Αφηρημένο

Παραλλαγές σε ρυθμιστικές περιοχές προβλέπεται ότι θα διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία της νόσου των κοινών ασθενειών. Πολυμορφισμούς χαρτογράφηση σε microRNA (miRNA) έχουν θέσεις δέσμευσης έχει αποδειχθεί ότι διαταράσσουν την ικανότητα των miRNAs να στοχεύουν τα γονίδια με αποτέλεσμα διαφορική mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης.

ευαισθησία του όγκου του δέρματος 5

(

Skts5

) αναγνωρίστηκε ως μια ευαισθησία που προσδίδει τόπο σε χημικά που προκαλείται από τον καρκίνο του δέρματος σε ΝΙΗ /Ola από SPRET /Ετερόγαμα ανάδρομες διασταυρώσεις F1. Για να προσδιορίσετε αν πολυμορφισμοί μεταξύ των στελεχών που αντιστοιχίζονται σε υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miRNA στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) των γονιδίων σε

Skts5

επηρεάζεται έκφρασης, πραγματοποιήσαμε μια συστηματική αξιολόγηση των 3’UTRs των υποψηφίων γονιδίων σε αυτό το τόπο. Εννέα γονίδια είχαν πολυμορφισμοί στο 3’UTRs τους, τα οποία ταιριάζουν τα δεδομένα σύνδεσης και οκτώ από αυτούς περιείχαν πολυμορφισμούς ύποπτο να παρεμβαίνει με ή να εισάγουν δεσμευτικές miRNA. 3’UTRs έξι γονίδια,

Bcap29

,

Dgkb, HBP1, Pik3cg, Twistnb

, και

Tspan13

επηρεάζονται διαφορετικά έκφραση λουσιφεράσης, αλλά δεν φαίνεται να ρυθμίζεται διαφορικά από τους αξιολογήθηκαν miRNAs προβλέπεται να συνδεθεί με μόνο μία από τις δύο ισομορφές. 3’UTRs από τέσσερα επιπλέον γονίδια που επιλέγεται από τον τόπο που ταιριάζουν λιγότερο αυστηρά κριτήρια αξιολογήθηκαν.

Ifrd1

και

Etv1

έδειξε διαφορές και περιείχαν πολυμορφισμούς προβλέπεται να διακόψει ή να δημιουργήσουν θέσεις δέσμευσης miRNA αλλά έδειξε καμία διαφορά στη ρύθμιση των miRNAs δοκιμαστεί. Εν ολίγοις, πολλαπλές 3’UTRs με υποτιθέμενο λειτουργικές παραλλαγές μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών στελεχών των ποντικών επηρεάζεται διαφορικής έκφρασης ανεξάρτητα της δέσμευσης προβλέψει miRNA

Παράθεση:. Skeeles LE, Φλέμινγκ JL, Mahler KL, Toland ΑΕ (2013) Η Επιπτώσεις της 3’ΙΙΤΡ Παραλλαγές για διαφορική έκφραση των υποψήφιων Καρκίνου Ευαισθησία γονίδια. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10.1371 /journal.pone.0058609

Επιμέλεια: Akio Kanai, Πανεπιστήμιο του Keio, Ιαπωνία

Ελήφθη: 16 Οκτ, 2012? Αποδεκτές: 6 Φεβ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Skeeles et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από MGO ΕΓΓ-07-083 από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία, CA134461 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου και το OSU Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Toland είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας του PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Mus spretus

ποντίκια είναι ανθεκτικά στον καρκίνο του δέρματος σε σύγκριση με το

Mus musculus

ποντίκια. Σε προηγούμενες μελέτες σύνδεσης του διμεθυλοβενζ [α] ανθρακενίου (DMBA) /12-Ο-δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13-οξικό (ΤΡΑ) – προκληθέντα καρκίνο του δέρματος ένας αριθμός καρκίνου του δέρματος loci ευαισθησία εντοπίστηκαν στην SPRET /ετερόμικτα από ποντικούς ΝΙΗ /Ola F1 αναδιασταύρωσης [1] – [4]. Σύνδεση μελέτες διεξήχθησαν επίσης χρησιμοποιώντας SPRET /EIJ από FVB /Ν, SPRET /EIJ από ΝΙΗ /Ola και STF /Pas από ΝΙΗ /Ola F1 διασταυρώσεως ποντίκια τα οποία προσδιορίζονται επιπλέον τόπους ευαισθησία. Ένας από τους τόπους ευαισθησία του δέρματος,

όγκων του δέρματος ευαισθησία 5

(

Skts5

), βρέθηκε στο SPRET /όμαιμο από ΝΙΗ /Ola διασχίζει, αλλά όχι σε STF /Pas από ΝΙΗ /Ola F1 ή SPRET /eIJ από FVB /Ν διασχίζει [3], [4]. Σύνδεση αποτελέσματα για SPRET /EIJ από ΝΙΗ /Ola ήταν διφορούμενα για την περιοχή αυτή. Αναλύσεις αλληλουχίας των 54 γονιδίων που κωδικοποιούν και στοιχεία σε μια περιοχή κορυφής δεσμού 14-Mb σε

Skts5

οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός αριθμού κωδικοποίησης αλλαγές που συμφωνούν με την αναλύσεις διασύνδεσης (Mahler et al. 2008).

