Αφηρημένο

Η πρωτεΐνη ρ37 στην επιφάνεια του

Mycoplasma hyorhinis

κύτταρα αποτελεί μέρος ενός συστήματος υψηλής συγγένειας μεταφορών και έχει βρεθεί σχετίζονται με των ζώων και ανθρώπινων καρκίνων. Εδώ μπορούμε να δείξουμε σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες, P37 επάγει ταχέως την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στη φλεγμονή και την εξέλιξη του καρκίνου. Αυτή η ενεργοποίηση του γονιδίου ήταν κυρίως μέσω του υποδοχέα ΤΙγ4. Δραστηριότητα χάθηκε από ρ37 όταν αφαιρέθηκαν τα Ο-τερματικά 20 αμινοξέα ή τα τέσσερα αμινοξέα ειδικό για την σύνδεση υδρογόνου πυροφωσφορικής θειαμίνης είχε αντικατασταθεί από βαλίνη. Ο αποκλεισμός του υποδοχέα IL6 ή την αναστολή της σηματοδότησης STAT3 οδήγησε σε αυξημένη γονιδιακή έκφραση ρ37 που προκαλείται. . Δεδομένου ότι ο καρκίνος που σχετίζεται ινοβλάστες υποστηρίξουν την ανάπτυξη, εισβολή και μετάσταση μέσω της ικανότητάς τους να ρυθμίζουν την φλεγμονή όγκων που σχετίζονται με την ταχεία επαγωγή σε ινοβλάστες του προ-φλεγμονωδών γονιδίων με ρ37 θα μπορούσε να αναμένεται να επηρεάσει την ανάπτυξη του καρκίνου

Παράθεση: Gomersall AC , Phan ΗΑ, Iacuone S, Li SF, Parish RW (2015) Η

Mycoplasma hyorhinis

P37 πρωτεΐνη προκαλεί γρήγορα γονίδια σε ινοβλάστες συνδεδεμένες με φλεγμονή και τον καρκίνο. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10.1371 /journal.pone.0140753

Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 25 Ιουν 2015? Αποδεκτές: 30η Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Gomersall et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Το αρχικό CEL αρχεία για ανάλυση μικροσυστοιχιών και άλλα δικαιολογητικά στοιχεία έχουν πλέον κατατεθεί σε Figshare σε https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136

Χρηματοδότηση:. ACG ήταν ο αποδέκτης ενός Αυστραλίας Βραβείο Μεταπτυχιακού .

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πρωτεΐνη ρ37 ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στην επιφάνεια των κυττάρων FS9 σαρκώματος ποντικού [1] . Τα μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον της πρωτεΐνης ρ37 ανέστειλαν την επεμβατική συμπεριφορά των κυττάρων FS9 αντιμέτωπος με την καρδιά κοτόπουλο ινοβλάστες [2]. Η πρωτεΐνη ρ37 βρέθηκε να είναι από

Mycoplasma hyorhinis

και αποτελούν μέρος ενός συστήματος μεταφοράς υψηλής συγγένειας τρεις πρωτεΐνες [3]. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι πολύ παρόμοια με περιπλασμική δεσμευτικές συστημάτων υψηλής μεταφοράς συγγένεια gram αρνητικών βακτηριδίων. Η P37 Ν-άκρο έχει την αλληλουχία αμινοξέων C-S-N που απαιτείται για μια Ν-τερματική επέκταση των λιπιδίων γλυκεριδίου-κυστεΐνη που παρεμβάλλει μέσα στην μεμβράνη μυκοπλασματικής [4]. Όταν

Μ

.

hyorhinis

ήταν παρούσα, Rat-1 κύτταρα και FS9, L929 και ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες ποντικού όλα εισέβαλε καρδιά κοτόπουλου ινοβλαστών στην αντιμέτωποι Προσδιορισμός μοσχεύματος [5]. Εάν P37-ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα προστέθηκαν στη δοκιμασία ανεστάλη η επεμβατική συμπεριφορά.

Η ανακάλυψη του ρ37 επαγόμενης κυτταρικής invasivity πρότεινε ότι

M

.

hyorhinis

μόλυνση θα μπορούσαν να παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου.

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση στη συνέχεια βρέθηκε να σχετίζεται με καρκίνους του ανθρώπου και των ζώων, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων καρκινωμάτων [6], καθώς και τον καρκίνο των ωοθηκών και μετάσταση λεμφαδένα [7].

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση συσχετίζεται με μετάσταση και προβλέπει φτωχή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου [8]. Fareed et al. ανέλυσε την ανοσολογική αντίδραση των ασθενών που ανοσοποιήθηκαν ενδολεμφικά με καρκινικά κύτταρα και βρέθηκε ασθενείς εμφανίζουν υποχώρηση του όγκου είχε μετρήσιμο τίτλο αντισωμάτων εναντίον μιας πρωτεΐνης 38 kDa [9]. Ilantzis et al. επιβεβαίωσε την πρωτεΐνη να είναι P37 [10]. Η πρωτεΐνη ρ37 έχει βρεθεί συνδέεται με ανθρώπινο γαστρικό καρκινώματα και όγκοι του προστάτη [11, 12]. Χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που στοχεύει το Ν-άκρο του P37, η πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε σε γαστρικό, του παχέως εντέρου, του οισοφάγου, του πνεύμονα, του μαστού και του γλοιώματος καρκινωμάτων, καθώς και στα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα από ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6, 13].

