Αφηρημένο

Σκοπός

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια δικόρυφη ασθένεια με επιθετικό και βραδείας εξέλιξης των μορφών. Τρέχουσα δοκιμή του ειδικού προστατικού αντιγόνου και δακτυλική εξέταση διαλογής παρέχουν ασαφή αποτελέσματα που οδηγούν σε τόσο κάτω και πάνω-θεραπεία. Ακριβή, συνεπή διάγνωση είναι ζωτικής σημασίας για ασθενείς με κίνδυνο διαστρωμάτωση και τη διευκόλυνση της διαδικασίας λήψης κλινικών αποφάσεων ως προς τη θεραπεία έναντι ενεργό επιτήρηση. Η διάγνωση επιτυγχάνεται σήμερα με βιοψία βελόνα, μια επώδυνη διαδικασία. Έτσι, υπάρχει μία κλινική ανάγκη για μια ελάχιστα επεμβατική δοκιμή για τον προσδιορισμό του προστάτη επιθετικότητα του καρκίνου. Ένα δείγμα αίματος για να προβλέψουμε σκορ Gleason, το οποίο είναι γνωστό ότι αντανακλά την επιθετικότητα του καρκίνου, θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια τέτοια δοκιμασία.

Υλικά και Μέθοδοι

mRNA αίματος απομονώθηκε από τη Βόρεια Αμερική και τη Μαλαισία προστάτη ασθενείς με καρκίνο /ελέγχους. ανάλυσης μικροσυστοιχιών διεξήχθη χρησιμοποιώντας την Affymetrix U133 συν 2 · 0 πλατφόρμα. προφίλ έκφρασης από 255 ασθενείς /ελέγχους που δημιουργούνται 85 υποψήφιες βιοδείκτες. Μετά από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (qRT-PCR), δέκα βιοδείκτες της νόσου που σχετίζεται με παρέμεινε για ζεύγη στατιστική ανάλυση και την κανονικοποίηση.

Αποτελέσματα

ανάλυση μικροσυστοιχιών διεξήχθη για τον εντοπισμό 85 γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ καρκίνο του προστάτη επιθετικό (σκορ Gleason ≥8) και τους ελέγχους. Η έκφραση αυτών των γονιδίων επιβεβαιώθηκε qRT-PCR. Η στατιστική ανάλυση έδωσε ένα τελικό πίνακα επτά γονιδίων αξιολογούνται ως έξι μεζονέτες γονίδιο-δείκτη. Αυτή η μοριακή υπογραφή προέβλεψε ως επιθετικό (δηλαδή, Gleason σκορ ≥8) το 55% των δειγμάτων G6, 49% των G7 (3 + 4), το 79% των G7 (4 + 3) και το 83% των G8-10, ενώ απορρίπτει 98 % των ελέγχων.

Συμπέρασμα

σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια νέα, με βάση το αίμα πάνελ βιοδεικτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βάση για μια απλή εξέταση αίματος για τον εντοπισμό των ανδρών με επιθετικό προστάτη καρκίνο και ως εκ τούτου να μειώσει την υπερδιάγνωσης και υπερθεραπεία που επί του παρόντος προκύπτει από τη διάγνωση με τη χρήση μόνο του PSA. Έχουμε συζητήσει πιθανές κλινικές χρήσεις του πίνακα για να διαπιστώσετε άνδρες πιο πιθανό να επωφεληθούν από τη βιοψία και την άμεση θεραπεία έναντι εκείνων που να ταιριάζει περισσότερο σε μια στρατηγική «ενεργό επιτήρηση»

Παράθεση:. Liong ML, Lim CR, Yang H, Chao S, Bong CW, Leong WS, et al. (2012) Biomarkers με βάση το αίμα του επιθετικού καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (9): e45802. doi: 10.1371 /journal.pone.0045802

Επιμέλεια: Franky L. Chan, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: May 24, 2012? Αποδεκτές: 24 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Liong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Chun Ρεν Lim, Hengxuan Yang, Samuel Chao, Chun Wei Bong, Τσουν Gook Yu, Εντι JJ Οοί, Karl Wassmann και Choong Chin Liew είναι υπάλληλοι της GeneNews Ltd, που υπό την αιγίδα αυτής της έρευνας. Choong Chin Liew είναι επικεφαλής επιστήμονας της GeneNews και κατέχει μετοχών της εταιρείας. Κανένας από τους άλλους συγγραφείς έχει οποιαδήποτε ανταγωνιστικά συμφέροντα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες (μετά καρκίνου του δέρματος) [1]. Η διαλογή για την ασθένεια είναι συνήθως από δακτυλική εξέταση (DRE) και αντιγόνο (PSA) δοκιμασία ειδικού προστατικού. Ωστόσο, τα οφέλη της PSA διαλογής /DRE είναι αμφιλεγόμενη, λόγω της υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών, χαμηλή θετική προγνωστική αξία (PPV) και αναφέρθηκαν φτωχή ακρίβεια στον εντοπισμό άνδρες επηρεάζονται από επιθετικό καρκίνο του προστάτη. Στη διάρκεια των τελευταίων ετών, δύο μεγάλες προοπτικές μελέτες από τις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρώπη ανέδειξαν την ασάφεια της αξίας των μεθόδων PSA-based για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του προστάτη. Το προστάτη, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και Δίκη προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου των ωοθηκών (PLCO) στις ΗΠΑ είναι εγγεγραμμένοι πάνω από 76.000 άνδρες τυχαιοποιήθηκαν να λάβουν ετήσια έλεγχο PSA για έξι χρόνια και DRE για τέσσερα χρόνια έναντι «συνήθη φροντίδα» [2]. Οι συγγραφείς δεν βρήκαν καμία διαφορά σε καρκίνωμα του προστάτη (ΚΓΠ)-σχετικών θνησιμότητας μεταξύ των δύο ομάδων. Η Ευρωπαϊκή τυχαιοποιημένη μελέτη του προσυμπτωματικού ελέγχου για ΚΓΠ (ERSPC) Δίκη περιλαμβάνονται 182.000 άνδρες μεταξύ των ηλικιών 50-74 ετών [3]. Αν και οι συγγραφείς ανέφεραν μείωση κατά 20% της θνησιμότητας CaP σε άνδρες που υποβλήθηκαν σε εξέταση PSA, τουλάχιστον μία φορά κάθε τέσσερα χρόνια, η μείωση της θνησιμότητας αποδειχθεί δαπανηρή – για κάθε ένα ενιαίο ανώτατο όριο θάνατο εμπόδισε, 1.410 άνδρες έπρεπε να προβληθεί σε ετήσια βάση και 48 άνδρες που χρειάζονται θεραπεία. Αυτές οι μελέτες έχουν αναζωογόνησε τη συζήτηση για τη χρησιμότητα και τους περιορισμούς της εξέτασης PSA [4] – [10].