γονιδιακή έκφραση απόκλιση είναι τεκμηριωθεί ότι είναι τόσο σημαντική, αν όχι περισσότερο σημαντική, για επιδεκτικότητα ασθένειας ως μη συνώνυμες κωδικοποίησης αλλαγές [5]. διαφορές της γονιδιακής έκφρασης οφείλεται σε κληρονομικούς παράγοντες μπορεί να προκληθεί από τις διακυμάνσεις στην ενισχυτή ή θέσεις δέσμευσης υποκινητή, μεταβολές στην επιγενετική ρύθμιση επηρεάζει μεθυλίωση ή χρωματίνης τροποποιήσεις, μεταβολές στην έκφραση των trans-δρώντες παράγοντες ή οι διαφορές στη ρύθμιση από microRNAs (miRNAs) [6] – [9]. πολυμορφισμών Single νουκλεοτιδίου (SNPs) που εμπίπτουν ειδικά στην μη μεταφραζόμενη περιοχή 3 (3’UTR) γονιδίων μπορεί να επηρεάσει την σταθερότητα του mRNA και τη μετάφραση μέσω συνέπειες για πολυαδενυλίωση και ρυθμιστικής πρωτεΐνης-mRNA και των αλληλεπιδράσεων miRNA-mRNA [10] – [12]. Προκαταρκτικές μελέτες σε ανθρώπους έχουν ταυτοποιήσει παραλλαγές στην 3’UTR των γονιδίων που φαίνεται να επηρεάζουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου διαταράσσοντας δέσμευσης [13] κανονική miRNA, [14]. Μία τέτοια παραλλαγή στο

KRAS2

γονίδιο αυξάνει τον κίνδυνο για πνεύμονα και τον καρκίνο των ωοθηκών, αλλάζοντας την ικανότητα των miRNA

ας-7

να δεσμεύσει [15], [16]. Μια άλλη μελέτη σε ποντίκια κοίταξε miRNA συμπληρωματικές χώρους για τρεις miRNAs που εισήχθησαν ή διαταράσσεται από SNPs από αλληλομόρφων-ανισορροπία αλληλουχίας [17]. Οι διαφορές στην έκφραση τοποθέτηση με τα δεδομένα RNA-αλληλουχία παρατηρήθηκαν για ένα μεγάλο ποσοστό των θεωρούμενων γονιδίων στόχων, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι διακυμάνσεις της 3’UTRs έχουν βασικό ρόλο διαφορές γονιδιακή έκφραση μεταξύ των ατόμων.

Για να προσδιοριστεί εάν πολυμορφισμούς σε υποθετικές miRNA θέσεις πρόσδεσης επηρέαζαν τη γονιδιακή έκφραση και θα μπορούσε να είναι λειτουργική υποψήφιοι για

Skts5

, πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση των περιοχών 3’ΙΙΤΡ για τα γονίδια σε όλη τη θέση. Εντοπίσαμε ακολουθία παραλλαγές σε εννέα γονίδια που ταιριάζει με την ανάλυση σύνδεσης (ήταν πολυμορφικοί μεταξύ SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola και δεν διαφέρουν μεταξύ STF /PAS και ΝΙΗ /Ola ή SPRET /EIJ και FVB /N). SNPs από οκτώ από αυτές τις 3’UTRs είχαν προβλεφθεί για τη χαρτογράφηση σε υποθετικές θέσεις πρόσδεσης microRNA. Ένα επιπλέον 18 γονίδια ήταν πολυμορφικοί μεταξύ SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola και SPRET /EIJ και FVB /N, αλλά όχι μεταξύ STF /PAS και ΝΙΗ /Ola. Εδώ, περιγράφουμε τα αποτελέσματα των παραλλαγών από αυτά τα γονίδια υποψήφια ευαισθησία στην έκφραση.

Υλικά και Μέθοδοι

ζωικό υλικό και κυτταρικές σειρές

Δεν υπάρχουν ζώα που ζουν χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ? υπάρχον DNA και ιστοί που παρέχονται από τους συνεργάτες ή μέσω εμπορικών πηγών. Η UCSF και το Πανεπιστήμιο του Roswell Park Θεσμικών φροντίδα των ζώων και των Επιτροπών Χρήση (IACUC) ενέκρινε το αρχικό έργο ζώου που παράγει τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Εργαστήριο προέλευση του καθενός από τα στελέχη των ποντικών στη μελέτη έχουν ως εξής: STF /PAS (καθαρή σειρά διατηρείται από το Ινστιτούτο Παστέρ), SPRET /eij (καθαρή σειρά διατηρείται από την Jackson Laboratories, Bar Harbor, ΜΕ), όμαιμο

spretus

(SPRET /Ετερόγαμα, όμαιμο γραμμή διατηρείται από Hiroki Nagase, Roswell Park Institute), FVB /Ν (καθαρή σειρά διατηρείται από τα εργαστήρια Jackson) και ΝΙΗ /Ola (καθαρή σειρά διατηρείται από Allan Balmain). ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα είναι ομόζυγο σε όλη την

Skts5

. Οι ιστοί για τους ποντικούς ΝΙΗ /Ola παρασχέθηκαν από τον Dr. Allan Balmain και ιστών για SPRET /ετερόμικτα ποντίκια δόθηκαν από Hiroki Nagase. DNA απομονώθηκε από ουρές ή σπλήνες ποντικών SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους [18]. SPRET /EIJ και FVB /Ν του DNA και των ιστών αγοράστηκαν από τα Jackson Laboratories. STF /PAS DNA ήταν ένα δώρο από τον Xavier Montagutelli, DVM, PhD του Ινστιτούτου Παστέρ. C5N, ένα μη-ανοσογόνο κερατινοκυττάρων ποντικού γραμμή που λαμβάνεται από Allan Balmain, διατηρήθηκε σε 1χ κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (ϋΜΕΜ) με 10% Εμβρυϊκό Βόειο Ορό (FBS) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αντιβιοτικό.

