Αφηρημένο

Host ανοσοποιητικό πεπτίδια, συμπεριλαμβανομένων καθελικιδίνες, έχουν αναφερθεί να έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες. Αναφέραμε προηγουμένως ότι LL-37, η μόνη cathelicidin σε ανθρώπους, καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αυτή τη μελέτη, το δυναμικό αντικαρκινική δράση του FK-16, ένα θραύσμα του LL-37 που αντιστοιχεί στα υπολείμματα 17 έως 32, σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου αξιολογήθηκε. FK-16 που προκαλείται από ένα μοναδικό πρότυπο του κυτταρικού θανάτου, που χαρακτηρίζεται από την ταυτόχρονη ενεργοποίηση της κασπάσης-ανεξάρτητης απόπτωσης και αυτοφαγία. Ο πρώην έγινε μέσω της πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ και EndoG ενώ η τελευταία χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση της LC3-I /II, Atg5 και ATG7 και αυξημένο σχηματισμό LC3 θετικών αυτοφαγοσώματα. Νοκ ντάουν της Atg5 ή ATG7 εξασθενεί την κυτταροτοξικότητα της FK-16, υποδεικνύοντας FK-16 που προκαλείται από αυτοφαγία ήταν φιλο-θάνατος στη φύση. Μηχανιστικά, FK-16 ενεργοποιείται πυρηνικών p53 να ρυθμίζουν προς τα πάνω Βαχ και ρυθμίζουν προς τα κάτω Bcl-2. Εξόντωση ρ53, γενετική εκτομή του Βαχ, ή η υπερέκφραση του Bcl-2 αντιστραφεί FK-16-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία. Είναι σημαντικό, η κατάργηση των εξαρτώμενων από EndoG ΟΕΕ /απόπτωση ενισχυμένη FK-16 που προκαλείται από αυτοφαγία, ενώ η κατάργηση της αυτοφαγία επαυξημένης FK-16-επαγόμενη AIF- /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση. Συλλογικά, FK-16 επάγει κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση και autophagy μέσω της κοινής ρ53-ΒοΙ-2 /Bax καταρράκτη σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Η μελέτη μας αποκάλυψε, επίσης, προηγουμένως άγνωστη αμοιβαία ρύθμιση μεταξύ των δύο αυτών οδών κυτταρικού θανάτου

Παράθεση:. Ren SX, Shen J, Cheng ASL, Lu L, Τσαν RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 Προέρχεται από το Αντικαρκινικό πεπτιδίου LL-37 Προκαλεί κασπάσης-ανεξάρτητης απόπτωσης και αυτοφαγικά θάνατο των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10.1371 /journal.pone.0063641

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 4 Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 20, 2013

Copyright: © 2013 Ren et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αντιμικροβιακός πεπτιδίων (ΑΜΡ), επίσης γνωστή ως οικοδεσπότης. άμυνα πεπτίδια, υπάρχουν σε ευκαρυωτικά κύτταρα ως συντηρημένο συστατικό του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. ΑΜΡ εκτελέσει πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στη μόλυνση ενεργώντας ως «φυσικά αντιβιοτικά» με άμεση θανάτωση των παθογόνων μικροβίων [1], [2]. Η εκλεκτικότητα του ΑΜΡ σε βακτηριακά κύτταρα βασίζεται σε κατιονικό τους δομές που είναι ζωτικής σημασίας για την αλληλεπίδραση με αρνητικά φορτισμένες βακτηριακές μεμβράνες [3], [4]. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι ΑΜΡ μπορεί επίσης να δεσμεύουν επιλεκτικά στα καρκινικά κύτταρα επί μη μετασχηματισμένα κύτταρα, λόγω της αυξημένης έκθεσης επιφάνεια αρνητικά φορτισμένων φωσφατιδυλοσερίνη στον καρκίνο [5]. Αυξημένα επίπεδα Ο-γλυκοζυλιωμένη μουκίνες, δυνητικές αρνητικές μεμβράνης, και αυξημένη ρευστότητα της μεμβράνης και κυτταρικής επιφάνειας έκταση σε καρκινικά κύτταρα μπορεί επίσης να συμβάλει σε αυτή την επιλεκτικότητα [6]. Πολυάριθμες ΑΜΡ του ανθρώπου (π.χ. β-definsin, LL-37) και μη-ανθρώπινων (π.χ. bMAP-28, λακτοφερρικίνη Β, μαγαϊνίνη II, μελιττίνη, ταχυπλεσίνη Ι) προελεύσεων έχουν αποδειχθεί ότι ασκούν κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα μέσω διαφόρων μηχανισμών [6 ]. Για παράδειγμα, λακτοφερρικίνη βοοειδών Β επαγόμενη μιτοχονδριακό μονοπάτι της απόπτωσης σε ανθρώπινα γραμμές λευχαιμίας και κυττάρων καρκινώματος αλλά όχι μη μετασχηματισμένα κύτταρα μέσω δημιουργίας δραστικών ειδών οξυγόνου [7]. Μαγγαϊνίνη II επάγεται επίσης κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα κύστης αλλά δεν φυσιολογικούς ινοβλάστες μέσω σχηματισμού πόρου στην κυτταρική μεμβράνη και την επακόλουθη λύση των κυττάρων [8]. Ανθρώπινη β-definsin-1, που επέδειξε ο καρκίνος-ειδική απώλεια της έκφρασης της νεφρικής σαφές καρκίνωμα κυττάρων, επαγόμενη από κασπάση-3-απόπτωση στο νεφρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή SW156 [9]. Σύμφωνα με την βάση δεδομένων ΑΜΡ (https://aps.unmc.edu/AP/main.php), πάνω από 130 τέτοια πεπτίδια είναι γνωστό ότι έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες [10].