Σημαντικά προβλήματα στις δοκιμές PSA προκύψουν ως αποτέλεσμα της υπερ- και υπο-διάγνωση. Περίπου το 15% των ανδρών των οποίων τα επίπεδα του PSA θεωρείται ως κανονικό (4 · 0 ng /mL ή λιγότερο), στην πραγματικότητα καρκίνο του λιμανιού του προστάτη, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος υψηλής ποιότητας [9]. Με την αύξηση του ορίου σε ένα επίπεδο που θεωρείται κλινικά οριακά (4 · 0 -10 · 0 ng /mL), περίπου το 25% των ανδρών έχουν βρεθεί να προσβληθεί από καρκίνο του προστάτη [2]. Αντιστρόφως, τα υψηλά επίπεδα PSA που παρατηρείται σε πολλούς άνδρες με βραδείας καρκίνους [11]. Εκτιμάται ότι υπερθεραπεία μπορεί να συμβεί σε 40% έως 50% των περιπτώσεων. Επιπλέον, πολλές μη-κακοήθεις καταστάσεις μπορεί να επηρεάσει PSA, συμπεριλαμβανομένης της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και προστατίτιδα. Επιβεβαίωση της διάγνωσης απαιτεί ορισμένες 12-18 πυρήνα βιοψίες, με σημαντικό κόστος και νοσηρότητα [12]. Υπό το φως αυτών των προκλήσεων PSA που σχετίζονται με, είναι προφανές ότι υπάρχει ανάγκη για περισσότερες κλινικά σχετική βιοδείκτες που είναι σε θέση να προβλέψει με ακρίβεια την παρουσία του επιθετικού καρκίνου του προστάτη.

Μια πρόσφατη αναδρομική μελέτη εντόπισε mRNA ιστού που βασίζεται υπογραφή έκφραση του βαθμού Gleason για την πρόβλεψη της θανατηφόρου καρκίνου του προστάτη [13]. Παρόμοια βιοδείκτες, αλλά με βάση το αίμα και ικανή να ταυτοποιήσει υψηλής ποιότητας καρκίνο του προστάτη [Gleason score 7 (4 + 3) -10] σε πρώιμο στάδιο (πριν από την απόφαση για βιοψία), θα ήταν κλινικά χρήσιμη [14], [15 ]. μια τέτοια τεχνική θα συμπληρώσει τις τρέχουσες μεθόδους και να συμβάλει στην αύξηση της εμπιστοσύνης στη διάγνωση και αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη.

Σε προηγούμενη εργασία, έχουμε αναπτύξει μια νέα βάση το αίμα του πίνακα βιοδείκτη σε θέση να κινδυνοκεντρικών διαστρωμάτωση των ασθενών για καρκίνο του παχέος εντέρου [16]. Τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής επιτρέπουν κλινικούς ιατρούς να ενθαρρύνει με μεγαλύτερη εμπιστοσύνη σε εκείνους τους ασθενείς με βαθμολογία «υψηλό ρεύμα κινδύνου» για να προχωρήσει με κολονοσκόπηση. Εδώ ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών με βάση το αίμα για υψηλής ποιότητας [Gleason στείλει 7 (4 + 3) -10] καρκίνου του προστάτη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για PSA-θετικών άνδρες κινδύνου διαστρωμάτωση. Η δοκιμή αυτή θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό της υποομάδας των ανδρών για τους οποίους το όφελος της βιοψίας είναι πιθανό να υπερτερούν του συναφούς κινδύνου και δυσφορία.