Ακολουθία ανάλυση

3’UTRs της χαρτογράφησης 39 γονίδια στο

Skts5

για τις οποίες δεν είχαμε δεδομένα ακολουθίας για όλα τα στελέχη που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις σύνδεσης προσδιορίστηκαν με τη χρήση της βάσης δεδομένων Ensembl, χτίζει 35-48 . Σχεδιάσαμε εκκινητών PCR με τη χρήση web-based πρόγραμμα SciTools PrimerQuest Ενσωματωμένη τεχνολογία του DNA [https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest? San Diego, CA]. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Εχο /SAP-IT (USB, Cleveland, ΟΗ) για την απομάκρυνση μονόκλωνο DNA. Αυτοματοποιημένη ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR διεξήχθη σε έναν ΑΒΙ 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA) με τυποποιημένες μεθόδους. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την ανάλυση της αλληλουχίας. Εμπρός και όπισθεν ακολουθία διαβάζει αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Lasergene /DNAstar 3.0 (DNASTAR, Madison, WI). Τα ίχνη ακολουθία επιθεωρήθηκαν οπτικά κάθε φορά που μια υποκατάσταση νουκλεοτιδίου υποδείχθηκε.

Αναγνώριση πιθανών microRNA θέσεων δέσμευσης

3’ΙΙΤΡ πολυμορφισμοί που παρατηρήθηκαν μόνο μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα αξιολογήθηκαν σε διαπιστώσετε αν διαταράσσεται ή να εισαχθούν

in silico

προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης microRNA. Τέσσερα προγράμματα χρησιμοποιήθηκαν: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (https://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], Πατροκλής ο Μακεδόνας Finder (www.patrocles.org) [21] και MicroSNiPer (https://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda μας επέτρεψε να προβλέψουμε αν SNPs μας ενδιαφέρουν διαταράσσεται θέσεις πρόσδεσης miRNA στο στέλεχος αναφοράς του ποντικιού, το οποίο ήταν πολύ παρόμοια με ΝΙΗ /Ola 3’UTRs. Τα άλλα τρία προγράμματα επιτρέπουν μοναδικές αλληλουχίες που θα αναλυθεί για θέσεις πρόσδεσης microRNA. Για τις περιοχές που προβλέπονται από MicroInspector, θεωρήσαμε πρώτο εκείνα που είχαν προβλεφθεί ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE) μεγαλύτερη από -15 kcal /joule σε μια μορφή και μια MFE μικρότερη των -20 kcal /joule σε άλλη μορφή. Όταν επαναξιολογηθεί, μόνο εκείνα τα οποία εκτιμάται ότι θα έχουν MFE μεγαλύτερη από -18 kcal /joule σε μια μορφή και μια MFE των -22 kcal /joule ή λιγότερο στην άλλη μορφή, όπως έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για

Mus musculus

[20], ελέγχθηκαν περαιτέρω πειραματικά. -22 Kcal /J ή λιγότερο θεωρήθηκε ισχυρή δέσμευση και -18 kcal /J ή υψηλότερο θεωρήθηκε καθόλου ή πολύ αδύναμη δεσμευτική. Πατροκλής ο Μακεδόνας και MicroSNiPer επιτρέπουν τη σύγκριση δύο μοναδικές αλληλουχίες για τις διαφορές στα προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης. MicroSNiPer απαιτεί SNPs που πρέπει να εγγραφούν στο πρόγραμμα πρόβλεψης, έτσι ώστε αυτό το εργαλείο δεν ήταν σε θέση να προβλέψει sites που δημιουργούνται ή διαταράσσεται από εισαγωγές ή διαγραφές. Χρησιμοποιώντας MicroInspector, Πατροκλής ο Μακεδόνας, και MicroSNiPer, πήραμε υποψήφιος miRNAs που προβλέπεται να συνδεθεί με μόνο το στέλεχος ποντικού (ΝΙΗ /Ola ή SPRET /Ετερόγαμα), που αποδεικνύεται χαμηλότερη έκφραση όπως μετράται από την έκφραση δοκιμασία λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ μας και ότι περιείχε ένα πολυμορφισμός στην θέση πρόσδεσης του miRNA που ταιριάζουν με τα αποτελέσματα της σύνδεσης του ποντικιού.

Κλωνοποίηση

Ένα τμήμα της κάθε υποψήφιο γονίδιο 3’UTR που περιλαμβάνονται πολυμορφικές θέσεις που ταιριάζουν με τη σύνδεση του ποντικιού και είχαν προβλεφθεί στην αλληλεπιδρούν με σύνδεση miRNA κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα ελέγχου Clontech pGL3 (Mountain View, CA) (Πίνακας S1). Ο φορέας γραμμικοποιήθηκε με αντίστροφη PCR (iPCR) χρησιμοποιώντας Advantage HD Polymerase Mix (Clontech), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. iPCR εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό IDT PrimerQuest. Γραμμική προϊόντα διαχωρίστηκαν από κυκλικό φορέα χρησιμοποιώντας το QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Frederick, MD). εκκινητές PCR για την κλωνοποίηση χρησιμοποιώντας Σε-σύντηξης πρωτόκολλο κιτ κλωνοποίησης HD Clontech έχουν σχεδιαστεί με τη χρήση του λογισμικού IDT PrimerQuest (Πίνακας S2). Τα προϊόντα PCR ενισχύθηκαν από ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα DNA, καθαρίστηκαν, και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα 3 ‘του γονιδίου της λουσιφεράσης με ανασυνδυασμό χρησιμοποιώντας κιτ κλωνοποίησης In-Fusion HD Clontech, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το πλασμιδικό DNA αναλύθηκε με πέψη περιορισμού και οι κλώνοι επαληθεύτηκαν αλληλουχία με αλληλούχιση Sanger.