Η προσθήκη P37 για την ανθρώπινη γαστρικού καρκινώματος κύτταρα (AGS) αυξημένη μετανάστευση σε φρεατίων (Matrigel) δοκιμασία [11]. Κατεργασία του γραμμές καρκίνου του προστάτη PC-3 και DU145 με ρ37 αυξήθηκε επίσης invasivity τους μέσω Matrigel [14]. Συμπερίληψη ενός μονοκλωνικού αντισώματος ρ37-ειδικό ανέστειλε αυτή την εισβολή. Το επίπεδο των μεταλλοπρωτεϊνασών 2 (ΜΜΡ2) αυξήθηκε στα μέσα του P37-θεραπεία και

P37

-επιμολυσμένα AGS κύτταρα [11]. Goodison et al. προτείνουν την αυξημένη invasivity μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μεγαλύτερο ποσοστό μετανάστευσης μετά από θεραπεία Ρ37 αντί αυξημένη ικανότητα να υποβαθμίσει την Matrigel [15]. θεραπεία P37 βρέθηκε επίσης να αυξηθεί

παράγοντα νέκρωσης των όγκων α

(

TNFa)

μεταγραφής γονιδίων και τα επίπεδα του TNFa στο μέσο των ανθρωπίνων μονοπυρηνικών κυττάρων περιφερειακού αίματος [16].

Διάφορες μυκοπλασματικών λοιμώξεων έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο και την αρθρίτιδα σε ζώα και ανθρώπους. Για παράδειγμα, η μόλυνση των 32D αιμοποιητικών κυττάρων με

Μ

.

fermentans

ή

Μ

.

penetrans

για 4-5 εβδομάδες επαγόμενη κακοήθη μετασχηματισμό και όταν εγχέεται σε γυμνά ποντίκια τα κύτταρα ταχέως σχημάτισαν όγκους [17].

Μ

.

hyorhinis

,

Μ

.

pneumoniae

,

Μ

.

hominis

,

Μ

.

fermentans

,

Μ

.

penetrans

και

Μ

.

arthritidas

όλα έχουν εμπλακεί σε ανθρώπινη αρθρίτιδα [18-21].

Μ

.

fermentans

παράγει οξεία αρθρίτιδα σε κουνέλια [21].

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη συνδέεται επίσης με πολυορογονίτιδα και αρθρίτιδα των χοίρων [22].

Ο σκοπός της εργασίας που αναφέρεται εδώ ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια των οποίων η έκφραση ενεργοποιείται ταχέως μετά από θεραπεία Ρ37 του ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες

in vitro

. κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιλέχθηκαν, όπως είναι μια τυπική γραμμή ινοβλαστών που έχει αποδειχθεί πολύτιμη για τη μελέτη των ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων της μεμβράνης cancer.The (ες) υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του γονιδίου ήταν επίσης να εντοπιστούν.

Μέθοδοι

κατασκευή πλασμίδιο

κατασκευή πλασμιδίου διεξήχθη με τη χρήση τυποποιημένων ένζυμο περιορισμού κλωνοποίησης. Η

P37

γονίδιο εισήχθη εντός του

Bam Ιστοσελίδα κόψιμο ΗΙ της pRSET φορέα έκφρασης pUC-προερχόμενο. (Invitrogen? Cat # V351-20) (Εικ S1A)

περικομμένο ρ37 κατασκευάστηκε με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) για να εισαγάγει το

Bam HI

και

Nco

μπορώ περιορισμό περικοπή περιοχές που πλευρίζουν την

P37

γονίδιο. Οι αντίστροφοι εκκινητές (S1 Πίνακας) εισήγαγε μια

Nco Ιστοσελίδα τομή Ι περιορισμού σε αρκετά σημεία που διευκόλυναν την παραγωγή αλληλουχιών DNA που μείωσε το μέγεθος της πρωτεΐνης P37 με 20, 60, 80 ή 105 αμινοξέα. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε πέψη με το

Bam ΗΙ και

Nco

ένζυμα περιορισμού Ι και συνδέθηκε στο pUC προερχόμενο pRSET ένα φορέα έκφρασης (Invitrogen? Cat # V351-20) (S2 Εικ) .

τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

μεταλλαξογένεση του γονιδίου που κωδικοποιεί ρ37 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το MutaGene φαγομιδίου

in vitro

κιτ μεταλλαξογένεσης (Bio-Rad? Cat # 170 με 3581) . Τα ολιγονουκλεοτίδια που παρέχονται στον Πίνακα S2

Τα τέσσερα αμινοξέα S255, F256, S257 και K258 στο P37 άλλαξαν σε βαλίνη χρησιμοποιώντας το κιτ QuikChange ΙΙ XL ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies? Cat # 200521). και η μέθοδος σχεδιασμού εκκινητή που αναπτύχθηκε από Zheng et al. [23]. Δύο αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση των μεταλλάξεων? η αντίστοιχη προς τα εμπρός και αντίστροφης οι εκκινητές που παρατίθενται στο S3 Πίνακα και ανάλυση αλληλουχίας σε S3 Σχ. Η βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης εκκινητή καθιερώθηκε ως 56,4 ° C.

Η έκφραση πρωτεΐνης και την αποσαφήνιση

Η έκφραση της πρωτεΐνης P37, ακρωτηριασμένες πρωτεΐνες P37 (p37-20, p37-60, p37-80 και p37-105) και η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ρ37 ολοκληρώθηκε στα κύτταρα OneShot®BL21 (DE3) (Invitrogen? Cat # C6000-03). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Luria-Bertani (LB) ζωμού που περιέχει 100 μg ml

-1 αμπικιλλίνη και επάγεται με IPTG (Ισοπροπυλο β-D-1-θειογαλακτοπυρανοσίδη) σε τελική συγκέντρωση 1 mM για 4 ώρες στους 37 ° C με ανακίνηση . Προκαλούμενη κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 300 mM NaCl, 10 mM ιμιδαζόλιο, 1 mg ml

-1 Η λυσοζύμη, ρΗ 8.0) που περιέχει ένα πλήρες, Μίνι Αναστολέα Πρωτεάσης κοκτέιλ Tablet (Roche? Cat # 11836153001). Ακατέργαστα λύματα ελήφθησαν με υπερήχους (6 κύκλοι, διαστήματα 30 δευτερολέπτων) που ακολουθείται από ανάδευση για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το κυτταρόλυμα κατέστη διαυγές με φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και συνενώθηκαν με διήθηση μέσω ενός φίλτρου 25 μm.

