Αφηρημένο

HER2 υπερεκφράζεται σε 15-20% των καρκίνων του μαστού. Η υπερέκφραση του HER2 είναι γνωστό ότι μειώνει την απόπτωση αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί για την ένωση αυτή παραμένουν ασαφείς. Για τη διαλεύκανση των μηχανισμών για HER2-μεσολάβηση της επιβίωσης, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ HER2 και p53 υπερεκφράζεται διαμορφωτή της απόπτωσης (PUMA), ένα ισχυρό απόπτωση επαγωγέα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι αλληλεπιδρά με HER2 Puma, η οποία ήταν ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση του HER2. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι HER2 αλληλεπίδρασε με PUMA τόσο μιτοχονδριακές και μη μιτοχονδριακή διαμερίσματα. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον HER2 φωσφορυλιώνει PUMA. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA δεν έχει ποτέ αναφερθεί. Χρησιμοποιώντας μια ενδοκυτταρική δοκιμασία βρήκαμε PUMA να είναι φωσφορυλιωμένη σε κύτταρα καρκίνου του μαστού με ενεργοποιημένο HER2. Μέσω δοκιμασία HER2 κινάσης ελεύθερο κυττάρων, παρατηρήσαμε ότι PUMA φωσφορυλιώθηκε άμεσα από HER2. Η ενεργοποίηση του HER2 μειώθηκε PUMA πρωτεΐνη ημίσειας ζωής. Να προσδιορίσει ποια από τις τρεις τυροσίνες εντός PUMA είναι στοχευμένες με HER2, δημιουργήσαμε τρεις PUMA μεταλλαγμένα μη-φωσφορυλίωση καθένα με μια απλή υποκατάσταση Tyr → Phe. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάθε PUMA μόνο μεταλλαγμένο είχε χάσει κάποια, αλλά όχι όλα φωσφορυλίωση από HER2 που δείχνει ότι HER2 στόχους και τις τρεις τυροσίνες. Κατά συνέπεια, δημιουργήσαμε ένα επιπλέον μεταλλαγμένο PUMA με τα τρία τυροσίνες μεταλλαγμένο (ΤΜ-PUMA) που δεν μπορούσε να φωσφορυλιωθεί από HER2. Είναι σημαντικό, TM-PUMA βρέθηκε να έχουν μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από PUMA. Μια αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ HER2 και PUMA σε 93 δείγματα διηθητικό καρκίνωμα του μαστού. Βρήκαμε επίσης ότι TM-PUMA κατέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι PUMA. Επίσης, TM-PUMA είχε ισχυρότερη τάση να επάγει απόπτωση από την PUMA. Μαζί, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι μπορεί να είναι PUMA φωσφορυλιωμένη τυροσίνη και ότι HER2 μεσολάβηση φωσφορυλίωση αποσταθεροποιεί PUMA πρωτεΐνη. Η αλληλεπίδραση HER2-PUMA αποτελεί ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο ρυθμίζεται PUMA και μια νέα μοριακή βάση για HER2-μεσολάβηση ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Carpenter RL, Han W, Paw Ι, Lo HW ( 2013) HER2 φωσφορυλιώνει και αποσταθεροποιεί Pro-αποπτωτικά PUMA, με αποτέλεσμα να ανταγωνίζεται απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (11): e78836. doi: 10.1371 /journal.pone.0078836

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 του Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 24 του Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Carpenter et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης K01-CA118423, και W81XWH-11-1-0600 από το Υπουργείο άμυνας των Ηνωμένων Πολιτειών, του Ιδρύματος όγκου Παιδιατρικής του εγκεφάλου, το Ίδρυμα Beez και της Διεύθυνσης Τειχών της Χειρουργικής Επιστημών Dani Π Bolognesi, Ph.D. Ανάθεσης και Clarence Gardner, Ph.D. Βραβείο (για την H-WL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

ποσοστά καρκίνου του μαστού μειώνεται, αλλά παραμένει μια σημαντική απειλή για τη δημόσια υγεία. Οι τρέχουσες εκτιμήσεις δείχνουν θα υπάρξουν 300.000 νέες περιπτώσεις και 40.000 θάνατοι από καρκίνο του μαστού το 2013 [1]. Εκτιμάται ότι θα υπάρξουν περισσότερες νέες περιπτώσεις καρκίνου του μαστού στις γυναίκες από ό, τι οποιοδήποτε άλλο είδος καρκίνου το 2013 [1]. HER2 υπερεκφράζεται σε 15-20% των ανθρώπινων καρκίνων του μαστού και αυτό υπερέκφραση συνδέεται με κακή έκβαση των ασθενών συμπεριλαμβανομένης μειωμένης συνολική επιβίωση, αυξημένη υποτροπή του όγκου, και πιο επιθετική νόσο [2] – [4]. Στη συνέχεια ετεροδιμερή με HER2 ενεργοποίηση του HER2 εμφανίζεται από ετεροδιμερισμού με άλλους υποδοχείς της erbB οικογένειας, όπως ερεγουλίνη σύνδεση με HER3 που θα να ενεργοποιήσετε κατάντη οδούς HER2 [5].