καθελικιδίνες είναι μια οικογένεια εξελικτικά συντηρημένες αμπέρ. HCAP-18 είναι η μόνη cathelicidin σε ανθρώπους. Αυτό προπροπρωτεΐνη 18-kDa αποτελείται από μία Ν-τερματική αλληλουχία σήματος, μία καθελίνης πεδίο που ομοιάζει, και ένα C-τερματικό τομέα ΑΜΡ. Πρωτεολυτική διάσπαση της HCAP-18 απελευθερώνει ένα 37-υπολειμμάτων, αμφιπαθών, ελικοειδές πεπτίδιο γνωστό ως LL-37. Αυτό το πεπτίδιο που εκκρίνεται από τα κύτταρα του μυελού των οστών, τα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα, και πολλά είδη των επιθηλιακών ιστών, όπως το δέρμα και το γαστρεντερικό βλεννογόνο. LL-37 δεν εμφανίζει μόνο σε ένα ευρύ φάσμα αντιμικροβιακών δραστηριοτήτων (π.χ. βακτήρια, μύκητες και ιούς), αλλά επίσης έχει την ικανότητα να εξουδετερώνουν βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών. Σημαντικά, LL-37 θα μπορούσε να μεσολαβήσει έμφυτη ανοσία μέσω ρύθμισης χημειοταξία των λευκοκυττάρων (π.χ. ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα, Τ-κύτταρα, ηωσινόφιλα και σιτευτικά κύτταρα) και η παραγωγή των κυτοκινών στις θέσεις μόλυνσης και φλεγμονής καθώς και την προώθηση επανεπιθηλίωση κατά την επούλωση των πληγών [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Αθροιστική στοιχεία από μελέτες της βιολογίας του όγκου δείχνει ότι LL-37 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση [15]. Για παράδειγμα, LL-37 ασκεί αντικαρκινικά αποτελέσματα επί του γαστρικού καρκίνου και λευχαιμικά κύτταρα Τ [16], [17]. Το Ο-τερματικό θραύσμα του LL-37 παρουσιάζει επίσης την κυτταροτοξικότητα έναντι τόσο ανθεκτικές στα φάρμακα και τα κύτταρα καρκινώματος του στόματος επιθηλιακό φάρμακο ευαίσθητη [18]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε επίσης ότι η έκφραση του LL-37 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του κόλου ενώ εξωγενούς LL-37 που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα κόλου. Σημαντικά, cathelicidin-ανεπαρκή ποντίκια παρουσίασαν αυξημένη ευαισθησία σε αζοξυμεθάνιο επαγόμενης καρκινογένεσης του παχέος εντέρου [19]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η LL-37 είναι ένα ενδογενές πεπτίδιο όγκων-καταστολή.

Δεδομένης της σημασίας του στην ανοσολογία και την έρευνα για τον καρκίνο, οι προσπάθειες έχουν βάλει εμπρός για να μελετήσουν τις δομικές και βιοφυσικές ιδιότητες του LL-37. Σελήνης

et al.

Περιγράφηκε για πρώτη φορά τη χρήση του συστήματος σύντηξης S-τρανσφεράσης της γλουταθειόνης για την έκφραση και τον καθαρισμό των ισοτόπων επισημασμένο LL-37 σε

Escherichia coil

[20]. Δομική ανάλυση με φασματοσκοπία NMR έδειξε ότι LL-37 χαρακτηρίζεται από ένα μακρύ αμφιπολικής έλικας που εκτείνεται στα υπολείμματα 2-31 με ολόκληρο μόριο καμπύλα ένα τρένο υδρόφοβων πλευρικών αλυσίδων [21]. Ramamoorthy

et al.

Έδειξαν ότι LL-37 προσανατολίζει κοντά στην επιφάνεια φωσφολιπιδίου διπλών στιβάδων και σχηματίζει δομές ολιγομερείς [22]. Για το σκοπό αυτό, LL-37 έχει την ικανότητα να διαταράξουν κυτταρική μεμβράνη [23], [24], [25].

Το κόστος που σχετίζεται με χημική σύνθεση είναι ένας από τους περιοριστικούς παράγοντες που εμποδίζουν τη χρήση πεπτιδίων ως θεραπευτικοί παράγοντες. Είναι επομένως σημαντικό να προσδιοριστεί η λειτουργική περιοχή του LL-37, έτσι ώστε βραχύτερα θραύσματα τα οποία διατηρούν τη βιολογική δραστικότητα του πεπτιδίου πλήρους μήκους μπορούν να παραχθούν με χαμηλότερο κόστος. Προηγούμενη ανάλυση δομής-λειτουργίας διαφορετικών LL-37 θραύσματα απέδειξε ότι LL7-27, ένα πεπτίδιο 21-υπολειμμάτων που προέρχονται από τα υπολείμματα 7-27 του LL-37, εμφανίζει ισχυρή δραστικότητα κατά μικροβίων (ιδιαίτερα θετικά κατά Gram βακτηρίδια) μέσω διακοπής του λιπιδική δομή διπλής στιβάδας [26]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι το Ν-τερματικό θραύσμα LL-12 που αντιστοιχεί εις τα υπόλοιπα 1-12 του LL-37 είναι ανενεργή κατά των βακτηρίων ή των καρκινικών κυττάρων ενώ FK-16 που αντιστοιχεί στα υπολείμματα 17-32 διατηρεί αντιβακτηριακή και κατά του όγκου αποτελέσματα [27]. Αυτό το θραύσμα έχει ακόμη και μια καλύτερη δραστικότητα έναντι προκαρυωτικά και τα εμπύρηνα κύτταρα από το πεπτίδιο πλήρους μήκους [28], υποδηλώνοντας ότι η FK-16 μπορούν να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια για περαιτέρω χαρακτηρισμό ως νέου αντικαρκινικό πεπτίδιο. Στην παρούσα μελέτη, η

in vitro

αντικαρκινική δράση της FK-16 διερευνήθηκε.