Η τοπο-Directed Mutagenesis

Για γονίδια στα οποία ο ΝΙΗ /Ola ή SPRET /Ετερόγαμα 3’UTR ήταν δύσκολο να κλώνος, πολυμορφικές θέσεις οι οποίες ταιριάζουν με το δεσμό ποντίκι άλλαξαν με τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (SDM) χρησιμοποιώντας πλασμίδια που περιείχαν το 3’UTR του άλλου στελέχους ως εκμαγείο. εναύσματα SDM σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας QuikChange Primer Πρόγραμμα Σχεδιασμού Stratagene, καθώς και SDM διεξήχθη χρησιμοποιώντας QuikChange Lightning πολλαπλών ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis Kit Strategene ανά κατασκευαστή συνιστώμενες συνθήκες (Agilent, Santa Clara, CA). Μεταλλαγμένες πλασμίδια επαληθεύτηκαν αλληλουχία.

Δοκιμασίες

Οι επιμολύνσεις /λουσιφεράση

κύτταρα C5N συν-επιμολύνθηκαν με τις pGL3 In-Fusion προϊόντα, ρΡΙ_-ΤΚ Renilla φορέα λουσιφεράση πυγολαμπίδας (Promega, Madison, WI) , και προ-miRNAs ή πρόδρομες MirVana μιμούνται miRNA (Ambion /Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη) για αναλύσεις miRNA. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη με Αντιδραστήριο Plus (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island ΝΥ) για επιμολύνσεις 3’UTR DNA και Lipofectamine 2000 (Invitrogen) για επιμολύνσεις χρησιμοποιώντας πλασμίδια (600 ng /φρεάτιο από κάθε πλασμίδιο) και προδρόμων miRNA ή κωδικοποιημένο μάρτυρες ( 13 pmole /φρεάτιο για μια 12-φρεατίων). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, πρωτεΐνη απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Μ-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), και το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Ribozol (ISC Bioexpress, Kaysville, UT). Για λουσιφεράση μετρήσεις, ένα D-λουσιφερίνης (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ) μίγμα, που περιέχει DTT και γλυκυλγλυκίνη προστέθηκε σε 30 μΐ απομονωθεί πρωτεΐνης σε ένα Vertias Microplate Luminometer χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Veritas Luciferase Assay (Promega, Madison, WI). Για να ενεργοποιήσετε την αντίδραση ενός ΑΤΡ μείγμα, με DTT, γλυκυλγλυκίνη, EGTA, μαγνήσιο

4, και K2PO

4, προστέθηκε. Μια δοκιμασία ρεπόρτερ ελέγχου περιλαμβάνονται η μητρική Coelenterizine (NanoLight Technologies, Pinetop, AZ) με ΑΤΡ, DTT, γλυκυλγλυκίνη, EGTA, μαγνήσιο

4, και K2PO

4, προστίθεται σε 30 μλ απομονωμένη πρωτεΐνη ακολουθώντας το πρωτόκολλο Promega Renilla. Λουσιφεράσης σχετική μονάδα φωτός διαβάζει ομαλοποιήθηκαν σε Renilla λουσιφεράσης. Luciferase αναλογίες σε σχέση με την ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα φαίνονται. Διαμολύνσεις και οι δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν τουλάχιστον δύο φορές για κάθε 3’UTR σύνολο των κατασκευών και της δοκιμασίας miRNA με την εξαίρεση του

miR-3064-3p

(

Pik3cg

), η οποία ήταν μόλις δοκιμάστηκε μία φορά και έδειξε πειστικά αποτελέσματα της χωρίς διαφορές. Student t-τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό σημασία των διαφορών έκφρασης.

Επιπλέον πειραματικές συνθήκες δοκιμάστηκαν για επιμολύνσεις με το

Twistnb

3’UTRs μαζί με το

miR-3074-5p

και /ή

miR-691

. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω εκτός του ότι τα κύτταρα C5N συλλέχθηκαν στις 24, 48, και 72 ώρες χρησιμοποιώντας μία υψηλότερη συγκέντρωση miRNA (26 pmoles) ή και τα δύο μαζί miRNAs (26 pmoles από το καθένα). Μια χαμηλότερη δόση των επιμολυσμένων miRNA (7 pmoles) ή και τα δύο μαζί miRNAs (7 pmole έκαστο) αξιολογήθηκε επίσης για επίδραση της

Twistnb

3’UTRs στις 24 και 48 ώρες. Επιπλέον πειράματα για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της

miR-3074-5p

στο

Twistnb

ισομορφές περιλαμβάνονται επιμολύνσεις στα κύτταρα C5N με ένα αντι-miRNA για

miR-3074-5p

ή ένας αναστολέας αρνητικό έλεγχο σε 24 και 48 ώρες μετά επιμόλυνση σε δύο συγκεντρώσεις (13 pmoles και 30 pmoles).

επιβεβαίωση των miRNA επιμόλυνσης με ποσοτική PCR (qPCR)

Για να επιβεβαιώσετε miRNA επιμόλυνση, RNA ήταν απομονώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ RT Multiscribe Applied Biosystem του σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (LifeTechnologies /Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Taqman ανιχνευτές για qPCR miRNAs αγοράστηκαν από την Applied Biosystems.

Sno202

χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σχετική έκφραση. qPCR διεξήχθη εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Πειράματα που περιλαμβάνονται no-RT και δεν τους ελέγχους πρότυπο. όριο κύκλου τιμές (CT) ήταν κατά μέσο όρο σε όλη την τριπλούν και τις αξίες CT δέλτα υπολογίστηκαν μεταξύ κάθε δοκιμής miRNA και πλαστή ελέγχου.

Αναγνώριση των υποψηφίων microRNA

Για να περιορίσετε τη λίστα των υποψήφιων microRNAs (miRNAs) , αναλύσαμε τόσο το ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα μορφές αυτών των θέσεων δέσμευσης σε δύο ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE) εργαλεία πρόβλεψης, RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] και RNAcofold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Έχουμε βελτιωθεί περαιτέρω λίστα των υποψήφιων 3’UTRs σε εκείνους των οποίων οι SNPs είχαν προβλεφθεί για να προκαλέσει μια 5 kcal /J ή μεγαλύτερη διαφορά στην miRNAbinding MFE μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /όμαιμο από τα δύο εργαλεία πρόβλεψης (Πίνακας S3).