Η υπερέκφραση του HER2 είναι γνωστό ότι μειώνει την απόπτωση. αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 προ-αποπτωτικών και ελέγχουν την εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι στα μιτοχόνδρια. Οι θετικές συσχετίσεις έχουν βρεθεί μεταξύ της έκφρασης HER2 και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Bcl-xL, Mcl-1, και Bcl-2 [6] – [8]. Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση του HER2 προκάλεσε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Bcl-2 και Bcl-xL, ενώ η αναστολή της HER2 μειωμένη Mcl-1 και η αυξημένη έκφραση Bax [6], [7], [9]. HER2 μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει ΡΙ3Κ-ΑΚΤ και ERK1 /2 σηματοδότηση, η οποία μπορεί να ρυθμίσει την απόπτωση με έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης, όπως προς τα πάνω ρύθμιση της survivin, και μετα-μεταφραστική ρύθμιση, όπως φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση του προ-αποπτωτικών Bad [10], [11 ]. ρύθμιση HER2 της απόπτωσης έχει κυρίως παρατηρηθεί ότι διαμεσολαβείται από μεταγενέστερους σηματοδότησης, ενώ δεν έχει αξιολογηθεί άμεση ρύθμιση των Bcl-2 πρωτεϊνών με HER2.

Το

PUMA

γονίδιο εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 2001 [ ,,,0],12], [13] ως μια οθόνη για μεταγραφική στόχους της ρ53. Η

BBC3

γονίδιο ταυτοποιήθηκε σύντομα μετά από δύο-υβριδίων ζυμομύκητα διαλογή και cDNA για αυτό το γονίδιο ίση με εκείνη του PUMA [14]. Αυτό αργότερα ανακάλυψη του

BBC3

γονίδιο διαπίστωσε επίσης ότι η έκφραση PUMA θα μπορούσε να προκληθεί από αποπτωτικά ερεθίσματα ανεξάρτητη της ρ53 [14]. PUMA περιέχει δύο λειτουργικές περιοχές στο C-τελικό άκρο, η περιοχή ΒΗ3 και το σήμα μιτοχονδριακή εντοπισμού (MLS) [15], [16]. Λειτουργική δραστικότητα του PUMA αρχίζει με πρωτεΐνη στόχευσης στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη όπου PUMA αλληλεπιδρά με αντι-αποπτωτικά μέλη οικογένειας Bcl-2 αναστέλλουν την καταστολή τους Βαχ και Bak [12], [17]. Η αναστολή της αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 οδηγεί στην ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax /Bak ενεργοποιεί μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ) και απελευθέρωση του κυτοχρώματος C [12], [16], [17]. Κυτταροπλασματικά κυτόχρωμα C σχηματίζει τελικά το αποπτωσώματος οδηγώντας σε ενεργοποίηση κασπασών τελεστών 3/9 και απόπτωση. Απώλεια ενεργότητας PUMA έχει συσχετιστεί με πολλούς τύπους καρκίνου. Η διαγραφή ενός τμήματος του χρωμοσώματος 19, όπου ο

PUMA

γονίδιο βρίσκεται, έχει αναφερθεί σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου του [13], [18], [19]. Επιπλέον,

PUMA

είναι ένα ρ53-επαγώγιμο γονίδιο ρ53 και έχει μεταλλάξεις σε περισσότερες από 40% των καρκίνων του [20]. Κατά συνέπεια, εξασθενημένη επαγωγή PUMA έχει παρατηρηθεί με μετάλλαξη ρ53 ή διαγραφή [13], [21]. Επίσης, τα καρκινικά κύτταρα με PUMA διαγραφεί έχουν υψηλή αντοχή σε p53-επαγώγιμο θεραπείες όπως παράγοντες βλάβης του DNA, UV, και γ-ακτινοβολία, μεταξύ άλλων, [19]. Ωστόσο, ένας αριθμός από μελέτες έχουν αναφέρει ότι η έκφραση PUMA μπορεί να επαχθεί με μηχανισμούς ρ53-ανεξάρτητη [19], [22] – [25].

Μια άμεση σύνδεση μεταξύ HER2 και PUMA δεν έχει διερευνηθεί. Επίσης άγνωστο είναι αν PUMA υφίσταται φωσφορυλίωση τυροσίνης. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε ένα νέο εύρημα που PUMA μπορεί να φωσφορυλιωθεί επί υπολειμμάτων τυροσίνης άμεσα από HER2. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση PUMA με HER2 οδηγεί σε PUMA αποσταθεροποίηση και την επιβίωση των κυττάρων. Δείχνουμε επίσης ότι ένα μεταλλαγμένο PUMA που δεν μπορεί να φωσφορυλιωθούν επί υπολειμμάτων τυροσίνης (ΤΜ-PUMA) έχει μία ενισχυμένη ικανότητα να επάγει απόπτωση. Στο σύνολό τους, η μελέτη μας αποκάλυψε ένα νέο HER2 → PUMA άξονα που αντιπροσωπεύει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο ρυθμίζονται PUMA πρωτεΐνης και PUMA μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο σηματοδότησης. Τα ευρήματά μας παρέχουν επίσης αποδεικτικά στοιχεία που εμπλέκουν PUMA κάτω ρύθμιση ως νέα μοριακή βάση για HER2-μεσολάβηση ανάπτυξη και την επιβίωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells and Cell Culture

MDA-MB -453, MCF-7, ΒΤ-474, και SK-BR3 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του μαστού ελήφθησαν από την American Type Culture Collection, ATCC (Manassas, VA). MDA-MB-453 κύτταρα διατηρήθηκαν σε Leibovitz L-15 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 0% διοξείδιο του άνθρακα. Τα κύτταρα MCF-7 διατηρήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1 mM πυρουβικό νάτριο, 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, και 10 μg /mL βόεια ινσουλίνη. ΒΤ-474 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. κύτταρα SK-BR3 διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS. MCF-7 κύτταρα /HER2 διατηρήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1 mM πυρουβικό νάτριο, 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, 10 μg /ml βόεια ινσουλίνη, και 350 μg /mL G418.