Αποτελέσματα

FK-16 έναντι LL-37 στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε Τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Οι κυτταροτοξικότητες της FK-16 και ο πλήρους μήκους LL-37 αρχικά μελετήθηκε σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον (LoVo και HCT116) με δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, τόσο FK-16 και LL-37 μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των LoVo και κυττάρων HCT116 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αισθητά, FK-16 εμφάνισε καλύτερη δραστικότητα κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα από LL-37. Επιπλέον, FK-16 είχε μια ελάχιστη επίδραση στη βιωσιμότητα των ανθρώπινων κανονικής βλεννογόνου του παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα NCM460. Ένα πεπτίδιο ελέγχου με περιπλεγμένο αλληλουχία του FK-16 είχαν επίσης αμελητέα αποτελέσματα επί LoVo και HCT116, υποδεικνύοντας FK-16 μεσολαβεί επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Όπως HCT116 ήταν πιο ευαίσθητη από LoVo να FK-16, επιλέχθηκε για επακόλουθη HCT116 μηχανιστική μελέτη και έλαβαν θεραπεία είτε με 20 μΜ ή 40 μΜ FK-16, κατά το οποίο συνέβη -20% και -50% της κυτταροτοξικότητας.

(Α) Επίδραση της LL-37, FK-16, και κωδικοποιημένα FK-16 (48 ώρες) επί της βιωσιμότητας των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116, LoVo) προσδιορίστηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. Η κυτταροτοξική δράση του FK-16 προσδιορίστηκε επίσης σε ανθρώπινο φυσιολογικό βλεννογόνου του παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα NCM460. (Β) εξωτερίκευση φωσφατιδυλ στα κύτταρα HCT116 αγωγή με ή χωρίς FK-16 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής /αννεξίνης κυττάρων PI V-βάφονται. (Γ) Αποτελέσματα της FK-16 για διάσπαση PARP και την ενεργοποίηση της κασπάσης σε κύτταρα HCT116 προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. Η σισπλατίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση της κασπάσης. (D) Προ-θεραπεία HCT116 κυττάρων με το παν-κασπάσης αναστολέα z-VAD-fmk για 1 ώρα δεν εμπόδισε FK-16-επαγόμενη απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων όπως προσδιορίζεται με ΜΤΤ δοκιμασία (24 h). (Ε) Η πυρηνική έκφραση του ΟΕΕ και EndoG σε κύτταρα HCT116 αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western των κλασματοποιημένα πρωτεϊνών. GAPDH και Lamin A /C χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για κυτοσολική (Cy) και πυρηνικές πρωτεΐνες (Nu), αντίστοιχα. (F) Επιπτώσεις της FK-16 (6 ώρες) για υποκυτταρική εντόπιση του ΟΕΕ (πράσινο) και EndoG (κόκκινο) σε HCT116 προσδιορίστηκαν με συνεστιακή ανοσοφθορισμού (400 ×). (G) Νοκ ντάουν του ΟΕΕ και EndoG εν μέρει αντιστράφηκε εξωτερίκευσης φωσφατιδυλ προκαλείται από την FK-16 (40 μΜ? 24 h) σε HCT116. Τα κύτταρα προκλήθηκαν με FK-16 στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των AIF- και EndoG-siRNAs. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01, διαφέρει σημαντικά από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου

Η

Πρόκληση ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση με FK-16

έχουν δείξει προηγουμένως ότι το LL-37 θα μπορούσε να επάγει κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [19]. Για να προσδιοριστεί εάν η απόπτωση με τη μεσολάβηση την κυτταροτοξικότητα της FK-16, η απώλεια της φωσφατιδυλσερίνης ασυμμετρία, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, προσδιορίστηκε ποσοτικά με κυτταρομετρία ιωδιούχου προπιδίου /αννεξίνης V διπλό χρώση κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, FK-16 που προκαλείται από φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευση χωρίς αύξηση της αναλογίας των ιωδιούχου προπιδίου

+ κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η FK-16 επαγόμενη απόπτωση αλλά όχι νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Σε αμφότερες τις 24 ώρες και 48 ώρες χρονικά σημεία, FK-16 θεραπεία δεν αυξάνει τη διάσπαση PARP ούτε ενεργοποιούν κασπάσες-3 και 7 (Σχ. 1 C). Να συμπίπτει, ο αναστολέας παν-κασπάσης z-VAD-fmk απέτυχε να αναστρέψει την απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων που προκαλείται από FK-16 (Εικ. 1D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η FK-16 επαγόμενη απόπτωση σε κασπάση-ανεξάρτητο τρόπο. ΟΕΕ και EndoG, αρχικά εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα κατά την ενεργοποίηση, είναι γνωστές μεσολαβητές της κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση [29]. Ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας κλασματοποιημένη λύματα πρωτεΐνης έδειξε ότι FK-16 αύξησε τα πυρηνικά επίπεδα των ΟΕΕ και EndoG (Εικ. 1 Ε). Ανοσοφθορισμός επιβεβαίωσε ότι ΟΕΕ και EndoG αναδιανέμονται από το κυτοσόλιο στον πυρήνα σε FK-16-αγωγή HCT116 κυττάρων (Εικ. 1 F). Η λειτουργική συμμετοχή των ΟΕΕ και EndoG στην FK-16-επαγόμενη απόπτωση περαιτέρω επαληθεύεται από τα πειράματα παρεμβολής RNA, στην οποία νοκ ντάουν του ΟΕΕ ή EndoG εξασθενημένη εξωτερική ανάθεση φωσφατιδυλσερίνη που προκαλείται από FK-16 (Εικ. 1G). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι, παρόμοια με LL-37, FK-16 επάγεται ΟΕΕ /EndoG εξαρτώμενη αλλά κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Επαγωγή αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου με FK-16 αλλά όχι LL-37

