Αφηρημένο

Quassinoids είναι μια ομάδα διτερπενοειδή που βρίσκονται στα φυτά από την οικογένεια Simaroubaceae . Επίσης, είναι οι μεγάλες βιοδραστικές ενώσεις που βρίσκονται στο

Eurycoma longifolia

το οποίο χρησιμοποιείται συχνά ως παραδοσιακή ιατρική στη Νοτιοανατολική Ασία για τη θεραπεία διαφόρων παθήσεων συμπεριλαμβανομένης της σεξουαλικής δυσλειτουργίας και υπογονιμότητας. Αυτές οι χρήσεις αποδοθεί στην ικανότητά της να βελτιώσει το επίπεδο της τεστοστερόνης στους άνδρες. Χρόνιες κατανάλωση

E

.

longifolia

εκχυλίσματα έχει αναφερθεί ότι αυξάνει το επίπεδο της τεστοστερόνης στους άνδρες και ζωικό μοντέλο, αλλά η επίδρασή της στην ανάπτυξη του προστάτη παραμένει άγνωστη. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη ερευνά τις επιπτώσεις μιας τυποποιημένης συνολικής σύνθεσης κασσινοειδή (SQ40) που περιέχει 40% του συνόλου των κασσινοειδή βρίσκονται στο

E

.

longifolia

σε LNCaP ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά. SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP σε IC

50 τιμή του 5,97 μg /mL, ενώ το IC

50 επί RWPE-1 ανθρώπινου προστάτη φυσιολογικά κύτταρα ήταν 59,26 μg /mL. SQ40 επίσης ανέστειλε 5α-διυδροτεστοστερόνη διεγείρεται ανάπτυξη σε κύτταρα LNCaP δοσοεξαρτώμενο. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα των SQ40 σε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP επίσης αποδειχθεί χρησιμοποιώντας δοκιμασία μαλακού άγαρ. SQ40 κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP μέσω G

0 /G

1 σύλληψης φάση, η οποία συνοδεύτηκε από την προς τα κάτω ρύθμιση των CDK4, CDK2, κυκλίνης D1 και κυκλίνη D3 και up-ρύθμιση του p21

WAF1 /Cip1 πρωτεΐνη επίπεδα. SQ40 σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ή μεγαλύτερης διάρκειας θεραπεία μπορεί να προκαλέσει σύλληψη G

ανάπτυξη 2Μ οδηγούν σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, όπως αποδεικνύεται από την ανίχνευση πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης διάσπαση σε κύτταρα LNCaP. Επιπλέον, SQ40 ανέστειλε επίσης μετατόπιση του υποδοχέα ανδρογόνων στον πυρήνα η οποία είναι σημαντική για την διενεργοποίηση του γονιδίου στόχου του, του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) και είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της έκκρισης PSA μετά τη θεραπεία. Επιπλέον, ενδοπεριτοναϊκή ένεση των 5 και 10 mg /kg του SQ40 επίσης κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου LNCaP σε μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη δείχνουν ότι η σύνθεση της τυποποιημένης συνολικό κασσινοειδή από

E

.

longifolia

προωθεί αντι-προστάτη δραστηριότητες του καρκίνου σε LNCaP ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Tong KL, Chan KL, Abubakar S, Χαμηλή BS, Ma HQ, Wong PF (2015) Η

In Vitro

και

In Vivo

Anti-Cancer Δραστηριότητες μιας σύνθεσης Τυποποιημένων Quassinoids από

Eurycoma longifolia

σε κύτταρα LNCaP Ανθρώπινα καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (3): e0121752. doi: 10.1371 /journal.pone.0121752

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Keith R. Davis, Πανεπιστήμιο της Ιντιάνα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15, Αύγ 2014? Αποδεκτές: 4 του Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Tong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Γεωργίας και Αγρο-Based Βιομηχανίας, Μαλαισία, NKEA Έρευνας Σχέδιο Χορηγιών (NRGS) -NH0711S001 και το Πανεπιστήμιο της Malaya /Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης (UM /Mohe) Επιπτώσεις Research Grant High (HIRG) E00002-20001. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Quassinoids είναι μια ομάδα διτερπενοειδών βρέθηκαν σε φυτά της οικογένειας των Simaroubaceae οποίες διαθέτουν βιοδραστικότητες όπως αντι-όγκου [1,2], αντι-φυματίωση [3], κατά της ελονοσίας [4,5], κατά του έλκους [6,7], εντόμων ρύθμισης της ανάπτυξης [8], αντι-HIV [9] και αντι-φλεγμονώδη [10,11]. αντικαρκινική δράση τους συζητήθηκε εκτενώς σε προηγούμενα σχόλια [12,13]. Κασσινοειδή αναφέρθηκαν ως τα κύρια συστατικά που βρέθηκαν στο

Eurycoma longifolia

[14].

