θεραπεία καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, της ταυτόχρονης θεραπείας του vorinostat με βαφιλομυκίνης Α1 (BafA1), ένας αναστολέας της autophagosome-λυσοσώματος σύντηξη, αυξήθηκε περαιτέρω συσσώρευση LC3-ΙΙ (σχήμα 3Β), συμβατό με vorinostat επάγουν ροή αυτοφαγικά παρά αναστέλλοντας την αποικοδομητική ικανότητα των autophagolysomes. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (EM) είναι ένα ευαίσθητο, ποσοτική και οριστική μέθοδος για την ανίχνευση της αυτοφαγία [24]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα κηλίδος western, η ανάλυση έδειξε ότι η ΕΜ vorinostat σημαντικά αυξημένο σχηματισμό autophagosome σε κύτταρα AGS (Σχήμα 4Β και Β ‘) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Α και Α’).

AGS (Α) και ΚΑΤΩ -III υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ vorinostat για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της LC3 και ρ62 αναλύθηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. επίπεδα Ρ62 μετρήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση των στυπωμάτων Western και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα της ακτίνης. επίπεδα Ρ62 των μη επεξεργασμένων AGS και τα κύτταρα KATOIII θεωρήθηκαν ως 1. (Β) AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 12 ώρες με 5 μΜ vorinostat με ή χωρίς 50 ηΜ βαφιλομυκίνης Α1 (BafA1). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανάλυση ανοσοκηλίδος για LC3 και ακτίνη.

Η

Μετά από 12 ώρες θεραπείας DMSO (Α, Α ‘) ή με 5 μΜ vorinostat (Β, Β’) (αριστερά πάνελ, μικρή μεγέθυνση, κλίμακα bar: 2 μm), πραγματοποιήθηκε ανάλυση ΕΜ. Υψηλή εικόνες μεγέθυνση εγκλωβιστούμε περιοχές με Av απεικονίζουν κενοτόπια αυτοφαγικά (αριστερά πάνελ, γραμμή κλίμακας: 500 nm? Ν: πυρήνας, Μ: μιτοχόνδρια).

Η

Για να διερευνηθεί αν η συσσώρευση των αυτοφαγοσώματα προστατεύει τα κύτταρα από το κυτταρικό στρες που προκαλείται από vorinostat, εμείς ανέστειλε τη διαδικασία αυτοφαγία χρησιμοποιώντας τη φαρμακολογική χλωροκίνη αναστολέα και μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) έναντι Beclin-1. Η προσθήκη χλωροκίνη να AGS vorinostat επεξεργασμένα και τα κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη βιωσιμότητα (Σχήμα 5Α). Η μείωση της βιωσιμότητας επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ σε επεξεργασία με Beclin-1 siRNA (Σχήμα 5Β). Μαζί, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της vorinostat επαγόμενης autophagy μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας του γαστρικού vorinostat καρκινικών κυττάρων.

(Α) και AGS ΚΑΤΟ-ΙΙΙ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ vorinostat και διαφορετικές συγκεντρώσεις χλωροκίνης (CQ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 12 ώρες με τη χρήση χρώσης crystal violet και ελέγχου (CTR) ορίστηκε ως 100%. (Β) κύτταρα ΚΑΤΩ-III επιμολύνονται με siRNA έναντι Beclin 1 (siBeclin1) ή με μη-στόχευση Risc Δωρεάν siRNA ή έχει υποστεί επεξεργασία με Dharmafect εγώ μονάχος (μακέτα). αποδοτικότητα siRNA επιβεβαιώθηκε με ανάλυση western blot των Beclin 1 και Risc Ελεύθερη ως έλεγχος. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε για να δείξει ίση φόρτωση πρωτεϊνών. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από 12 ώρες θεραπείας vorinostat χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων χωρίς αγωγή ελέγχου (CTR) ορίστηκε ως 100%. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Vorinostat αλλάζει γονίδιο υπογραφή στο ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Για να κατανοήσουμε τις επιπτώσεις των vorinostat στην έκφραση γονιδίων σε γαστρικό καρκίνο κυττάρων γραμμές, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών της ΕΕΑ αντιμετωπίζονται vorinostat και ΚΑΤΩ-III κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου (Εικ. 2). Η ανάλυσή μας έδειξε σημαντικές διαφορές σε επίπεδο γονιδιώματος μεταξύ ανεπεξέργαστων και vorinostat-θεραπεία γαστρικών καρκινικών κυττάρων (AGS και ΚΑΤΩ-III). Μετά vorinostat κατεργασία, η έκφραση των γονιδίων 1014 αυξήθηκε και η έκφραση των γονιδίων 760 μειώθηκε στην κυτταρική γραμμή AGS. Στην κυτταρική σειρά ΚΑΤΩ-III, 164 γονίδια ήταν μέχρι και 191 γονίδια τα κάτω ρύθμιση (δύο φορές διαφορά?