για να προσδιοριστεί η επίδραση της FK-16 σε ένα άλλο κασπάσης-ανεξάρτητο μονοπάτι κυτταρικού θανάτου, ήτοι, αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο [30], αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης LC3 (ιδιαίτερα LC3-ΙΙ το οποίο είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με η έκταση της αυτοφαγία) και δύο άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αυτοφαγία, δηλαδή Atg5 και ATG7. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η FK-16 αυξήθηκε LC3-Ι και LC3-ΙΙ, καθώς και την έκφραση Atg5 και ATG7 πρωτεΐνη (σχήμα 2Α & amp?. 2Β). FK-16 επάγεται επίσης το σχηματισμό LC3

+ αυτοφαγικά κενοτόπια σε HCT116 (Σχ. 2C). Τόσο η επαγωγή της LC3-Ι έκφραση /II και ο σχηματισμός της LC3

+ αυτοφαγικά κενοτόπια με FK-16 θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από 3-μεθυλαδενίνη, ένα III φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης Class. Αντίθετα, το πλήρες μήκος LL-37 πεπτίδιο είχε ελάχιστη επίδραση επί της LC3-Ι έκφραση /II (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η υπερδομική ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε ότι ένα 48 h-έκθεση σε FK-16 που προκαλείται από μαζική κενοτοπίων στα κύτταρα HCT116, στις οποίες παρατηρήθηκαν φολιδωτή και μυελίνης όπως δομές που μοιάζουν με αργά αυτοφαγικά κενοτόπια (Σχ. 2D). Σχηματισμός όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια, το οποίο είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της αυτοφαγία, ενισχύθηκε επίσης με FK-16 όπως προσδιορίζεται με ζωτική χρώση των κυττάρων HCT116 με πορτοκαλί της ακριδίνης, χρώμα που εκπέμπει φωτεινό κόκκινο φθορισμό σε όξινα κυστίδια αλλά φθορίζει πράσινο σε κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα (Σχ. 2Ε). Ο σχηματισμός autolysosomes ήταν επίσης αυξημένη σε FK-16-επεξεργασμένα κύτταρα ως ορατό με χρώση monodansylcadaverine (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αύξηση της ροής αυτοφαγικά προκαλείται από FK-16 επιβεβαιώθηκε με κατεργασία κυττάρων HCT116 με FK-16 και βαφιλομυκίνης A

1 (α lysosomotropic παράγων), μόνα τους ή σε συνδυασμό. Η αναστολή της λειτουργίας λυσοσωματικής με βαφιλομυκίνης A

1 αύξησε τα επίπεδα τόσο της LC3-Ι και -II που προκαλείται από FK-16 (Σχ. 2F), γεγονός που υποδηλώνει ότι η FK-16 αυξήθηκε αυτοφαγικά ροή. Ανάλογα με το κυτταρικό περιβάλλον, αυτοφαγία μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα προ-θανάτου ή μηχανισμό προ-επιβίωσης. Για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου του autophagy επάγεται από FK-16, μια προσέγγιση παρεμβολή RNA χρησιμοποιήθηκε για την κατάργηση autophagy μέσω στόχευσης Atg5 και ATG7, αμφότερες των οποίων απαιτούνται για τον σχηματισμό αυτοφαγοσώματα κατά το αρχικό στάδιο. Εξόντωση Atg5 ή ATG7 μείωσε σημαντικά την κυτταροτοξική δράση του FK-16 (Σχ. 2G), γεγονός που υποδηλώνει ότι η FK-16 επάγεται αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

(Α) κύτταρα HCT116 παρουσίασαν αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης του LC3-I /II μετά από κατεργασία με FK-16 για 24 ώρες και 48 ώρες. έκφραση LC3 που προκαλείται από FK-16 καταργήθηκε από τον αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ (5 mM, 1 ώρα προ-επεξεργασία). (Β) FK-16 επάγει επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης Atg5 και ATG7. (Γ) επεξεργασία HCT116 με FK-16 για 24 ώρες ή 48 ώρες ενισχύεται εμφανώς το σχηματισμό κενοτοπίων αυτοφαγικά όπως προσδιορίζεται με χρώση ανοσοφθορισμού για LC3 (400 Χ). Ο σχηματισμός της LC3

+ αυτοφαγοσώματα προκαλείται από την FK-16 έχει αποκλειστεί από 3-MA. (Δ) Η υπερδομική ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε το σχηματισμό autophagosome ή δευτερογενών λυσοσώματα με το υπολειμματικό χωνευμένο υλικό σε FK-16-αγωγή HCT116 κύτταρα (40 μΜ? 48 h). (Ε) Η συσσώρευση των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια, τα οποία εκπέμπονται φωτεινό κόκκινο φθορισμού, που επάγεται από FK-16 (40 μΜ) οπτικοποιήθηκε με χρώση πορτοκαλί της ακριδίνης (400 Χ). (F) Αυξημένη ροή αυτοφαγικά επιβεβαιώθηκε με συν-θεραπεία κύτταρα HCT116 με FK-16 και βαφιλομυκίνης A