E

.

longifolia

ανήκει στην οικογένεια των φυτών Simaroubaceae και τοπικά γνωστό ως «Tongkat Ali» ή «Pasak Bumi» στη Μαλαισία και την Ινδονησία, «Ian Ντον» στην Ταϊλάνδη και «Cay Binh βα» στο Βιετνάμ [15] .

E

.

longifolia

είναι ένα δημοφιλές βότανο που χρησιμοποιείται παραδοσιακά για τη βελτίωση της ανδρικής λίμπιντο, τη σεξουαλική ανδρεία και τη γονιμότητα. Λόγω της μοναδικής ενίσχυση της τεστοστερόνης περιουσία του, τα ακατέργαστα εκχυλίσματα του φυτού αυτού είναι πλέον ευρέως στην αγορά και να χρησιμοποιούνται για να αυξήσουν την ανδρική αρρενωπότητα και σωστή σεξουαλική δυσλειτουργία [14,15]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η κατανάλωση του εκχυλίσματος αυξημένη παραγωγή τεστοστερόνης και συνέβαλαν στην βελτίωση της ποιότητας του σπέρματος σε άνδρες με ιδιοπαθή υπογονιμότητα και το επίπεδο της τεστοστερόνης του όψιμης έναρξης υπογοναδισμού [16], και ανδρογόνων ανεπάρκεια οστεοπόρωση ζωικό μοντέλο [17]. Η αυξημένη παραγωγή της τεστοστερόνης από

E

.

longifolia

έχει αποδοθεί στην αύξηση του επιπέδου ανθρώπινης χοριακής γοναδοτροπίνης [18] και την αναστολή της δραστικότητας της φωσφοδιεστεράσης και αρωματάσης μετατροπή της τεστοστερόνης σε οιστρογόνα τα οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί υποθαλάμου-υπόφυσης-γονάδων άξονα για να αυξήσει τα επίπεδα της τεστοστερόνης [ ,,,0],19,20].

ανδρογόνα όπως τεστοστερόνη και 5α-διυδροτεστοστερόνη (DHT) είναι σημαντικά για την ανάπτυξη, την ωρίμανση και λειτουργία του προστάτη αδένα. Παρ ‘όλα αυτά, η απορρύθμιση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μονοπάτι έχει ενοχοποιηθεί σε καλοήθεις και κακοήθεις παθήσεις του προστάτη, όπως καλοήθους υπερτροφίας του προστάτη (ΒΡΗ) και του καρκίνου του προστάτη [21,22]. Από ανύψωση της τεστοστερόνης έχει συσχετιστεί με αύξηση του κινδύνου για καρκινογένεση προστάτη [23], είναι μιτογόνος σε προστατικά κύτταρα [24-26] και έχει δειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός υποκινητής του όγκου στον προστάτη τρωκτικού [27], αναλάβαμε την παρούσα μελέτη για να καθοριστεί εάν

E

.

longifolia

εκχύλισμα προάγει ή αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Το πείραμα με ποντίκια έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Ιατρική Σχολή Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας (Ηθική Αριθμός αναφοράς: 07/06/2013 /PHAR /WPF). Το σύνολο πείραμα πραγματοποιήθηκε στο AAALAC Διεθνή διαπιστευμένο Πειραματική Μονάδα Ζώων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας.

Προετοιμασία μιας σύνθεσης τυποποιημένων κασσινοειδή από

E

.

longifolia

Η

Μια τυποποιημένη σύνθεση κασσινοειδή (SQ40) που περιέχει 40% του συνόλου των κασσινοειδή στο

E

.

longifolia

παρασκευάστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο της μελέτης χαμηλό του [28]. Εν συντομία, οι ξηραίνονται στον αέρα σε σκόνη ρίζες (15 kg) του

E

.

longifolia

εκχυλίσθηκαν με 6 χ 4 L 95% μεθανόλης επί 6 ημέρες στους 60 ° C. Το συνδυασμένο εκχύλισμα μεθανόλης με εξάτμιση μέχρι ξηρού υπό μερικό κενό απέδωσε ένα σκούρο καφέ υπόλειμμα 450 g (3% β /β), η οποία ήταν δίπλα σε χρωματογραφία σε μια προ-συσκευασμένη Diaion ΗΡ 20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) στήλη ρητίνης. Η επιλεγείσα κασσινοειδές κλάσμα πλούσιο, SQ40 προήλθε με έκλουση με μία βαθμίδα Η

μίγματα 2O-MeOH (1: 0 έως 0: 1) στη μείωση πολικότητα [20], και στη συνέχεια ξηραίνεται υπό μερικό κενό έως 45 g ( 10% w /w του ακατέργαστου εκχυλίσματος). Η ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) ποσοτικά τις μεγάλες κασσινοειδή ως 32,16% β /β σε SQ40, το οποίο περιλαμβάνει 14,49 ± 0,26% της eurycomanone, 7,39 ± 0,17% epoxyeurycomanone, 0,72 ± 0,06% 13,21-dihydroeurycomanone και 9,54 ± 0,22% w /w eurycomanol [19]. Αυτά τα κασσινοειδή απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν δομές τους (& gt? 95%) ταυτοποιήθηκαν και επιβεβαιώθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [29-31]. Η καθαρότητα των ενώσεων προσδιορίστηκε με Empower 2 λογισμικό του σταθμού εργασίας (Waters, Milford, ΜΑ, USA) που λειτουργεί σε ένα σύστημα Waters Delta Prep HPLC εξοπλισμένο με έναν ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων Waters 2996.

