Αφηρημένο

Καρκίνος-όρχεων (CT) αντιγόνα εκφράζονται κυρίως στους όρχεις ή πλακούντα , αλλά απουσιάζει από τις περισσότερες ενήλικους ιστούς. Κατά τη διάρκεια του κακοήθους μετασχηματισμού CT γονίδια συχνά ενεργοποιούνται. CT αντιγόνο 16 (CT16, PAGE5) εκφράζεται συχνά σε προχωρημένο μελάνωμα, αλλά η βιολογική λειτουργία του ήταν άγνωστη. Να εξετάσει το ρόλο της CT16 στην επιβίωση των κυττάρων που το γκρέμισε στο Α2058 κύτταρα μελανώματος με τη χρήση ειδικών siRNAs και εκτίθενται τα κύτταρα να σισπλατίνη φάρμακο για τον καρκίνο είναι γνωστό ότι επάγουν την απόπτωση. Ως αποτέλεσμα, η επιβίωση των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της CT16 στην επιβίωση των κυττάρων με περισσότερη λεπτομέρεια, τα προφίλ έκφρασης κυτταρικού γονιδίου ερευνήθηκαν μετά CT16 σίγηση σε CT16 κύτταρα θετικά Α2058 μελανώματος, καθώς και μετά από CT16 υπερέκφραση σε αρνητικό WM-266-4 κύτταρα μελανώματος CT16. Μεταξύ των 11 γονιδίων τόσο απορυθμίζεται από CT16 σίγηση και μειωτικά από CT16 υπερέκφραση ή αντίστροφα, 4 γονίδια ήταν πιθανώς αποπτωτικά ή αντιαποπτωτικού γονίδια. CT16 αναγνωρίστηκε ως θετικός ρυθμιστής της αντιαποπτωτικών μεταλλοθειονίνης 2Α και ιντερλευκίνη 8 γονίδια, ενώ ανέστειλε την έκφραση της επαγωγής απόπτωσης 1 γονίδιο dickkopf (DKK1). Επιπλέον CT16 ενίσχυσε την έκφραση των λιπαρών πρωτεΐνης 7, ένα γνωστό προαγωγό της προόδου μελανώματος δέσμευσης οξέος. Η επίδραση της CT16 στην έκφραση DKK1 ήταν p53 ανεξάρτητη. Επιπλέον, CT16 δεν ρυθμίζουν αποπτωτικών γονιδίων μέσω μεθυλίωσης του DNA. Σε είκοσι δείγματα ιστού της μετάστασης μελανώματος μέσο επίπεδο mRNA DKK1 δείχθηκε ότι είναι σημαντικά (ρ & lt? 0,05) χαμηλότερη στους υψηλής CT16 που εκφράζουν όγκους (η = 3) σε σύγκριση με τους όγκους με χαμηλή έκφραση CT16 (n = 17). Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CT16 προωθεί την επιβίωση των κυττάρων μελανώματος και συνεπώς είναι ένας πιθανός στόχος για μελλοντική ανάπτυξη φαρμάκων

Παράθεση:. Nylund C, Rappu P, Pakula Ε, Heino Α, Laato L, Elo LL, et al. (2012) Μελάνωμα-Associated Καρκίνου-Όρχεων Αντιγόνου 16 (CT16) ρυθμίζει την έκφραση των αποπτωτικών και Αντι-αποπτωτική Γονίδια και προωθεί κυττάρων επιβίωσης. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10.1371 /journal.pone.0045382

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4η Μαΐου, 2012? Αποδεκτές: 17 Αύγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτεμβρίου 2012

Copyright: © Nylund et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο Turku επιχορήγηση Νοσοκομείο EVO (έργα 13040 και 13041, https://www.tyks.fi), Southwest ταμεία του Ιδρύματος Έρευνας για τον Καρκίνο της Φινλανδίας (https://www.cancer.fi), Ακαδημία της Φινλανδίας (http : //www.aka.fi), το Ίδρυμα Sigrid Juselius (https://www.sigridjuselius.fi), και η Εταιρεία Καρκίνου της Φινλανδίας (https://www.cancer.fi). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα καρκινικά αντιγόνα-όρχεων (CTA) σχηματίζουν μία ετερόλογη ομάδα πρωτεϊνών που εκφράζονται σε γαμέτες και τροφοβλαστών [1]. CTdatabase του Ludwig Institute for Cancer Research (https://www.cta.lncc.br/index.php) [2] απαριθμεί περισσότερα από 140 CTAs. Το CTAs μπορεί να διαιρεθεί με το Χ-χρωμόσωμα-κωδικοποιημένο (X-CTA) και μη-Χ-χρωμόσωμα-κωδικοποιημένα CTAs (μη-X-CTA). Ο πιο κοινός μηχανισμός ενεργοποίησης γονιδίου CTA είναι η απομεθυλίωση υποκινητή [1]. Γαμετογένεσης και ογκογένεση έχουν πολλές αντίστοιχες και κοινές εκδηλώσεις, συμπεριλαμβανομένων των παγκόσμιων υπομεθυλίωση και της έκφρασης CTA [3]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές, κατά πόσον η έκφραση του CTAs είναι απλώς μια συνέπεια του απομεθυλίωσης γεγονότα κοινά σε ογκογένεση ή αν η CTAs έχουν ενεργό ρόλο στην προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου.