Χημικές ουσίες και Αντιδραστήρια

Όλα τα χημικά αγοράστηκαν από Sigma (St. Louis, ΜΟ) εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Κυκλοεξιμίδιο αγοράστηκε από Amresco (Solon, ΟΗ), MG132 αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA), ανισομυκίνης αγοράστηκε από Enzo Επιστημών Ζωής (Farmingdale, NY), και λαπατινίμπη αγοράστηκε από LC Laboratories (Woburn, ΜΑ). Τουμπουλίνης, β-ακτίνη, και IgG αντισώματα αγοράστηκαν από την Sigma. ΗΑ αντίσωμα αγοράστηκε από την Roche (Indianapolis, ΙΝ), PARP-1 αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), COX IV αντίσωμα αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ), και 4Ο10 αντίσωμα αγοράστηκε από την Millipore ( Billerica, ΜΑ). PUMA, HER2, και φωσφόρου-HER2 (Y1248) αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ).

πλασμίδια

Το πλασμίδιο ρΗΑ-PUMA παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Bert Vogelstein μέσω Addgene πλασμίδιο 16588 [13]. Γενιά και μόνο μεταλλαγμένα PUMAs (Y58F-PUMA, Y152F-PUMA, και Y172F-PUMA), καθώς και η τριπλή μετάλλαξη (Y58F /Y152F /Y172F-PUMA) έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ QuikChange ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Santa Clara , CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για μεταλλαξογένεση ήταν τα ακόλουθα: Y58F-Forward 5′-TGCCCGCTGCCTTTCTCTGCGCCCCCA-3 ‘, Y58F-Reverse 5′-TGGGGGCGCAGA GAAAGGCAGCGGGCA-3′, Y152F-Forward 5’-CTCAACGCACAGTTTGAGCGGCGGAGA-3 ‘, Y152F-Reverse 5’-TCTCCGCCGCTCAAACTGTGCGTTGAG- 3 ‘, Y172F-Forward 5′-TCACCTGGAGGGTCCTGTTCAATCTCATCAT-3′, και Y172F-Reverse 5’-ATGATGAGATTGAACAGGACCCTCCAGGGTGA-3 ‘. Η μετάλλαξη επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας.

Ανοσοκαταβύθιση /Western Blotting (IP /WB)

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ 40, 0,1% SDS, 1% δεοξυχολικό νάτριο) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης /φωσφατάσης που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους και συλλογής του υπερκειμένου. Ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα προ-καθαριστεί με 1 μg IgG κουνελιού και 20 μι πρωτεΐνη-Α-αγαρόζης για 1 ώρα στους 4 ° C. Διαυγασμένα λύματα στη συνέχεια επωάστηκαν με 1 μg HER2 ή PUMA αντίσωμα ή ελέγχου IgG κουνελιού στους 4 ° C όλη τη νύκτα με ανάδευση. Στη συνέχεια προστέθηκε πρωτεΐνη Α-αγαρόζη και επωάστηκε στους 4 ° C για 60 λεπτά με ανάδευση. Πρωτεΐνη σφαιρίδια Α-αγαρόζη συλλέχθηκαν και πλύθηκαν πολλές φορές με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA στους 4 ° C. Τα πλυμένα σφαιρίδια έβρασαν και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Προσδιορισμός φωσφορυλίωσης τυροσίνης PUMA προσδιορίστηκε με ανοσοκαταβύθιση PUMA ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-τυροσίνης 4G10 Platinum αντίσωμα (Millipore).

ελεύθερα κυττάρων HER2 Κινάσης Δοκιμασίες

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη PUMA ( ΟηΟεηε, Rockville, MD) αποφωσφορυλιώθηκε με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη ΡΤΡ1Β στους 30 ° C που ακολουθείται από ΡΤΡ1Β απενεργοποίηση στους 65 ° C. Αποφωσφορυλιωμένο PUMA μετά επωάστηκε με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη HER2 (Promega, Madison, WI) και ΑΤΡ στους 30 ° C. Το δείγμα στη συνέχεια βράζεται και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-τυροσίνης 4G10 Platinum αντίσωμα (Millipore).

Ανοσοκαταβύθιση-κινάσης Δοκιμασία

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΗΑ-tagged πλασμίδια PUMA και κυτταρολύματα συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. Ανοσοκαταβυθίστηκαν έγινε με ΗΑ αντίσωμα όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από πλύσεις, σφαιρίδια Α-αγαρόζη πρωτεΐνη αποφωσφορυλιώθηκαν με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΡΤΡ1Β που ακολουθείται από επώαση με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη HER2, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα στη συνέχεια βράζεται και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-τυροσίνης 4G10 Platinum αντίσωμα (Millipore).