P

& lt? 0.001). Vorinostat μεταβάλλονται σημαντικά την έκφραση των γονιδίων 140 και στις δύο AGS και κυτταρικές γραμμές ΚΑΤΟ-ΙΙΙ (vorinostat ειδικό γονίδιο υπογραφής). Τα γονίδια που πλέον μεταβληθεί μετά τη θεραπεία vorinostat ταυτοποιήθηκαν ως

SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK

(& gt? 4 φορές μέχρι -Κανονισμός) και

MUC1, IFITM1, ANKRD37

(& gt?. 4 φορές κάτω ρύθμιση)

Στη συνέχεια, έχουμε ως στόχο τον εντοπισμό των υποψηφίων βιοδεικτών που μπορεί να προβλέψει την ευαισθησία vorinostat των ασθενών ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου . Ως εκ τούτου, συνδυάσαμε το σύνολο των μεταβάλλονται γονιδίων σε κατεργασμένα vorinostat γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (vorinostat ειδικού γονιδίου υπογραφή) και των δύο ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο υπογραφές που δημιουργούνται από τα δεδομένα Yosei και Stanford χρησιμοποιώντας ανάλυση διάγραμμα Venn. Βρήκαμε ότι τα σχετικά επίπεδα έκφρασης 12 γονιδίων αντιστράφηκαν με επεξεργασία vorinostat (Σχήμα 6). Από αυτά τα 12 γονίδια, 7 γονίδια υψηλής έκφρασης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη (

ITGB5

,

Tyms

,

ΜΥΒ

,

APOC1

,

CBX5

,

PLA2G2A

,

KIF20A

) και 5 χαμηλής εκφρασμένα γονίδια ήταν μέχρι ρυθμίζονται μετά τη θεραπεία vorinostat (

SCGB2A1

,

TCN1

,

CFD

,

APLP1

,

NQO1

(Πίνακας 3).

Venn διάγραμμα των γονιδίων που επιλέγονται από μονοπαραγοντική δοκιμασία (δύο δειγμάτων t-test) επιλέχθηκαν γονίδια για την p & lt?.. 0.001 μεταξύ σύγκριση ομάδων Ο κόκκινος κύκλος (γονίδιο κατάλογος Α) αντιπροσωπεύει γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένα γονίδια από τα δεδομένα Yonsei τον μπλε κύκλο (γονίδιο κατάλογο Β) αντιπροσωπεύει γαστρικό καρκίνο συγκεκριμένα γονίδια από τα δεδομένα του Στάνφορντ.. το κίτρινο κύκλο (γονίδιο κατάλογο C) αντιπροσωπεύει vorinostat συγκεκριμένο γονίδιο υπογραφή από τις δύο AGS και κυτταρικές σειρές ΚΑΤΩ-III (

P

& lt? 0.001, 2 φορές αλλαγή).

η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα παγκόσμιο ανθρώπινο γαστρικό γονίδιο υπογραφή του καρκίνου μπορεί να είναι χρήσιμο για να βρείτε θεραπευτικούς παράγοντες που μάλλον στοχεύουν τη γενωμική υπογραφή του γαστρικού καρκίνου, αντί να στοχεύουν ένα ή δύο συγκεκριμένα γονίδια. Χρήση του χάρτη Συνδεσιμότητα, βρήκαμε ότι οι αναστολείς HDAC, όπως vorinostat και τριχοστατίνη Α, είχε έναν αντιστρόφως ανάλογη γονίδιο υπογραφή σε σύγκριση με το γαστρικό καρκίνο ειδικό γονίδιο υπογραφή και ως εκ τούτου μπορεί να είναι μόλυβδος θεραπευτική υποψήφιοι για καρκίνο του στομάχου.

In vitro

αξιολόγηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των vorinostat αποκάλυψε ότι αυτό θεραπευτικό φάρμακο κατέστειλε την ανάπτυξη των διαφόρων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου. Δίπλα στο αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της, vorinostat υπερεκφράζεται επίσης αυτοφαγία-ειδικών γονιδίων. Αναστολή της vorinostat που προκαλείται από αυτοφαγία οδήγησε σε περαιτέρω μείωση της βιωσιμότητας. Επιπλέον, συνδυασμένη ανάλυση των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου αντιμετωπίζονται με vorinostat και τα δείγματα των ασθενών με γαστρικό καρκίνο έδειξαν ότι vorinostat αλλάξει τα επίπεδα έκφρασης ενός συνόλου δώδεκα γαστρικού καρκίνου συγκεκριμένων γονιδίων.

Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι HDAC αναστολείς, vorinostat και τριχοστατίνη Α, ήταν οι κορυφαίοι υποψήφιοι για θεραπευτικές γαστρικού καρκίνου, η οποία συμφωνεί με την ιδέα ότι HDAC υπερεκφράζεται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς [26]. Οι αναστολείς HDAC έχουν δειχθεί ότι αυξάνουν την ακετυλίωση των ιστονών, ως εκ τούτου επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου. Αυτοί οι αναστολείς δηλωτικό αντικαρκινικά αποτελέσματα επάγοντας την εγγενή και εξωγενή οδό απόπτωσης [27], [28], μπλοκάροντας την αγγειογένεση των όγκων [29], και αναστέλλοντας οδούς ενδοκυτταρική απόκριση στρες [30]. Επειδή οι αναστολείς HDAC έχουν παγκόσμιες επιπτώσεις στην έκφραση των γονιδίων, που μπορεί να επηρεάσει ακόμη unrevealed κυτταρικές διεργασίες [31], [32]. Σε κλινικές ρυθμίσεις, οι αναστολείς HDAC έχουν ως επί το πλείστον εφαρμοστεί σε αιματολογικές κακοήθειες, αλλά κλινικές δοκιμές σε συμπαγείς όγκους βρίσκονται σε εξέλιξη. Μια πρόσφατη μελέτη, την υποστήριξη μας

in vitro

ευρήματα έδειξαν θεραπευτική αποτελεσματικότητα των αναστολέων HDAC σε δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου με τη χρήση της δοκιμασίας ιστοκαλλιέργεια ανταπόκριση των ναρκωτικών [33]. Ωστόσο, μένει να αφανέρωτο αν συγκεκριμένες υποομάδες μοριακού ορίζονται μπορεί να προβλέψει απάντηση ή αντίσταση σε αναστολείς HDAC.