κυττάρων

Αφηρημένο

Ιστορικό

όγκου

in vivo

αντιμετωπίζουν διαφορετικά είδη μικροπεριβάλλοντα, τόσο σε η τοποθεσία του πρωτογενούς όγκου και σε θέσεις απομακρυσμένες μεταστάσεις. Η κατανόηση του πώς οι διάφορες μηχανικές ιδιότητες αυτών των μικροπεριβάλλοντα επηρεάζει την βιολογία των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου είναι ζωτικής σημασίας για τον προσδιορισμό μοριακών στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποιεί εύκαμπτα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου ως υποστρώματα για την κυτταρική ανάπτυξη, σε συνδυασμό με ένα νέο πρωτεομική προσέγγιση για τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων ακαμψίας που εξαρτώνται από κυτταρικές γραμμές καρκίνου που συμβάλλουν στην διαφορική ανάπτυξη τους σε μαλακό και άκαμπτα υποστρώματα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε πιο άκαμπτο /άκαμπτος υποστρώματα (& gt? 10.000 Ρα), κύτταρα σε μαλακό υποστρώματα (150-300 Ρα) εμφάνισαν μια μεγαλύτερη κυτταρικού κύκλου, οφείλεται κατά κύριο λόγο την παράταση της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου, και ήταν μεταβολικά λιγότερο ενεργό, δείχνοντας μειωμένα επίπεδα ενδοκυτταρικής ΑΤΡ και αξιοσημείωτη μείωση στην πρωτεϊνική σύνθεση. Χρησιμοποιώντας σταθερή επισήμανση ισότοπο αμινοξέων σε καλλιέργεια (SILAC) και φασματομετρία μάζας, μετρήσαμε τα ποσοστά της πρωτεϊνοσύνθεσης πάνω από 1200 κυτταρικών πρωτεϊνών υπό συνθήκες ανάπτυξης σε μαλακό και άκαμπτα /δύσκαμπτος υποστρώματα. Εντοπίσαμε κυτταρικές πρωτεΐνες των οποίων οι συνθέσεις είτε κατά προτίμηση αναστέλλεται ή διατηρημένα σε μαλακό μήτρες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που ρυθμίζουν κυτταροσκελετού δομές (π.χ., τουμπουλίνες) και γλυκόλυση (π.χ., φωσφοφρουκτοκινάση-1), ενώ η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που ρυθμίζουν βασικές μεταβολικές οδούς που απαιτούνται για την επιβίωση, π.χ., νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλτρανσφεράση, ένα ρυθμιστή της διάσωσης NAD μονοπάτι.

Συμπεράσματα /Σημασία

Οι κυτταρικές ιδιότητες της ακαμψίας που εξαρτώνται από τα καρκινικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε μαλακό πίνακες θυμίζουν τις ιδιότητες των αδρανών καρκινικών κυττάρων, π.χ., αργό ρυθμό ανάπτυξης και μειωμένο μεταβολισμό. Προτείνουμε ότι η χρήση των σχετικά μαλακό τζελ ως υποστρώματα καλλιέργειας κυττάρων θα επιτρέψει μοριακών οδών που πρέπει να μελετηθούν υπό συνθήκες οι οποίες αντανακλούν τις διαφορετικές μηχανικά περιβάλλοντα που αντιμετωπίζουν τα καρκινικά κύτταρα κατά την μετάσταση σε μακρινές περιοχές

Παράθεση:. Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman ΒΑ, Grigera PR, Jeffery ΕΔ, et al. (2012) Matrix ακαμψία Ρυθμίζει Καρκίνος Ανάπτυξη των κυττάρων διαμορφώνοντας κυτταρικό μεταβολισμό και Protein Synthesis. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10.1371 /journal.pone.0037231

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 14 Φεβρουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 16, Απριλίου 2012? Δημοσιεύθηκε: May 18, 2012 |

Copyright: © 2012 Tilghman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH) -Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) CA40042 (JTP) και ΝΙΗ 1U54 GM64346 (JTP και JWF) (www.nih.gov) και χρηματοδότηση από την Coulter Ίδρυμα Μεταγραφική Συνεργάτες Βραβείο (www. whcf.org) (JTP). EMB υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ-NCI Τ32 CA09109. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Sensing οι μηχανικές ιδιότητες της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) είναι ένας κεντρικός μηχανισμός για τη ρύθμιση της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού του ένα πλήθος τύπων κυττάρων τόσο

in vitro

και

in vivo

. Άφθονη αποδείξεις εμπλέκουν αλλαγές στα μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την απόκριση των κυττάρων σε μικροπεριβάλλοντος συνθήματα ως κρίσιμα γεγονότα στην έναρξη του όγκου, εξέλιξη, μετάσταση και ίσως ληθάργου όγκου [1], [2]. Επιπλέον, η αύξηση της ακαμψίας του ιστού λόγω της τοπικής συσσώρευσης ένα πυκνό, διασταυρωμένη μήτρα κολλαγόνου είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της εξέλιξης του καρκίνου σε μαλακούς ιστούς και είναι η βάση για την ανίχνευση πολλών τύπων όγκων με φυσική ψηλάφηση [3], [4].