Αξιολόγηση της έκφρασης mRNA με qPCR

για την ταυτοποίηση των γονιδίων που δείχνουν διαφορική έκφραση, RNA απομονώθηκε από ουρές των ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα ποντίκια χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις κατασκευαστή συνιστώμενες συνθήκες. Ένα μικρογραμμάριο RNA από κάθε ζώο αντιστράφηκε μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Για την εκτίμηση της έκφρασης του mRNA των υποψηφίων

Skts5

γονίδια, Taqman ανιχνευτές αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Sciences Life Technologies). Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν. Τρία γονίδια ελέγχου,

L19

,

Ppia

και

Hprt

, χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό σχετική έκφραση και η μέση διαφορά σε έκφραση υπολογίστηκε στις τρεις ελέγχους. Πειράματα που περιλαμβάνονται κενά νερό και δεν-RT ελέγχους. Σημασία της διαφορικής έκφρασης καθορίστηκε με Student Τ-τεστ.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των υποψηφίων 3’UTRs για τη μελέτη

Skts5

είναι ένας όγκος του δέρματος θέση ευαισθησίας προηγουμένως ταυτοποιηθεί σε F1 ποντικούς αναδιασταύρωσης μεταξύ ευπαθών ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα στελέχη [4], [25]. Σύνδεση σε αυτό το τόπο δεν βρέθηκε σε επαναδιασταυρώσεις F1 μεταξύ ΝΙΗ /Ola και STF /PAS ή μεταξύ FVB /N και SPRET /eij, άλλα ανθεκτικά δέρμα στελέχη του Mus spretus υποδηλώνοντας ότι δυνητικά λειτουργικές παραλλαγές αλληλουχία η οποία ήταν παρόντα σε SPRET /Ετερόγαμα, αλλά όχι σε STF /PAS ή SPRET /eIJ, θα μπορούσε να θεωρηθεί ως υποψήφιος παραλλαγές. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε την αλληλουχία που κωδικοποιεί τα εξώνια για 54 γονίδια στο ελάχιστο

Skts5

περιοχή σύνδεσης σε στελέχη ποντικών επιρρεπείς σε καρκίνο του δέρματος (ΝΙΗ /Ola και FVB /N) και ποντικούς ανθεκτικό σε καρκίνο του δέρματος (SPRET /Ετερόγαμα , SPRET /eIJ, STF /PAS) [4]. Στην αρχική μας μελέτη, δεν ολοκληρώσει προσδιορισμού του γονότυπου του συνόλου 3’UTRs για όλα τα γονίδια σε όλες τις στελέχη ποντικών που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη. Για να δημιουργήσετε τα δεδομένα που λείπουν ακολουθία, μπορούμε αλληλουχία η μεγαλύτερη 3’UTR έκδοση των 39 γονιδίων για τα στελέχη για τα οποία έχουμε έλειπαν τα δεδομένα, κυρίως STF /PAS. Των γονιδίων αξιολογούνται, υπήρχαν 24 3’ΙΙΤΡ πολυμορφισμούς από εννέα γονίδια, τα οποία ταιριάζουν με τις πιο συντηρητικές στοιχεία σύνδεσης στο ότι ήταν πολυμορφικοί μόνο μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα, αλλά δεν ήταν πολυμορφικοί μεταξύ STF /PAS και ΝΙΗ /Ola ή μεταξύ FVB /N και SPRET /eij (Πίνακας 1).

η

Επίδραση των 3’ΙΙΤΡ παραλλαγές στην έκφραση

Περιμέναμε ότι μόνο ένα υποσύνολο των 24 3’UTR πολυμορφισμούς θα να προβλεφθεί να μεταβάλει δεσμευτική miRNA. Για τον εντοπισμό αυτών των SNPs, μπήκαμε τόσο το ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα ακολουθίες σε δύο προγράμματα miRNA δεσμευτική πρόβλεψη, MicroInspector [20] και η Μιράντα [19]. Δεκαπέντε πολυμορφισμοί είχαν προβλεφθεί να επηρεάσει δεσμευτική miRNA.

Cbll1

ήταν το μόνο γονίδιο με 3’ΙΙΤΡ παραλλαγή τοποθέτηση της σύνδεσης που δεν έχουν τουλάχιστον ένα υποψήφιο SNP προβλέπεται να διαταράξει ή να εισάγουν ένα site miRNA (Πίνακας 2? Πίνακα S3? Σχήμα S1).

για να προσδιορίσετε αν 3’UTRs πολυμορφισμούς επηρεάζεται η έκφραση, έχουμε κλωνοποιημένα θραύσματα των 3’UTRs των 245 έως 1.652 bp σε μέγεθος το οποίο περιείχε τις παραλλαγές που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τα οκτώ γονίδια με πολυμορφισμούς προσαρμογή των δεδομένων σύνδεσης και την προβλεπόμενη να παρεμβαίνει με δεσμευτική miRNA (Πίνακας S1). Η 3’ΙΙΤΡ για

Cbll1

κλωνοποιήθηκε επίσης. Μετά την κλωνοποίηση του 3’UTR θραύσματα

Bcap29

,

Cbll1

,

Dgkb

,

HBP1

,

Meox2

,

Pik3cg

,

Stxbp1

,

Tspan13

, και

Twistnb

, στον φορέα λουσιφεράσης pGL3-ελέγχου, επιμολύναμε τα κατασκευάσματα σε C5N φυσιολογικά κύτταρα κερατινοκυττάρων και μετράται λουσιφεράσης επίπεδα των δύο ισομορφών. Υποθέσαμε ότι, εάν η παραλλαγή του 3’UTR είχε προβλεφθεί για να δείξει δεσμευτικές μόνο σε ένα στέλεχος miRNA, θα πρέπει να υπάρχει μικρότερη έκφραση λουσιφεράσης σε σύγκριση με την παραλλαγή που δεν προβλέπεται να δεσμεύσει το miRNA. Οι αμετάφραστες περιοχές για