Αποικίας Δοκιμασίες Σχηματισμού

Μετά την επιμόλυνση των πλασμιδίων έδειξε κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 -Καλά πλακών καλλιέργειας για να προσδιοριστεί αγκύρωση εξαρτώμενη κλωνογόνο αύξηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επίσης σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων με αγαρόζη για να προσδιοριστεί αγκύρωση ανεξάρτητη κλωνογόνο ανάπτυξη. Wells προ-επικαλυμμένα με ένα κάτω στρώμα του 0.5% αγαρόζη και τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ανώτερο στρώμα με 0.35% αγαρόζης. Μετά από 2-4 εβδομάδες, οι αποικίες με ή χωρίς αγαρόζη βάφτηκαν με μπλε διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (Sigma) για 1 ώρα και οι αποικίες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια υποδεικνύονται, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αναφερόμενες ενώσεις, και συλλέχθηκαν με θρυψίνη /EDTA. Η απόπτωση ήταν τότε προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας FITC-αννεξίνης V /προπίδιο κιτ ανίχνευσης ιωδιούχο από την BD Pharmingen (San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα ροής BD FACSCalibur κυτταρόμετρο. PARP-1 διάσπασης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση των κυτταρολυμάτων εξής ενδεικνυόμενη επιμόλυνση και θεραπεία.

Προσδιορισμός PUMA μιτοχονδριακού Επίπεδα

μιτοχονδριακή κλασματοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας από την Pierce /Thermo Scientific (Rockford, IL), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [26]. Εν συντομία, η πρωτεΐνη απομονώνεται από το μιτοχονδριακό εκχύλισμα (ΜΕ) και του μη-μιτοχονδριακό εκχύλισμα (NME). Το ME και NME στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση. εντάσεις μπάντα στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΙΗ ImageJ. Η έκταση της PUMA μιτοχονδριακής εντοπισμού (mtPUMA Index) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας πυκνότητες μπάντα με την ακόλουθη εξίσωση:.% ME είναι το ποσοστό του συνολικού ME φορτωμένες και% NME είναι το ποσοστό του συνολικού NME φορτωθεί για ανοσοκηλίδωση

Ανοσοϊστοχημεία of Clinical δείγματα όγκων

τα πλακίδια αγοράστηκαν από την US Biomax (Rockville, MD). Εκτίμηση της έντασης HER2 (0-3 +) ολοκληρώθηκε από ΗΠΑ Biomax. ανίχνευση PUMA διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Τα πλακίδια επωάστηκαν με PUMA αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Η ιστολογική βαθμολογία (H-score) υπολογίστηκαν από τις δύο τοις εκατό θετικότητα (Α%, Α = 1-100) και την ένταση (Β = 0-3 +) χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Η-Score = A × B. Chi-square ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η σχέση μεταξύ της έντασης HER2 και PUMA H-Score.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SE. Οι διαφορές προσδιορίστηκαν μέσω One-Way ANOVA με δοκιμή post-hoc Tukey ή έλεγχος τ όπου ενδείκνυται. ανάλυση Chi-Square έγινε για τα αποτελέσματα IHC. Σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

HER2 Σωματικά Associates με PUMA

Για να διερευνηθεί αν HER2 έχει καμία αλληλεπίδραση με PUMA, έχουμε καταρχάς αξιολόγησε κατά πόσο HER2 μπορεί να αλληλεπιδρούν φυσικά με PUMA χρήση ανοσοκατακρήμνισης /δυτικής κηλίδας (IP /WB). Χρησιμοποιήσαμε SK-BR3 και ΒΤ-474 κύτταρα καρκίνου του μαστού που υπερεκφράζουν το HER2, λόγω της ενίσχυσης του γονιδίου HER2. Εμείς ανοσοκαταβυθίστηκαν HER2 από αυτά τα κύτταρα και διαπίστωσε ότι PUMA θα μπορούσε να ανιχνευθεί με HER2 τραβήξει κάτω στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1α). Αυτό έδειξε μια νέα διαπίστωση ότι HER2 αλληλεπιδρά φυσικά με την PUMA. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν είχαμε ανιχνεύσει μία αλληλεπίδραση μεταξύ HER2 και Bad ή BMF, άλλα ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, γεγονός που υποδηλώνει την αλληλεπίδραση με HER2 είναι ειδικά για PUMA (Σχήμα 1α). Είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσο δραστηριότητα HER2 κινάσης που απαιτούνται για την αλληλεπίδραση με την PUMA. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς heregulin ως μέσο ενεργοποίησης δραστικότητας κινάσης HER2. Αξίζει να σημειωθεί ότι, HER2 δεν έχει προφανή συνδέτες και βασίζεται σε σύνδεση με ερεγουλίνη δεσμεύεται HER3 για την ενεργοποίηση? HER3 δεν έχει κινάσης [5]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1β, HER2 ενεργοποιήθηκε με ερεγουλίνη, αλλά αυτό δεν άλλαξε σημαντικά την αλληλεπίδραση του HER2 με PUMA. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς lapatinib, το οποίο αναστέλλει την ενεργοποίηση του HER2 [29]. Η λαπατινίμπη μειωμένη ενεργοποίηση του HER2, αλλά επίσης δεν επηρέασε σημαντικά την αλληλεπίδραση του HER2 και PUMA (Σχήμα 1γ). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι HER2 μπορεί να αλληλεπιδρούν φυσικά με PUMA και αυτή η αλληλεπίδραση δεν εξαρτάται από δραστικότητα κινάσης της HER2.