αργινίνη απορροφούν πρωτεΐνη διευκρίνιση

υψηλότερες συγκεντρώσεις του ρ37 κόλουρου πεπτίδια ήταν που βρίσκεται στο αδιάλυτο κλάσμα του

E

.

coli

λύμα και έτσι να αυξήσουν τις αποδόσεις του διαλυτού ρ37 αργινίνη μουλιάσει (argSOAK) μέθοδος που χρησιμοποιείται. Περικομμένο πεπτίδια διαλυτοποιήθηκαν με 1 Μ αργινίνη εμποτισμού πριν από τον καθαρισμό με τη χρήση της μεθόδου που περιγράφεται από Tsumoto et al. [24]. Μητρική P37 καθαρίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας το 1 Μ αργινίνη μουλιάσει για να εξασφαλιστεί η μέθοδος δεν απενεργοποιούν την πρωτεΐνη

Καθαρισμός πρωτεΐνης

Καθαρισμός πρωτεΐνης επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Profinity

TM IMAC ρητίνη (BioRad.? Cat # 156-0123) με αποκλίσεις από το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Δύο ml του Profinity

TM IMAC ρητίνη προστέθηκε για κάθε 25 ml παρασκευάζονται εκκαθαρίζονται λύματος. Να επιτραπεί η σύνδεση της πρωτεΐνης το μίγμα ρητίνης /λύμα επωάστηκε για 1 ώρα στους 4 ° C, με ανάδευση. Το μίγμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα 3000 g για την κατακρήμνιση του ρητίνης. Η ρητίνη πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 10ml (50 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 300 mM NaCl, 20 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 8,0) με ανάδευση για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το μείγμα ρητίνης /πλύση φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα 3000 g για να σφαιροποιηθούν ρητίνη. Πρωτεΐνη αναγνώσεις απορρόφησης στα 280 nm (Α

280) ελήφθησαν από τα υπερκείμενα πλύσης. Η ρητίνη πλύθηκε επανειλημμένα έως ότου τα υπερκείμενα πλύσης A

280 ήταν μικρότερη από 0,01.

Η έκλουση επιτεύχθηκε με την προσθήκη 7 ml Ρυθμιστικού Έκλουσης (50 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 300 mM NaCl, 500 mM ιμιδαζόλης, ρΗ 8.0) για κάθε 2 ml ρητίνης, με 1 ώρας επώαση, ανάδευση στους 4 ° C. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στα 3000 g για να σφαιροποιηθούν ρητίνη και για κάθε 7 ml, συλλέχθηκαν πέντε δείγματα 1 ml του υπερκείμενου που περιέχει το εκλουόμενη πρωτεΐνη. Η εκλουσθείσα πρωτεΐνη αποθηκεύτηκε στους -80 ° C

Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης εκτιμήθηκαν μετά την Pierce® BCA Protein Assay Kit. (ThermoScientific? Cat # 23227) και το πρόγραμμα του BCA Eppendorf BioPhotometer 6131. ​​

SDS-PAGE, χρώση Coomassie Blue και κηλίδωση Western

τα δείγματα πρωτεΐνης μετουσιώθηκαν με θερμική κατεργασία στους 95 ° C για 10 λεπτά και διαχωρίστηκαν σε 12% ακρυλαμίδη διαχωρισμού πηκτωμάτων με ένα 4% ακρυλαμιδίου πηκτή στοιβασίας. Τα πήγματα κατασκευάστηκε σύμφωνα με τη Mini-PROTEAN

® 3 κυττάρων (BioRad? Cat # 165-3301 /165-3302) τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το Mini-PROTEAN 3 κυττάρων Mini Tank (BioRad? Cat # 165 – 3.302) συγκροτήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα πηκτώματα έτρεξαν για 60 λεπτά, 200 volts στους 4 ° C (Bio-Rad Powerpac

TM Προμήθεια Βασικές εξουσία ).

Για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας καθαρισμού πήγματα SDS-PAGE κηλιδώθηκαν με 0.1% Coomassie Blue Stain (0,1% Coomassie Blue R-250, 40% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ) για όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανάδευση. Τα πηκτώματα SDS-PAGE σταθεροποιήθηκαν πριν από την Coomassie Blue χρώση με διάλυμα μονιμοποίησης (50% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ) σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά με ήπια ανάδευση. Μετά πηκτές Coomassie Blue χρώση έγιναν αποχρωματίσθηκαν χρησιμοποιώντας μεθανόλη 40%, 10% οξικό οξύ διάλυμα αποχρωματισμού επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με απαλή ανάδευση.