Bcap29

,

Dgkb

,

HBP1, Pik3cg

,

Stxbp1

, και

Twistnb

είχε πολυμορφικές θέσεις που είχαν προβλεφθεί τόσο για την εισαγωγή και να διαταράξουν υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miRNA. Έτσι, για αυτά τα έξι γονίδια, δεν ήταν σαφές πώς ο πολυμορφισμός μπορεί να επηρεάσει την έκφραση. Από τους εννέα 3’UTRs αξιολογήθηκαν, έξι έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά λουσιφεράσης έκφραση μεταξύ των στελεχών (Εικόνα 1 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι πιο έντονες διαφορές στην έκφραση λουσιφεράσης ήταν στα 3’UTRs του

ΗΒΡ1

και

Bcap29

(Σχήμα 1). Για πολλά από τα γονίδια, τόσο 3’ΙΙΤΡ ισομορφές έδειξε μειωμένη έκφραση λουσιφεράσης σε σχέση με το φορέα pGL3 γεγονός που υποδηλώνει ότι miRNAs ή άλλων ρυθμιστικών μηχανισμών έχουν επιπτώσεις και στις δύο 3’ΙΙΤΡ μορφές.

Εκπρόσωπος σχετική λουσιφεράσης μονάδες ομαλοποιηθεί να κοροϊδεύει για ο φορέας λουσιφεράσης pGL3 (σκούρο γκρι), ΝΙΗ 3’UTR (Μαύρο) και SPRET /Ετερόγαμα 3’UTRs (ανοιχτό γκρι) για έξι γονίδια εμφανίζονται. Οι Ρ-τιμές της διαφορικής έκφρασης μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα υποδεικνύεται. Α

Bcap29

? Β

Dgkb

? Γ

ΗΒΡ1

? Δ

Pik3cg

? Ε

Twistnb

? ΣΤ

Tspan13

.

Η

Αναγνώριση παραλλαγές επηρεάζουν υποθετικές θέσεις πρόσδεσης microRNA

Όπως παραλλαγές στην 3’UTR περιοχές έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν δεσμευτική miRNA και μετέπειτα γονίδιο και η έκφραση πρωτεΐνης [15], [16], υποθέσαμε ότι οι παραλλαγές 3’UTR προσαρμογή των δεδομένων της σύνδεσης θα μπορούσε να επηρεάσει γονιδιακής ρύθμισης και ως εκ τούτου να επηρεάσουν τη διαφορά στην ευαισθησία του καρκίνου μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα ποντίκια. Έξι από τα εννέα 3’UTRs αξιολογούνται,

Bcap29

,

Dgkb

,

HBP1

,

Pik3cg

,

Twistnb

και

Tspan1

, έδειξε διαφορικής έκφρασης λουσιφεράσης μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα, αλλά όπως πολλά από αυτά είχαν πολλαπλές SNPs που προβλέπεται να επηρεάσει δέσμευσης, θελήσαμε να δοθεί προτεραιότητα ποια SNPs και miRNAs ήταν πιο πιθανό να το κάνει αυτό. Επιπλέον, όπως ορισμένοι SNPs είχαν προηγουμένως καθοριστεί τόσο εισαγάγει και να διαταράξουν πιθανές θέσεις πρόσδεσης, θέλαμε να χρησιμοποιήσουμε τα δεδομένα της λουσιφεράσης μας για να επιλέξετε miRNAs που θα ταιριάζουν τα δεδομένα έκφρασης. Για να περιορίσετε περαιτέρω κατάλογο υποψήφιων SNP μας και να επιλέξετε το δυναμικό miRNAs για τη μελέτη, ακολουθία από 3’UTRs των γονιδίων με τις υποψήφιες παραλλαγές αξιολογήθηκαν με τη χρήση πρόσθετων miRNA προγράμματα δεσμευτική πρόβλεψη Πατροκλής ο Μακεδόνας, και MicroSNiPer. Χρησιμοποιήσαμε επίσης MicroInspector, για τον εντοπισμό θέσεων σύνδεσης με ένα MFE μικρότερη από -22 kcal /J σε μία μορφή (ισχυρή δέσμευση) και μεγαλύτερη από -18 kcal /J στη άλλη μορφή (ασθενής ή καθόλου δεσμευτικό), όπως συνιστάται για Mus musculus [20]. Για όλες τις προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης miRNA, που καθορίζεται σε ποιο βαθμό ο πολυμορφισμός είχε προβλεφθεί να επηρεάσει την ισχύ της δέσμευσης. Χρησιμοποιώντας RNAhybrid και RNAcofold, υπολογίσαμε μια ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης των υποθετικών miRNAs. Δοκιμάσαμε διαφορές έκφραση όλων των αλληλεπιδράσεων των miRNAs που έδειξε προβλέψει διαφορές μεγαλύτερες από 5 kcal /J μεταξύ των δύο διαφορετικές μορφές στα δύο εργαλεία πρόβλεψης. Όλα τα έξι γονίδια με παραλλαγές οι οποίες ταιριάζουν στα δεδομένα σύνδεσης και έδειξε διαφορές στην έκφραση λουσιφεράσης είχαν παραλλαγές με σημαντικές διαφορές στη προβλεπόμενη ελεύθερη σύνδεση του miRNAs, μερικά από τα οποία περιέχονται SNPs στην περιοχή προβλεπόμενο σπόρων (Πίνακας 2, Εικόνα S1).