α) SKBR3 και τα κύτταρα ΒΤ-474 λύθηκαν και συνολικής πρωτεΐνης υποβάλλονται σε ανοσοκαταβύθιση με είτε IgG ελέγχου ή HER2 αντισώματα ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν επίσης σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. β) MDA-MB-453 κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 16 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ερεγουλίνη (100 ng /mL) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα κατόπιν λύθηκαν και η συνολική πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση είτε με IgG ελέγχου ή αντισώματα HER2 ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν επίσης σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. γ) MDA-MB-453 κύτταρα επωάστηκαν με λαπατινίμπη (10 μΜ) για δύο ώρες. Τα κύτταρα κατόπιν λύθηκαν και η συνολική πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση είτε με IgG ελέγχου ή αντισώματα HER2 ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν επίσης σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. δ) Το μιτοχονδριακό (ΜΕ) και μη-μιτοχονδριακό εκχύλισμα (NME) απομονώθηκαν από ΒΤ-474 κύτταρα και οι δύο εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. ME και NME επίσης υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

PUMA εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια, καθώς περιέχει ένα σήμα εντοπισμού μιτοχονδριακό [12], [16], αλλά PUMA έχει επίσης παρατηρηθεί για την προαγωγή της απόπτωσης χωρίς μιτοχονδριακή εντοπισμός [15]. Επιπλέον, HER2 κυρίως εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος, αλλά έχει πρόσφατα βρεθεί ότι εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια όπου επηρεάζει τον κυτταρικό μεταβολισμό και προωθεί την αντίσταση του trastuzumab [30]. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα καθορίζονται, εφόσον PUMA και HER2 σωματικά αλληλεπιδρούν. Μιτοχονδριακή (ΜΕ) και μη μιτοχονδριακών εκχυλίσματα (NME) απομονώθηκαν από ΒΤ-474 κύτταρα και ανοσοκηλίδωση για α-τουμπουλίνης και COX IV επιβεβαιώνεται ότι υπάρχει αποτελεσματικός απομόνωση των μιτοχονδρίων και μη μιτοχονδριακών κλάσματα (Σχήμα 1δ). Σχήμα 1δ δείχνει ότι η PUMA και HER2 εντοπίστηκαν τόσο στην ME και το NME επιβεβαιώνοντας προηγούμενες παρατηρήσεις [30]. Παρά φόρτωση ίσων ποσοτήτων πρωτεΐνης (60 μg), εμφανίστηκε να είναι μεγαλύτερα επίπεδα PUMA και HER2 στο ME από το NME εκεί. Ωστόσο, αυτή η προφανής ανισορροπία οφείλεται στο γεγονός ότι το 60 μg είναι το 80% του ME συγκομίζονται, αλλά μόνο το 2% του NME συγκομιδή. Για τον προσδιορισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ HER2 και Puma, HER2 ανοσοκαταβυθίστηκε από ίσες ποσότητες του ME και NME ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση. Παρατηρήσαμε αλληλεπίδραση μεταξύ HER2 και PUMA τόσο στο ME και το NME (Σχήμα 1δ). Αυτά είναι τα πρώτα στοιχεία δείχνουν HER2 αλληλεπιδρά φυσικά με την PUMA και ότι αυτή η αλληλεπίδραση συμβαίνει μέσα και έξω από το μιτοχονδριακό διαμερίσματος.

HER2 φωσφορυλιώνει Άμεσα PUMA

Μετά την ανίχνευση μιας άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ HER2 και PUMA , είμαστε δίπλα καθοριστεί αν η PUMA θα μπορούσε να φωσφορυλιώνονται με HER2. Για το καλύτερο της γνώσης μας, φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον πρώτα PUMA μπορεί να φωσφορυλιωμένη τυροσίνη ενδοκυτταρικά, εμείς πέθαναν από κύτταρα HER2-υπερεκφράζουν για 16 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται τα κύτταρα με ή χωρίς ερεγουλίνης για την ενεργοποίηση HER2. Υποβάλαμε τα προϊόντα λύσης κυττάρων για IP /WB χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα PUMA για IP και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-φωσφο-τυροσίνης αντισώματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη PUMA ανιχνεύθηκε εύκολα σε κύτταρα ερεγουλίνη-διεγερμένα που εξέφραζαν ενεργοποιημένο φωσφορυλιωμένο HER2 (ρ-HER2). Ωστόσο, τα κύτταρα MCF-7, τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα HER2, δεν ανταποκρίθηκαν σε heregulin και δεν δείχνουν σημαντική φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA (Σχήμα 2β). Σε αντίθεση, MCF-7 κύτταρα με σταθερά, αναγκαστική υπερέκφραση του HER2 (κύτταρα MCF-7 /HER2) δείχνει φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA σε απόκριση ερεγουλίνης (σχήμα 2γ). Αυτά τα αποτελέσματα είναι η πρώτη που δείχνει ότι PUMA μπορεί να φωσφορυλιωθεί επί υπολειμμάτων τυροσίνης και αυτό συνέβη με HER2 διέγερση με ερεγουλίνη.