Σύμφωνα με την CTdatabase, πολλοί μη-X- CTAs φαίνεται να έχουν ένα ρόλο στην σπερματογένεση και σπέρμα λειτουργία σε φυσιολογικούς όρχεις. Σε αντίθεση, ο βιολογικός ρόλος του X-CTAs είναι ως επί το πλείστον άγνωστη. Η λειτουργία των γονιδιακών προϊόντων που κωδικοποιούνται από δύο οικογένειες X-CTA, MAGE και SSX, έχει προηγουμένως μελετηθεί. έχουν αντιγόνα MAGE-A έχουν αναφερθεί ότι αλληλεπιδρούν απευθείας με ρ53 και να καταστέλλουν τη λειτουργία του [4], [5]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες MAGE δειχθεί ότι σχηματίζει ένα σύμπλοκο με μία πρωτεΐνη σκαλωσιές, πρωτεΐνη KRAB σχετιζόμενη 1 (KAP1) και για την καταστολή ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση [6]. MAGE έχει επίσης αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με RING Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης και να ενισχύσουν την δραστηριότητα των πρωτεϊνών ουβικιτινίωση περιοχή RING προς τους στόχους τους, όπως ρ53 [7]. Τα μέλη της οικογένειας SSX που μπορεί να συντηχθούν με SS18, ως αποτέλεσμα μιας συγκεκριμένης χρωμοσωμική μετάθεση σε ανθρώπινο αρθρικό σάρκωμα [8], έχουν προταθεί ότι δρουν ως ρυθμιστές της μεταγραφής [9]. Ζυμομύκητα δυο υβριδίων-διαλογή και αναλύσεις καθέλκυσης γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη προσδένεται σε SSX2 RAB3IP και πρωτεΐνες SSX2IP [10]. Από την άλλη πλευρά, έχουν SSX πρωτεΐνες έχουν αναφερθεί να συνεντοπίζονται με τα μέλη του συμπλόκου της ομάδας Polycomb [11], και μετέπειτα μελέτες απόδειξη του ρόλου των πρωτεϊνών SSX σε τροποποίηση ιστόνης και μεθυλίωσης του DNA έχουν βρεθεί [12], [13] .

CT16 (επίσης γνωστή ως PAGE5, GAGEE1, CT16.1) είναι ένα Χ-ΟΤΑ και τους στενότερους συγγενείς του ανήκουν στην οικογένεια του προστάτη που σχετίζεται με αντιγόνο (γονίδια PAGE), η οποία με τη σειρά της σχετίζεται με XAGE και οικογένειες γονιδίων GAGE ​​[14]. CT16 αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε μια μελέτη όπου η βάση δεδομένων Unigene αναζητήθηκε για συστάδες γονιδίων που περιέχουν εκφράζεται ετικέτες αλληλουχίας προήλθε μόνο από τα δύο φυσιολογικά ανθρώπινα όρχεις και cDNA όγκων βιβλιοθήκες. Η έκφραση των CT16 σε μελανώματα καθώς και σε πνεύμονα και νεφρικούς καρκίνους δείχθηκε στο επίπεδο του mRNA [15]. Πιο πρόσφατα έχουμε ανέφεραν την έκφραση του mRNA CT16 σε 11 από τους 22 μελανώματος μετάστασης του δέρματος. Επιπλέον, δείξαμε ότι παρά την ομολογία με γνωστές προστάτη αντιγόνα που σχετίζονται CT16 δεν εκφράζεται σε πρωτογενή καρκίνο του προστάτη [16]. Έχουμε επίσης αναπτύξει μια ευαίσθητη δοκιμασία για τη μέτρηση της CT16 απευθείας από ορούς ασθενών και έδειξε ότι 14 από τους 23 (61%) ασθενείς με μεταστατικό μελάνωμα είχαν ανιχνεύσιμα επίπεδα CT16 [16].

Ο βιολογικός ρόλος του CT16 ήταν άγνωστη , αλλά υπάρχουν κάποιες αναφορές σχετικά με τις υποθετικές λειτουργίες των ομολόγων CT16. Ένα GAGE ​​μέλος της οικογένειας που έχει 30% ταυτότητα με CT16 έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την απόπτωση και να αλληλεπιδρούν με nucleophosmin /B23 και ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης 1 [17]. Ομοίως, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ο καρκίνος του προστάτη αντιγόνου 4 (Σελίδα4), το οποίο έχει 43% ταυτότητα με CT16, είναι ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη [18]. Στην ίδια μελέτη, οι συγγραφείς ανέφεραν επίσης ότι Σελίδα4 αποτελεί εγγενώς διαταραγμένη πρωτεΐνη (IDP) που δεσμεύεται με αλληλουχίες GC-πλούσιες σε δίκλωνο DNA [18]. Η ανάλυση NMR του CT16 έχει επίσης δηλώσει ότι είναι μια IDP [19]. Στην πραγματικότητα, η ανάλυση αλληλουχίας με αλγόριθμο IUPred (https://iupred.enzim.hu) [20] προβλέπει ότι όλες οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με CT16 είναι εγγενώς διαταραγμένο. Εκτοπισμένων είναι πρωτεΐνες που δεν σχηματίζουν μία άκαμπτη δομή 3-D σε φυσιολογικές συνθήκες [21]. Επιπλέον, μια πρόσφατη

in silico

ανάλυση δείχνει ότι οι περισσότεροι CTAs είναι εσωτερικά εκτοπισμένοι [22]. Περίπου το 25% των πρωτεϊνών των θηλαστικών προβλέπονται να είναι εσωτερικά εκτοπισμένων, και περίπου 75% των πρωτεϊνών σηματοδότησης θηλαστικών προβλέπεται να έχουν μακρά διαταραγμένο περιφέρειες [23]. Έχει προταθεί ότι οι εσωτερικά εκτοπισμένοι συχνά έχουν πολλαπλές λειτουργίες, μια ιδιότητα που ονομάζεται ως λαθραία [24]. Έτσι, επίσης, CT16 και CT16 που σχετίζονται με CTAs μπορεί να έχουν διαφορετικές λειτουργίες, ανάλογα με το βιολογικό πλαίσιο και την κυτταρική εντόπιση.