1. Η θεραπεία με βαφιλομυκίνης A

1 (10 nmol /L) δεν εμπόδισε την προς τα πάνω ρύθμιση της LC3-I /II σε κύτταρα που επωάστηκαν με FK-16 (40 μΜ). (G) εξόντωση Atg5 ή ATG7 εξασθένησε την κυτταροτοξική δράση του 48-h θεραπεία της FK-16 (40 μΜ) σε HCT116. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.D. τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

σ

& lt? 0,05? **

ρ

& lt? 0,01 σημαντικά διαφορετικό από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου.

†,

σ

& lt? 0,05?

††,

σ

& lt?. 0.01 σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με FK-16

Η

Απαίτηση της p53 για FK-16-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγικά

κυττάρων Death

Ο όγκος p53 πρωτεΐνη καταστολής είναι γνωστό να λάβει μέρος σε δύο κασπάσης-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από το θάνατο των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ΟΕΕ /Ενδο-εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγία [31], [32]. Εδώ, δείξαμε ότι η FK-16 ενεργοποιείται άμεσα ρ53 να διαμεσολαβεί και τις δύο οδούς κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, FK-16 αύξησε την πυρηνική επίπεδο των p53 και ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση της PUMA και Bax. Σταθερά, FK-16 μείωσε την έκφραση του Bcl-2. Για να διαλευκανθεί η λειτουργική συμμετοχή της p53 στον ΟΕΕ /Ενδο-εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο που προκλήθηκε από FK-16, p53 χτυπήθηκε κάτω από siRNA. Νοκ ντάουν του p53 αποκατασταθεί όχι μόνο την έκφραση των Bax και Bcl-2, αλλά και εντυπωσιακά μειωμένη FK-16-επαγόμενη LC3-I /II, Atg5 και ATG7 έκφρασης, καθώς και την πυρηνική έκφραση του ΟΕΕ και EndoG, γεγονός που υποδηλώνει ότι η p53 ήταν μια κοινή ενεργοποιητή και των δύο οδών κυτταρικού θανάτου (Σχ. 3Β). Κατά συνέπεια, knockdown του ρ53 μειωμένη εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνη (Εικ. 3C), το σχηματισμό LC3

+ αυτοφαγικά κενοτόπιο (Σχ. 3D) και την απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας (Εικ. 3Ε) που προκαλείται από FK-16.

(Α) κύτταρα HCT116 επωάστηκαν με FK-16 για 24 ώρες ή 48 ώρες. Κυτταρολύματος και πυρήνων ρ53 και συνολική έκφραση των Bcl-2 μελών (Puma, Bcl-2, Βαχ και Bak) προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. GAPDH και Lamin A /C χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για κυτοσολικές και πυρηνικές πρωτεΐνες, αντίστοιχα. (Β) εξόντωση ρ53 ανέστρεψε την προς τα πάνω ρύθμιση των προ-αυτοφαγικά παραγόντων (Atg5 και ATG7) και προ-αποπτωτικών παραγόντων (Βαχ, Bak, πυρηνική ΟΕΕ και πυρηνική EndoG), καθώς και προς τα κάτω ρύθμιση της Bcl-2 με FK-16. (C) FK-16 απέτυχε να προκαλείται από την εξωτερική ανάθεση φωσφατιδυλ στα κύτταρα HCT116 p53-εξαντλημένο. Μετά την επιμόλυνση με ελέγχου-ή p53-siRNA για 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς FK-16 (40 μΜ) για άλλες 24 ώρες και ακολούθησε ιωδιούχο προπίδιο /χρώση αννεξίνης V-διπλό. (D) εξόντωση 53 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των LC3

+ αυτοφαγικά κενοτόπια σε FK-16-κατεργασμένων κυττάρων (40 μΜ? 48 ώρες) όπως προσδιορίζεται με ομοεστιακό ανοσοφθορισμού (400 Χ). Πυρήνες (μπλε) βάφτηκαν με DAPI. (Ε) εξόντωση ρ53 αντιστραφεί μερικώς την ανασταλτική επίδραση της FK-16 σχετικά με τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε HCT116 όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.D. τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

σ

& lt? 0,05? **

ρ

& lt? 0,01 σημαντικά διαφορετικό από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου.

†,

σ

& lt? 0,05?

††,

ρ

& lt? 0,01 σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με FK-16

Η

τροποποιημένη έκφραση του Bcl-2 και Bax κατά τη διάρκεια της FK-. 16-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου

Δεδομένου ότι η οικογένεια Bcl-2 έχει αναφερθεί να ρυθμίζουν τόσο κασπάση-ανεξάρτητη απόπτωση και αυτοφαγία σε άλλα βιολογικά περιβάλλοντα [30], [32], από την επόμενη ερωτήθηκαν αν FK- 16-επαγόμενη κόλου θανάτου από καρκίνο κυττάρου προκαλείται μέσω Bcl-2 και Bax, και τα δύο από τα οποία ήταν κατάντη της ρ53 (Εικ. 3Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αποκατάσταση της έκφρασης Bcl-2 με επιμόλυνση με Bcl-2 που κωδικοποιεί πλασμίδιο ή γενετική εκτομή του Βαχ χρησιμοποιώντας Βαχ