Οι άνδρες με τα κλινικά εντοπισμένο όγκους χαμηλής ποιότητας που συνιστάται συχνά για να υποβληθεί σε έλεγχο και όχι δραστική θεραπεία για μια ασθένεια που είναι απίθανο να προχωρήσει. Ωστόσο, Borocas και οι συνεργάτες του έχουν δείξει ότι λιγότεροι από το 10% των ανδρών προτιμούν επιτήρησης πάνω από ενεργό θεραπεία [17]. Μία προτεινόμενη εξήγηση για αυτό είναι ότι ακόμη και σε άνδρες με χαμηλό κίνδυνο, υπάρχει ο φόβος ότι μια απειλητική για τη ζωή, υψηλής ποιότητας καρκίνο θα μπορούσε να χαθεί [18], [19]. Ένα τεστ που μπορεί να προβλέψει την παρουσία πιθανών όγκων υψηλού βαθμού θα μπορούσε να ανακουφίσει το άγχος του ασθενούς, με αποτέλεσμα την μεγαλύτερη ανοχή για την επιτήρηση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα αίματος

Δείγμα εξαγοράς για την ταυτοποίηση βιοδεικτών πραγματοποιήθηκε μεταξύ 2004 και 2009 σε κλινικές ουρολογία σε όλη τη Βόρεια Αμερική (Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς και Boston, MA, USA) και την Ασία (Πενάνγκ, Μαλαισία). Γράφει, λήφθηκε ενυπόγραφη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες και έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο του κάθε ιδρύματος Ερευνών Δεοντολογίας [Συνεργάτες Φροντίδα Υγείας Διοικητικό κριτική Θεσμική (Νοσοκομείου Brigham and Women της Βοστώνης), Πανεπιστήμιο Δίκτυο Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Ερευνών Υγείας (Sunnybrook Νοσοκομείο Τορόντο), και Μικτή Επιτροπή Δεοντολογίας της Σχολής Φαρμακευτικών Επιστημών (USM Νοσοκομείο Lam Wah Ee σε κλινικές μελέτες (Πενάνγκ)].

Όλα τα δείγματα αίματος ελήφθησαν πριν από οποιαδήποτε θεραπεία ή βιοψίες. η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με διορθικό υπερηχογράφημα καθοδηγούμενη Tru-cut® βιοψία με βελόνα ή /και ιστοπαθολογικά ευρήματα σε ριζική δείγματα προστατεκτομή (Βλέπε προσάρτημα S1). Όταν ένα δείγμα είχε μια ριζοσπαστική έκθεση προστατεκτομή, ο τελικός βαθμός βασίστηκε στην έκθεση προστατεκτομή. ο αριθμός των βασικών δειγμάτων που λαμβάνονται στο βιοψία ήταν 6 + 6 για τον όγκο του προστάτη & lt? 40 γραμμάρια και 7 + 7 για τον όγκο & gt?. 40 γραμμάρια παθολόγους κάθε οργάνου in-house καθορίζεται διάγνωση και αξιολόγηση της βαθμολογίας Gleason υποθέσεις με σκορ Gleason = 7 αποκλείστηκαν από το σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης για τον έλεγχο διαφορών της γονιδιακής έκφρασης του ενδιάμεσου βαθμού. καρκίνο του προστάτη με Gleason score 7 (3 + 4), η οποία, υποθέσαμε, θα μπορούσε να είναι σημαντικά διαφορετική από ό, τι πιο επιθετική Gleason score 7 (4 + 3) [14], [15]. Τα δείγματα που έχουν Gleason score ≥ 8 σε βιοψία με ή χωρίς προστατεκτομή ήταν ειδικά επιλεγεί για την ανάλυση και την ανάπτυξη του γονιδίου υπογραφή με το σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης. Το μοντέλο που αναπτύχθηκε με το Gleason στείλει ≥ 8 στη συνέχεια εφαρμόστηκε αργότερα στους ασθενείς με Gleason score 7 για να προσδιοριστεί εάν η μοριακή υπογραφή μπορεί να διαφοροποιήσει μεταξύ 7 (3 + 4) έναντι πιο επιθετική βαθμολογίες 7 (4 + 3) Gleason.

Συνολικά, συλλέξαμε 1.938 δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 739 περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη (PRCA) και 1.199 ελέγχους (G0). Από αυτή την ομάδα, ένα υποσύνολο του δείγματος 255 (n = 91 PRCA με Gleason score ≥ 8 και n = 164 έλεγχοι) συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA ήταν να αναιρέσει σε μια αρχική μελέτη για την ανακάλυψη βιοδεικτών σε μια πλατφόρμα μικροσυστοιχιών. Τα δείγματα σε κάθε ομάδα ήταν συμφωνημένα για την ηλικία, τη φυλή, BMI, και συνοδά νοσήματα (Πίνακας 1).

Η

Για τις μελέτες επαλήθευσης qRT-PCR, ελέγξαμε τα ταυτοποιημένα γονίδια για τα περισσότερα από τα ίδια δείγματα υβριδοποιήθηκαν για γονιδιακή ταυτοποίηση. Χρησιμοποιήσαμε 245 δείγματα (G8 = 54, G0 = 191) για Cohort μας έχω μελετήσει, 182 δείγματα (G8 n = 80 και ελέγχων n = 102) για τη μελέτη μας Cohort ΙΙ και 121 δείγματα (G8 n = 64 και ελέγχων n = 57 ) ως ανεξάρτητη σειρά δοκιμών για τη μελέτη μας κοόρτης III (Σχήμα 1). Α IV ομάδα Cohort των περιπτώσεων με καρκίνο του ενδιάμεσου βαθμού (G6 n = 33, G7 (3 + 4) n = 35, και G7 (4 + 3) n = 43) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των επιδόσεων του καρκίνου επιθετικότητα.