Στην εργασία αυτή μελετήσαμε το ρόλο των CT16 σε μελάνωμα. Δείχνουμε ότι αποσιώπηση της CT16 με siRNAs ενισχύει την επαγόμενη από σισπλατίνη κυτταρικό θάνατο. ανάλυση μεταγραφικό χρησιμοποιώντας CT16 υπερέκφραση και νοκ ντάουν αποκάλυψε ότι CT16 ρυθμίζει αρνητικά, ίσως έμμεσα, την έκφραση μιας πρωτεΐνης αντιαποπτωτικού DKK1. Έχουμε αποδείξει ότι η ρύθμιση αυτή είναι ανεξάρτητη p53 και CT16 δεν έχει καμία επίδραση στη μεθυλίωση των γονιδίων που ρυθμίζουν την επιβίωση. Προτείνουμε επίσης ότι τα ανθρώπινα δείγματα μετάσταση μελανώματος με υψηλό επίπεδο CT16 mRNA μπορεί να έχουν μικρότερη mRNA DKK1 από αυτούς με χαμηλά επίπεδα CT16 mRNA.

Αποτελέσματα

CT16 εκφράζεται σε μετάσταση μελανώματος και κυτταρικές σειρές μελανώματος σε επίπεδο πρωτεΐνης

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως την παραγωγή ειδικών πολυκλωνικό αντίσωμα κατά ανθρώπινης ανασυνδυασμένης CT16 [16]. Εδώ, το αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η έκφραση CT16 σε επίπεδο πρωτεΐνης στη μετάσταση του δέρματος μελανώματος. Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. έκφραση CT16 ήταν ορατή μόνο σε ιστούς μετάστασης μελανώματος που εξέφραζαν CT16 mRNA (Σχήμα 1Α, Β). Επιπλέον, η ποσότητα του CT16-ειδική χρώση συσχετίζονται καλά με τα επίπεδα του mRNA (Σχήμα S1). Τα πρωταρχικά δείγματα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι δεν έδειξαν καμία χρώση για CT16 (Εικόνα 1 C). Ένα δείγμα όρχεις χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και CT16 βρισκόταν στο βασικό διαμέρισμα του σπερματογένεσης επιθήλιο, κυρίως σε σπερματογόνια (Εικόνα 1D). Στα δείγματα μετάστασης μελανώματος CT16 φαινόταν να είναι κυρίως κυτταροπλασματική, αν και σε μερικά κύτταρα πυρήνες επίσης θετικά χρωματισμένων (Σχήμα 1Α).

CT16 ανιχνεύθηκε στα δείγματα ιστού με CT16-ειδικό αντίσωμα οπτικοποιήθηκε με κιτ Vectastain ABC και διαμινοβενζιδίνη, και οι τομές με αιματοξυλίνη. (Α, Β) μελάνωμα δείγματα μετάσταση δέρματος από δύο ασθενείς. (C) Πρωτογενής καρκίνος του προστάτη (αρνητικός μάρτυρας). δείγμα (D) όρχεων (θετικός έλεγχος). Τόσο η κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση CT16-ειδικά είναι ορατή στην μεγεθυμένη περιοχή (ένθετο) του δείγματος μελανώματος μετάσταση του δέρματος. Στο δείγμα των όρχεων είναι η μεγέθυνση παρουσιάζει CT16-ειδική χρώση σπερμογονίων. Η γραμμή κλίμακας στην εικόνα όρχεις αντιπροσωπεύει τη μεγέθυνση ως 150 μm για όλες τις εικόνες.

Η

Η ενδοκυτταρική τοποθεσία του CT16 μελετήθηκε περαιτέρω σε SK-MEL-2 κύτταρα μελανώματος καθώς και στα WM-266- 4 κύτταρα μελανώματος σταθερά επιμολυσμένα με CT16 cDNA που περιέχουν ή ακέραια (ελέγχουν cDNA) που περιέχει φορέα έκφρασης. Η έκφραση CT16 των CT16 επιμολυσμένα κύτταρα είχαν ελεγχθεί τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης (Εικόνα S2). δοκιμασία ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας το CT16 αντίσωμα (Σχήμα 2Α) επιβεβαίωσε την εξειδίκευση του αντισώματος, δεδομένου ότι CT16 αρνητικό WM-266-4 κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ελέγχου έδειξαν κάποια φθορισμό υποβάθρου μόνο (Σχήμα 2Α). Σε CT16 θετικά κύτταρα CT16 φαίνεται να εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα (εξαιρουμένων πυρήνια) και κυτταρόπλασμα. Για να επιβεβαιωθεί ο εντοπισμός στον πυρήνα, SK-MEL-2 πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε και αναλύθηκε με κηλίδωση Western. CT16 βρέθηκε τόσο στην πυρηνική και κυτοσολικό κλάσμα, ενώ ένα κυτοσολική πρωτεΐνη ελέγχου ΜΕΚ1 /2 ήταν παρούσα μόνο στο κυτοσολικό κλάσμα (Σχήμα 2Β).

(Α) Εικόνες υποδεικνύονται ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μελανώματος επισημάνθηκαν με κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι ανθρώπινης πρωτεΐνης αντιγόνο καρκίνου όρχεων CT16 που ακολουθείται από δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (η &? L). Εικόνες συλλήφθηκαν, σε ίσες χρόνους έκθεσης να συγκρίνει ποιοτικά την έκφραση του αντιγόνου CT16 στις κυτταρικές γραμμές. Η ένταση φθορισμού σε WM-266-4 κύτταρα επιμολυσμένα με CT16 cDNA που περιέχει το πλασμίδιο είναι παρόμοιο με αυτό του CT16-θετικών κυττάρων SK-MEL-2. WM-266-4 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα δείχνει απλώς φθορισμό υποβάθρου. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 20 μm για όλες τις εικόνες. (Β) στύπωμα Western του κυτοσολίου και πυρηνικά κλάσματα των κυττάρων SK-MEL-2. Για την ανίχνευση των CT16, τα δείγματα τρέχουν σε ένα 12% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου μη μετουσίωσης, όπου CT16 συνήθως μεταναστεύει ως δύο ή τρεις διακριτές ζώνες. ΜΕΚ1 /2 ανιχνεύθηκε στα δείγματα τρέχουν σε ένα αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%.