Παρασκευή απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS)

απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να καταστρέφουν των αυξητικών παραγόντων που υπάρχουν στον ορό [32]. Εν συντομία, 5 g ξυλάνθρακα επικαλυμμένο με δεξτράνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε σε 500 mL βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και αναμίχθηκε ήπια για 1 ώρα. Το FBS στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 2500 χ g για 10 λεπτά κάτω από στείρες συνθήκες. υπερκείμενο ορός στη συνέχεια συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε ένα δεύτερο κύκλο θεραπείας ξυλάνθρακα επικαλυμμένο με δεξτράνη. Τέλος, ο ορός διηθήθηκε μέσω ενός 0.2 μm πορώδους μεμβράνης (Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Βέλγιο) και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C για περαιτέρω χρήση. Η στειρότητα του CSS ελέγχθηκε με επώαση μερίδα των μέσων ενημέρωσης σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 για 14 ημέρες.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, LNCaP και PC- 3 κύτταρα, τα ανθρώπινα κανονικό προστάτη, RWPE-1 κύτταρα και τα ανθρώπινα φυσιολογικό ήπαρ, WRL 68 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). LNCaP κύτταρα προήλθαν από υπερκλείδιους λεμφαδένα του ασθενούς του οποίου καρκίνου του προστάτη που δεικνύουν ανδρογόνων ανεξάρτητη ανάπτυξη. Τα κύτταρα LNCaP ευαίσθητο στα ανδρογόνα και εκφράζουν ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA), φωσφατάση προστατικού οξέος και AR [33]. LNCaP κύτταρα έχουν ένα ενιαίο σημείο μετάλλαξη του κωδικονίου 868 (Thr σε Αία) στον τομέα του AR ανδρογόνων πρόσδεσης και αντιδρά όχι μόνο στα ανδρογόνα, αλλά και να αντιανδρογόνα, προγεστίνες και οιστρογόνα [34]. PC-3 κύτταρα που προέρχονται από μεταστάσεις στα οστά σε έναν ασθενή με αδενοκαρκίνωμα του προστάτη βαθμού IV και δεν ανταποκρίνεται σε ανδρογόνα, γλυκοκορτικοειδή, ή επιδερμικό ή ινοβλαστών αυξητικούς παράγοντες [35]. κύτταρα RWPE-1 ήταν η μη νεοπλασματικά ενήλικο άνθρωπο επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη από περιφερειακή ζώνη μιας ιστολογικά φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη ενηλίκου και αποθανάτισε με ανθρωπίνων θηλωμάτων 18 [36]. LNCaP και κυττάρων PC-3 καλλιεργήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute μέσο (RPMI 1640? Invitrogen, Carlsbad, USA) συμπληρωμένο με 10% ν /ν FBS και 1% v /v πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, USA), ενώ RWPE -1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκύτταρα άνευ ορού μέσο (Κ-SFM? Invitrogen, Carlsbad, USA) συμπληρωμένο με 0,5% ν /ν πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. WRL 68 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM? Invitrogen, Carlsbad, USA) συμπληρωμένο με 10% ν /ν FBS και 1% v /v πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η επίδραση της SQ40 στην βιωσιμότητα των LNCaP, PC- 3, RWPE-1 και WRL 68 κύτταρα προσδιορίστηκε με 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] tetrazoliumbromide -2,5-διφαινυλ (ΜΤΤ? Invitrogen, Carlsbad, USA) δοκιμασίας. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε βέλτιστη πυκνότητα κυττάρων περίπου 1.5 χ 10

4 LNCaP κύτταρα /φρεάτιο? 1,25 χ 10

4 PC-3 κύτταρα /φρεάτιο? 1.5 x 10

4 RWPE-1 κύτταρα /καλά? 1,25 x 10

4 ΠΕΑ 68 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (2,5 έως 100 μg /mL) του SQ40 για 72 ώρες. Στο τέλος της επώασης, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [37]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου του οχήματος, αποδίδεται ως 100% βιωσιμότητα. Τέλος, το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC

50) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

διυδροτεστοστερόνη (DHT) θεραπεία

LNCaP κύτταρα σε επεξεργασία με 5α-ανδροσταν-17β-ολ-3-όνη (DHT? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η ανταπόκριση αυτών των κυττάρων σε μιτογονική διέγερση από DHT. Πριν από την θεραπεία, τα κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 5% CSS για 48 ώρες για την αποφυγή παρεμβολών των ανδρογόνων και άλλων αυξητικών παραγόντων που υπάρχουν στο πλήρες FBS. Περίπου 1,5 χ 10