Ανάλυση των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών σε καλλιέργεια κυττάρων είναι σχεδόν πάντα πραγματοποιείται με τη χρήση κυττάρων καλλιεργημένων σε άκαμπτο πλαστικό, ή, λιγότερο συχνά, σε Matrigel ή μαλακό άγαρ, οι μηχανικές ιδιότητες του οποίου είναι ανεπαρκώς καθορισμένες ή /και δύσκολο να μετατονίζω. Έχουμε περιγράψει προηγουμένως μια απλή μέθοδο υψηλής απόδοσης για την καλλιέργεια κυττάρων του όγκου την βιολογικώς σχετικό εύκαμπτα υποστρώματα χρησιμοποιώντας ECM συζευγμένο πολυακρυλαμιδίου (ΡΑ) πηκτώματα που μπορούν να καλύπτουν ένα φάσμα ακαμψία περιλαμβάνει μέτρα ελαστικότητας των 100 pascal ([Pa] ή N /m2) -150000 Pa [5]. Σε αυτή τη δοκιμασία χρησιμοποιούμε ένα σύστημα δοκιμασίας 96-φρεατίων που ντύνει PA πήγματα ποικίλης ακαμψίας σε καθορισμένα διαστήματα χρήστη σε όλη την πλάκα [6]. Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη δοκιμασία για την εκτίμηση πώς οι αλλαγές στην ακαμψία της ECM ρυθμίζουν τις βιολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, καθώς και στην ανάπτυξη, τη μορφολογία, και μεταναστευτικές ιδιότητες. Οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν ομαδοποιήθηκαν σε δύο κατηγορίες με βάση τα προφίλ πολλαπλασιασμό τους: «εξαρτάται ακαμψία» γραμμές παρουσίασαν αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων όπως εξωκυττάριο ακαμψία αυξάνεται, ενώ η «ακαμψία ανεξάρτητη» γραμμές αυξήθηκαν εξίσου καλά σε όλο το φάσμα δοκιμαστεί της δυσκαμψίας. Σημαντικά, τα κύτταρα τα οποία αναπτύχθηκαν καλά σε μαλακά πηκτώματα εμφάνισε μειωμένη εξάπλωση και τη μετανάστευση υπό αυτές τις συνθήκες και μεγάλωσε φτωχά όταν εισάγεται μέσα στο μαλακό ιστό περιβάλλον του πνεύμονα. Η ακαμψία εξαρτώμενη καρκινώματος πνεύμονα Α549 γραμμή ανταποκρίθηκαν στην καλλιέργεια σε μαλακά πηκτώματα με την έκφραση του διαφοροποιημένα επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης και μειώνοντας την έκφραση του παράγοντα Slug μεσεγχυματικά μεταγραφής. Παρομοίως, η ακαμψία έχει βρεθεί επίσης να ρυθμίζουν τη μετάβαση των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [7]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι μηχανικές ιδιότητες του περιβάλλοντος μήτρας παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και τις μορφολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, και ότι η «προφίλ ακαμψία» είναι μια εγγενής ιδιότητα του κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή.

πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές ανταποκρίνονται σε λιγότερο άκαμπτη μικροπεριβάλλοντα από πολλαπλασιαζόμενα πιο αργά? Ωστόσο, αλλαγές στον κυτταρικό μεταβολισμό που οφείλονται σε αλλαγές στην ακαμψία του μικροπεριβάλλοντος δεν έχουν χαρακτηρισθεί καλά. Κυτταρικές αλλαγές στις μεταβολικές διεργασίες όπως η σύνθεση των πρωτεϊνών μπορεί να είναι ιδιαίτερα σχετική καθώς εισάγετε τα καρκινικά κύτταρα σε «λανθάνουσα» κατάσταση, κυρίως σε περιοχές του απομακρυσμένων μεταστάσεων, όπου τα κύτταρα έχουν εισαχθεί σε ένα ξένο μικροπεριβάλλον [8], [9]. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε τις ιδιότητες ακαμψίας που εξαρτώνται από κυτταρικές γραμμές καρκίνου που συμβάλλουν στην διαφορική ανάπτυξη τους σε μαλακό και άκαμπτα υποστρώματα πολυακρυλαμιδίου. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε πιο άκαμπτο /άκαμπτος υποστρώματα, τα κύτταρα σε μαλακό υποστρώματα (150-300 Ρα) εμφάνισαν μια μεγαλύτερη κυτταρικού κύκλου, οφείλεται κατά κύριο λόγο την παράταση της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου, και ήταν μεταβολικά λιγότερο ενεργή, δείχνοντας μειωμένα επίπεδα ενδοκυτταρικής ΑΤΡ και αξιοσημείωτη μείωση στην πρωτεϊνική σύνθεση. Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών οι οποίες παρουσιάζουν ποσοστά σύνθεση απόκλιση όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μαλακά έναντι σκληρής γέλης, χρησιμοποιήσαμε ένα πρόσφατα αναπτύχθηκε εφαρμογή σταθερών επισήμανση ισότοπο αμινοξέων σε καλλιέργεια (SILAC) και φασματομετρία μάζας για τη μέτρηση των ποσοστών της πρωτεϊνοσύνθεσης άνω 1200 κυτταρικές πρωτεΐνες υπό συνθήκες ανάπτυξης σε μαλακό και άκαμπτο /άκαμπτος υποστρώματα [10]. Ότι τα συνολικά ποσοστά της πρωτεϊνοσύνθεσης μειωθεί αισθητά το ακαμψία εξαρτώμενη κύτταρα αναπτύσσονται σε μαλακό υποστρώματα, εντοπίσαμε κυτταρικές πρωτεΐνες των οποίων οι συνθέσεις κατά προτίμηση αναστέλλεται με καλλιέργεια σε μαλακό υποστρώματα και πρωτεΐνες των οποίων οι συνθέσεις ήταν σχετικά διατηρημένα όταν αναπτύσσονται σε μαλακό μήτρες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που ρυθμίζουν κυτταροσκελετικές δομών (π.χ., υπομονάδες τουμπουλίνης) και γλυκόλυση (π.χ., φωσφοφρουκτοκινάση Ρ-1 και συνθάση ΑΤΡ), ενώ η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που ρυθμίζουν κλειδί μεταβολικών οδών αναγκαία για την εξουδετέρωση της ζημίας από αντιδραστικά είδη οξυγόνου, όπως αλδο-κετο μέλη της οικογένειας αναγωγάσης και νικοτιναμίδιο φωσφοριβοσυλτρανσφεράση, ένα ρυθμιστή της μεθόδου απόπλυσης NAD. Οι κυτταρικές ιδιότητες της ακαμψίας που εξαρτώνται από τα καρκινικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε μαλακό μήτρες θυμίζουν τις ιδιότητες των αδρανών καρκινικών κυττάρων, δηλαδή να επιβραδύνει το ρυθμό ανάπτυξης και μειωμένο μεταβολισμό. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η ακαμψία του μικροπεριβάλλοντος μπορούν να διαμορφώσουν πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με ρύθμιση βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Περαιτέρω, η μαλακή τεχνολογία πλάκα μπορεί να παρέχει μια μοναδική πλατφόρμα για τη μελέτη των καρκινικών κυττάρων που υποβάλλονται σε δυναμική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού σε απόκριση στις αλλαγές του μηχανικού περιβάλλοντος, παρέχοντας έτσι πληροφορίες για το πώς μικροπεριβάλλοντος αλλαγές ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη του καρκίνου σε πειραματικά ζωικά μοντέλα και σε ασθενείς.