Η

CT16 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Η επίδραση της CT16 στον πολλαπλασιασμό μελετήθηκε με τη σταθερά CT16 επιμολυσμένα WM-266-4 κύτταρα. Επιπλέον, δύο siRNAs κατά CT16 mRNA σχεδιάστηκαν και επαλήθευσε ότι προκαλεί περισσότερο από 80% αναστολή της έκφρασης CT16, η οποία διήρκεσε τουλάχιστον 96 ώρες (Σχήμα S3A-C). Τα siRNAs θεωρήθηκαν ότι είναι ειδικοί για CT16, δεδομένου ότι δεν ρυθμίζουν την έκφραση άλλων CT-αντιγόνα, π.χ. MAGE-1 ή GAGE-1 (Σχήμα S3D). Είναι σημαντικό ότι οι κυτταρικές σειρές μελανώματος που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη δεν εκφράζουν PAGE2B, το πλησιέστερο ομόλογο με CT16 (Σχήμα S3E). Ούτε η υπερέκφραση της CT16 στα κύτταρα WM-266-4 ούτε μεταχείριση των Α2058 κυττάρων με CT16 ειδικά siRNA που είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 3Α, Β).

(Α) Τα κύτταρα Α2058 αντιμετωπίζονται με CT16 ειδικό ή ελέγχου siRNA υποβλήθηκαν σε κινητό τίτλος 96 δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Το διαλυτοποιημένο προϊόν φορμαζάνης χρωστικής ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 570 nm. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των WM-266-4 σταθερά επιμολυσμένα με CT16 ή cDNA έλεγχο. (Γ) CT16 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα Α2058 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ cisplatin επί 17 ώρες για να επάγει απόπτωση και κυτταρολύματα κηλιδώθηκαν για διασπασμένης κασπάσης-3. (D) Α2058 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ενδεικνυόμενη siRNA για 48 ώρες αφέθηκαν να προσκολληθούν στην πλάκα xCELLigence για 10 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης κατά το χρόνο μηδέν και το κύτταρο δείκτη μεταγενέστερα μετρήθηκε σε διαστήματα 10 λεπτών για 30 ώρες είχε. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις των τριών πειραμάτων. Ο δείκτης κύτταρο όλων των δειγμάτων κανονικοποιήθηκε προς 1 κατά τον χρόνο μηδέν. (Ε) Cross-τομές σε τρία χρονικά σημεία του πειράματος xCELLigence. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά από τη θεραπεία siRNA ελέγχου,

P

& lt?. 0.001 (HSD ANOVA, κατά Tukey)

Η

CT16 προωθεί την επιβίωση των κυττάρων μελανώματος

Για να ελέγξετε περαιτέρω το βιολογικός ρόλος του CT16 εκθέσαμε κύτταρα μελανώματος σε προκαλούν απόπτωση φάρμακο για τον καρκίνο, σισπλατίνη. Α2058 κύτταρα πρώτα αγωγή είτε με CT16 συγκεκριμένες siRNAs ή να ελέγξει siRNA για 48 ώρες, και μετά την προσθήκη του σισπλατίνη τις κυτταρικές καλλιέργειες παρακολουθήθηκαν για 30 ώρες σε διαστήματα 10 λεπτών χρησιμοποιώντας τεχνολογία xCELLigence. Σε αυτή την τεχνολογία, τα κύτταρα αναπτύσσονται πάνω σε μία επιφάνεια που περιέχει ολοκληρωμένα μικρο-ηλεκτρόδια, και η ηλεκτρική αντίσταση μεταξύ των ηλεκτροδίων που προκαλείται από τα κύτταρα μετριέται. Η σχετική αλλαγή στην μετρούμενη ηλεκτρική αντίσταση εκφράζεται ως Κυττάρων Δείκτη (CI). Τόσο ο αριθμός των κυττάρων και η μορφολογία επηρεάζει την CI, και την κυτταρική αποκόλληση και ο θάνατος θεωρείται ως μια μείωση της CI.

Η σισπλατίνη μειώθηκε CI της CT16 siRNA επεξεργασμένων κυττάρων αισθητά περισσότερο από αυτό του ελέγχου κυττάρων αντιμετωπίζεται siRNA (Σχήμα 3D, E ). Η διαφορά ήταν εμφανέστερη όταν σισπλατίνη συγκέντρωση 50 μΜ χρησιμοποιήθηκε. Σε αντίθεση, CT16 δεν είχε επίδραση επί της επιβίωσης παρουσία σταυροσπορίνη (0 έως 600 ηΜ) (δεν φαίνεται). Έτσι, φαίνεται ότι αναστέλλει CT16 επαγόμενη σισπλατίνη αλλά όχι σταυροσπορίνη που επάγεται θάνατος των κυττάρων Α2058 μελανώματος.

Με την παρουσία της cisplatin CT16 siRNAs θα μπορούσε να αυξήσει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, όπως φαίνεται από κηλίδωση Western με αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά διασπασμένη κασπάση-3 (Σχήμα 3C). Έτσι, CT16 θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα του μελανώματος από την απόπτωση.