4 LNCaP κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν επί πλάκας 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (20-140 ηΜ) της DHT με ή χωρίς 3, 6 και 12 μg /mL των SQ40 για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με SQ40 στο IC

50 αξία του σε 72 ώρες. Πριν από την σπορά πάνω σε μαλακό άγαρ, σε ένα κυτταρικό αιώρημα που λαμβάνεται με διέλευση των κυττάρων μέσω μιας λεπτής βελόνας. Πέντε χιλιάδες SQ40-κατεργασία και τα κύτταρα φορέα που ελέγχεται αναμίχθηκαν με μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0.3% άγαρ και εμβολιάζονται πάνω σε ένα στρώμα βάσης που περιέχει 0,5% άγαρ σε μέσο ανάπτυξης σε 60 mm τρυβλία πιάτα. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα για άλλες 3 εβδομάδες. Τα μέσα αναπληρώνονται κάθε 3 ημέρες με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης. Στο τελικό σημείο του πειράματος, οι αποικίες μόνο μεγαλύτερο από 0,5 mm μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

εξετάστηκαν Η κινητική ανάπτυξη των LNCaP και κυττάρων RWPE-1 σε πραγματικό χρόνο από το τηλέφωνο Ανάλυση (RTCA) System real-Time (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Η σύνθετη αντίσταση θα αυξηθεί όταν προσκολλημένα κύτταρα προσκολληθούν και να εξαπλωθεί σε όλη την επιφάνεια του αισθητήρα του ενός ηλεκτροδίου και μείωση όταν τα κύτταρα γύρο μέχρι και αποκολληθούν. Εν συντομία, 50 μL ολοκληρωθεί μέσο καλλιέργειας προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο του E-πλάκα 16 και ανάγνωση υποβάθρου καταγράφηκε. Ένα κυτταρικό εναιώρημα 50 μι σε κυτταρική πυκνότητα 3,0 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο E-πλάκας 16. Οι αλλαγές στην εμπέδηση λόγω της προσκόλλησης των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και διασποράς παρακολουθούνταν επί μία νύκτα. Όταν τα κύτταρα εισήλθε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5 έως 80 μg /mL του SQ40. Τα κύτταρα κατεργασμένα με πλήρες μέσο ανάπτυξης που αναφέρεται ως έλεγχος του οχήματος ενώ 5 μΜ κύτταρα πακλιταξέλη επεξεργασμένα αναφέρονταν ως θετικός έλεγχος. Τα κύτταρα στη συνέχεια παρακολουθείται για άλλα 72 ώρες. Οι τιμές σύνθετης αντίστασης εκφράστηκαν ως η κυτταρική Δείκτη (CI). Οι καμπύλες ανάπτυξης κανονικοποιήθηκαν προς το CI της τελευταίας μετρημένο χρονικό σημείο πριν από την προσθήκη φαρμάκων ή ελέγχου του οχήματος.

αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης δοκιμή

κύτταρα Συρρέουσες LNCaP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο καλλιέργειας όχημα, 3 , 6, 12 και 20 μg /mL των SQ40 για 72 και 96 ώρες. LNCaP κύτταρα που κατεργάζονται με 1 μΜ πακλιταξέλης για 72 και 96 ώρες χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος και τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. Τα επεξεργασμένα και ελέγχου του οχήματος κύτταρα συλλέχθηκαν στο τελικό σημείο της περιόδου επώασης και τα αιωρήματα κυττάρων αναμείχθηκαν με 0,4% trypan blue διάλυμα (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε αναλογία 1: 1 και επωάστηκαν για 3- 5 λεπτά. Τα χρωματισμένα και μη χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν με τη χρήση ενός θαλάμου αιμοκυτταρόμετρο. Ποσοστό των νεκρών κυττάρων σε κάθε συγκέντρωση υπολογίστηκε σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση.

(1)

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

κύτταρα Συρρέουσες LNCaP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο καλλιέργειας όχημα, 3, 6 και 12 μg /κ.εκ. SQ40 για 24, 48 και 72 ώρες. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμή κύκλου PLUS σετ αντιδραστηρίων DNA (BD Biosciences, New Jersey, USA). Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη χρώση, τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής FACSCanto II (BD Biosciences, New Jersey, USA). Ένα ελάχιστο 20000 εκδηλώσεων ανά δείγμα καταγράφηκαν για κάθε δείγμα και τα δεδομένα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής DNA Μοντελοποίηση λογισμικού, ModFit LT 3.2 (Verity Software House, USA).