Αποτελέσματα

εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ακαμψίας κυττάρων που εξαρτώνται σε μαλακά πηκτώματα

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών μπορούν να διαχωρίζονται με βάση την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται σχετικά μαλακό (& lt? 1000 Pa) τζελ κολλαγόνου με λεπτό υμένιο. Τα κύτταρα Α549 (καρκίνωμα πνεύμονος) και MDA-MB-231 κύτταρα (καρκίνωμα μαστού) ταξινομούνται ως «ακαμψία εξαρτώμενη» και έκθεμα χρόνους διπλασιασμού που είναι τουλάχιστον 2 φορές μεγαλύτερο σε μαλακά έναντι δύσκαμπτος μήτρες. Σε αντίθεση, τα κύτταρα «ακαμψία-ανεξάρτητο» mPanc96 (παγκρεατικό καρκίνωμα) αναπτύσσονται εξίσου καλά σε μαλακά σε σύγκριση με άκαμπτο πίνακες και έχουν παρόμοιους χρόνους διπλασιασμού υπό αυτές τις συνθήκες ([5], αδημοσίευτες παρατηρήσεις).

Για να κατανοήσουμε το μοριακή βάση για την αργή ανάπτυξη της ακαμψίας που εξαρτώνται από κυτταρικές γραμμές καρκίνου σε μαλακό μήτρες, μετρήσαμε κλειδί ρυθμιστών της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, καθώς και το χρόνο που απαιτείται για τα κύτταρα να διασχίζει το κυτταρικό κύκλο σε μαλακό ή άκαμπτο υποστρώματα. Η κυκλίνη D1 είναι κρίσιμη για τα κύτταρα να εισέλθουν στον κύκλο του κυττάρου, και η απώλεια της έκφρασης κυκλίνης D1 είναι ένας δείκτης για κύτταρα που έχουν εξέλθει από το κυτταρικό κύκλο και είναι ηρεμίας [11]. Επιπλέον, η έκφραση της κυκλίνης D1 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται από ακαμψία μήτρα μέσω της FAK-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της RAC σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα [12]. Η έκφραση της κυκλίνης D1 σε ακαμψία εξαρτώμενη καρκινικά κύτταρα μετρήθηκε για να προσδιοριστεί εάν τα κύτταρα έξοδο από το κυτταρικό κύκλο όταν καλλιεργούνται σε μαλακές πηκτές. Η ακαμψία εξαρτώμενη Α549 ή MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 150 Pa, 4800 Pa, ή 19.200 γέλες Pa για 2 ή 5 ημέρες, και η έκφραση της κυκλίνης D1 μετρήθηκε με κηλίδα western. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν ακόμη κυκλίνη D1, ακόμη και όταν καλλιεργούνται με τα μαλακά (150 Ρα) πηκτώματα (Εικόνα 1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ακαμψία που εξαρτώνται από κύτταρα δεν έξοδο από το κυτταρικό κύκλο, ακόμη και σε μαλακά πηκτώματα όταν τα κύτταρα εμφανίζουν βραδύτερη ανάπτυξη.

Α549 κύτταρα και MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 150 Pa, 4800 Pa, ή 19.200 πηκτές πολυακρυλαμιδίου Pa για 2 ή 5 ημέρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν με western blot για την έκφραση της κυκλίνης D1 (άνω πλαίσιο). Η έκφραση του GAPDH αναλύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ). Η κηλίδα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων.

Η

Από ακαμψία εξαρτώμενη Α549 κύτταρα δεν έξοδο από το κυτταρικό κύκλο όταν απλώνονται σε μαλακό γέλες, και μόνο ~ 5% των κυττάρων υποβληθούν σε απόπτωση υπό αυτές τις συνθήκες [5 ], υποθέσαμε ότι τα κύτταρα αυτά προχωρούν μέσω του κύκλου του κυττάρου πιο αργά από ό, τι όταν αναπτύσσονται σε δύσκαμπτος υποστρώματα. Για να εξεταστεί το ρυθμό εξέλιξης μέσω ειδικών φάσεων του κυτταρικού κύκλου, η ακαμψία εξαρτώμενη Α549 γραμμή καρκινώματος πνεύμονα καλλιεργήθηκε σε μαλακές (150 Pa) ή άκαμπτο (19.200 Ρα) γέλες για δύο ή πέντε ημέρες και στη συνέχεια δονήθηκαν για 30 λεπτά με το νουκλεοτίδιο αναλόγου βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) για την επισήμανση του πληθυσμού κυττάρων που υποβάλλονται σε σύνθεση του DNA. Ο χρόνος που ξοδεύεται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με FACS για την παρακολούθηση της BrdU-θετικών πληθυσμού καθώς τα κύτταρα προχώρησαν μέσα από τις φάσεις S και G2 και συσσωρευμένη στην G1 φάση [13]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τα κύτταρα σε μαλακό πηκτώματα προχώρησαν πιο αργά μέσα από την φάση G1 του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα που αναπτύσσονται σε άκαμπτο μήτρες (Σχήμα 2), σύμφωνα με μια παγκόσμια μείωση στον κυτταρικό μεταβολισμό ή αναβολικές διεργασίες που επηρεάζουν την κυτταρική «ανάπτυξη» στάδιο του κυτταρικού κύκλου. Επειδή τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου είναι παρόμοια μετά από 2 και 5 ημέρες σε μαλακά πηκτώματα, είναι πιθανό ότι αυτό αντιπροσωπεύει μια μέτρηση σταθερής κατάστασης, σε αντίθεση με την πιθανότητα ότι η κυτταρική ανάπτυξη βαθμιαία επιβραδύνεται πάροδο του χρόνου. Με βάση το υπολογισθέν μήκος του κυτταρικού κύκλου για κύτταρα που αναπτύσσονται σε μαλακό έναντι σκληρής γέλης, μετά από 5 ημέρες ο λόγος των κυττάρων σε μαλακό έναντι δύσκαμπτη μήτρες θα ήταν 1:4.3. Η ίδια αναλογία της ανάπτυξης σε μαλακό έναντι σκληρής γέλης (1:4.3) παρατηρήθηκε με το χέρι μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που υπάρχουν σε πέντε ημέρες, την επικύρωση έτσι τους υπολογισμούς BrdU παλμού-εκδίωξης.