Για την ταυτοποίηση πρωτεΐνης, μετά διαχωρισμό επί 12% ακρυλαμίδιο διαχωρισμού πηκτώματα, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου μετά την BIO-RAD Mini Trans-Blot

® πρωτόκολλο ηλεκτροφορητικής (Cat # 170-3930 /170-3935). Το ΒΙΟ-RAD Mini Trans-Blot

® σύστημα ηλεκτροφορητικής έτρεξε για 2 ώρες στους 200 volts

Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε γάλα 5% άπαχο σε Tris ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα Tween-20 (TBST.: 137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20), επωάστηκαν και πάλι για 1 ώρα με το Τ7-Tag μονοκλωνικό αντίσωμα (Novagen? Cat # 69522) αραιωμένο 1: 10.000 σε 5% σκόνη άπαχου γάλακτος που ακολουθείται από ένα 1 ώρες επώαση με IgG αρμορακίας υπεροξείδιο (HRP) κατσίκας-αντι (Invitrogen? Cat # G-21040) αραιωμένο 1: 10.000 σε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη

κηλίδες Western αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας την αλκαλική φωσφατάση. σύζευγμα Υπόστρωμα Kit (BioRad? Cat # 170 – 6432). Η μεμβράνη είχε εκτεθεί στο φως για 10 λεπτά με ανάδευση και πλένεται με αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O να σταματήσει αντίδραση πριν από τη σάρωση

Η PageRuler Προχρωματισμένοι Πρωτεΐνη Σκάλα. (Fermentas? Cat # SM0671) χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το μέγεθος της πρωτεΐνης.

Microarray Analysis

Ολικό RNA εξήχθη από ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες σε επεξεργασία με 15 μg ml

-1 καθαρισμένη πρωτεΐνη ρ37 για 24 ώρες ή μη επεξεργασμένα ινοβλάστες ΝΙΗ3Τ3 με τη χρήση της RNeasy® Mini Kit ( Qiagen? Cat # 74104). Τρεις βιολογική αντίγραφα λήφθηκαν από κάθε θεραπεία. Γονιδιακό μόλυνση υποβλήθηκε σε διαλογή με PCR και εξαλείφεται χρησιμοποιώντας Δεοξυριβονουκλεάση Ι, Amplification Grade (Invitrogen? Cat # 18068-015) ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή. την ακεραιότητα και την ποιότητα του RNA ελέγχθηκε με τη χρήση της Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Καλιφόρνια, ΗΠΑ).

RNA ενισχύθηκε και cDNA συντίθεται σύμφωνα με τις οδηγίες στο Genechip® 3 ‘Εγχειρίδιο ΑΕΚ Express Kit χρήστη ( Affymetrix? Cat # P /N702646 Rev.8). Μετά βιοτίνη επισήμανση των cDNA και κατακερματισμού, τα δείγματα υβριδοποιούνται προς Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Πίνακες, πλύθηκε με χρήση ρευστών Station Genechip® και σαρώθηκαν με τη χρήση του σαρωτή Genechip® 3000. δεδομένα μικροσυστοιχιών υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού Affymetrix® Expression Κονσόλα ™ 1.2 (Affymetrix ? Cat # P /N 702387 Rev. 2) και CLC Genomics Workbench 4.7 (CLC bio, https://www.clcbio.com?. Vat # DK28305087)

RT

2 Profiler ™ PCR Array Σύστημα

Ολικό RNA εξήχθη από ινοβλάστες ΝΙΗ3Τ3 που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με P37, P37 και S31-201, S31-201 μόνο ή μη επεξεργασμένα ινοβλάστες ΝΙΗ3Τ3 με τη χρήση της RNeasy® Mini Kit (Qiagen? Cat # 74104) . Τρεις βιολογική αντίγραφα λήφθηκαν από κάθε θεραπεία. Γονιδιακό μόλυνση υποβλήθηκε σε διαλογή με PCR και εξαλείφεται χρησιμοποιώντας Δεοξυριβονουκλεάση Ι, Amplification Grade (Invitrogen? Cat # 18068-015) ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή. την ακεραιότητα και την ποιότητα του RNA ελέγχθηκε με τη χρήση της Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Καλιφόρνια, ΗΠΑ)

RNA αντίστροφη μεταγραφή και η RT

2 Profiler

TM Φλεγμονώδης Απόκριση & amp.? συστοιχίες αυτοανοσία PCR (SABioscience? Cat # PAMM-077A-12) πραγματοποιήθηκαν ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (SABiosciences? Μέρος # 1022Α). Ισχυρές θετικές συσχετίσεις του κατωφλίου κύκλου (Ct) τιμές μεταξύ της συστοιχίας PCR βιολογική επαναλήψεων για κάθε επεξεργασία που αναφέρεται αξιόπιστη ανίχνευση qPCR της γονιδιακής έκφρασης (S4 Σχήμα).

Μια ανάλυση ΑΝΟνΑ συγκρίνοντας γονίδιο τιμές Ct των επεξεργασμένων δείγματα με το μη επεξεργασμένο έλεγχο

Ποσοτική PCR (qPCR)

RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την RNeasy® Mini Kit. (Qiagen? Cat # 74104) από τρεις βιολογικούς επαναλήψεις των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες. Το RNA ήταν ϋΝάση (Invitrogen? Cat # 18068-015) πριν από συμπληρωματικές μετατροπή του DNA (SuperScript

TM III, Invitrogen? Cat # 18080-044). Ποσοτική amplication του cDNA πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για κάθε βιολογικό αντίγραφο χρησιμοποιώντας iQ

TM SYBR

® Πράσινη Supermix (BioRad? Cat # 170-3884) και qPCR ολιγονουκλεοτίδια (S4 πίνακας) χρησιμοποιώντας ένα iCycler iQ

TM Ρεάλ -Ώρα Σύστημα ανίχνευσης PCR (BIORAD? 170-8740). Οι ίδιες συνθήκες ενίσχυσης χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα σύνολα εκκινητών? αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά? διεργασία ενίσχυσης εναλλάσσονται 40x μέσω μετουσίωση στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, συγκόλληση του αρχικού τεμαχίου 60

° C για 30 δευτερόλεπτα και, στη συνέχεια, μια επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Εκπεμπόμενος φθορισμός μετρήθηκε κατά τη διάρκεια της ανακυκλωμένα φάση επέκτασης. Μία τελική επέκταση στους 95 ° C για 1 λεπτό ολοκληρώθηκε πριν από την καμπύλη διαστάσεως. Η καμπύλη διαστάσεως άρχισε στους 55 ° C με αύξηση 0,5 ° C μέχρι την τελική θερμοκρασία των 95 ° C επετεύχθη.