Επίδραση των microRNAs στην έκφραση

για να καθοριστεί εάν οι προβλεπόμενες miRNAs θα μπορούσε να επηρεάσει λουσιφεράσης διαφορές έκφραση

Bcap29

,

Dgkb

,

ΗΒΡ1

,

Pik3cg

,

Twistnb

και

Tspan13

, είμαστε συν-επιμολυσμένα κύτταρα C5N με το ΝΙΗ /Ola ή SPRET /Ετερόγαμα κατασκευάσματα λουσιφεράσης και πρόδρομος miRNA προβλέπεται να δεσμεύουν στις παραλλαγές συνεπής με σύνδεση και των αρχικών δεδομένων έκφραση λουσιφεράσης μας (Πίνακας 2). Εμείς επιλέξαμε 13 υποψήφιες miRNAs για την αξιολόγηση. Αρχίσαμε μελέτες μας μόνο κατά την αξιολόγηση η ισομορφή προβλέπεται να δεσμεύεται από την miRNA και αξιολογήθηκαν δύο ισομορφές, όταν είδαμε ένα αποτέλεσμα στην αναμενόμενη κατεύθυνση του miRNA στα επίπεδα λουσιφεράσης. miRNAs για

Pik3cg

(

miR-707

),

HBP1

(

miR-127

,

miR-183

, και

miR-873

),

Twistnb

(

miR-718

, και

miR-691

), και

Dgkb

(

miR-489

) δεν είχε καμία επίδραση επί της λουσιφεράσης έκφρασης (Σχήμα 2Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

miR-1940

με το

Tspan13

3’ΙΙΤΡ και

miR-31

με το

HBP1

3’ΙΙΤΡ μειώθηκε λουσιφεράσης έκφραση και των δύο ισομορφών παρόμοια υποδηλώνοντας ότι αυτά τα miRNAs δεσμεύονται τα 3’UTRs στον ίδιο βαθμό (Σχήμα 2Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Άλλα miRNAs,

miR-128 (Bcap29), miR-3064-3p (Pik3cg)

,

miR-3074-5p

(

Twistnb

) και

miR -485 (Dgkb)

μείωσε την λουσιφεράσης έκφραση του ελέγχου pGL3 κενού φορέα στον ίδιο βαθμό με το φορέα που περιέχει το κλωνοποιημένο 3’UTR (Σχήμα 2C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα miRNAs που επιλέξαμε για την ανάλυση δεν ήταν υπεύθυνη για τις παρατηρούμενες διαφορές στην έκφραση λουσιφεράσης μεταξύ SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola.

Εκπρόσωπος πειράματα δείχνουν καμία επίδραση των miRNA στην έκφραση λουσιφεράσης και παρόμοιες επιδράσεις της miRNA και στις δύο ισομορφές απεικονίζονται. Α

Dgkb

3’ΙΙΤΡ με

miR-489

? Β

Tspan13

3’ΙΙΤΡ με

miR-1940? Γ Dgkb με miR-485

. pGL3, pGL3 λουσιφεράσης φορέα χωρίς ένθετο? ΝΙΗ, ΝΙΗ /Ola 3’UTR? SPRET, SPRET /Ετερόγαμα 3’UTR? NC, ομελέτα miRNA ελέγχου? Σκούρο γκρι μπάρες, τον φορέα λουσιφεράσης pGL3? Μαύρες γραμμές, τον φορέα pGL3 με το ΝΙΗ /Ola 3’UTR? Ανοιχτό γκρι μπαρ, τον φορέα pGL3 που περιέχει το SPRET /Ετερόγαμα 3’ΙΙΤΡ.

Η

Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι θα έλειπαν διαφορική επίδραση των miRNAs στην έκφραση λουσιφεράσης, λόγω των πειραματικών συνθηκών που χρησιμοποιούνται, αξιολογήσαμε η

Twistnb

3’ΙΙΤΡ χρησιμοποιώντας πρόσθετες δόσεις των miRNAs

miR-3074-5p

και

miR-691

και επιπλέον χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση. Αυτό 3’UTR επιλέχθηκε για λεπτομερέστερη μελέτη επειδή περιείχε παραλλαγές προβλέπεται ότι δεσμεύονται με την περιοχή σπόρων και των δύο αυτών miRNA (Σχήμα S1). Δεν παρατηρήσαμε διαφορές στην επίδραση των miRNAs σε σύγκριση με την αρχική πειράματά μας (Σχήμα 3Α, 3Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όπως miRNAs μπορούν να δρουν σε συνδυασμό, αξιολογήσαμε επίσης

miR-3074-5p

και

miR-691

σε συνδυασμό για το

Twistnb

3’ΙΙΤΡ ΝΙΗ /Ola και SPRET /όμαιμο ισομορφές και διαπίστωσαν ότι τα αποτελέσματα για τον συνδυασμό

miR-691

και

miR-3074-5p

ήταν πανομοιότυπα με εκείνα του

miR-3074-5p

μόνο του (Σχήμα 3Α, 3Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα δεδομένα μας δεν είναι πιθανό να είναι ένα κατασκεύασμα των πειραματικών συνθηκών που χρησιμοποιούνται.

Εκπρόσωπος πειράματα που δείχνουν μη ειδική επίδραση του

miR-3074-5p

και /ή

miR-691

στις δύο ισομορφές του

Twistnb

εμφανίζονται σε χαμηλή επιμόλυνση δόση των προδρόμων miRNA. Α

Twistnb

3’UTRs στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με

miR-3074-5p

,

miR-691

ή δύο miRNAs. Β

Twistnb

3’UTRs στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με

miR-3074-5p

,

miR-691

ή δύο miRNAs. pGL3, pGL3 λουσιφεράσης φορέα χωρίς ένθετο? ΝΙΗ, ΝΙΗ /Ola 3’UTR? SPRET, SPRET /Ετερόγαμα 3’UTR? NC, ομελέτα miRNA ελέγχου? Σκούρο γκρι μπάρες, τον φορέα λουσιφεράσης pGL3? Μαύρες γραμμές, τον φορέα pGL3 με το ΝΙΗ /Ola 3’UTR? Ανοιχτό γκρι μπαρ, τον φορέα pGL3 που περιέχει το SPRET /Ετερόγαμα 3’ΙΙΤΡ.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση του