Γονιδιακή Ταυτοποίηση χρησιμοποιώντας Affymetrix U133Plus 2.0 GeneChip συστοιχίες ολιγονουκλεοτίδιο πραγματοποιήθηκε στο Τορόντο του Καναδά, και Πενάνγκ, Μαλαισία, παράλληλα. Στο Τορόντο, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε 166 δείγματα (G8 = 42, G0 = 124). Στη θέση της Μαλαισίας, 89 δείγματα προφίλ (49 G8, 40 G0). Από την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, 85 γονίδια που ταυτοποιούνται στις δύο τοποθεσίες δοκιμάστηκαν σε μια σειρά μελετών επαλήθευσης PCR ποσοτική πραγματικού χρόνου. Είκοσι γονίδια επαληθεύονται μέσω μιας κοόρτης μελετήσει σε αρκετές ομάδες των δειγμάτων EDTA (συνολικά 245). Αυτά τα 20 γονίδια που εξετάστηκαν περαιτέρω σε μια σειρά Cohort II πειραμάτων σε δείγματα PAXgene (σύνολο 182), εκτελείται ανεξάρτητα σε Πενάνγκ, Μαλαισία. 10 από τα γονίδια ελέγχθηκαν, εκ των οποίων 7 γονίδια κατέστη οριστική βιοδεικτών μας και επιβεβαίωσε επίσης σε ένα άλλο τεστ ανεξάρτητων δειγμάτων set-Cohort III (σύνολο 121).

Η

Τα δείγματα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση, εάν ένα άτομο ήταν αποφασισμένος να είχατε: 1) προηγούμενες PRCA? 2) προκαρκινικές αλλοιώσεις, όπως υψηλής ποιότητας προστάτη ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία και άτυπα πολλαπλασιασμό μικρών κυψελωτά? 3) ιστορία του κάθε καρκίνου? . Και /ή 4) σοβαρές ιατρικές καταστάσεις απαγορεύουν θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη, όπως καρδιακή ή νεφρική ανεπάρκεια

Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε υποομάδες με βάση Gleason βαθμολογία: G6 (Gleason score ≤ 6)? G7 (σκορ Gleason = 7)? G8 (Gleason score ≥ 8)? και τους ελέγχους (G0). Η βορειοαμερικανική ομάδα ελέγχου περιελάμβανε ασθενείς Ουρολογικής Κλινικής με μία μόνο αρνητική βιοψία. Η μαλαισιανή ομάδα ελέγχου αποτελείτο από άνδρες ηλικίας 50-75 ετών, αρνητικό για DRE, και των οποίων η PSA τα επίπεδα ήταν κάτω του 2 · 5 ng /ml για πέντε συναπτά έτη, μέχρι και την ημερομηνία πρόσληψης. Αυτή η επιπλέον προϋπόθεση ευθυγραμμίζει αποτελεσματικά τα Μαλαισίας ελέγχους με τη βορειοαμερικανική ετήσια πρότυπο ελέγχου PSA. Αυτό επέτρεψε επίσης να διασφαλίσουμε ότι η ταχύτητα του PSA παρέμεινε κάτω από 0 · 4 ng /ml /έτος, μειώνοντας την πιθανότητα έχασε καρκινώματα σε μια αμελητέας αξίας.

συλλογή αίματος και την απομόνωση RNA

Για μικροσυστοιχιών ανάλυση και κοόρτης Ι, δείγματα περιφερικού ολικού αίματος (2 χ 10 ml) συλλέχθηκαν σε EDTA Vacutainer® σωλήνες (Becton Dickinson) (για να αποφευχθεί το πρόβλημα μεταγραφή υψηλής σφαιρίνης στο Affymetrix μικροσυστοιχίες που συνδέονται με το σύστημα PAXgene), και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

τα δείγματα έτρεξαν στο Affymetrix U133 Plus 2.0 της πλατφόρμας. Confirmational ανάλυση έγινε με τη χρήση qRT-PCR για Cohort ΙΙ και ΙΙΙ Cohort. Για qRT-PCR, το αίμα συλλέγεται σε σωλήνες PAXgene ™ (PreAnalytiX) υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο PAXgene ™ Blood RNA Kit. Το σύστημα PAXgene είναι πιο κατάλληλο για τις μελέτες RT-PCR, και είναι μια καλύτερη τακτοποίηση για πραγματικής ζωής κλινικές εφαρμογές, χάρη στην ικανότητά του να σταθεροποιεί αμέσως RNA και να το κρατήσει σταθερή για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, παρέχοντας έτσι μεγαλύτερη ευελιξία στη δείγμα συλλογής και μεταφοράς.

ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με τη χρήση του 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). Όλα τα δείγματα πληρούν τα ακόλουθα κριτήρια ποιότητας: RIN≥7 · 0? 28S: αναλογία 18S rRNA ≥ 1 · 0? και επικυρωμένη Agilent BioAnalyzer σάρωση. ποσότητα RNA προσδιορίστηκε με απορρόφηση στα 260 nm σε ένα DU-640 φασματοφωτόμετρο (Beckman Coulter).

μικροσυστοιχιών υβριδισμό και ανάλυση δεδομένων

εξόρυξης δεδομένων μικροσυστοιχιών για τον εντοπισμό επιθετικό βιοδείκτες του καρκίνου του προστάτη που εμπλέκονται δύο αναλύσεις ταυτόχρονα πραγματοποιείται στο North American μας (Τορόντο, Καναδάς) και ασιατικές περιοχές (Πενάνγκ, Μαλαισία). Κατά τη βορειοαμερικανική ιστοσελίδα, είμαστε σε υβριδισμό 166 δείγματα (G8 n = 42? G0 n = 124). Γονίδια αναγνωρίζονται ως σημαντικές (p & lt? 0,05, φορές αλλαγή ≥1.0, Benjamini-Hochberg FDR διορθωμένη) επιλέχθηκαν για περαιτέρω κατάντη σχολιασμούς μελέτη με τη χρήση και το σχεδιασμό καθετήρα, [διαθέσιμα στην ιστοσελίδα του Affymetrix (https://www.affymetrix.com)] και πληροφορίες για τη γονιδιακή δομή και τη λειτουργία [διαθέσιμα σε Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ιστοσελίδας (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)]. Παρόμοιες διαδικασίες επιλογής και της περισυλλογής δεδομένων έγιναν σε ασιατικές site μας στη Μαλαισία με 89 δείγματα (G8 n = 49? G0 n = 40), βλέπε Σχήμα 1.