– /- κύτταρα HCT116 κατήργησε FK-16-επαγόμενη έκφραση LC3-Ι /ΙΙ, Atg5 και ATG7 καθώς και στην πυρηνική έκφραση του ΟΕΕ και EndoG (Σχ 4Α & amp?. Β), υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-2 και προς τα πάνω ρύθμιση του Βαχ ήταν απαραίτητα για FK-16-επαγόμενη αυτοφαγικά και αποπτωτικά σηματοδότηση. Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, η αποκατάσταση της Bcl-2 έκφρασης ή γενετικό κατάλυση του Βαχ μείωσε το σχηματισμό της LC3

+ αυτοφαγικά χυμοτόπια (Εικ. 4C) και την απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας (Εικ. 4D) που προκαλείται από FK-16. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η FK-16 ενήργησαν μέσω της οδού p53-Bcl-2 /Bax σε ταυτόχρονα επάγει ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγία μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο.

(Α) Αποκατάσταση της έκφρασης Bcl-2 με επιμόλυνση με Bcl-2 που κωδικοποιεί πλασμίδιο ανέστρεψε την προς τα πάνω ρύθμιση των προ-αυτοφαγικά (Atg5, ATG7 και LC3-I /II) και προ-αποπτωτικά (πυρηνικό ΟΕΕ και πυρηνική EndoG) παράγοντες που επάγεται από FK-16 (40 μΜ? 48 ώρες) σε HCT116. (Β) Γενετική εκτομή του Βαχ (Bax KO) σε HCT116 αντιστραφεί FK-16-επαγόμενη αποπτωτικών και αυτοφαγικά σήματα. Βαχ

+/- HCT116 σε επεξεργασία με ή χωρίς FK-16 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (C) Αποκατάσταση της Bcl-2 έκφραση ή γενετική εκτομή του Βαχ σε HCT116 κατάργησε το σχηματισμό LC3

+ αυτοφαγικά κενοτόπια που προκαλείται από FK-16 (40 μΜ? 48 ώρες) όπως προσδιορίζεται με ομοεστιακό ανοσοφθορισμού (400 Χ). (D) Αποκατάσταση της Bcl-2 έκφραση ή γενετική εκτομή του Βαχ αντιστραφεί μερικώς την ανασταλτική επίδραση της FK-16 σχετικά με τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε HCT116 όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.D. τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

σ

& lt? 0,05? **

ρ

& lt? 0,01 σημαντικά διαφορετικό από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου.

††,

σ

& lt? 0,01 σημαντικά διαφορετικό από κενό φορέα-επιμολυσμένα ή Bax

+/- κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με FK-16

Η

Αμοιβαίες κανονισμού μεταξύ. κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση και αυτοφαγικά

κυτταρικού θανάτου

Για να διαλευκανθεί το δυναμικό στιχομυθία μεταξύ αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο και ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση στη δράση της FK-16, αυτές οι δύο κυτταρικές διεργασίες καταργήθηκαν από την RNA παρεμβολής. Οι νοκ ντάουν αποτελεσματικότητες Atg5-, Atg7-, AIF- και EndoG-siRNA που επιβεβαιώθηκαν με κηλίδα Western (Εικ. 5Α). Αναστολή της αυτοφαγία από Atg5- ή ATG7-siRNA επαυξημένης ουσιαστικά πυρηνική έκφραση του ΟΕΕ και EndoG προκαλείται από FK-16 (Εικ. 5Β). Να συμπίπτει, knockdown του Atg5 ή ATG7 ενισχυμένη επίσης FK-16-επαγόμενη φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευση (Σχ. 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή της autophagy ενταθεί FK-16-επαγόμενη ΟΕΕ /EndoG εξαρτώμενη απόπτωση. Αντίστοιχα, η κατάργηση του ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση από AIF- ή EndoG-siRNA ενισχυμένη έκφραση Atg5 και ATG7 προκαλείται από FK-16 (Εικ. 5D), υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση μεγεθύνεται το αυτοφαγικά σήμα στο FK- 16-θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Να συμπίπτει, AIF- και EndoG-siRNA που ενίσχυσε την έκφραση της LC3-I /II. Τα ευρήματα έδειξαν την ύπαρξη αδήλωτης αμοιβαία ρύθμιση μεταξύ αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο και ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση.