Α549 κύτταρα σημάνθηκαν με BrdU για 30 λεπτά μετά από ανάπτυξη σε μαλακό ή άκαμπτο πήγματα για 2 ημέρες. Α κύτταρα Σήμανση με BrDU για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα δονήθηκαν με BrDU για 30 λεπτά, και η BrDU θετικών πληθυσμός ακολουθείται πάροδο του χρόνου καθώς μεταβάσεις μέσα από τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. B. Scatter ιστογράμματα οικόπεδο BrdU-επισημασμένων κυττάρων σε μαλακό (άνω πάνελ) ή άκαμπτο (κάτω πίνακας) γελών, βάφτηκαν για περιεχόμενο DNA (Χ-άξονας) και BrdU (Υ-άξονας). Οι χρόνοι που αναφέρονται είναι οι χρόνοι, σε ώρες, μετά τον παλμό BrdU. Γ ανάλυση εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη επί του διαγράμματος διασποράς ιστογράμματα από τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε πήγματα για 2 ημέρες (αριστερά) ή 5 ημέρες (δεξιά).

Η

Κινητή μεταβολισμού σε ακαμψία εξαρτώμενη κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί μαλακά πηκτώματα

Η φάση G1 του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κυτταρική μεταβολικά γεγονότα και είναι κρίσιμη για τη σύνθεση των δομικών πρωτεϊνών και ενζύμων που συμβάλλουν στην παραγωγή νέων οργανιδίων και τη συνολική ανάπτυξη του κυττάρου. Επειδή το G1 φάση του κυτταρικού κύκλου παρατάθηκε σε ακαμψία εξαρτώμενη κύτταρα αναπτύσσονται σε μαλακό γέλες, υποθέσαμε ότι μπορεί να υπάρχει μεταβολικές αλλαγές υπό συνθήκες αύξησης των μαλακών υποστρωμάτων. Η καλλιέργεια του ακαμψία εξαρτώμενη Α549 ή MDA-MB-231 κυττάρων σε μαλακό γέλες για 2 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα μία μείωση κατά περίπου 50% στα επίπεδα του ΑΤΡ σε σύγκριση με τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε άκαμπτο πηκτώματα (Εικόνα 3). Όπως και η επιμήκυνση της φάσης G1, τα χαμηλότερα επίπεδα κυτταρικής ΑΤΡ είναι συνεπείς με μια μείωση στον κυτταρικό μεταβολισμό όταν ακαμψία που εξαρτώνται από κύτταρα καλλιεργούνται σε μαλακά πηκτώματα.

επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν σε κύτταρα Α549 (αριστερά) ή MDA-MB-231 κύτταρα (δεξιά) μετά από καλλιέργεια σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου για 2 ημέρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο δύο πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ± S.E., των κυττάρων σε μαλακό (300 Pa) ή άκαμπτο (19.200 Ρα) γέλες. Τα συνολικά επίπεδα ΑΤΡ κανονικοποιήθηκαν σε αριθμούς κυττάρων. * P & lt?. 0.05

Η

Επίδραση της ακαμψίας στην πρωτεϊνική σύνθεση σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μαλακό τζελ

Λόγω της παρατεταμένης G1 φάση και τη μείωση των επιπέδων ΑΤΡ σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μαλακό τζελ , προσδιορίσαμε αν ακαμψία μήτρα μπορεί να ρυθμίζει καθαρή σύνθεση πρωτεϊνών σε ακαμψία-εξαρτώμενα κύτταρα. Για την εκτίμηση των αλλαγών στη σύνθεση της παγκόσμιας πρωτεΐνης και για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να διαφορικά συντεθούν υπό μαλακό έναντι δύσκαμπτος συνθήκες, χρησιμοποιήσαμε ένα πρόσφατα αναπτύχθηκε εφαρμογή σταθερών επισήμανση ισότοπο αμινοξέων σε κυτταρική καλλιέργεια (SILAC), σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας [10 ]. Ακαμψία που εξαρτώνται από Α549 κύτταρα και ακαμψία ανεξάρτητη κύτταρα mPanc96 αναπτύχθηκαν σε SILAC πολυμέσων για δύο γενεές σε πλαστικά πιάτα καλλιέργειας ιστού για την επισήμανση πλήρως το πρωτεώματος με «βαριά» αμινοξέα (Σχήμα 4Α). Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν είτε μαλακά ή σκληρά πηκτώματα και καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε «βαριά» αμινοξέα για επιπλέον 4 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες ( «παλμική») σε «ελαφρά» media (φυσιολογικό μέσο καλλιέργειας ιστού), και κυτταρικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κάθε ένα από τα δείγματα και διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE. Πρωτεΐνες που υπάρχουν στο μαλακό και σκληρό δείγματα αναλύθηκαν με τη λήψη δέκα φέτες πηκτής από κάθε ίχνος πρωτεΐνη και υποβάλλοντας το καθένα σε πέψη με θρυψίνη. Καθαρή πρωτεϊνική σύνθεση κατά τη διάρκεια του 24 hour «παλμού» μετρήθηκε με προσδιορισμό της αναλογίας των βαρέων στο φως πεπτιδίων με φασματομετρία μάζας για πρωτεΐνες στα μαλακά και δύσκαμπτες δείγματα. Ένα προκαταρκτικό πείραμα με κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πλαστικές απέδωσε βαρύ στο φως αναλογίες (λόγοι H /L) των πεπτιδίων που ήταν παρόμοια με εκείνα των κυττάρων Α549 καλλιεργούνται σε μορφή σκληρής γέλης (0,6246 ± 0,2326 για τις πλαστικές έναντι 0,5482 ± 0,1785 για δύσκαμπτη τζελ). Η Εικόνα 4Β δείχνει Boxplots για αναλογίες H /L πρωτεϊνών που προσδιορίζονται για Α549 και mPanc96 κύτταρα σε μαλακό και σκληρό τζελ χρησιμοποιώντας SILAC. Η μέση αναλογία βαριάς /ελαφράς των πεπτιδίων στα κύτταρα Α549 σε μαλακά πηκτώματα ήταν σημαντικά υψηλότερη (ρ & lt? 0,05) από ό, τι στα κύτταρα επί σκληρής γέλης, υποδεικνύοντας ότι η καθαρή σύνθεση πρωτεϊνών μειώθηκε σε κύτταρα σε μαλακές γέλες, (δηλαδή, λιγότερες φως αμινο οξέα ενσωματώθηκαν κατά τη διάρκεια του παλμού στο κύτταρο αυξάνεται σε μαλακά υποστρώματα σε σύγκριση με το άκαμπτο υποστρώματα). Σε αντίθεση, τα βαρέα /φως αναλογίες των πεπτιδίων στα κύτταρα mPanc96 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των κυττάρων που αναπτύσσονται σε μαλακό ή άκαμπτο πηκτώματα (ρ & gt? 0,05). (Σχήμα 4Β)