MDA-MB-453 (α), ή MCF-7 (β), ή MCF- 7 /(γ) κύτταρα HER2 επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 16 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ερεγουλίνη (100 ng /mL) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα κατόπιν λύθηκαν και η συνολική πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση είτε με IgG ελέγχου ή αντισώματα PUMA ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν επίσης σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη PUMA ανιχνεύθηκε με 4G10 φωσφο-τυροσίνη αντισώματα. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη PUMA υποβλήθηκε σε δοκιμασία HER2 κινάσης (όπως αναφέρεται στις Μεθόδους & amp? Υλικά) παρουσία ή απουσία λαπατινίμπη (δ) ή με την αύξηση των επιπέδων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης PUMA (ε). στ) Η ανασυνδυασμένη HER2 ανοσοκατακρημνίσθηκε με την παρουσία ή απουσία καθαρισμένων PUMA ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

επόμενο θέλαμε να προσδιοριστεί εάν θα μπορούσε να HER2 φωσφορυλιώνουν άμεσα PUMA. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε εμπορικά διαθέσιμα καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες PUMA και HER2 να εκτελέσει μια δοκιμασία κινάσης ελεύθερο κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2d, PUMA ήταν έντονα φωσφορυλιωμένο στα κατάλοιπα τυροσίνης παρουσία HER2. Όπως ήταν αναμενόμενο, HER2 υποβλήθηκαν σε αυτο-φωσφορυλίωση. Με την παρουσία του lapatinib, φωσφορυλίωση HER2 χάθηκε, και κατά συνέπεια, δεν υπήρχε φωσφορυλίωση τυροσίνης του PUMA. Παρατηρήσαμε επίσης μία αύξηση της δόσης-απόκρισης σε φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA με την αύξηση των επιπέδων της PUMA πρωτεΐνης παρουσία του HER2 (Σχήμα 2Ε). Χρησιμοποιώντας IP-WB, δείχνουμε ότι η περαιτέρω κυλιόμενο ανασυνδυασμένης HER2 επίσης οδηγεί σε κυλιόμενο καθαρισμένου PUMA (Σχήμα 2στ), επιβεβαιώνοντας HER2 συσχετίζει άμεσα με PUMA στο πλαίσιο του προσδιορισμού κινάσης ελεύθερο κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι η PUMA μπορούν να φωσφορυλιωθούν στα υπολείμματα τυροσίνης απ ‘ευθείας από το HER2.

HER2 φωσφορυλιώνει PUMA στο Three τυροσίνης

Μια αναζήτηση της ανθρώπινης αλληλουχίας πρωτεΐνης PUMA αποκάλυψε την παρουσία του τρία κατάλοιπα τυροσίνης, δηλαδή Y58, Y152, και Y172 (Σχήμα 3α). Και τα τρία κατάλοιπα τυροσίνης σε PUMA βρέθηκαν να είναι συντηρημένες σε πολλαπλές είδη θηλαστικών (Σχήμα 3α), υποδεικνύοντας αυτά τα υπολείμματα είναι δυνητικά λειτουργικά σημαντικές. Για να προσδιοριστεί ποια συγκεκριμένα κατάλοιπο τυροσίνης PUMA (ες) που HER2 φωσφορυλιώνει, πραγματοποιήσαμε τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση να μεταλλάσσονται κάθε τυροσίνη (Tyr? Υ) σε φαινυλαλανίνη (Phe? F) χρησιμοποιώντας έναν φορέα έκφρασης που φέρει ετικέτα ΗΑ-PUMA ως μήτρα. Φαινυλαλανίνη έχει την ίδια ομάδα R όπως τυροσίνη χωρίς οξυγόνο να δεσμεύει φωσφορικό και, ως εκ τούτου, δεν μπορούν να φωσφορυλιωθούν. Αυτά τα μεταλλάγματα PUMA (Y58F-, Y152F-, Y172F-PUMA), μαζί με άγριου τύπου PUMA (WT-PUMA), εκφράστηκαν σε κύτταρα, ανοσοκαταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα ΗΑ-tag, και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κινάσης HER2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, WT-PUMA έντονα φωσφορυλιώθηκε με ανασυνδυασμένη HER2 ενώ όλα τα μεταλλάγματα έδειξαν ένα χαμηλό επίπεδο φωσφορυλίωσης, υποδεικνύοντας ότι και οι τρεις τυροσίνες μπορούν να φωσφορυλιωθούν. Για να κατανοήσουμε πλήρως τις βιολογικές συνέπειες της φωσφορυλίωσης τυροσίνης PUMA δημιουργήσαμε ένα επιπλέον μεταλλαγμένο PUMA, μια τριπλή μετάλλαξη PUMA (TM-PUMA), στην οποία και οι τρεις τυροσίνες (Y58, Y152, Y172 και) έχουν μεταλλαχθεί σε φαινυλαλανίνη. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία HER2 κινάσης ελεύθερο κυττάρων (σχήμα 3β), WT-PUMA έδειξαν φωσφο-τυροσίνης ζώνες ενώ κανένα ανιχνεύθηκαν με TM-PUMA, υποδεικνύοντας το TM-PUMA δεν φωσφορυλιώνεται από HER2. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η TM-PUMA δεν μπορεί να είναι τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη λόγω της αδυναμίας της να αλληλεπιδρά με HER2, είμαστε δίπλα προσδιοριστεί αν TM-PUMA μπορεί να αλληλεπιδρούν φυσικά με HER2. IP /WB με HER2 αντίσωμα (Σχήμα 3γ) έδειξαν ότι HER2 αλληλεπίδρασε με τόσο WT-PUMA και TM-PUMA εξίσου υποδεικνύει την έλλειψη φωσφορυλίωσης TM-PUMA με HER2 δεν οφείλεται σε μειωμένη αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα στα Σχήματα 2 και 3 είναι η πρώτη απόδειξη ότι PUMA υφίσταται φωσφορυλίωση τυροσίνης και ότι HER2 μπορεί να φωσφορυλιώσει άμεσα PUMA.