Τα αρχεία δεδομένων μικροσυστοιχιών για τη συνδυασμένη 91 G8 και 164 G0 δείγματα ήταν σε διόρθωση υποβάθρου μέσω GCRMA και εισάγονται στο λογισμικό GeneSpring (έκδοση 7 · 3 · 1, Agilent, California, USA) για ανάλυση. Αναξιόπιστη σήματα, όπως ορίζεται από το πρότυπο σφάλματος cross-γονιδίου, απορρίφθηκαν από την ανάλυση.

εντάσεις σήματος σύνολο Probe συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων και Ελέγχου Νόσων. Γονίδια προσδιορίστηκαν να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων, χρησιμοποιώντας την ανάλυση διασποράς δοκιμής (ANOVA) που ενσωματώνεται στην GeneSpring. Probesets με p-τιμές μικρότερες από 0 · 05 και διπλώστε μεγέθη μεταβολή μεγαλύτερη του 1 · 2 προσδιορίστηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Το μέγεθος του δείγματος προσδιορίστηκε με βάση την εκτίμηση που είχε κάνει για μια προηγούμενη μελέτη, δηλαδή, ότι τα 100 δείγματα ανά ομάδα που απαιτείται για την επίτευξη επαρκούς ισχύος (0,80), με σφάλμα τύπου Ι μικρότερο από 0.05 και μία πτυχή αλλαγή μεγέθους μεγαλύτερη από 1.2, ένα μεγάλο ποσοστό (πάνω από 75%) των γονιδίων που διερευνήθηκαν [20].

δεδομένα μικροσυστοιχιών επίσης σε επεξεργασία από MAS5. σετ καθετήρα που χαρακτηρίζονται ως «απών» ή «οριακή» σε κάθε δείγμα απορρίφθηκαν. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα που παρέχεται από R Bioconductor.org (Seattle, Washington, USA). επιλέχθηκαν μόνο τα γονίδια που εμφανίστηκε στατιστικά σημαντική και στις δύο περιοχές συλλογής.

Ποσοτική πραγματικό χρόνο

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Τα γονίδια που επιλέγονται από τις αναλύσεις μικροσυστοιχιών επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε μία ομάδα έχω μελετήσει. Μόνο γονίδια που εντοπίστηκαν στην ανάλυση μικροσυστοιχιών που επίσης παρέμεινε στατιστικά σημαντική στη μελέτη κοόρτης που qRT-PCR επελέγησαν για περαιτέρω κατάντη ανάλυση.

πρότυπο cDNA για qRT-PCR μεταγράφηκε αντίστροφα από RNA χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Αντίστροφη Kit Μεταγραφή (Applied Biosystems). 20 ng του cDNA χρησιμοποιήθηκαν σε έναν όγκο αντίδρασης 25 μL σε μία αντίδραση TaqMan® Duplex (για μια επισκόπηση της μεθοδολογίας, βλέπε Εικόνα 1).

Genes επαληθεύεται κοόρτης Ι κατόπιν ελέγχθηκαν σε μια μελέτη κοόρτης II . δείγματα αίματος κοόρτης II συλλέχθηκαν σε σωλήνες PAXgene ™ (PreAnalytiX), αλλιώς κοόρτης Ι και μεθοδολογίες μελέτη II ήταν ταυτόσημα.

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε duplex δοκιμές qRT-PCR. Κάθε γονίδιο ενδιαφέροντος δοκιμάστηκε σε μία σειρά πειραμάτων, με ένα ενδογενές γονίδιο αναφοράς (ACTB? Βήτα ακτίνης). Baseline έκφραση ACTB μας επέτρεψε να προσδιοριστούν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα μεταγράφων γονιδίου μεταξύ του καρκίνου του προστάτη και των ομάδων ελέγχου. Γονίδια επαληθεύεται και από τις δύο αναλύσεις ομάδα συνδυάστηκαν ως ζεύγη? αναλογίες ενός υπερεκφρασμένου γονιδίου και ένα υποεκφράζονται γονίδιο μετρήθηκαν άμεσα σε duplex αντιδράσεις. Η γονιδιακή έκφραση διαφορές εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου (Ct) της σχετικής ποσοτικοποίησης [21], ομαλοποιώντας τις τιμές Ct σχέση με το γονίδιο αναφοράς. Αυτό έγινε με τον υπολογισμό ενός ΔΟΙ

δείγματος = Ct

(γονίδιο-στόχος) – Ct

(γονίδιο εταίρος). Η σχετική φορές αλλαγή (νόσος έναντι του ελέγχου) εκπροσωπήθηκε ως 2

-ΔΔCt, όπου ΔΔCt = σημαίνει ΔCt

Ca – σημαίνει ΔΟΙ

έλεγχο

Εμείς επιλέξαμε SAMSN1, ένα υπερεκφρασμένο γονίδιο. , το γονίδιο συνεργάτη με κάθε μία από τις έξι ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων στόχων. Αυτή η μορφή επιτρέπει τον υπολογισμό ενός δείκτη γονιδιακής έκφρασης «UP /DOWN» ανάμεσα σε κάθε υποεκφράζονται γονίδιο βιοδείκτη PRCA και αμφίδρομη εταίρο της, SAMSN1, από τη διαφορά των τιμών τους Ct όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Μια μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney αξιολογούνται στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των επιπέδων ελέγχου και PRCA mRNA.