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε ανάλυση SILAC να προσδιοριστεί τα ποσοστά της πρωτεϊνοσύνθεσης σε μαλακό ή δύσκαμπτο τζελ. A. Επισκόπηση της διαδικασίας SILAC. Κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό ή άκαμπτο τζελ 4 ημέρες παρουσία του «βαριά» των μέσων ενημέρωσης, που ακολουθείται από μια 24-ωρη επώαση με «φως» media. Τα κύτταρα λύθηκαν, κυτταρικές πρωτείνες υπέστησαν πέψη με θρυψίνη, και τα προκύπτοντα πεπτίδια αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας. B. Boxplots βαρέων στο φως (H /L) αναλογίες των πρωτεϊνών από κύτταρα Α549 (αριστερά) ή κύτταρα mPanc96 (δεξιά) έχουν αναπτυχθεί σε άκαμπτο (19.200 Ρα) ή μαλακή (150 Ρα) υποστρώματα. διανομές αναλογία /L H είναι σημαντικά διαφορετικές μεταξύ δύσκαμπτος και μαλακά για τα κύτταρα Α549 αλλά όχι για κύτταρα mPanc96 χρησιμοποιώντας δύο-tailed unpaired t-tests. Τα κουτιά περιέχουν τα δεδομένα μεταξύ των 25 και 75 εκατοστημόριο, και η γραμμή μέσα στο κουτί υποδεικνύει την μέση. Η διακεκομμένη γραμμή στο πάνω μέρος του γραφήματος σηματοδοτεί το ανώτερο όριο, πάνω από το οποίο είχαν περικοπεί οι ακραίες τιμές.

Η

Η ανάλυση φασματομετρίας μάζας προσδιορίζονται 631 μοναδικές πρωτεΐνες στα κύτταρα Α549 και 729 μοναδικές πρωτεΐνες στα κύτταρα mPanc96 (πίνακες S1 και S2). Σχετική ποσοστά της σύνθεσης (λόγος H /L) για τις μεμονωμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια συγκρίνεται μεταξύ των κυττάρων που αναπτύσσονται σε σκληρό και μαλακό συνθήκες για τον προσδιορισμό πρωτεϊνών που διαφορικά «εκφράζεται» ή μετάφραση. Δεδομένου ότι οι κατανομές των αναλογιών H /L διέφερε μεταξύ σκληρό και μαλακό πειράματα, οι αναλογίες H /L και εκτιμάται μεταβλητότητα ομαλοποιήθηκαν ανεξάρτητα για δείγματα Α549 και mPanc96 (βλέπε Μέθοδοι), και προσδιορίσαμε τις πρωτεΐνες με σημαντικά διαφορετικές αναλογίες H /L (ρ & lt? 0,05 ) χρησιμοποιώντας t-tests. Το Σχήμα 5 δείχνει τα scatterplots των κανονικοποιημένων δεικτών H /L μεταξύ ανάπτυξης δείγματα σε σκληρό και μαλακό υποστρώματα. Οι πρωτεΐνες που έχουν σημαντικά μικρότερη αναλογία H /L (σώζεται σύνθεση) σε μαλακό σε σύγκριση με το άκαμπτο τζελ που αναφέρονται στο κόκκινο και πρωτεΐνες που έχουν σημαντικά υψηλότερη αναλογία H /L (πιο αργή σύνθεση) σε μαλακό από ό, τι οι άκαμπτες γέλες που αναφέρονται στο πράσινο. Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει την αναμενόμενη αναλογία H /L κάτω από την μηδενική υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες διατηρούν την ίδια H /L αναλογία σε σχέση με το μέσο όρο.