CT16 ρυθμίζει γονίδια επιβίωσης που σχετίζονται με

Για να εξετάσει περαιτέρω το ρόλο της CT16 στην επιβίωση των κυττάρων, δύο transcriptomic πειράματα προφίλ διεξήχθησαν. Στο πρώτο πείραμα, CT16 κύτταρα μελανώματος Α2058 θετικά υποβλήθηκαν σε αγωγή με CT16 συγκεκριμένες siRNA και στη συνέχεια σε σύγκριση με κύτταρα Α2058 έλαβαν θεραπεία με έλεγχο siRNA. Στο δεύτερο πείραμα, σταθερώς ελέγχουν cDNA επιμολυσμένα WM-266-4 κύτταρα μελανώματος συγκρίθηκε με σταθερώς CT16 cDNA επιμολυσμένων κυττάρων. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIAME, στο Gene Expression NCBI του Omnibus [25], αριθμός ένταξης GSE31352 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). Ο αλγόριθμος προϊόν κατάταξη χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων [26]. Ο αλγόριθμος εντοπίζει γονίδια που βρίσκονται συνεχώς ανάμεσα στα πιο απότομη ανωφέρεια ή μειωτικά γονίδια σε όλες τις επαναλήψεις. Η χρήση τάξεις, αντί των τιμών έκφρασης αυξάνει την αντοχή κατά του θορύβου. Τα γονίδια με το προϊόν κατάταξη ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) & lt? 0,05 υποβλήθηκαν σε ανάλυση οντολογία γονιδίων από το εργαλείο GoTermMapper που χαρτογραφεί τα γονίδια σε επιλεγμένα κυτταρικό συστατικό και βιολογικών κατηγορίες οντολογία γονιδίων διαδικασία (Slims GO). Η συνολική διανομή από κυτταρικό συστατικό ή βιολογική διεργασία των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων βρέθηκε να είναι παρόμοια και στις δύο CT16 υπερέκφραση και knockdown πειράματα (Σχήμα 4). Για τον προσδιορισμό των βιολογικών διαδικασιών οι διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μπορούν να συμμετέχουν σε μια λειτουργική ανάλυση σχολιασμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας εργαλείο DAVID. Μόνο οι όροι με Benjamini-Hochberg FDR & lt? 0,05 συμπεριλήφθηκαν στα αποτελέσματα. Τα γονίδια που υπερεκφράζονται με CT16 υπερέκφραση σημαντικά εμπλουτισμένο σε βιολογικές διαδικασίες που προάγουν την επιβίωση ή σχετίζονται με τη φλεγμονή, χημικές ομοιόσταση καθώς και απόκριση σε ερεθίσματα και τραυματισμό (Πίνακας 1). Τα γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με CT16 υπερέκφραση ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται αποκλειστικά στην επεξεργασία του αντιγόνου και παρουσίαση του πεπτιδίου ή αντιγόνου πολυσακχαρίτη μέσω διαδικασίας MHC κατηγορίας II (Πίνακας 1). Ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στο πείραμα νοκ ντάουν CT16 δεν αποκάλυψε βιολογικών διεργασιών με Benjamini-Hochberg FDR & lt? 0,05 (δεν απεικονίζεται)

Τα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων από νοκ ντάουν και υπερέκφραση πειράματα CT16 αναλύθηκαν ξεχωριστά.. Ο αριθμός των γονιδίων που σχολιάζονται στην ιδιαίτερη κατηγορία είναι σε παρένθεση. Η χαρτογράφηση με GO λεπτό οντολογία έγινε με GoTermMapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).

Η

Για να περιορίσετε τον αριθμό των γονιδίων που πρέπει να μελετηθεί, επιλέξαμε μόνο τα γονίδια που ρυθμίζεται προς τα κάτω από CT16 ειδικά siRNA και υπερεκφράζεται λόγω CT16 υπερέκφραση ή

αντίστροφα

(προϊόν κατάταξη FDR & lt? 0.1 και στα δύο πειράματα). Από το σύνολο των 11 γονιδίων που πληρούν αυτά τα κριτήρια, 5 έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι εμπλέκεται εις την πρόοδον του καρκίνου (Πίνακας 2). Με βάση αυτά τα πειράματα CT16 αναγνωρίστηκε ως θετικός ρυθμιστής της αντιαποπτωτικών μεταλλοθειονεΐνης 2Α (MT2A) και ιντερλευκίνη 8 γονίδια (IL8), ενώ ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου που διεγείρουν απόπτωση dickkopf 1 (DKK1). Επιπλέον, CT16 ενίσχυσε την έκφραση των πρωτεϊνών δέσμευσης λιπαρού οξέος 7 (FABP7), ένα γνωστό προαγωγό της εξέλιξης του μελανώματος. Η διαφορική ρύθμιση της FABP7, MT2A και DKK1 γονίδια επιβεβαιώθηκε με πραγματικό χρόνο qRT-PCR ανάλυση της CT16 υπερεκφράζουν WM-266-4 κύτταρα (Εικόνα 5Α, Σχήμα S4).

(Α) Έλεγχος των διαφορικών DKK1 έκφραση mRNA σε (κύτταρα WM-266-4 επιμολύνονται με cDNA έλεγχο ή CT16 cDNA. από qRT-PCR. (Β) έκφραση Διαφορική DKK1 mRNA ήταν επίσης επαναλήψιμη σε Α2058 κύτταρα κατεργασμένα με υποδεικνυόμενη siRNAs για 48 ώρες. (C) κηλίδα Western για DKK1 σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων Α2058 σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη siRNAs για 48 ώρες. (D) DKK1 ρυθμίζεται μειωτικά σε δείγματα μελανώματος με υψηλή έκφραση CT16. επίπεδα CT16 και DKK1 mRNA των δειγμάτων ιστού μελανώματος μετάσταση δέρμα ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR. Το em

σ

τιμή λήφθηκε με εξέταση τη διαφορά επιπέδου DKK1 mRNA μεταξύ των δειγμάτων μελανώματος με υψηλό επίπεδο CT16 mRNA (& gt? 22% των β-ακτίνης mRNA) και εκείνων με χαμηλό επίπεδο CT16 mRNA (& lt? 7% του β ακτίνης mRNA) από τεστ Tukey-Kramer.