Οι αρνητικοί έλεγχοι ελέγχθηκαν για την εξάλειψη της μόλυνσης και μία μόνον κορυφή έγινε δεκτή στην καμπύλη διαστάσεως κάθε δοκιμή γονιδίου. Όλα τα ενισχυμένα προϊόντα αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία για να δείξει εξειδίκευση των ολιγονουκλεοτιδίων qPCR.

Διπλώστε Αλλαγή

Για να εξομαλύνει τις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεταξύ των δειγμάτων όλων των γονιδίων του ενδιαφέροντος τιμές (ΔΑΙ) Ct αφαιρέθηκαν από τις μέσες τιμές Ct από τα δύο ενδογενή γονίδια αναφοράς

βactin

και

GAPDH

(

γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση

)? ΔCt (εξίσωση 1). Όλες οι τιμές Ct ελήφθησαν από τρεις βιολογικούς επαναλήψεις και τρεις τεχνικές επαναλήψεις της κάθε βιολογικής επανάληψη (Ν = 9)

Εξίσωση 1

Η διαφορά μεταξύ του γονιδίου του ενδιαφέροντος ΔCt ενός δείγματος σε επεξεργασία και ένα δείγμα ελέγχου υπολογίστηκε.? ΔΔCt (εξίσωση 2). Η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης της εκθετικής αλλαγής ανά κύκλο και γονίδιο (Ε) του κάθε εκκινητή υπολογίστηκε από την αποδοτικότητα τοις εκατό (Ε%)? Ε (εξίσωση 3). Τοις εκατό βελτίωση της αποτελεσματικότητας των 100 ± 10% και R

2≥0.985 κρίθηκαν αποδεκτές. Όλα εκκινητή αποδοτικότητες ζεύγος μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S4.

Εξίσωση 2Equation 3

Ο ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε με την αντίστοιχη τιμή γονίδιο εκκινητή E για να υπολογιστεί η σχετική μεταβολή φορές της έκφρασης του γονιδίου οφείλεται σε θεραπεία (Εξίσωση 4). Μια ομαλοποιημένη ΔΔCt & gt? 1 δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση και & lt? 1 δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση.

Εξίσωση 4

Μπαρ Σφάλμα

Η τυπική απόκλιση (

σ

) υπολογίστηκε με βάση ΔΔCt (εξίσωση 5). Το τυπικό σφάλμα (SE) υπολογίστηκε από την τυπική απόκλιση (Εξίσωση 6) και το ανώτερο (Εξίσωση 7) και κάτω (Eq 8) ράβδοι σφάλματος υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το τυπικό σφάλμα, E-αξία και φορές αλλαγή. Ν, ο αριθμός του μεγέθους του δείγματος = 9.

Εξίσωση 5Equation 6Equation 7Equation 8

Σφάλμα τιμές μπαρ για όλα τα γραφήματα που παρέχονται στον Πίνακα S5.

Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA)

Μια ανάλυση ΑΝΟνΑ εκτελέσθηκε επί όλων των δεδομένων qPCR συγκρίνοντας το κανονικοποιημένο κατώφλι κύκλου (ΔCt) των επεξεργασμένων δειγμάτων με τους ελέγχους ή επεξεργασμένα δείγματα ελέγχου. Όλα τα πειράματα συνίστατο από τρία βιολογικών επαναλήψεων και τρεις τεχνικές επαναλήψεις της κάθε βιολογικής επανάληψη (Ν = 9).

Τα κύτταρα θηλαστικών

Ποντίκια εμβρυϊκά (ΝΙΗ3Τ3) ινοβλάστες καθιερώθηκαν από έμβρυα ποντικού ΝΙΗ Swiss, ελήφθησαν από το The Peter MacCallum Cancer Centre, Ανατολική Μελβούρνη.

συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων

ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε Τροποποιημένο Μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), NaHCO

3 και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Plasmocin

TM (Invivogen) προστέθηκε σε όλα τα μέσα καλλιέργειας σε συγκέντρωση 5 μg ml

-1. Η κυτταρική γραμμή και των μέσων ελέγχθηκε για μόλυνση μυκοπλάσματος χρησιμοποιώντας Mycoplasma εκκινητές που περιγράφονται από Uphoff και Drexler [25]. συνθήκες PCR ενίσχυση περιελάμβανε ένα αρχικό μετουσίωση στους 95

° C για 3 λεπτά και επακόλουθη διαδικασία ενίσχυσης ανακυκλώνεται 32x μέσω μετουσίωση στους 95

° C για 10 δευτερόλεπτα, συγκόλληση του αρχικού τεμαχίου 65

° C για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση σε 72

° C για 30 δευτερόλεπτα. Μια τελική επέκταση 95

° C για 1 λεπτό ολοκληρώθηκε. Η κυτταρική γραμμή και όλα τα μέσα κυτταρικής πείραμα βρέθηκαν αρνητικά για μόλυνση του μυκοπλάσματος.