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Η πρωτεΐνη έκφραση του G

1 /S ρυθμιστές όπως οι εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ), CDK4, CDK2, κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, ρ21

WAF1 /Cip1 και ρ27

Kip1 και διασπάται-πολυ (ADP ριβόζης) πολυμεράσης (PARP) αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) Lysis Buffer Σύστημα παρουσία διαλύματος 1% φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 1% διάλυμα ορθοβαναδικού νατρίου και 1% διάλυμα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε με Protein Assay Pierce BCA Kit (Thermo Scientific, Walthan, ΜΑ). Ίση ποσότητα των πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε 12% δωδεκυλο νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου θειικού-(SDS-PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) (μέγεθος πόρων 0,45 μm? Milipore, Bedford, ΜΑ). Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια CDK4, CDK2, Κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, ρ21

WAF1 /Cip1, ρ27

Kip1 και διασπάται-PARP (Asp214) (D64E10) (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ ). Αυτό το στάδιο ακολουθήθηκε από επώαση με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου. Μετά τα στάδια πλύσης, οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρωματομετρικά χρησιμοποιώντας 3,3,5,5 tetramethylbenzine (ΤΜΒ? Sigma Aldrich, Louis, ΜΟ) διάλυμα και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης (BioRad, Richmond, Calif)

υποδοχέα ανδρογόνου (AR) και του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) ELISA

εν συντομία τα κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% CSS για 48 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3, 6 και 12 μg /mL του SQ40 με ή χωρίς 100 ηΜ DHT για άλλες 72 ώρες. DHT προστέθηκε για την τόνωση AR μετατόπισης. Το πυρηνικό κλάσμα λήφθηκε από το προϊόν λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας Nuclear Extraction Kit (Cayman Chemical, ΜΙ, USA) και το επίπεδο πυρηνικής AR μετρήθηκε χρησιμοποιώντας πυρηνικό υποδοχέα Σάντουιτς AR ELISA (Active Motif, Carlsbad, USA). επίπεδο AR ομαλοποιήθηκε με το συνολικό επίπεδο πυρηνικής πρωτεΐνης. Στο ίδιο πείραμα, το μέσο ανάπτυξης του ελέγχου του οχήματος και τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και το εκκρινόμενο επίπεδο PSA ποσοτικοποιήθηκε με ειδικό προστατικό αντιγόνο Ανθρώπινα Kit ELISA (Abcam, ΜΑ, USA). Οι τιμές PSA κανονικοποιήθηκαν έναντι συνολικού αριθμού των κυττάρων.

In vivo

LNCaP μελέτη ξενομοσχεύματος

Αρσενικά NCr ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, ηλικίας 5 εβδομάδων, 20-25 γραμμάρια αγοράστηκαν από InVivos Pte. Ltd (Σιγκαπούρη) και στεγάζονται σε ατομικά αεριζόμενους κλωβούς υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερα παθογόνων και διατηρούνται σε έναν κύκλο φωτός-σκότους 12 ώρες στους 24 ° C. Τα ζώα που παρέχονται με αποστειρωμένο φαγητό και νερό ad libitium. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν πριν την έγχυση των κυττάρων LNCaP (2 χ 10

6) με 50% matrigel (0.1 mL? Becton Dickinson, Jersey, USA) στο δεξί πλευρό του γυμνού υποδορίως ποντίκι. Η αγωγή άρχισε όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί. Ποντικοί που φέρουν όγκο κατανεμήθηκαν τυχαία σε 4 ομάδες. Κάθε ομάδα αποτελείτο από 6 ζώα. Αυτές οι ομάδες ποντικών δόθηκε τότε ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις του διαλύματος φορέα (αλατούχο διάλυμα), 5 mg /kg πακλιταξέλης (θετικός έλεγχος), 5 και 10 mg /kg τρεις φορές SQ40 την εβδομάδα για 6 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου ψηλαφείται και το μήκος και το πλάτος μετρήθηκαν με παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο, 0.5 x μήκος x πλάτος

2. Ο όγκος του βάρους και του όγκου του κάθε ποντικού μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα για μια περίοδο 6 εβδομάδων. Οι ποντικοί θανατώθηκαν όταν οι όζοι του όγκου έφθασε 1,5 εκατοστά σε διάμετρο.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σε τρία τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA), με εξέταση πολλαπλού Σύγκριση Bonferroni χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism (έκδοση 5.0). Η στατιστική σημαντικότητα εκφράστηκε ως *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001 έναντι ελέγχου οχήματος και

#

σ

& lt? 0,05?

##,

σ

& lt? 0,01?

###,

σ

& lt?. 0.001 έναντι 100 nM κύτταρα DHT-διεγείρονται

Αποτελέσματα

SQ40 επιλεκτικά κυτταροτοξική δράση στα LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη και ανέστειλε την DHT διεγερμένων ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP

In vitro κυτταροτοξικότητα

δραστηριότητα SQ40 εξετάστηκε στην ανθρώπινη φυσιολογική προστάτη, RWPE-1 κύτταρα, τα ανθρώπινα φυσιολογικό ήπαρ, ΠΕΑ 68 κύτταρα, τα ανθρώπινα καρκίνος του προστάτη, PC- 3 και LNCaP κύτταρα. Οι συγκεντρώσεις που προκάλεσαν ημιμέγιστη ανασταλτική δράση (IC