(Α) Οι νοκ ντάουν αποτελεσματικότητες AIF-, EndoG-, Atg5- και ATG7-siRNA που επιβεβαιώθηκαν από προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης των αντίστοιχων στόχων σε HCT116. (Β) Νοκ ντάουν της Atg5 ή ATG7 αυξημένη βασική και FK-16-επαγόμενη (40 μΜ? 6 ώρες) πυρηνική έκφραση του ΟΕΕ και EndoG. (C) Νοκ ντάουν της Atg5 ή ATG7 αυξημένη FK-16-επαγόμενη (40 μΜ? 48 ώρες) φωσφατιδυλ εξωτερίκευσης όπως προσδιορίζεται με χρώση αννεξίνης V και κυτταρομετρία ροής. (D) Νοκ ντάουν του ΟΕΕ ή EndoG αυξημένη βασική και FK-16-επαγόμενη (40 μΜ? 48 ώρες) Atg5 και ATG7 έκφραση της πρωτεΐνης. (Ε) Νοκ ντάουν της Atg5 ή ATG7 καταργηθεί, ενώ Νοκ ντάουν του ΟΕΕ ή EndoG ενισχυμένη FK-16-επαγόμενη (40 μΜ? 48 ώρες) LC3 Ι-ΙΙ έκφραση /στην HCT116. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Διέγερση απόπτωσης σε κύτταρα όγκου έχει από καιρό αναγνωριστεί ως ένα ουσιαστικό προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου [33]. Ωστόσο, η εγγενής αντίσταση ορισμένων καρκινικών κυττάρων στην απόπτωση και την ταχεία regrowth του όγκου μετά την αρχική απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες παραμένουν μείζονες κλινικές conundrums. Ως εκ τούτου, υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον εντός της επιστημονικής κοινότητας στη μελέτη την πλήρη γκάμα της κασπάσης-ανεξάρτητο κυτταρικό θάνατο και τον εντοπισμό των παραγόντων που δρουν κυρίως μέσω του μηχανισμού της κασπάσης-ανεξάρτητη. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η αγωγή με την αντικαρκινική πεπτίδιο FK-16 μειώνεται έντονα την βιωσιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων απουσία της ενεργοποίησης κασπάσης ή διαπερατοποίηση μεμβράνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ούτε ο κλασσικός κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση ούτε νέκρωση ήταν υπεύθυνη για την κυτταροτοξικότητα του . Για το σκοπό αυτό, FK-16-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν βιοχημικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών συνεπής με ΟΕΕ /EndoG εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο. Πάνω απ ‘όλα, knockdown των γονιδίων κεντρικής σε αυτές τις δύο κυτταρικές διεργασίες εξασθένησε την κυτταροτοξικότητα της FK-16. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η FK-16 είναι ένας ενεργοποιητής διπλής λειτουργίας της κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου. Ωστόσο, είναι επίσης αξίζει να σημειωθεί ότι σε ορισμένες πειραματικές ρυθμίσεις (Σχήμα 1 G & amp?. 3C), FK-16 μετρίως αυξημένη χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να εξηγηθεί από την αυξημένη κυτταρικό στρες που συνδέεται με siRNA επιμόλυνση, η οποία θα μπορούσε να καταστήσει τα κύτταρα πιο ευαίσθητα στη μεμβράνη που διαταράσσουν επίδραση της FK-16.

Ένας αριθμός κυτταρικών τονίζει, συμπεριλαμβανομένων των βλαβών του DNA και του ογκογονιδίου ενεργοποίηση, έχουν δειχθεί ότι ενεργοποιούν ρ53. Ανάλογα με το αρχικό ερέθισμα και την κυτταρική έννοια, η ενεργοποίηση της ρ53 θα μπορούσε να προκαλέσει ένα ρεπερτόριο των απαντήσεων, συμπεριλαμβανομένων διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, κυτταρική γήρανση, τη διαφοροποίηση και autophagy [34]. Δεδομένου ότι η απώλεια της έκφρασης p53 είναι κοινή σε ανθρώπινους καρκίνους, αποκαθιστώντας δραστηριότητα της ρ53 είναι μια ελκυστική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου. Από αυτή την άποψη, ένας αριθμός πειραματικών αντικαρκινικών παραγόντων p53-αποκατάσταση (π.χ. CP-31,398 και νουτλίνη) έχουν ταυτοποιηθεί [35]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η FK-16 είναι ένα μυθιστόρημα ενεργοποιητής της σηματοδότησης ρ53. FK-16 όχι μόνο αύξησε συσσώρευση πυρηνικών p53, αλλά επίσης προκάλεσε την έκφραση της PUMA και Bax, δύο από τα οποία είναι γνωστά μεταγραφικού στόχους της ρ53 [36], [37]. Νοκ ντάουν του p53 αντιστρέφεται επίσης FK-16-επαγόμενη ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η προ-αποπτωτικά και pro-αυτοφαγικά επίδραση της FK-16 απαιτούνται ρ53-εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση του Βαχ και προς τα κάτω ρύθμιση του Bcl-2. Σε γραμμές με αυτά τα ευρήματα, οι κεντρικές ρόλους του p53-Bax /Bcl-2 καταρράκτη στην εξαρτώμενη EndoG ΟΕΕ /απόπτωση και αυτοφαγία έχουν αναφερθεί. Για παράδειγμα, ένα ανάλογο του DNA που βλάπτουν κυκλοφωσφαμίδη φαρμάκου και μια μεγάλη πολυφαινόλης πράσινου τσαγιού έχουν δειχθεί ότι ενεργοποιούν ρ53 και Bax για να προκαλέσει την πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ και EndoG να μεσολαβήσει απόπτωση σε κύτταρα όγκου [32], [38]. p53 ως μεταγραφικός παράγοντας διεγείρει επίσης αυτοφαγία μέσω επαγωγής πολλαπλές pro-αυτοφαγικά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

DRAM

,

SKP2

,

SESN2

, και

ULK1 /2

, εκτός από

PUMA

και

ΒΑΧ

[30]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της ρ53 θα μπορούσε να προωθήσει την διάσταση του συμπλόκου Bcl-2-Beclin-1 και ως εκ τούτου disinhibiting Beclin-1-εξαρτώμενη autophagy [39].