α) Γραμμική αναπαράσταση της πρωτεΐνης PUMA με κάθε τυροσίνη, η περιοχή ΒΗ3, και μιτοχονδριακή σήμα εντοπισμού (MLS) τομέα που αναφέρεται (άνω πάνελ). Τυροσίνες 58, 152, και 172 στην πρωτεΐνη PUMA διατηρείται σε πολλαπλές είδη θηλαστικών, τα οποία υποδεικνύονται (κάτω πίνακας). β) άγριου τύπου ΗΑ-tagged πρωτεΐνες PUMA είχε μεταλλαχθεί έτσι ώστε κάθε τυροσίνη άλλαξε σε φαινυλαλανίνη (Y58F, Y152F, Y172F) ή όλα τα τυροσίνες μεταλλάχθηκαν (τριπλή μετάλλαξη: TM). Τα κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με WT-PUMA ή κάθε μεταλλάκτη PUMA και λύμα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκε ανοσοκαθίζηση είτε με IgG ελέγχου ή ΗΑ-κατευθυνόμενη αντισώματα. Μετά ανοσοκαταβύθιση, το προϊόν υποβλήθηκε σε δοκιμασία κινάσης HER2, όπως αναφέρεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. γ) WT-PUMA ή TM-PUMA διαμολύνθηκαν σε MDA-MB-453 κύτταρα. Τα κύτταρα λύθηκαν και συνολικής πρωτεΐνης υποβάλλονται σε ανοσοκαταβύθιση και ανοσοστύπωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν επίσης σε ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

TM-PUMA έχει μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής από ό, τι WT-PUMA

Είμαστε δίπλα θέλησε να προσδιορίσει αν η φωσφορυλίωση PUMA με HER2 αλλοιωμένη σταθερότητα PUMA. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την ημιζωή της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κυκλοεξιμίδη, η οποία αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεση που επιτρέπει την ανίχνευση του όταν αποικοδομούνται πρωτεΐνες. Κυκλοεξιμίδιο είναι μια κοινή μέθοδος για τον προσδιορισμό της σταθερότητας της πρωτεΐνης και αρκετές σχετικές εργασίες έχουν χρησιμοποιήσει αυτή τη μέθοδο τα τελευταία χρόνια [31] – [34]. Έτσι, HER2-υπερεκφράζουν MDA-MB-453 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κυκλοεξιμίδιο για έως και 16 ώρες με την παρουσία ή απουσία ερεγουλίνης για την ενεργοποίηση HER2. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4α, ερεγουλίνη επαγόμενη ενεργοποίηση HER2 σε αυτά τα κύτταρα και οδήγησε επίσης σε αυξημένη αποικοδόμηση πρωτεΐνης PUMA. Για να εξεταστεί περαιτέρω η σταθερότητα της Puma, αξιολογήσαμε PUMA ημίσειας ζωής χρησιμοποιώντας κύτταρα MCF-7, τα οποία έχουν χαμηλή έκφραση HER2, ή MCF-7 κύτταρα /HER2, τα οποία έχουν σταθερή υπερέκφραση του HER2. Το σχήμα 4b δείχνει ότι PUMA αποικοδομείται γρηγορότερα σε MCF-7 /HER2 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα MCF-7 που δείχνει υπερέκφραση του HER2 μειώνει σταθερότητα PUMA. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν ο χρόνος ημίσειας ζωής του ΤΜ-Puma, η οποία δεν μπορεί να είναι φωσφορυλιωμένη τυροσίνη, διαφέρει από εκείνη των WT-PUMA. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με WT-PUMA ή TM-PUMA ακολουθούμενη από κυκλοεξιμίδιο θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4c, τα επίπεδα WT-PUMA μειώθηκε σημαντικά κατά 16 ώρες ενώ τα επίπεδα ΤΜ-PUMA δεν μειώνονται σημαντικά. Μετά την ποσοτικοποίηση των σημάτων ζώνης PUMA και συνωμοτούν τους την πάροδο του χρόνου, βρήκαμε ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής για την WT-PUMA ήταν περίπου 7 ώρες, ενώ εκείνη του TM-PUMA ήταν περισσότερο από 16 ώρες. Έχει δειχθεί προηγουμένως ότι PUMA μπορεί να στοχεύεται στο πρωτεασώματος για την αποικοδόμηση [31]. Για να προσδιορίσετε αν WT-PUMA ή TM-PUMA ρυθμίζεται από το πρωτεασώματος, πραγματοποιήσαμε το πείραμα ημίσειας ζωής με την παρουσία του MG132 αναστολέα πρωτεασώματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4δ, παρατηρήσαμε ότι WT-PUMA ημίσειας ζωής θα μπορούσε να επεκταθεί με αναστολή του πρωτεασώματος επιβεβαιώνοντας προηγούμενα αποτελέσματα [31]. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν φωσφορυλίωση του HER2 μεσολάβηση μειώνει την ημιζωή του PUMA.