η

για να ελέγξετε τα κριτήρια επιλογής των γονιδίων στον πίνακα 2, που χρησιμοποιούνται σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR για την ανάλυση τριών γονιδίων, CTSL, DDAH1 και BIRC5 που ρυθμίζεται προς τα κάτω από CT16 ειδικά siRNA και υπερεκφράζεται λόγω CT16 υπερέκφραση ή

αντίστροφα

αλλά είχε το προϊόν κατάταξη FDR & gt? 0.1. Σε αυτές τις μετρήσεις η επίδραση της CT16 επί της έκφρασης δεν θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί (Σχήμα S4). Έτσι, το επιλεγμένο προϊόν οριακή τιμή FDR βαθμό αποτελεσματικά φιλτράρονται false positives, διατηρώντας τα πραγματικά αυτά.

CT16 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της DKK1 σε μελάνωμα

Η εξωκυττάρια Wnt ανταγωνιστής DKK1 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτες, δεδομένου ότι έχει ήδη αποδειχθεί για την ενεργοποίηση της απόπτωσης και να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μελάνωμα και άλλους καρκίνους [27], [28]. Δύο ανεξάρτητες siRNAs CT16 αυξημένα επίπεδα DKK1 mRNA σε κύτταρα Α2058 (Σχήμα 5Β). Η επίδραση της CT16 επί της έκφρασης DKK1 επιβεβαιώθηκε επίσης στο επίπεδο της πρωτεΐνης στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων Α2058 κυττάρων με κηλίδες Western. Knockdown από το CT16 ειδικό siRNA είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στην συσσώρευση της πρωτεΐνης DKK1 μέσα στο μέσο (Σχήμα 5C).

Για την απόδειξη ότι CT16 ρυθμίζει επίσης τα επίπεδα έκφρασης DKK1 σε όγκους, τα δείγματα μετάσταση δέρμα 20 μελανώματος αναλύθηκαν με σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR. Το επίπεδο CT16 mRNA σε σχέση με την β-ακτίνη ήταν κάτω από 7% σε 17 δείγματα που ομαδοποιούνται στο χαμηλότερο δείγματα μελανώματος CT16. επίπεδο CT16 mRNA ήταν πάνω από 22% της β-ακτίνης σε τρία δείγματα που ταξινομήθηκαν ως υψηλά δείγματα μελανώματος CT16. Είναι ενδιαφέρον ότι οι υψηλά δείγματα CT16 είχαν σημαντικά (ρ & lt? 0,05, δοκιμή Tukey-Kramer) χαμηλότερο μέσο επίπεδο DKK1 mRNA σε σύγκριση με εκείνη του χαμηλού δειγμάτων CT16 (Εικόνα 5D), γεγονός που υποδηλώνει ότι το υψηλό επίπεδο CT16 μπορεί να είναι ένας λόγος για περιγράφηκε προηγουμένως προς τα κάτω ρύθμιση του έκφραση DKK1 σε μελάνωμα.

CT16 ρυθμίζει γονίδια στόχους της σε μια p53 και μεθυλίωσης του DNA ανεξάρτητο τρόπο

Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις του X-CTAs είναι γνωστά μόνο σε λίγες περιπτώσεις. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες MAGE που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τις λειτουργίες p53 (Yang et al., 2007), θελήσαμε να μελετήσουμε τις επιπτώσεις σε διαφορετικές θετικές κυτταρικές σειρές CT16. Καμία αλλαγή στην έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 ανιχνεύθηκε με ανοσοαποτύπωση σε CT16 siRNA knockdown κυττάρων SK-MEL-2 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA αγωγή (Σχήμα S5A). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης μεταξύ του CT16 και cDNA ελέγχου επιμολυσμένα WM-266-4 κύτταρα (Σχήμα S5B). Δοκιμάσαμε επίσης τα αποτελέσματα των CT16 σε ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος Saos-2 που είναι γνωστό ότι δεν έχουν καμία έκφραση ρ53. Η αρνητική έκφραση του ρ53 σε κύτταρα Saos-2 επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (δεν φαίνεται). Το αποτέλεσμα έδειξε, ομοίως όπως στα κύτταρα Α2058, μια σαφή προς τα πάνω ρύθμιση, από DKK1 μετά CT16 knockdown, υποδεικνύοντας ότι η ρ53 δεν εμπλέκεται στη διαδικασία (Σχήμα S5c). Ούτε είχαν CT16 κάποια επίδραση στην διαμορφωτική μεταβολή του ρ53 στο ακατέργαστο εκχύλισμα του WM-266-4 κύτταρα (Σχήμα S5D). Επιπλέον, δεν υπήρχε διαφορά στην σταθερότητα p53 μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία Α2058 CT16 siRNA και τα κύτταρα ελέγχου μετά την αναστολή της σύνθεσης πρωτεΐνης με CHX Σχήμα S5E). Σύμφωνα με αυτό, καμία σημαντική εμπλουτισμός των γονιδίων στόχων p53 μεταξύ διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων βρέθηκε (δεν φαίνεται). Μαζί αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η ρ53 δεν μεσολαβούν τα αποτελέσματα των CT16 ή να συμμετέχουν στην απόπτωση.