Ένα ενδιαφέρον εύρημα που αναδύεται από αυτή την εργασία είναι η ανακάλυψη της αμοιβαιότητας ρυθμιστικό μηχανισμό μεταξύ των δύο οδών κυτταρικού θανάτου κασπάσης-ανεξάρτητη. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η κατάργηση του ΟΕΕ /EndoG-εξαρτώμενη απόπτωση ενισχύει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο και αντιστρόφως, υποδεικνύοντας ότι οι δύο αυτές πορείες μεσολαβούν την κυτταροτοξικότητα της FK-16 σε ένα συνεργατικό τρόπο. Αν και FK-16-επαγόμενη αυτοφαγία βρίσκεται να είναι προ-θάνατος στη φύση, αποκλεισμός του autophagy επάγει παραδόξως κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση σε FK-16-κατεργασμένα κύτταρα. Μια εξήγηση για αυτό το αίνιγμα είναι ότι αποκλεισμός της FK-16-επαγόμενη autophagy εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο, αλλά εξακολουθεί να ενεργοποιεί κασπάση-ανεξάρτητη απόπτωση σε αντισταθμιστική τρόπο και το καθαρό αποτέλεσμα είναι η διατήρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα στα οποία και οι δύο οδούς κυτταρικού θανάτου είναι ενεργοποιηθεί. Για το σκοπό αυτό, η άμεση συμβολή του αυτοφαγία στο θάνατο του κυττάρου έχει αναφερθεί ευρέως, παρά τις πρόσφατες διενέξεις για την πραγματική ύπαρξη του «αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου» [40], [41], [42], [43]. Ενώ συν-ενεργοποίηση αυτοφαγία και κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση έχει τεκμηριωθεί σε διάφορα βιολογικά περιβάλλοντα [44], [45], [46], υπάρχουν μόνο σποραδικές μελέτες στη βιβλιογραφία που έχουν προσπαθήσει να αποσαφηνιστεί η σχέση μεταξύ αυτών των δύο διαδικασιών. Συνεπής με τα ευρήματά μας, Zheng

et al.

Και Άιμερ

et al.

Διαπίστωσε ότι αυτοφαγία θα μπορούσε να προστατεύσει έναντι της κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση σε Hoechst 33342 επεξεργασμένα κύτταρα HeLa και ερλοτινίμπη επεξεργασμένα κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αντίστοιχα [47], [48]. Αναστολή της autophagy με 3-μεθυλαδενίνη επιταχύνει επίσης rottlerin επαγόμενη κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου ινοσαρκώματος ΗΤ1080 [49].

Ταυτοποίηση των αντικαρκινικών πεπτιδίων από την υπάρχουσα βάση δεδομένων AMP είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων καρκίνο θεραπευτική. Σε αυτή τη μελέτη, FK-16, ένα θραύσμα του LL-37, παρουσιάζει μια καλύτερη αντικαρκινική δράση από το πεπτίδιο πλήρους μήκους. FK-16 εμπλέκει επίσης ένα πρόσθετο μονοπάτι κυτταρικού θανάτου, δηλαδή, αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο. Η συντομευμένη διάρκεια της FK-16 μπορεί επίσης να μειώσει το κόστος παραγωγής που συνδέεται με πεπτιδική σύνθεση. Στο σύνολό τους, η αντικαρκινική πεπτίδιο FK-16 επάγει ΟΕΕ /EndoG εξαρτώμενη απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο μέσω της κοινής ρ53-Ββχ /Bcl-2 καταρράκτη σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα (Εικ. 6). Τα δεδομένα μας αποκαλύπτει επίσης μια νέα αμοιβαία ρύθμιση μεταξύ των δύο αυτών οδών κυτταρικού θανάτου κασπάσης-ανεξάρτητη.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Τα πεπτίδια

Το συνθετικό LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) και ομελέτα FK-16 (DQVLRFRNFRIKLVKI) πεπτιδίων με καθαρότητα & gt?. 95% αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)

Cell Culture and Cell Βιωσιμότητας Δοκιμασία

το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT116 και LoVo ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bax

– /- και Bax

+/- κύτταρα HCT116 παρήχθησαν μέσω γονιδιακής στόχευσης [50] και παρέχονται από τον καθηγητή Bert Vogelstein (Ludwig Κέντρο στο Johns Hopkins). Το ανθρώπινο hormal παχέος εντέρου βλεννογόνου επιθηλιακά κυτταρική σειρά NCM460 αποκτήθηκε από INCELL Corporation. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε αντίστοιχες συνιστώμενη μέσα καλλιέργειας τους, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα . Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου] δοκιμασίας. Εν συντομία, 5000 κύτταρα τοποθετήθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά την επεξεργασία, το διάλυμα ΜΤΤ διαλύθηκε σε μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 0,5 mmol /L προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες. Διμεθυλοσουλφοξείδιο προστέθηκε στη συνέχεια διαλυτοποίηση ΜΤΤ τετραζολίου κρύσταλλο. Τέλος, η οπτική πυκνότητα προσδιορίστηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα Benchmark Plus μικροπλάκα αναγνώστη (Bio-Rad, Hercules, USA).

Η ποσοτικοποίηση της φωσφατιδυλοσερίνης Εξωτερίκευση

Για τη μέτρηση της φωσφατιδυλσερίνης εξωτερίκευσης, επεξεργασμένα κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χρώση ιωδιούχου προπιδίου και αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (Invitrogen, USA). Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε σκοτάδι, διπλά επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα FACSCalibur Σύστημα και CellQuest.

Πυρηνική Εκχύλιση πρωτεϊνών και Western Blot

Η απομόνωση των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας NucBuster Kit πρωτεΐνη Extraction (EMD Biosciences, Darmstadt, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την απομόνωση των πρωτεϊνών ολόκληρου κυττάρου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό ραδιοανοσοκατακρήμνισης περιέχει αναστολείς πρωτεϊνάσης και φωσφατάσης.