αναλογίες H /L πρωτεϊνών που προσδιορίζονται τόσο σκληρό και μαλακό δείγματα συναρτήσει της κάθε άλλα για τα κύτταρα Α549 (αριστερά) και κύτταρα mPanc96 (δεξιά). αναλογίες H /L από το Σχήμα 4 ήταν ποσοστημόριο κανονικοποιημένη και t-tests διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας εκτιμώμενη μεταβλητότητα (βλέπε Μέθοδοι) για την αναγνώριση μεμονωμένων πρωτεϊνών με σχετικά διαφορετικές ταχύτητες σύνθεση μεταξύ σκληρό και μαλακό δείγματα. Πρωτεΐνες που συντίθενται γρηγορότερα (σχετικά χαμηλότερη H /αναλογία L και ρ-τιμή & lt? 0,05). Σε μαλακό δείγματα (σε σύγκριση με άκαμπτο δείγματα) εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, και οι πρωτεΐνες που συντίθενται βραδύτερη σε μαλακό δείγματα που φαίνεται στο πράσινο

από τις πρωτεΐνες που προσδιορίζονται με φασματοσκοπία μάζας, χωρίσαμε τις πρωτεΐνες που εμφάνισαν σημαντικά διαφορετικές αναλογίες H /L (p & lt? 0,05) μεταξύ των κυττάρων που καλλιεργούνται σε σκληρό και μαλακό τζελ (Πίνακας S3 για τα κύτταρα Α549? Πίνακας S4 για mPanc96 κύτταρα). Σε κύτταρα Α549, αρκετές πρωτεΐνες με κοινές βιολογικές λειτουργίες συγκεντρωμένα στην κατηγορία των πιο αργή σύνθεση για μαλακές γέλες (Πίνακας 1). Αυτές περιελάμβαναν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε σύνθεση πρωτεϊνών, όπως ριβοσωμικές πρωτεΐνες και παράγοντες επιμήκυνσης. Υπομονάδες των μικροσωληνίσκων (τουμπουλίνες) συγκεντρωμένα επίσης στην κατηγορία των πιο αργή σύνθεση σε μαλακό τζελ. Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο πρωτεΐνες με κρίσιμους ρόλους στην παραγωγή ΑΤΡ εμφανίζεται επίσης βραδύτερους ρυθμούς σύνθεση σε μαλακά πηκτώματα: 6-φωσφοφρουκτοκινάση τύπου C (PFKP-1) και μία υπομονάδα συνθάσης ΑΤΡ. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι όταν τα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται σε ένα μαλακό μικροπεριβάλλον, ένα υποσύνολο των πρωτεϊνών – περιλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στην μετάφραση και μικροσωληνίσκων δυναμική – συντίθεται πιο αργά σε σχέση με τον μέσο ρυθμό σύνθεσης απ ‘ότι όταν καλλιεργούνται σε μορφή σκληρής γέλης

Αντίθετα, πρωτεΐνες που είχαν υψηλότερα ποσοστά σύνθεσης από το μεγαλύτερο μέρος των κυτταρικών πρωτεϊνών όταν απλώνονται σε μαλακό πηκτές περιλαμβάνονται μέλη της οικογένειας αναγωγάσης αλδο-κετο, τα οποία εμπλέκονται στην άμυνα κατά των αντιδραστικά είδη οξυγόνου, και νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλτρανσφεράση, η οποία είναι σημαντικό για τη διατήρηση φυσιολογικών επιπέδων των συμπαραγόντων νικοτιναμιδίου (δηλαδή, NADPH) που είναι σημαντικά για αυτές τις αντιδράσεις οξειδοαναγωγής (Πίνακας 2). Επιπροσθέτως, οι πρωτεΐνες με ρόλους σε ενδοκυττάρωση και διακίνησης κυστιδίων, ειδικά αννεξίνες και πρωτεΐνες Rab, βρέθηκαν επίσης να διατηρείται σε κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό τζελ. Τα δεδομένα σε αυτόν τον πίνακα δείχνουν ότι όταν τα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται σε ένα μαλακό μικροπεριβάλλον, η σύνθεση των πρωτεϊνών που είναι σημαντικές για τη ρύθμιση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της δυναμικής μεμβράνης διατηρείται.

Η

Παρόμοια με κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό γέλες, αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες συντέθηκαν επίσης πιο αργά σε κύτταρα mPanc96 που καλλιεργήθηκαν σε μαλακά πηκτώματα (Πίνακας 3). Ωστόσο, σε αντίθεση με τα κύτταρα Α549, αρκετές πρωτεΐνες με ρόλους σε μετάφραση βρέθηκαν επίσης να έχουν υψηλότερα ποσοστά σύνθεσης στα κύτταρα mPanc96 όταν καλλιεργούνται σε μαλακές πηκτές (Πίνακας 4). Επιπλέον, ενώ τα κύτταρα Α549 έδειξε πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε οδούς διακίνησης κυστιδίων και το οξειδωτικό στρες, όπως έχουν διατηρηθεί τα ποσοστά σύνθεση σε μαλακά πηκτώματα, πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες, όπως υπομονάδες coatomer και υπεροξειδική δισμουτάση, αντίστοιχα, συνετέθησαν πιο αργά σε κύτταρα mPanc96 καλλιεργήθηκαν επί μαλακά πηκτώματα (Πίνακας 3), υποδεικνύοντας ότι αυτές οι μέθοδοι μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω όταν τα κύτταρα αναπτύσσονται σε mPanc96 μαλακό μικροπεριβάλλοντα. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της προσκόλλησης κυττάρου-μήτρας και ακτίνης δυναμική, συμπεριλαμβανομένου του μέλους της οικογένειας Rac RhoG, fascin, και ανεστραμμένα formin-2, βρέθηκαν να έχουν υψηλότερα ποσοστά της σύνθεσης όταν τα κύτταρα mPanc96 καλλιεργούνται σε μαλακά πηκτώματα (Πίνακας 4), εκτός από δύο πρωτεΐνες (κιτρικό συνθάσης και μηλική αφυδρογονάση) που έχουν κρίσιμους ρόλους στον κύκλο του κιτρικού οξέος, μια σημαντική μεταβολική διαδικασία για την παραγωγή των προδρόμων ΑΤΡ και αμινοξέων. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι όταν η ακαμψία ανεξάρτητη κυτταρική γραμμή mPanc96 καλλιεργείται σε ένα μαλακό μικροπεριβάλλον, υπάρχει μία μείωση στη σύνθεση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε οδούς διακίνησης κυστιδίων και το οξειδωτικό στρες, ενώ υπάρχει μια αύξηση στη σύνθεση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ακτίνη δυναμική και ο κύκλος του κιτρικού οξέος.