Αποτελέσματα

Από Cohort Ι (συνδυασμένη Βόρειας Αμερικής και της Μαλαισίας περιοχές μελέτης) εντοπίστηκαν 85 γονίδια να είναι σημαντικά που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ Gleason σκοράρει ≥8 καρκίνο του προστάτη και τους ελέγχους, και επιλέγονται για περαιτέρω διερεύνηση μέσω qRT-PCR (Σχήμα 1).

Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

επαλήθευσης

Αυτά τα 85 γονίδια που εξετάστηκαν στο 245 Cohort δείγματα που συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA (G8 n = 54? G0 n = 191). Είκοσι από τα γονίδια που ελέγχθηκαν ως υπόλοιπο σημαντική σε μια δοκιμασία qRT-PCR και διατηρούνται για τη μελέτη κοόρτης II.

Από τα 20 υποψήφια γονίδια, δέκα παρέμειναν σημαντικές σε Cohort δείγματα ΙΙ συλλέγονται σε σωλήνες PAXgene (p-value & lt? 0.001, πολλαπλές μεταβολές από 1 · 31 να 1 · 58 για υπερεκφράζεται γονίδια και -1 · 28 να -1 · 48 για υποεκφράζονται γονίδια)

Οι τιμές έκφραση των γονιδίων δέκα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πολυμεταβλητό. μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης. Η AUC ROC κάθε μεμονωμένου γονιδίου κυμαινόταν από 0 · 60 να 0 · 69? ζεύγη σύγκριση οδήγησε σε επτά, οκτώ συνδυασμούς ή εννέα γονίδιο που όλοι πέτυχαν AUC περίπου 0 · 82. Ενδιαφέρον, ο καλύτερος συνδυασμός επτά-γονίδιο αποτελείται από ένα υπερεκφρασμένο γονίδιο και έξι υποεκφράζονται γονίδια (AUC = 0 · 82). Έτσι επιλέξαμε αυτό το επτά-γονίδιο πάνελ βιοδεικτών για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη υψηλής ποιότητας (Πίνακας 2).

Η

Χρησιμοποιήσαμε το ενιαίο υπερεκφράζεται γονίδιο, SAMSN1, για να είναι το κοινό γονίδιο συνεργάτη για κάθε μία από τις έξι υποεκφράζονται γονίδια: CRTAM, CXCR3, FCRL3, KIAA1143, KLF12 και TMEM204. Οι έξι διπλά μόρια που αντιπροσωπεύουν έξι αναλογίες γονιδιακής έκφρασης αξιολογήθηκαν στα δείγματα ίδιας ομάδας II (G8, η = 80? Ctrl, n = 102). Τα επίπεδα έκφρασης των έξι διπόλων παρατηρήθηκαν να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ομάδων και Ελέγχου Νόσων (ρ & lt? 0,0001 και πολλαπλές μεταβολές του 1 · 44-1 · 66? Πίνακας 2). Διακριτική απόδοση αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας AUC ROC Η διακριτική ικανότητα των έξι διπλής όψης πίνακα (συνδυαστική απόδοση των έξι μεζονέτες) πέτυχε AUC 0 · 74 (95% CI: 0 · 67-0 · 80), ειδικότητα 84%, ευαισθησία 63% και ακρίβεια 75%.

για να εκτιμηθεί η πιθανότητα ότι τα αποτελέσματα οφείλονταν απλώς σε τυχαία πιθανότητα, θα εκτελούνται δύο φορές cross-επικυρώσεις, στην οποία τα μισά από τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν συντελεστές και τα κατώφλια για το μοντέλο, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την πρόβλεψη το υπόλοιπο ήμισυ των δειγμάτων. Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται 1000 φορές, χρησιμοποιώντας τα πραγματικά δεδομένα, πρώτα με την επιθετική κατάσταση του καρκίνου και μια δεύτερη φορά με το καθεστώς τυχαία εκ νέου εκχωρηθεί. Η κατανομή της AUC ROC από κάθε ανάλυση οδήγησε σε δύο καλά διαχωρισμένα καμπύλες με λιγότερο από 5% επικάλυψη από την οποία συμπεραίνουμε ότι η παρατηρούμενη απόδοση είναι απίθανο να είναι απλώς το αποτέλεσμα τυχαία πιθανότητα (Σχήμα 2).

τα ιστογράμματα της AUC χαράχθηκαν και σύγκριση? αποτελέσματα έδειξαν AUCs από τα δεδομένα της PCR και διαχωρίζονται από τα μηδενικά σύνολα, με μια επικάλυψη μικρότερη από 5%.

Η

Από τα στοιχεία, φτιάξαμε ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης που συνδυάζει δείκτες PSA και γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας G8 δειγμάτων κατά τους ελέγχους για να ενισχύσει περαιτέρω την διακριτική ικανότητα του πάνελ. Αυτό επιτυγχάνεται μια AUC ROC 0,99 στις 69 G8 έναντι 101 ελέγχων της κοόρτης II (ευαισθησία = 96%, ειδικότητα = 100%).