miR-3074-5p

για pGL3 και ΝΙΗ /Ola και SPRET /όμαιμο

Twistnb

3’UTRs, έχουμε επιμολυσμένα έναν αναστολέα για

miR-3074-5p

και σε σύγκριση με την έκφραση σε έναν αναστολέα αρνητικού ελέγχου και

miR-3074-5p

. Αν τα miRNA άμεσα με στόχο την προβλεπόμενη SPRET /Ετερόγαμα

Twistnb

ισομορφή και η παρατηρούμενη επίδραση στο φορέα pGL3 και το ΝΙΗ /Ola

Twistnb

ήταν μη-ειδικά εφέ (Εικόνα 3Α και Β) , θα περίμενε κανείς ότι η προσθήκη του αναστολέα θα έχει τη μεγαλύτερη επίδραση επί του φορέα pGL3 με την SPRET /Ετερόγαμα 3’UTR. Προσθήκη των αντι-

miR-3074-5p

έδειξε την μεγαλύτερη αύξηση φορές σε λουσιφεράσης έκφραση του φορέα pGL3 και έδειξε μη ειδικές αυξήσεις στην έκφραση του SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola ισομορφών υποδηλώνοντας ότι η μειωμένη έκφραση λουσιφεράσης είναι μη ειδική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

είναι πιθανό ότι η ενδογενής miRNAs μπορεί να ασκεί τη μέγιστη knock-down και η προσθήκη προδρόμου miRNA να C5N κύτταρά μας δεν θα οδηγούσε περαιτέρω μειώσεις στην έκφραση λουσιφεράσης. Για να αξιολογηθεί αυτή η πιθανότητα, μετρήσαμε miRNA έκφραση του RNA μας που συλλέγονται από τα κύτταρα C5N που ήταν ψευδο-επιμολυσμένα. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλα τα miRNAs αξιολογούνται παρουσίασαν στοιχεία της έκφρασης στα μη επιμολυσμένα με qPCR, αλλά οι περισσότερες από αυτές εκφράστηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του 1% ή λιγότερο του ελέγχου,

Sno-202

. Έτσι, για την πλειονότητα των miRNAs σε αυτή τη μελέτη, τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης στα κύτταρα C5N είναι απίθανο να προκαλεί μέγιστη knockdown του προβλεπόμενου 3’UTR στόχο. Τα microRNAs που δείχνει υψηλότερο επίπεδο του ενδογενούς έκφρασης περιλαμβάνονται

miR-31

(252% του ελέγχου),

miR-183

(12,5% του ελέγχου),

miR-675-3p

(2,2% του ελέγχου) και

miR-3074-5p

(3,7% του ελέγχου).

mRNA έκφραση των γονιδίων στόχων υποψήφιος

Ένα αποτέλεσμα miRNA δέσμευση mRNA είναι αποικοδόμηση του προϊόντος mRNA και μειωμένη έκφραση. Γονίδια χαρτογράφηση για να

Skts5

αξιολογήθηκαν από qPCR να προσδιοριστεί αν υπήρχαν διαφορές στα mRNA ουρά μεταξύ ΝΙΗ /Ola και SPRET /Ετερόγαμα. Των δοκιμαζόμενων γονίδια που περιέχουν παραλλαγές υποψήφιος 3’ΙΙΤΡ βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην έκφραση του mRNA στο

Bcap29

,

HBP1

,

Pik3cg

,

Twistnb και Tspan13

, αλλά δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του

Dgkb

και

Meox2

(Σχήμα 4 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έκφραση για

Stxbp6

ήταν πολύ χαμηλή για σύγκριση. Γονίδια που έδειξαν συνεπή αποτελέσματα μεταξύ των λουσιφεράσης έκφρασης και την qPCR είναι

Bcap29

(υψηλότερη έκφραση σε ΝΙΗ /Ola),

HBP1

(υψηλότερη έκφραση σε SPRET /Ετερόγαμα),

Meox2

(καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση),

Twistnb

(υψηλότερη έκφραση σε ΝΙΗ /Ola) και

Tspan13

(υψηλότερη έκφραση σε SPRET /Ετερόγαμα).

Bcap29

έδειξε τον υψηλότερο βαθμό διαφορά, περίπου 15 φορές υψηλότερη έκφραση σε ΝΙΗ /Ola από SPRET /Ετερόγαμα (Σχήμα 4).

Dgkb

δεν έδειξε σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA, αλλά υψηλότερη έκφραση της λουσιφεράσης του ΝΙΗ 3’UTR.

Pik3cg

έδειξε υψηλότερη έκφραση της SPRET mRNA /Ετερόγαμα, αλλά χαμηλότερη έκφραση λουσιφεράσης. Έτσι, πέντε από τα επτά γονίδια αξιολογήθηκε με qPCR έδειξαν συνεπή πρότυπα έκφρασης μεταξύ mRNA και την επίδραση του 3’UTR στην έκφραση λουσιφεράσης. Όπως miRNAs λειτουργήσει με δύο τρόπους, ένας αυξάνοντας αποικοδόμηση του mRNA και το άλλο παρεμβαίνοντας με μετάφραση, είναι πιθανό ότι καμία διαφορά στην έκφραση του mRNA θα παρατηρηθεί ακόμη και όταν δεσμευτικός απόκλιση miRNA λαμβάνει χώρα [26], [27].

Ποσοτική PCR επτά γονιδίων αξιολογούνται για διαφορική έκφραση λουσιφεράσης μεταξύ SPRET /Ετερόγαμα και ΝΙΗ /Ola 3’ΙΙΤΡ φαίνονται.