η

Επειδή τα στοιχεία αυτά αντικατοπτρίζουν μόνο τη σύνθεση των πρωτεϊνών, και τα συνολικά επίπεδα των πρωτεϊνών καθορίζεται από την ισορροπία της σύνθεσης και αποδόμησης, επιδιώξαμε να ελεγχθεί αν αυτή η μεταβολή της σύνθεσης πρωτεΐνης ήταν στην πραγματικότητα επηρεάζουν τα κυτταρικά επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών. Κυτταρολύματα από Α549 και κύτταρα mPanc96 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό ή άκαμπτο πηκτώματα υποβλήθηκαν σε Western Blot για ακτίνη, μια πρωτεΐνη που είχε δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές στις σχετικές σύνθεση όταν καλλιεργούνται σε μαλακά πηκτώματα, και δύο πρωτεΐνες που έδειξαν υψηλή ευαισθησία στην ακαμψία, δηλαδή, τουμπουλίνης και φωσφοφρουκτοκινάση-1. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης, επειδή δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην σχετική σύνθεση του GAPDH μεταξύ μαλακών και δύσκαμπτες πηκτώματα (ρ = 0,55, βλέπε Πίνακα S1, γραμμή 275). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, ακτίνη εκφράστηκε σε παρόμοια επίπεδα όταν καλλιεργούνται σε μαλακό ή άκαμπτο γέλες, ενώ τα επίπεδα της τουμπουλίνης και PFKP-1 ήταν χαμηλότερα για τα μαλακά πηκτώματα σε κύτταρα Α549, υποδεικνύοντας ότι ο χαμηλότερος ρυθμός της σύνθεσης των πρωτεϊνών αυτών που παρατηρήθηκαν στο SILAC δεδομένα αντανακλάται από τα χαμηλότερα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών στα κύτταρα. Σε αντίθεση, τα κύτταρα mPanc96 δεν έδειξαν μεταβολές στην τουμπουλίνης ή επίπεδα PFKP-1 όταν καλλιεργούνται σε μαλακές πηκτές. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι, τουλάχιστον για τις πρωτεΐνες που εξετάστηκαν (τουμπουλίνης και PFKP-1), ένα βραδύτερο ρυθμό σύνθεσης αντιστοιχεί σε χαμηλότερα επίπεδα κυτταρικής πρωτεΐνης.

A. Τα επίπεδα ακτίνης, τουμπουλίνης, και φωσφοφρουκτοκινάση-1 σε κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό (150 Pa) ή άκαμπτο (19.200 Ρα) πηκτώματα αναλύθηκαν με western blot. Κάτω πάνελ δείχνουν επίπεδα GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. B. Η επιπέδων της ακτίνης, τουμπουλίνης, και PFKP-1 σε κύτταρα mPanc96 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό ή άκαμπτο πηκτώματα όπως αναλύεται με στύπωμα Western. Κάτω πάνελ δείχνουν επίπεδα GAPDH στα κυτταρολύματα ως μάρτυρας φόρτωσης. C. Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτελέσματα κηλίδος στο (Α) και (Β). Τα επίπεδα του κάθε πρωτεΐνη κανονικοποιήθηκαν με το ποσό της GAPDH σε κάθε δείγμα. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε δείγματα που παρασκευάστηκαν από δύσκαμπτο γέλες τέθηκαν στο 100%, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης στα μαλακά δείγματα εμφανίζονται ως ποσοστό έκφραση αυτών των δειγμάτων. Τα αποτελέσματα δείχνουν την μέση τιμή ± S.E. τουλάχιστον τριών πειραμάτων. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με το επίπεδο της ακτίνης έκφρασης

Η

Συζήτηση

Σε αυτή την εργασία, έχουμε αποδείξει ότι η ακαμψία της εξωκυττάριας μήτρας ρυθμίζει τον κυτταρικό μεταβολισμό και την πρωτεϊνική σύνθεση σε καρκίνο κύτταρα. Η ακαμψία εξαρτώμενη καρκινικές κυτταρικές σειρές Α549 και MDA-MB-231 διατηρηθεί η έκφραση της κυκλίνης D1 όταν καλλιεργούνται σε ορό σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου που έχουν μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με εκείνη του μαλακού ιστού όπως του πνεύμονα ή του μαστού. Παρά έκφραση κυκλίνης D1, κύτταρα Α549, όταν καλλιεργούνται σε μαλακά πηκτώματα, δείχνουν μια επιμήκυνση της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχουν ελαττώματα στη σύνθεση των δομικών και ενζυματικές συστατικά απαραίτητα για τη μετάβαση στη φάση S . Κατά συνέπεια, η ακαμψία που εξαρτώνται από κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα των κυτταρικών επιπέδων ΑΤΡ όταν καλλιεργούνται σε μαλακές πηκτές. Επιπλέον, η σύνθεση πρωτεΐνης σε κύτταρα Α549 είναι βραδύτερη υπό αυτές τις συνθήκες, με τη σύνθεση συγκεκριμένων δομικών πρωτεϊνών και γλυκολυτικά ένζυμα όπως τουμπουλίνης, φωσφοφρουκτοκινάση, και ΑΤΡ συνθάσης ιδιαίτερα ευαίσθητα στη μείωση εξωκυτταρικό ακαμψία. Πρωτεΐνες που ήταν λιγότερο ευαίσθητοι στη μεταβολή της ακαμψίας περιλαμβάνονται ένζυμα όπως αλδο-κετο αναγωγάσης και νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των προϊόντων ROS.