50) επί 68 κύτταρα RWPE-1 και WRL ήταν 59,26 μg /mL και 27.69 μg /mL, αντίστοιχα (Σχ. 1, μαύρο και μπλε γραμμή). SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP σε IC

50 του 5,97 μg /mL σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 1, κόκκινη γραμμή). Το IC

50 τιμές της σύνθεσης κασσινοειδή επί RWPE-1 και WRL-68 κύτταρα υψηλότερη σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων LNCaP, γεγονός που υποδηλώνει ότι SQ40 ήταν πιο εκλεκτική για LNCaP κύτταρα καρκίνου από τα φυσιολογικά κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, SQ40 ανέστειλε το 50% της κυτταρικής ανάπτυξης στο PC-3 κύτταρα σε συγκέντρωση υψηλότερη από (87,94 μg /mL? Σχ. 1, πράσινη γραμμή) εκείνη των κυττάρων LNCaP που υποδηλώνει ότι η κασσινοειδές κλάσμα πλούσιο επηρεάζονται τα κύτταρα LNCaP αλλά όχι τα PC-3 κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

RWPE-1 κανονικό προστάτη κύτταρα (μαύρο), WRL 68 φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα (μπλε), LNCaP (κόκκινο) και PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (πράσινο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (2,5 έως 100 μg /mL) του SQ40 για 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μείωσης ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± SEM τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. IC

50 αξίες των SQ40 επί RWPE-1, WRL 68, LNCaP και κυττάρων στο θεραπεία 72 ώρες ήταν 3 PC-59,26 μg /mL, 27,69 μg /mL, 5.97 μg /mL και 87.94 μg /mL, αντίστοιχα.

Η κυτταροτοξική δράση των SQ40 αξιολογήθηκε περαιτέρω σε ανδρογόνα διεγερμένα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη. LNCaP κύτταρα πρώτα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέσο ανάπτυξης που συμπληρώθηκε με 5% CSS και DHT προστέθηκε να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων DHT, τα κύτταρα LNCaP διεγέρθηκαν να αυξηθεί εκθετικά. Συν-θεραπεία με 3, 6 και 12 μg /ml SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP κατά περισσότερο από 50% σε σύγκριση με κύτταρα διεγερμένα μόνο με DHT (Σχ. 2).

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις DHT με ή χωρίς 3, 6 και 12 μg /mL των SQ40 για 72 ώρες σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% CSS και κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρησιμοποίηση δοκιμασίας μείωσης ΜΤΤ. Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος χωρίς θεραπεία DHT. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

SQ40 κατέστειλε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP

Η επίδραση της SQ40 σε κύτταρα LNCaP αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μαλακού άγαρ. Τα κύτταρα LNCaP προ-αγωγή με SQ40 στο IC

50 αξία του σε 3 ημέρες πριν από την επίστρωση επί του μαλακού μέσο άγαρ σε ένα αριθμό ίσο κυττάρου με τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος. Το μέγεθος των αποικιών των κυττάρων κασσινοειδή σύνθεση επεξεργασμένο ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τις κυτταρικές αποικίες ελέγχου του οχήματος (Σχ. 3Α και 3Β). Επιπλέον, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών SQ40 επεξεργασμένου LNCaP κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου (Σχ 3C?.

σ

& lt? 0,05). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι SQ40 ανέστειλε αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη των LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με SQ40 ή ελέγχου του οχήματος για 72 ώρες και στη συνέχεια απλώνονται στο μαλακό μέσο άγαρ για άλλες 3 εβδομάδες. Αντιπροσωπευτικά αποικίες (Α) έλεγχος του οχήματος και (Β) SQ40-κατεργασμένων κυττάρων LNCaP απεικονίζεται. (C) γραφικές παραστάσεις των μαλακό άγαρ αποτελεσματικότητας σχηματισμού αποικίας. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων για τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος και έξι ανεξάρτητα πειράματα για SQ40-κατεργασμένα κύτταρα. * Υποδηλώνει

σ

& lt?. 0,05 έναντι ελέγχου οχήματος

Η

SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP σε χαμηλή συγκέντρωση, αλλά προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε υψηλή συγκέντρωση

Η κινητική ανάπτυξης των LNCaP και τα κύτταρα RWPE-1 παρακολουθήθηκαν σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μέτρησης αίσθησης κύτταρο αντίσταση που βασίζεται. Παρατηρήθηκε ότι οι κανονικοποιημένες τιμές CI για SQ40 κατεργασμένα LNCaP κύτταρα έδειξαν σταθερή μείωση μετά από 6 ώρες θεραπείας με την σύνθεση κασσινοειδή. Μετά από 72 ώρες κατεργασίας, παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με χαμηλότερες συγκεντρώσεις (2,5-10 μg /mL) του SQ40 δέχεται μόνο το ήμισυ περίπου των κανονικοποιημένων CI τιμές των κυττάρων ελέγχου του οχήματος και αυτό δείχνει ότι SQ40 σε χαμηλές συγκεντρώσεις εξασκεί κυτταροστατικά επίδραση στα κύτταρα LNCaP. Ωστόσο, SQ40 σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (20-80 μg /mL) είχε ως αποτέλεσμα πολύ χαμηλές κανονικοποιημένες τιμές CI παρόμοια με εκείνη του θετικού ελέγχου, 5 μΜ paclitaxel επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4Α).