Όλα πλάκες καλλιέργειας επωάστηκαν σε ένα θερμοστατούμενο με ύδωρ Incubator (Forma Scientific). Η θερμοκοιτίδα ήταν αυτόματα ρυθμίζονται σε 37

° C με 5% CO

2

Αναστολείς

Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι αναστολείς:. IL6R αναστολέας LEAF

TM καθαρίζεται αντι- ποντικό /αρουραίος CD126 μονοκλωνικό αντίσωμα (IL6R

i

) (Biolegend? Cat # 115809) (AB_2127939) σε τελική συγκέντρωση 0.1 μg ml

-1. Η τελική συγκέντρωση καθορίστηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR το οποίο έδειξε ότι οι συγκεντρώσεις της χίμαιρας IL6R

i

κυμαίνεται από 0,1 έως 0,5 μg ml

-1 ανέστειλε Π37 επαγόμενη

αμυλοειδούς A3 ορού

(

Saa3

) έκφρασης. Η χημική ανιχνευτής STAT3 Inhibitor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology? Cat # SC-204304) χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 100 μΜ [26]. Η Viral πεπτιδικός αναστολέας ΤΙγ4 (VIPER) και το πεπτίδιο ελέγχου VIPER CP7 χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,5 μΜ (Imgenex? Cat # img-2011set). Οι συγκέντρωση αναστολής VIPER 0,5 μΜ προσδιορίστηκε με κατεργασία κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με 1 μg ml

-1 λιποπολυσακχαρίτη (LPS) (InvivoGen? Cat # tlrl-3pelps) αναστολή με 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 και 25 μΜ ΟΧΙΆ. Η τελική συγκέντρωση του 0,5 μΜ VIPER βρέθηκε να μειώνει την έκφραση του

Saa3

από 12-πλάσια έως 5-φορές. CP7 βρέθηκε επίσης ότι αναστέλλει την επαγόμενη από LPS

Saa3

έκφραση σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ωστόσο σε 0,5 μΜ CP7,

Saa3

έκφραση δεν ήταν σημαντικά ανέστειλε.

θεραπεία κυττάρων

ινοβλάστες ΝΙΗ3Τ3 για θεραπεία περάστηκαν μέσα στον απαιτούμενο αριθμό πλακών καλλιέργειας ιστού για να επιτρέψει για τρεις βιολογικούς επαναλήψεις ανά αγωγή. Όλες οι γραμμές ΝΙΗ3Τ3 προέρχονταν από την ίδια πάγωμα κάτω από παρτίδα σε χωρίο 10? Παρουσιάστηκε θεραπεία πριν πέρασμα 15. Πριν από τη θεραπεία, ϋΜΕΜ 10% FCS μέσο αναρροφήθηκε και κυτταρικές καλλιέργειες πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με 1χ φωσφορικά (PBS? 137 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, 10 mM Na

2HPO

4.2H

2O, 2 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, ρΗ 7.4), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

για την αγωγή ρ37 η απαιτούμενη συγκέντρωση του καθαρισμένου ρ37 προστέθηκε στο μέσον ϋΜΕΜ 10% FCS που καλύπτει τα κύτταρα και οι καλλιέργειες επωάζονται για τον απαιτούμενο χρονικό διάστημα. Στην περίπτωση των δοκιμών χρόνου, κύτταρα θεραπείες ξεκίνησαν τις ώρες που επιτρέπεται για όλα τα μαθήματα της θεραπείας πρέπει να συγχρονιστούν και να είναι έτοιμη για την εκχύλιση RNA σε Τ

0.

ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς πριν από τη θεραπεία 24 ώρες με ή χωρίς P37. Προεπεξεργασία χρόνο επώασης ποικίλει ανάλογα με τον αναστολέα? 1 ώρα για την IL6R

i

, 2 ώρες για το VIPER και CP7 και 24 ωρών για S31-201. Περατώθηκαν

Θεραπείες με πλύσιμο και λύση των κυττάρων για άμεση εξαγωγή RNA. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν μετά τη θεραπεία για τα επίπεδα τοξικότητας, αν υπήρχε διαπιστωμένη τοξική επίδραση τερματίστηκε το πείραμα.

δοκιμασίες Μετανάστευση

Η μετανάστευση των κυττάρων τονώθηκε σε μονοστιβάδα, χρησιμοποιώντας ένα

στο vitro

δοκιμασία πληγή μηδέν. ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες αναπτύχθηκαν σε συρροή μονοστιβάδα 100% και γδαρμένο χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα, σχηματίζοντας ένα τραύμα από περίπου 300 μm σε διάμετρο. Τα κυτταρικά θραύσματα έπλυνε με 1χ PBS και DMEM 10% FCS προστέθηκε με 25 μg ml

-1 ρ37 για θεραπεία ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες. Οι καλλιέργειες που δεν είχαν επιτύχει συρρέουσα μονοστιβάδα μετά από θεραπεία 24 ωρών και πληγές που ήταν μεγαλύτερη ή μικρότερη από 300 μm εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Εικόνες συλλήφθηκαν σε 0, 14, 19, 24 και 38 ώρες. Έξι εικόνες συλλήφθηκαν ανά χρονικό σημείο ανά πλάκα. πλάκες εις τριπλούν ολοκληρώθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο (Ν = 18). Ρυθμός της κυτταρικής μετανάστευσης εκφράστηκε ως επιφάνεια (μm

2) καλύπτονται από μεταναστευτικά κύτταρα διαιρούνται με το χρόνο (ώρες). Για να προσδιορισθεί η περιοχή στην οποία τα κύτταρα είχαν μεταναστεύσει σε κάθε χρονικό σημείο, η περιοχή του τραύματος σε κάθε χρονικό σημείο αφαιρέθηκε από την αρχική περιοχή του τραύματος. ImageJ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η περιοχή του τραύματος.