Matrix ακαμψία έχει προταθεί να είναι ένας μηχανισμός που υπογραμμίζει την τροπισμό ιστού των μεταστάσεων του καρκίνου, επειδή αύξηση των κυτταρικές γραμμές καρκινώματος σε μαλακό ή άκαμπτο πηκτώματα συσχετίζεται με την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μαλακό ή άκαμπτο ιστούς [5], [14]. Ωστόσο, ο μηχανισμός (ες) που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε ένα ιστό-ειδικό τρόπο είναι αναμφίβολα περίπλοκη. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι ένας τρόπος με τον οποίο ακαμψία που εξαρτώνται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ανταποκρίνεται σε ένα λιγότερο από ευνοϊκό περιβάλλον ιστο-μήτρα είναι να μειωθεί μεταβολική κατάσταση τους, το οποίο προσφέρει μία πιθανή μηχανισμός για την παρατηρούμενη τροπισμό ιστού των κυττάρων του όγκου, και ίσως ιστού που εξαρτάται από λήθαργο όγκου.

όγκων ληθάργου ορίζεται ως ένα στάδιο στην εξέλιξη του καρκίνου στην οποία υπολειμματική νόσος υπάρχει αλλά είναι ασυμπτωματική [15]. Αδρανής καρκινικά κύτταρα μπορούν να διαμένουν απαρατήρητα σε περιοχές απομακρυσμένες από τον πρωτογενή όγκο, εν αναμονή της μετέπειτα ανάπτυξης και της κλινικής υποτροπής [16]. Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν ένα μοντέλο σύμφωνα με την οποία τα καρκινικά κύτταρα από τον πρωτογενή όγκο θα διαδώσει νωρίς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου, έτσι ώστε από τη στιγμή που ανιχνεύεται ο πρωτογενής όγκος, μπορεί να υπάρχουν αδρανείς καρκινικά κύτταρα που διαμένουν ήδη σε απομακρυσμένες θέσεις [17]. Αυτά τα κύτταρα είναι είτε προσωρινά μη παραγωγική ή υπάρχει μια ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου, ή το ανοσοποιητικό σύστημα είναι η διατήρηση των αριθμών των κυττάρων υπό έλεγχο. Είναι ενδιαφέρον ότι η τελευταία δυνατότητα έχει τεθεί υπό έλεγχο, λόγω των μελετών που δείχνουν έλλειψη υποτροπής του όγκου σε ασθενείς με καρκίνο που έχουν υποβληθεί σε ανοσοκατασταλτική θεραπεία [18].

Πρόσφατες μελέτες έχουν ενοχοποιήσει το μικροπεριβάλλον ως βασικό ρυθμιστή των καρκινικών κυττάρων λήθαργου και επανάληψη. Ειδικότερα, οι ιδιότητες της εξωκυττάριας μήτρας σε θέσεις μετάστασης μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό της κατάστασης των διαδίδονται καρκινικών κυττάρων [9]. Ωστόσο, μηχανιστική αντίληψη για το πώς συμβαίνει λήθαργου είναι σπάνιο, δεδομένου ότι αδρανείς καρκινικά κύτταρα είναι δύσκολο να ανιχνευθούν και in vivo μελέτη, και υπάρχει μια σπανιότητα των in vitro μοντέλων για καρκινικών κυττάρων λήθαργο. Μέχρι πρόσφατα, έχουν τέτοια μοντέλα έχουν περιοριστεί σε κύτταρα που αναπτύχθηκαν επί χοριοαλλαντοϊκές μεμβράνες (CAMs) ή σε 3D μήτρα που προέρχεται από τον όγκο Engelbreth-Holm-Swarm (EHS μήτρα, ή Matrigel) [19], [20]. Matrigel είναι ένα μίγμα λαμινίνη, κολλαγόνο IV, και εντακτίνης, εκτός από μια ποικιλία από πρωτεάσες και αυξητικούς παράγοντες όπως ΤΟΡβ, FGF, EGF, PDGF, και IGF [21]. Επειδή παράγεται από έναν όγκο, η ειδική σύνθεση του Matrigel δεν είναι σαφώς καθορισμένη, και μπορεί να ποικίλει από παρτίδα σε παρτίδα, παράγοντας μεταβλητότητα των πειραματικών αποτελεσμάτων [22]. Ενώ οι μηχανικές ιδιότητες του Matrigel έχουν αναλυθεί, μπορούν επίσης να υπόκεινται σε μεταβλητότητα επειδή ο πολυμερισμός της επηρεάζεται από τη σύνθεσή του και άλλους πειραματικούς παράγοντες όπως η θερμοκρασία [23]. Επιπλέον, επί του παρόντος ο μόνος τρόπος για να αλλάξει τις μηχανικές ιδιότητες του Matrigel είναι να προσθέσει επιπλέον συστατικά μήτρας όπως κολλαγόνο Ι [24], το οποίο μπορεί επίσης να περιπλέξουν την ερμηνεία των πειραματικών αποτελεσμάτων.

Πρόσφατα, in vitro μοντέλα για ληθάργου όγκου έχουν επεκταθεί για να περιλάβει τη χρήση γελών πολυακρυλαμιδίου όπως υποστρώματα ανάπτυξης [25]. Σε αντίθεση με Matrigel, πολυακρυλαμίδιο είναι ένα σταθερό, ομοιογενές πολυμερές, και μηχανικές ιδιότητες του δεν είναι ευαίσθητοι στις μεταβολές της θερμοκρασίας [26]. ακαμψία του είναι εύκολα μπορούν να ρυθμιστούν με ρύθμιση της ποσότητας του μέσου διασύνδεσης δις χωρίς να επηρεάζουν την ικανότητα του να δεσμεύει μόρια ECM στην επιφάνειά του [6]. υδρογέλες πολυακρυλαμιδίου μπορεί να περιλαμβάνει ένα φάσμα ελαστικότητας που περιλαμβάνει μια σειρά ανθρώπινων ιστών από το λίπος στους σκελετικούς μύες [27], καθώς και μια ποικιλία μορίων ECM μπορεί να συζευχθεί με την επιφάνειά του, συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου, φιμπρονεκτίνη, και μη πολυμερισμένο Matrigel. Επιπλέον, ένα σύστημα υψηλής απόδοσης αναπτύχθηκε πρόσφατα για να καταστεί δυνατή η διαλογή των αναστολέων μικρών μορίων με τα κύτταρα καλλιεργημένα σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου που εκτείνονται σε μια σειρά από ελαστικότητας [5], [6].