Ο κινητική ανάπτυξης (Α) LNCaP και (Β) RWPE-1 κύτταρα εξετάστηκαν σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας RTCA. Οι τιμές σύνθετης αντίστασης καταγράφηκαν σε πραγματικό χρόνο και εκφράστηκαν ως το κύτταρο Δείκτη (CI). Κύτταρα κατεργασμένα με μέσα ανάπτυξης μόνος αναφέρονταν ως έκδοχο ελέγχου, ενώ 5 μΜ κύτταρα πακλιταξέλη επεξεργασμένα αναφέρονταν ως θετικός έλεγχος. (C) SQ40-κατεργασμένων κυττάρων LNCaP χρωματίστηκαν με 0,4% trypan blue λύσεις σε αναλογία 1: 1 μετά από 72 και 96 ώρες αγωγής αντίστοιχα. Κύτταρα κατεργασμένα με μέσα ανάπτυξης μόνος αναφέρονταν ως έκδοχο ελέγχου ενώ 1 μΜ κύτταρα πακλιταξέλη αγωγή αναφέρονταν ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** Υποδεικνύει

σ

& lt? Αντιμετωπίζονται έλεγχο του οχήματος 0,01 έναντι 72 ωρών.

## δεικνύει

σ

& lt? 0,01?

###,

σ

& lt?. 0.001 έναντι αντιμετωπίζονται ελέγχου του οχήματος 96-ωρη

Η

Σε αντίθεση, οι RWPE-1 κύτταρα φυσιολογικό προστάτη αντιμετωπίζεται με & lt? 20 μg /mL του SQ40 έδειξαν κανονικοποιημένες τιμές CI που ήταν παρόμοιες με αυτές των κυττάρων ελέγχου φορέα υποδηλώνοντας ότι SQ40 σε αυτές τις δόσεις δεν προκάλεσε κυτταροτοξική επίδραση σε φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη. Ωστόσο, παρατηρήθηκε κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα RWPE-1 σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις της σύνθεσης κασσινοειδή (40 και 80 μg /mL? Εικ. 4Β). Σε όλες τις μεταγενέστερες μελέτες, 3, 6, και 12 μg /mL του SQ40 χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων LNCaP. Για να καταδειχθεί ότι τα επόμενα μοριακά επιδράσεις των SQ40 σε αυτές τις δόσεις δεν εισφέρει το υψηλό ποσοστό των νεκρών κυττάρων, trypan χρώση αποκλεισμού μπλε διεξήχθη για να προσδιοριστεί το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων στις καλλιέργειες. Μετά από 72 ώρες επεξεργασίας, το ποσοστό των νεκρών κυττάρων ήταν ~ 20% και 35% στις 12 και 20 μg /mL SQ40-κατεργασμένων κυττάρων LNCaP σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Μια εκτεταμένη διάρκεια θεραπείας 96 ωρών αυξήθηκε το ποσοστό των νεκρών κυττάρων στο ~ 30% και ~ 60% σε 12 και 20 μg /mL SQ40-επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP, αντίστοιχα (Σχήμα 4C?.

σ

& lt? 0.001 ).

SQ40 επάγεται G

0 /G

1 σύλληψης φάση σε κύτταρα LNCaP

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη για να διερευνηθεί η ανασταλτική δράση των SQ40 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των LNCaP κύτταρα. LNCaP κύτταρα σε 70-80% συρροή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3, 6 και 12 μg /mL της σύνθεσης κασσινοειδή για 24, 48 και 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, SQ40 συνελήφθη σημαντικά LNCaP κύτταρα σε G

0 /G

1 φάσης σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε θεραπεία 24 ωρών, τα κύτταρα LNCaP εμφάνισαν υψηλότερες G

0 πληθυσμός /G1 κύτταρο φάση σε 80,22% (

ρ

& lt? 0,01) σε 3 μg /mL κασσινοειδή κύτταρα σύνθεση επεξεργασμένα και 85,45% (

ρ

& lt? 0.001) σε 6 μg /mL κασσινοειδή κύτταρα σύνθεση που έλαβαν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος (65,22%? Εικ. 5Α). Ο πληθυσμός των κυττάρων των 6 μg /mL κασσινοειδή σύνθεση επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP στο G

0 /G

1 φάση αυξήθηκε σημαντικά σε 96,15% (

σ

& lt? 0.001) και 93,67% (

ρ

& lt?. 0.001) μετά την επεξεργασία 48- και 72-ωρών, αντίστοιχα (Σχήμα 5Α). Η αύξηση του ποσοστού του πληθυσμού κυττάρων σε G

0 /G

1 φάση συνοδεύεται από μια μείωση στο ποσοστό του πληθυσμού των κυττάρων στη φάση S (3,11%?