Αποτελέσματα

Η γονιδιακή έκφραση των χαρακτηριστικών των P37 αντιμετωπίζονται ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες

Η ανασυνδυασμένη

P37 γονιδιακής έκφρασης

προκλήθηκε σε

Escherichia coli

και η πρωτεΐνη καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία Νί-συγγένειας (Εικόνα 1). Αρχικά, η επίδραση του καθαρισμένου Ρ37 επί ΝΙΗ3Τ3 μετανάστευση των ινοβλαστών προσδιορίστηκε. Σε μια δοκιμασία επούλωσης τραυμάτων 25 μg ml

-1 αντιμετωπίζονται P37 ινοβλάστες παρουσίασαν αυξημένα ποσοστά μετανάστευσης (S5B σχήμα) και το κλείσιμο ταχύτερη πληγή από τους ελέγχους (S5A σχήμα). P37 δεν επηρέασε το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3. Υπάρχει μία αναφορά της θεραπείας ρ37 προκαλώντας μια μικρή αύξηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη DU145 (εφόσον δεν υπάρχουν στοιχεία), όμως, τα κύτταρα του προστάτη PC3 ήταν ανεπηρέαστες (15).

Καθαρίστηκε ρ37 διαχωρίστηκε με 12% SDS- PAGE και χρωματίστηκαν με Coomassie blue (Α). Η καθαρισμένη πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο και ανιχνεύθηκαν με το μονοκλωνικό αντίσωμα Τ7-Tag και του τράγου IgG αρμορακίας υπεροξείδιο (HRP) αντι-ποντικού (Β). Τα πρότυπα μοριακού βάρους (MW) είναι σε κιλό Daltons (kDa) και υποδεικνύονται αριστερά του σχήματος. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη ρ37 έτρεξε στη θέση του περίπου 52 kDa. Η πρωτεΐνη ρ37 προβλέπεται να είναι 43,5 kDa με ένα πρόσθετο 8,5 kDa ως αποτέλεσμα της ετικέτα 6Χ His και Xpress Επιτόπου του pRSET Α πλαισίου ανάγνωσης. Η ταυτότητα της καθαρισμένης πρωτεΐνης ρ37 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη χρήση προσδιορισμού αλληλουχίας πρωτεΐνης.

Η

ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες επωάστηκαν με 15 μg ml

-1 ρ37 για 24 ώρες και η ανάλυση μικροσυστοιχιών του καθαρισμένου ολικού RNA υποδεικνύεται έκφραση 537 γονιδίων επηρεάζεται σημαντικά (p≤0.001)? 288 από αυτά τα γονίδια ρυθμίζεται αυξητικά (φορές μεταβολής ≥ 3) (S6 πίνακα). Οι αναθέσεις γονιδίων οντολογίας για τα 288 γονίδια σημαντικά απορυθμίζεται παρέχονται σε S6 Εικ. Οι δέκα πιο έντονα αυξητικά γονίδια (9 έως 64 φορές) έχουν όλα αναφερθεί να επηρεάζει την εξέλιξη του καρκίνου και /ή της φλεγμονής (βλέπε Συζήτηση). Έχουμε επιλέξει για ανάλυση επιπλέον οκτώ γονιδίων (ρυθμισμένη προς τα πάνω 3- έως 9-φορές) που επηρεάζουν επίσης φλεγμονή /καρκίνου. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών για τους δεκαοκτώ γονιδίων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR (qPCR) (S7 σχήμα). Προς τα πάνω ρύθμιση σε απόκριση σε θεραπεία ρ37 επιβεβαιώθηκε για δεκατέσσερα από τα γονίδια. Οι φορές αλλαγές παρέμεινε σχετικά σταθερή μεταξύ των διαφόρων (αργότερα) πειράματα. Μπορούμε στη συνέχεια να χρησιμοποιούνται 25 μg ml

-1 P37 και 24 θεραπείες ώρα? φορές οι αλλαγές ήταν συγκρίσιμα μεταξύ των πειραμάτων.

απτοσφαιρίνης

(

Hp

) ήταν μια εξαίρεση.

Η ανάλυση μικροσυστοιχιών εντοπίστηκαν 249 γονίδια ισχυρά μειωτικά (πάσο αλλαγή ≥ 3) (S7 Πίνακας). Προς τα κάτω ρύθμιση των πέντε από αυτά τα γονίδια έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου και την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης οξείας φάσης (ΑΡΡ) γονίδια (S8 πίνακα).

Επίδραση των διαφορετικών συγκεντρώσεων ρ37 και τους χρόνους αγωγής

ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες επωάστηκαν με 0,5, 1, 5 και 25 μg ml

-1 ρ37 για 24 ώρες. Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις ρ37 ήταν λιγότερο αποτελεσματικά στην τόνωση της γονιδιακής έκφρασης, αν και

Συμπλήρωμα συστατικό 3

(

C3

) και

λιποκαλίνη 2

(

Lcn2

) ήταν ακόμη σημαντικά ενεργοποιείται από 5 μg ml

-1 ρ37 (Πίνακας 1).

η

για να προσδιορίσετε τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση πάροδο του χρόνου ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5 μg ml

-1 P37 για 2 , 4, 8, 12 και 24 ώρες.

Αγγειοποιητίνης όπως-4

(

Angptl4

),

αμυλοειδές ορού A3

(

Saa3

),

μόριο αγγειακή προσκόλληση των κυττάρων 1

(

VCAM1

) και

η ιντερλευκίνη 6

(

IL6

) έκφραση αυξήθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια των πρώτων 4 ωρών από τη θεραπεία, αλλά η ενεργοποίηση είχε πέσει σε χαμηλά επίπεδα ή απουσίαζε σε 24 ώρες (Πίνακας 2). Η σημαντική αύξηση των

Lcn2

και

συνέβη C3

έκφρασης μεταξύ 12 και 24 ωρών.