Μερικά X-CTAs επηρεάζουν επίσης γονίδιο μεθυλίωσης και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε ιστόνες. Για τη μελέτη αυτή, ένας προαγωγός-ειδική ανάλυση χρωματίνη ανοσοκαθίζησης γονιδιώματος κλίμακα για WM-266-4 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με CT16 ή cDNA έλεγχος διεξήχθη με τη χρήση ειδικών μεθυλίωσης του DNA και ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 ειδικά αντισώματα και μία μικροσειρά που καλύπτει 30.000 ανθρώπινα προαγωγούς. Τα δείγμα-ειδικά γονίδια, ορίζονται ως αυτές με κορυφές (ανιχνεύονται και αξιολογούνται από το λογισμικό NimbleScan) με FDR & lt? 0.05 στο δείγμα και FDR≥0.2 στον έλεγχο ή αντίστροφα, αναλύθηκαν με τη χρήση DAVID. Δεν υπήρχαν σημαντικά εμπλουτισμένο γονιδίων σε οποιεσδήποτε κατηγορίες γονίδιο οντολογία μεταξύ των γονιδίων δείγμα-ειδική (δεν φαίνεται). Έχουμε, επίσης, σε σύγκριση με τους καταλόγους των διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται WM-266-4 με τις δείγματος-ειδικών γονιδίων-λίστες από τις δύο συγκεκριμένες μεθυλίωση και ακετυλίωση ιστονών αναλύσεις ειδική ανοσοκαταβύθιση (Πίνακας S1). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι υπάρχει μια σύνδεση μεταξύ των ιστονών Η3 ακετυλίωση και γονιδιακή έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζονται CT16. Ωστόσο, είναι ασαφές εάν CT16 εμπλέκεται σε γεγονότα ακετυλίωση ιστονών ή το αποτέλεσμα απλώς αντανακλά τη γνωστή σχέση μεταξύ της ιστόνης Η3 ακετυλίωση και γονιδιακή έκφραση. Σε αντίθεση με ιστόνης Η3 ακετυλίωση, μεθυλίωση του DNA δεν έδειξε συσχέτιση με CT16 ρυθμιζόμενα γονίδια που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης με CT16 δεν διαμεσολαβείται από μεθυλίωση του DNA.

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι κατηγορίας Ι MAGE πρωτεΐνες ρυθμίζουν KAP1 και μεταγραφή KRAB πεδίο δακτύλου ψευδαργύρου παράγοντας διαμεσολαβούμενη γονιδιακή καταστολή μέσω της αλληλεπίδρασης με KAP1 [34]. Ωστόσο, δεν είναι πολύ πιθανό ότι και CT16 θα αλληλεπιδρούν με KAP1, δεδομένου ότι οι στόχοι KAP1 προσδιορίζονται σε μια ανάλυση χρωματίνη ανοσοκαταβύθισης γονιδιώματος σε επίπεδο της πρόσδεσης KAP1 [35] δεν εμπλουτίστηκαν μεταξύ διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων είτε από το knockdown CT16 ή πειράματα υπερέκφραση ( δεν παρουσιάζονται).

Έχουμε αποκλεισθεί προηγουμένως την πιθανότητα ότι θα μπορούσε να CT16 συνδέονται απευθείας προς αλληλουχίες πλούσιες σε GC σε δίκλωνο DNA [19] κατά παρόμοιο τρόπο όπως παράλογο του Σελίδα4 [18]. Εδώ, δεν θα μπορούσαμε να δείξουμε εντοπισμό των CT16 στις άμεσες υποκινητές των γονιδίων στόχων του (Εικόνα S6). Έτσι, ο μηχανισμός δράσης CT16, όπως και η λειτουργία των περισσότερων άλλων X-CTAs, παραμένει άγνωστη.

Συζήτηση

Η αποτελεσματική θεραπεία του μεταστατικού μελανώματος είναι ένα σημαντικό άλυτο πρόβλημα. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για να πάρει νέες πληροφορίες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την επιβίωση και την αντίσταση των ναρκωτικών σε μελάνωμα. Πρόσφατα αποτελέσματα από κλινικές δοκιμές που έχουν αποφέρει αισιοδοξία ότι στο εγγύς μέλλον νέα ειδικά φάρμακα, όπως το ipilimumab [36] και οι αναστολείς BRAF [37], θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να σταματήσει την εξέλιξη της νόσου σε προχωρημένο στάδιο. Ωστόσο, πολλά μελανώματα, επίσης, φαίνεται να αναπτύξουν αντίσταση εναντίον των νέων μορίων του φαρμάκου γρήγορα, μερικές φορές σε μήνες [38].

Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι η έκφραση του CT16 συχνά επάγεται σε ανθρώπινο μελάνωμα. Επιπλέον, CT16 ορό μπορεί να μετρηθεί και να χρησιμοποιηθεί για να ακολουθήσει την εξέλιξη της νόσου [16]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι CT16 προστατεύει τα κύτταρα μελανώματος έναντι σισπλατίνης (50 μΜ) προκάλεσε τον θάνατο των κυττάρων. σύμπλοκα λευκόχρυσου συνδέονται και το DNA διασταυρώσεων, η οποία οδηγεί σε απόπτωση. Είναι ενδιαφέρον, CT16 δεν μπορούσε να εμποδίσει σταυροσπορίνης που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Η σταυροσπορίνη είναι ένα αλκαλοειδές που αναστέλλει ένα ευρύ φάσμα κινασών πρωτεΐνης [39], και έτσι μπορεί να ενεργοποιήσει απόπτωση από αρκετούς διαφορετικούς μηχανισμούς [40]. Οι κυτταρικές λειτουργίες των περισσοτέρων CTAs είναι άγνωστες, αλλά εκτός από την CT16 επίσης ορισμένα άλλα X-CTAs έχουν συνδεθεί με την κυτταρική επιβίωση. Η επιμόλυνση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με MAGE-A2 και MAGE-Α6 μπορεί να επάγει την πακλιταξέλη και την αντίσταση δοξορουβικίνη με έναν άγνωστο μηχανισμό [41]. Επιπλέον, GAGE-7 έχει περιγραφεί να δρα ως αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη σε κύτταρα HeLa [17], [42]. Πιο πρόσφατα, ένας καρκίνος του προστάτη αντιγόνο που σχετίζεται, Σελίδα4, αναφέρθηκε ότι αναστέλλει επαγόμενη από στρες κυτταρικού θανάτου [18].