Αυτό σε συνδυασμό πάνελ των δεικτών PSA και την έκφραση του γονιδίου (βλέπε Πίνακα 3) ορίζεται από Cohort II δοκιμάστηκε σε δείγματα ομάδα III. Και οι έξι μεζονέτες παρέμεινε σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ της G8 και των ελέγχων (όλες οι τιμές p είναι ≤ 0,01). Η εξίσωση που χτίστηκε από τη μελέτη κοόρτης II – με σταθερές παραμέτρους – εφαρμόστηκε στο νέο σύνολο δεδομένων Cohort ΙΙΙ, για να παρέχει μια ανεξάρτητη αξιολόγηση της διαφορικής απόδοσης του πάνελ βιοδεικτών. Η AUC ROC ήταν 0,88 στις 54 G8 έναντι 57 ελέγχους (ευαισθησία = 83%, ειδικότητα = 98%).

Η

Όλες οι αναλύσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω εμπλεκόμενους δείγματα του ελέγχου ή της G8 περιπτώσεις και χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση του μοντέλου. Ωστόσο, ο στόχος σε αυτή τη μελέτη ήταν η εκτίμηση επιθετικότητα του καρκίνου. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε Cohort IV, ένα σύνολο που περιλαμβάνει τις περιπτώσεις ενδιάμεσους βαθμούς καρκίνου (G6 n = 33, G7 (3 + 4) n = 35, και G7 (4 + 3) n = 43). Για την ανάλυση αυτή, ο έλεγχος, G6 και G7 (3 + 4) περιπτώσεις θεωρήθηκαν μη επιθετικών καρκίνων και G7 (4 + 3) και G8 θεωρήθηκαν επιθετικών καρκίνων. Ανάλυση ROC (όπως εφαρμόζεται για Κοόρτεις Ι, ΙΙ, ΙΙΙ) δεν είναι κατάλληλο εδώ, όπως ROC υπολογισμός είναι καλύτερο για απλή θετικές και αρνητικές αναλογίες μέσα στις ομάδες, και Cohort IV περιείχαν πιο περίπλοκη υποομάδες.

Αντ ‘αυτού, για Cohort ανάλυση IV, αξιολογήσαμε το θετικό ποσοστό πρόβλεψης για κάθε υποομάδα, και διαπίστωσε ότι το 55% των G6, 49% των G7 (3 + 4) και 79% των G7 (4 + 3) ανιχνεύθηκαν με την ίδια υπογραφή που είχε εντοπίσει η G8 επιθετικές περιπτώσεις καρκίνου (Σχήμα 3). Αντίθετα, το επίπεδο του PSA και μόνο ήταν σε θέση να διαφοροποιήσει μεταξύ των λιγότερο επιθετική G6, G7 (3 + 4) και την πιο επιθετική G7 (4 + 3) ομάδες, δίνοντας θετικούς ρυθμούς πρόβλεψη του 88%, 89% και 100%, αντίστοιχα, σε δείγματα όπου τα επίπεδα PSA έφθασε 4 ng /ml.

Το αρνητικό ποσοστό πρόβλεψη για τις περιπτώσεις ελέγχου σύμφωνα με το χάρτη, μαζί με τις θετικές τιμές πρόβλεψη για τις περιπτώσεις καρκίνου. PSA και μόνο έχει υψηλή θετική προγνωστική τιμές για όλους τους βαθμούς του καρκίνου (& gt? 87%), αλλά η συνδυασμένη PSA και RNA πάνελ έχει χαμηλότερα θετικά ποσοστά πρόβλεψης για την λιγότερο επιθετική G6 και G7 (3 + 4) υποομάδες, 55% και 49% αντίστοιχα ), ενώ σχεδόν το ίδιο θετικό ρυθμό πρόβλεψη για την πιο επιθετική G7 (4 + 3), όπως ομάδες G8 (79% και 83% αντίστοιχα.

η

Συζήτηση

στόχος μας σε αυτή τη μελέτη ήταν να εντοπίσει βιοδείκτες με βάση το αίμα για επιθετικό καρκίνο του προστάτη. Εμείς συλλέγονται δείγματα σε διάφορες θέσεις, τόσο από ασιατικές και μη-Ασιάτες, προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι εθνοτικές και φυλετικές διαφορές. η στρατηγική μας επικεντρώνεται κυρίως στον εντοπισμό των βιοδεικτών για την υψηλ τατης καρκίνους βαθμός (Gleason σκορ 8-10), και στη συνέχεια εφαρμόστηκε το μοντέλο σε ασθενείς με Gleason score 7 (4 + 3), Gleason score 7 (3 + 4), Gleason σκορ 6 και τους ελέγχους. το μοντέλο ήταν επιτυχής όσον αφορά τη διάκριση των ασθενών με υψηλό κίνδυνο Gleason score 7 (4 + 3) για να Gleason σκοράρει 10 από αυτούς με χαμηλά για την ενδιάμεση κίνδυνο Gleason σκορ 6 και το σκορ Gleason 7 (3 + 4). Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα αυτού του μοντέλου επτά γονιδίων για την πρόβλεψη επιθετικό καρκίνο του προστάτη είναι ενθαρρυντικά και πρέπει να επικυρωθεί σε ένα πολυ-site επικύρωση κλινική μελέτη.

Όπως επιβεβαιώνεται στα παραπάνω αποτελέσματα, η PSA από μόνο του έχει υψηλή θετική ποσοστό πρόβλεψης. Η προσθήκη της αναφερόμενης πάνελ βιοδεικτών με βάση το αίμα βελτιωμένη ακρίβεια PSA για επιθετικές μορφές καρκίνου. Αυτό επιτεύχθηκε με τη διόρθωση για το υπερ-διάγνωση των επιθετικών καρκίνων στο G6 και G7 ομάδες με περίπου το μισό (λιγότερες περιπτώσεις θα πρέπει να αναμένεται να εμφανίζουν επιθετική μορφή καρκίνου μοριακή υπογραφή στις ομάδες του καρκίνου του χαμηλότερου βαθμού).