ρ

& lt? 0,01) και G

2 /M φάσης (3,21%) επί των κυττάρων LNCaP μετά από 72-ωρών θεραπείας (Εικ. 5D). Αυτές οι σημαντικές αλλαγές δείχνουν ότι SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP με τη σύλληψη των κυττάρων σε G

0 /G

1 φάση.

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μέσο ανάπτυξης (έλεγχος οχήματος), 3, 6 και 12 μg /mL του SQ40. διανομή κυττάρων στο (Α) G

0 /G

1, (Β) S και (Γ) G

2 /M φάση σε 24, 48 και 72 ώρες θεραπεία αναλύθηκαν με ροή FACSCanto II κυτταρομετρία και αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης ModFit κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Υποδηλώνει

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0,001 έναντι του ελέγχου του οχήματος. (D) Η έκφραση της πρωτεΐνης του διασπασμένης ΡΑΚΡ σε κύτταρα LNCaP κατά την κατεργασία SQ40 για 72 και 96 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 12 μg /mL του SQ40 παρουσίασαν σημαντική αύξηση στο G

2 /M φάση μετά από 72 ώρες θεραπεία. Η G

κυτταρικό πληθυσμό 2 /M φάση σε 12 μg mL SQ40 επεξεργασμένο LNCaP κύτταρα /ήταν 9,58%, 8,94% και 10,23% (

σ

& lt? 0,01) μετά από 24-, 48-, και 72- θεραπείες ώρες, αντίστοιχα, ενώ αυτές των κυττάρων ελέγχου του οχήματος ήταν 10,55%, 7,95% και 4,58% μετά από 24-, 48-, και η θεραπεία 72 ωρών, αντίστοιχα (Εικ. 5C). Επιπλέον, διασπάται-PARP, ένα αποπτωτικό δείκτη ανιχνεύθηκε όταν η διάρκεια της θεραπείας με 12 μg /mL του SQ40 επεκτάθηκε σε 96 ώρες. Επιπλέον, διασπάται-PARP ανιχνεύτηκε επίσης σημαντικά στις 72 ώρες, όταν η συγκέντρωση του SQ40 αυξήθηκε σε 20 μg /mL (Σχ. 5D). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι SQ40 επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μετά G

2 /M σύλληψης.

SQ40 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP με προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών CDK4, CDK2 και Κυκλίνη D1 και up-ρυθμιστική ρ21

WAF1 /Kip1 έκφραση της πρωτεΐνης επίπεδο

η ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της SQ40 για κυτταρικού κύκλου της έκφρασης ρυθμιστικής πρωτεΐνης. Το επίπεδο έκφρασης του G

1 /S ρυθμιστική πρωτεΐνη συμπεριλαμβανομένης CDK4, CDK2, Κυκλίνη D1 και κυκλίνη D3 ήταν πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα LNCaP όταν διεγείρονται να πολλαπλασιάζονται με DHT, ενός μεταβολίτη της τεστοστερόνης (Εικ. 6). Η παρουσία των SQ40 σε 100 ηΜ κύτταρα LNCaP DHT διεγερμένα ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης CDK4, CDK2, Κυκλίνη D1 και κυκλίνη D3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 6). Επιπλέον, SQ40 αύξησε το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του αναστολέα ρ21 του κυτταρικού κύκλου

WAF1 /Kip1 παρουσία 100 ηΜ DHT, όμως, η σύνθεση κασσινοειδή δεν επηρέασε το επίπεδο έκφρασης της ρ27

Kip1 μετά από 72 ώρες αγωγής σε κύτταρα LNCaP. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω την κυτταρομετρία ροής ευρήματα που SQ40 συνελήφθη κύτταρα σε G

0 /G

1 φάση.

κύτταρα LNCaP ήταν πρώτα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με 5% CSS για 48 ώρες και στη συνέχεια επεξεργασία με 3, 6 και 12 μg /mL του SQ40 με την παρουσία 100 ηΜ DHT για 72 ώρες. Ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης για τον εντοπισμό CDK4, CDK2, κυκλίνη D1, κυκλίνης D3, p21

WAF1 /Cip1 και p27

Kip1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

SQ40 καταστέλλεται επίπεδο πρωτεΐνης AR και μείωσε την παραγωγή του PSA σε κύτταρα LNCaP

Η επίδραση της SQ40 επί της πρωτεΐνης AR του LNCaP διερευνήθηκε επόμενος. εκχύλισμα Πυρηνική AR σε 100 ηΜ DHT διεγερμένα LNCaP-κυττάρων αυξήθηκε κατά 25% σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ. 7Α). θεραπεία SQ40 στους 3 και 6 μg /mL μείωσε μάλλον το βασικό επίπεδο πυρηνικής AR κατά 25%, καθώς και σε σύγκριση με τις μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ 7Α?.

σ

& gt? 0,05).