Με βάση την ανάλυση ευρείας γονιδιακής έκφρασης γονιδιώματος μας, CT16 μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά συγκεκριμένες βιολογικές διεργασίες όπως η απόπτωση και παρουσίαση αντιγόνου για την ενίσχυση της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων. Ο μηχανισμός δράσης CT16 φαίνεται να είναι, τουλάχιστον εν μέρει σχετίζονται με το γεγονός ότι μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών γονίδια, όπως μεταλλοθειονεϊνης 2Α, IL-8 και DKK1. Αυτά τα τρία γονίδια ήταν μεταξύ των έντεκα γονίδια που βρέθηκαν να ρυθμίζεται από CT16 τόσο στα σίγηση και υπερέκφραση πειράματα CT16. Μεταλλοθειονεΐνη 2Α είναι γνωστό ότι προστατεύουν τα κύτταρα HeLa από ROS που προκαλείται θάνατος [30], ενώ η IL-8 αναστέλλει ρυμουλκουμένων και προκαλούμενη από φάρμακο απόπτωση κυττάρων καρκίνου του προστάτη [33] και αυξάνει την ογκογονικότητα και μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων μελανώματος [32]. Πιο ενδιαφέρον είναι, CT16 βρέθηκε να είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του DKK1, ένα γονίδιο που περιγράφεται για να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε κακόηθες μελάνωμα [43]. DKK1 είναι ένας αναστολέας εξωκυτταρικό αντι-αποπτωτικής παθολογικής οδού Wnt-σηματοδότηση [44] που μπορεί να επάγει απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος [27]. Ως εκ τούτου, μείωση στην έκφραση DKK1 θεωρείται ότι είναι ένας σημαντικός μηχανισμός επιβίωσης σε κύτταρα μελανώματος. Όταν αναλύσαμε 20 μεταστάσεις δέρματος μελανώματος στην έκφρασή τους DKK1 και CT16 mRNA, τρία δείγματα έδειξαν εξαιρετικά υψηλά επίπεδα CT16 και ταυτόχρονα πολύ χαμηλή έκφραση DKK1. Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι CT16 υπερέκφραση δεν είναι μία, αλλά μάλλον ο μόνος μηχανισμός που οδηγεί σε καταστολή DKK1 σε μελάνωμα. CT16 ενισχύει επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης που δεσμεύεται με λιπαρό οξύ 7 (FABP7), ένα γνωστό προαγωγό της προόδου μελανώματος [29].

Ο ακριβής μηχανισμός του τρόπου με CT16 ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων αυτών παραμένει να μελετηθεί. Σελίδα4, ένα παράλογο του CT16, δείχθηκε πρόσφατα να δεσμεύονται άμεσα με το DNA [18]. Επιπλέον, και οι δύο CT16 και Σελίδα4 είναι εγγενώς διαταραγμένο πρωτεΐνες [18], [19], [45]. Ωστόσο, CT16 πρόσδεσης στο DNA δεν έχει παρατηρηθεί [19]. Ως εκ τούτου, παρά την ομολογία μεταξύ Σελίδα4 και CT16 ο μηχανισμός δράσης μπορεί να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών. Επιπλέον, έχουμε εξαιρούνται τα δύο άλλων γνωστών μηχανισμών της CTA-X δράση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ρ53 δεν διαμεσολαβεί τις επιδράσεις του CT16, παρά το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες MAGE ενεργεί με αυτόν τον τρόπο. Ούτε θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε σύνδεση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και CT16 ρυθμίζονται τα γονίδια.

Για να ολοκληρώσω, η πρόσφατη πρόοδος στην ανάπτυξη της φαρμακευτικής αγωγής εναντίον προχωρημένο μελάνωμα έχει οδηγήσει στην επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων βιοδεικτών της εξέλιξης της νόσου. Έχουμε πρότεινε πρόσφατα ότι τα επίπεδα ορού CT16 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας και υποθετικό υποτροπές. Εδώ, αναφέρουμε ότι CT16 συμβάλλει επίσης στην παθογένεση της νόσου ρυθμίζοντας τόσο αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών γονιδίων και την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης μελανώματος. Ως εκ τούτου, CT16 είναι ένα υποθετικό μόριο-στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων που στοχεύουν να ενισχύσουν το αποτέλεσμα της επαγωγής απόπτωσης των ναρκωτικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Οι κλινικές μελέτες εγκρίθηκαν από η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku, και κάθε ασθενής που παρέχονται γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν στις εξετάσεις και /ή να επιτρέψει δείγματα ιστού του /της πρέπει να χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς.

οι κυτταρικές σειρές και επιμολύνσεις

Οι κυτταρικές σειρές μελανώματος Α2058, SK-MEL-2, και WM-266-4 αρχικά ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) επικυρώνονται από την προστασία της υγείας Οργανισμό Πολιτισμού Συλλογές (Porton Down, Ηνωμένο Βασίλειο) με τη χρήση STR μέθοδος ανάλυσης. Οι κυτταρικές σειρές μελανώματος διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 και 37 ° C σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Το cDNA CT16 συμπεριλαμβανομένου του κωδικονίου τερματισμού κλωνοποιήθηκε με PCR από τον φορέα έκφρασης για CT16 [16] και εισάγεται σε

Xba

Ι και

Eco RI

θέσεις pEXPR-IBA103 πλασμίδιο (ΙΒΑ GmbH, Göttingen, Γερμανία). Μία ποσότητα 1 μg του CT16 cDNA που περιέχει ή ακέραια (ελέγχουν cDNA) φορέα pEXPR-IBA103 επιμολύνθηκε σε WM-266-4 κύτταρα χρησιμοποιώντας Fugene 6 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση για 48 ώρες τα G418-ανθεκτικά κύτταρα επιλέγονται με 0.8 mg /ml G418 (Invitrogen). Τα σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 0.2 mg /ml G418.