Decorin

(

DCN

) και

ανασταλτικό παράγοντα λευχαιμίας

(

LIF

) έκφραση αυξήθηκε κατά τις πρώτες 4 ώρες, στη συνέχεια έπεσε και στη συνέχεια αυξήθηκε ελαφρά και πάλι στις 24 ώρες.

Η

Αν και κάποια μεταβλητότητα σε φορές αλλαγή συνέβη όταν ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μg ml

-1 ρ37 για 24 ώρες (Πίνακας 1 και αργότερα πειράματα), πέντε γονίδια

Angptl4

,

Saa3

,

DCN

,

C3

και

Lcn2

ενεργοποιήθηκαν σταθερά πάνω από 10 φορές. Τρία γονίδια

υαλουρονικό συνθάσης 2

(

HAS2

),

Hp

και

LIF

κατά τουλάχιστον 5 φορές.

P37 ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου μέσω του

υποδοχέα ΤΙγ4

Οι ραγδαίες αυξήσεις των

Angptl4

,

LIF

,

Saa3

,

IL6

και

VCAM1

έκφραση σε P37 ινοβλάστες θεραπεία προτείνεται η πρωτεΐνη P37 είναι σηματοδότηση μέσω του ΤοΙΙ υποδοχέα 4 (ΤΙγ4). ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες έχουν ΤΙγ4 από την 1η μg ml

-1 λιποπολυσακχαρίτη (LPS) θεραπεία για 6 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια 28-πλάσια αύξηση σε

IL6

έκφρασης σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες [27]. Εμείς αγωγή ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες με 1 μg ml

-1 LPS για 24 ώρες και βρήκε ένα 2-φορές και 12 φορές αύξηση σε

IL6

και

Saa3

έκφραση, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν φαίνεται). Η Viral πεπτιδικός αναστολέας ΤΙγ4 (VIPER) και το πεπτίδιο ελέγχου (CP7) [28] χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν τα σήματα ρ37 μέσω ΤΙγ4. ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες επωάστηκαν για 24 ώρες με ρ37 (25 μg ml

-1) ή προ-επεξεργασία για 2 ώρες με το VIPER ή CP7 πεπτίδια (0.5 μΜ) πριν από την προσθήκη του P37. Η επίδραση των πεπτιδίων επί των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων επτά πιο έντονα επάγεται από ρ37 προσδιορίστηκε (Σχήμα 2). Η P37-επαγόμενη έκφραση όλων των επτά γονιδίων ανεστάλη σημαντικά από VIPER. Παρά το γεγονός ότι έλαβε χώρα κάποια CP7 επαγόμενη αναστολή, στις περισσότερες περιπτώσεις αυτό ήταν σημαντικά μικρότερη από την αναστολή που προκαλείται από VIPER. Θεραπεία της ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες με 0,5 μΜ VIPER ή CP7 μόνη δεν είχε καμία επίδραση στα γονίδια που ελέγχθηκαν, με την εξαίρεση του

Saa3

το οποίο ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά 0,5 φορές (S8A Σχήμα).

Ποσοτική PCR ( qPCR) ανάλυση των ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες αγωγή με 25 μg ml

-1 ρ37 για 24 ώρες (μαύρο) ή προ-επεξεργασία για 2 ώρες με VIPER (γκρι) ή το πεπτίδιο ελέγχου CP7 (λευκό) πριν από τις 25 μg ml

-1 P37-θεραπείας για 24 ώρες. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των CP7 ή VIPER + P37 θεραπείες και θεραπεία P37 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση ANOVA (+ p ≤ 0,05, ++ p≤0.01, +++ p≤0.001).

Η

Αποκοπή της P37 ή μεταλλάσσοντας την θέση πρόσδεσης TPP αναστέλλει γονίδιο

ενεργοποίηση

Τέσσερις κολοβωμένη πεπτίδια ρ37 παρασκευάστηκαν από τα οποία 20, 60, 80 ή 105 αμινοξέα είχαν διαγραφεί από το C-τελικό άκρο. Διαλυτά πεπτίδια (25 μg ml

-1) καθαρίζεται με τη μέθοδο argSOAK χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες. Η ικανότητα του ρ37 να επάγει την έκφραση του γονιδίου χάθηκε όταν το C-τερματικό 20 αμινοξέα απουσίαζαν (Σχήμα 3). Η εξαίρεση ήταν

Angptl4

του οποίου το επίπεδο έκφρασης που επάγεται από το 20 αμινοξέων πεπτίδιο κολοβωμένη ήταν παρόμοια με το πεπτίδιο πλήρους μήκους ρ37. Τα επίπεδα έκφρασης των άλλων γονιδίων που ελέγχθηκαν (επτά απεικονίζονται) δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από τις κολοβωμένες πεπτίδια ρ37.

ανάλυση ποσοτικής PCR της ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες αγωγή με 25 μg ml

-1 ρ37 εκτός από 20 αμινοξέων (αα), 60aa, 80aa ή 105aa (σκούρο γκρι σε λευκό) από το Ο-άκρο? για 24 ώρες. Αργινίνη μουλιάσει (argSOAK) καθαρίζεται P37 (σκοτεινότερη γκρίζα) ελαφρώς μειώνεται P37-επαγόμενη (μαύρο) της γονιδιακής έκφρασης σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες. Σημαντικές διαφορές μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ινοβλάστες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση ANOVA (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001)

Η

Η κρυσταλλική δομή του ρ37 έχει οριστεί να. 1.9 ψήφισμα Α [29]. P37 είναι ένα άλφα /βήτα πρωτεΐνη κατηγορία που αποτελείται από δύο περιοχές που χωρίζονται από μια σχισμή η οποία υποδεικνύει τη μοντελοποίηση δεσμεύει πυροφωσφορική θειαμίνη (ΤΡΡ).