α) MDA-MB-453 κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 16 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ερεγουλίνη (100 ng /mL) και κυκλοεξιμίδιο (10 μg /mL). Ολόκληρο κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. β) MCF-7 και MCF-7 /κυττάρων HER2 επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 16 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ερεγουλίνη (100 ng /mL) και κυκλοεξιμίδιο (10 μg /mL). Ολόκληρο κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. c, d) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με HER2 και είτε WT-PUMA ή TM-PUMA. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 16 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ερεγουλίνη (100 ng /mL) και κυκλοεξιμίδιο (10 μg /ml) χωρίς (γ) ή με MG132 (10 μΜ) συν-θεραπεία (δ). Ολόκληρο κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε ανοσοστύπωμα με υποδεικνυόμενα αντισώματα. ε) τα κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με WT-PUMA ή TM-PUMA και μιτοχόνδρια απομονώθηκαν. ME και NME υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με υποδεικνυόμενα αντισώματα. στ) Chi-square πίνακες για ανάλυση δειγμάτων κλινικής καρκίνου. Med-High HER2 = 2-3 +. Χαμηλή HER2 = 0-1 +. ζ) Δείγμα IHC εικόνες από κλινικά δείγματα καρκίνου για υψηλή HER2 + Χαμηλή PUMA (περίπτωση 1) και Χαμηλής HER2 + Υψηλή PUMA (περίπτωση 2).

Η

επόμενο ρώτησε αν TM-PUMA διατηρεί την ικανότητα να υποστούν translocalization στα μιτοχόνδρια, όπου PUMA προάγει την απόπτωση. Έτσι, WT-PUMA ή TM-PUMA επιμολύνθηκαν σε κύτταρα που ακολουθείται από απομόνωση του ME και NME με επακόλουθη ανοσοκηλίδωση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4e δείχνει, TM-PUMA διατήρησαν την ικανότητα να υποβληθούν σε μιτοχονδριακό εντοπισμό. Επιπλέον, παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα TM-PUMA σε σύγκριση με το WT-PUMA στο ME, η οποία επιβεβαιώθηκε από τον υπολογισμό του mtPUMA Index (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) με αποτέλεσμα 3,3 φορές περισσότερες TM-PUMA στα μιτοχόνδρια από ό, τι WT-PUMA. Ένα υψηλότερο επίπεδο TM-PUMA στα μιτοχόνδρια είναι πιθανόν το αποτέλεσμα αυξημένη σταθερότητα της πρωτεΐνης του TM-PUMA πρωτεΐνης παρουσία του HER2. Μαζί, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η σταθερότητα της πρωτεΐνης PUMA μειώνεται με την ενεργοποίηση του HER2 και κλείδωμα φωσφορυλίωση τυροσίνης PUMA ενισχύει τη σταθερότητα PUMA και έχει ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη μιτοχονδριακή επίπεδα της PUMA.

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η σχέση αυτή διατηρείται

in vivo

, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία σε ένα σύνολο κλινικά δείγματα καρκίνου (n = 93) για την ανίχνευση και HER2 PUMA. Μετά βαθμολόγησης, χωρίσαμε τα δείγματα σε χαμηλή HER2 (0-1 + ένταση) ή μέτρια προς υψηλή HER2 (2-3 + ένταση). PUMA χωρίστηκε σε υψηλή PUMA (είτε ≥150 H-Score ή ≥100 H-Score) ή χαμηλή PUMA (είτε & lt? 150 H-Score ή & lt? 100 H-Score). Στη συνέχεια εκτελείται ένα chi-square ανάλυση για να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ HER2 και της έκφρασης PUMA (Σχήμα 4F). Η ανάλυση chi-square χρησιμοποιώντας είτε φράγμα PUMA (150 H-Score ή 100 H-Score) οδήγησε σε στατιστικά σημαντική (p = 0,045 και p = 0,027, αντίστοιχα). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν οι ιστοί με υψηλή έκφραση HER2 τείνουν να έχουν χαμηλότερη έκφραση PUMA

in vivo

(Εικόνα 4G) που υποστηρίζουν τα δεδομένα μας από τις κυτταρικές σειρές που HER2 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση PUMA.

TM-PUMA έχει ισχυρότερη επίδραση από WT-PUMA στην καταστολή κλωνογόνος Ανάπτυξης

Σχήμα 4 ανέφεραν ότι TM-PUMA είχε μεγαλύτερη σταθερότητα πρωτεΐνης και υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια, το οποίο μπορεί να υποδεικνύει ότι TM-PUMA έχει μια αυξημένη ικανότητα να προωθήσει την απόπτωση . Για να εξεταστεί η επίδραση του ΤΜ-PUMA στη βιωσιμότητα των κυττάρων, εκφράσαμε ένα άδειο φορέα, WT-PUMA ή TM-PUMA σε δύο διαφορετικά καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές HER2-υπερεκφράζουν, δηλαδή ΒΤ-474 (Σχήμα 5e) και MDA-MB-453 (Σχήμα 5F) κυττάρων, και παρακολουθήθηκε η ικανότητα αυτών των κυττάρων να σχηματίζουν αποικίες.