Εντοπίσαμε γονίδια βιοδεικτών υποψήφια και αναπτύχθηκε δίπολα γονίδιο με τον συνδυασμό ενός υπερεκφρασμένο γονίδιο με ένα γονίδιο υποεκφράζεται προκειμένου να ενισχυθεί η διαφορική έκφραση γονιδίων και την κανονικοποίηση για μεμονωμένες παραλλαγές (Πίνακας 2). Επαλήθευσης για ανεξάρτητα δείγματα Cohort III έδειξε ότι είχαμε επιτυχία στις προσπάθειές μας. Αυτό αντιπροσωπεύεται από την ανάλυσή μας σε ασθενείς ελέγχου και επιβεβαιώθηκε Gleason στείλει 8-10 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, με ειδικότητα 80% ή καλύτερα. Ένα μοντέλο πρόβλεψης γονιδιακών μόνο πολυμεταβλητή χτισμένο σε δεδομένα Cohort II εφαρμόστηκε σε δείγματα κοόρτης III, και η ειδικότητα παρέμεινε υψηλό στο 83%.

Οι επτά γονίδια που εντοπίστηκαν από το mRNA που προέρχονται από το αίμα σε αυτή τη μελέτη ασχολούνται κυρίως με την ανοσολογική αντίδραση, χημειοταξία, και ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου στην καρκινογένεση [22] – [25]. Ενδιαφέρον, η μελέτη μας βρέθηκε CRTAM υποεκφράζεται σημαντικά σε επιθετικό καρκίνο του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ένα πιθανό ρόλο για την ανεπάρκεια των Τ-κυττάρων στον καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, αλλαγμένη έκφραση KLF έχει βρεθεί σε όγκους και την εξέλιξη του όγκου [26] – [29], και αρκετές έρευνες αναφέρουν ότι η πρωτεΐνη ενεργοποιητή 2 άλφα (ΑΡ-2alpha) παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [30], [31].

Πολλοί άνδρες με καρκίνο του προστάτη νωρίς ποτέ δεν θα εξελιχθεί σε καρκίνο προχωρημένο στάδιο. Το υποσύνολο των ανδρών με βραδείας εξέλιξης της νόσου θα είναι άριστοι υποψήφιοι για την ενεργό επιτήρηση. Ωστόσο, υπάρχει έλλειψη σαφών κριτηρίων για τη διαφοροποίηση ανάμεσα σε εκείνους που διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο για επιθετικό καρκίνο και εκείνων των οποίων η νόσος θα ακολουθήσει μια νωχελικός πορεία [4], [32], [33]. PSA ως ένας μοναχικός ενδεικτική βιοδείκτη έχει υψηλό ψευδώς θετικό και σημαντικό ψευδώς αρνητικό ποσοστό [34]. Είναι εκθέτει πολλοί άνδρες σε επαναλαμβανόμενες βιοψίες περιττή, με κίνδυνο πόνου, μόλυνση, σήψη, και τις πιθανές διαδοχικές κατάντη συνέπειες, όπως ριζική προστατεκτομή με παρενέργειες της ανικανότητας και ακράτειας [35]. Έτσι, μια σημαντική κλινική πρόκληση στην ογκολογία του προστάτη είναι ο εντοπισμός, εντός του πληθυσμού της PSA-θετικό άνδρες, εκείνοι με υψηλής ποιότητας ή επιθετική μορφή καρκίνου, χωρίς να απαιτείται σε όλους τους ασθενείς να υποβληθούν σε μια οδυνηρή βιοψία ιστού.

Η αιματοεγκεφαλικού βασίζεται βιοδείκτη υπογραφή που αναφέρονται εδώ προσδιορίζει καρκίνοι του προστάτη με Gleason βαθμολογίες μεταξύ 7 (4 + 3) και 10. αντιγράφεται σε μια πιο γενικευμένη και αντιπροσωπευτικό του πληθυσμού, αυτό βιοδείκτη υπογραφή μπορεί να τελειοποιηθεί και να χρησιμοποιούνται για να σχηματίσουν τη βάση για ένα απλό τεστ αίματος. Χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την PSA ως εργαλείο διαστρωμάτωση κινδύνου, η αναφερόμενη υπογραφή μπορεί να εντοπίσει τους άνδρες που κινδυνεύουν να έχουν υψηλής ποιότητας καρκίνο του προστάτη. Βιοψία, βιοψία κορεσμό, την επιβεβαίωση και παρέμβαση μπορεί να συνιστάται για τους άνδρες αυτής της κατηγορίας, ως θεραπεία για τον καρκίνο του υψηλότερου βαθμού έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει θετικά τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών, σε σύγκριση με την παρατήρηση [36]. Αντίθετα, οι άνδρες χωρίς αυτό βιοδείκτη υπογραφή μπορεί να έχει περισσότερη εμπιστοσύνη στην επιλογή «ενεργό επιτήρηση» πάνω από την άμεση θεραπεία.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Παράρτημα S1.

Λεπτομέρειες βιοψίες δειγμάτων καρκίνου του προστάτη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0045802.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να αναγνωρίσουμε τη συνεισφορά των Δρ G Lee και ο Δρ WL Chong. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη τη συντακτική βοήθεια της Isolde Πρίγκιπας και ο David J Novak.