Abstract

αερόβια γλυκόλυση σε καρκινικά κύτταρα ρυθμίζεται από πολλαπλούς τελεστές που περιλαμβάνουν Akt και πυροσταφυλική κινάση Μ2 (PKM2). Η βλεννίνη 1 (MUC 1) είναι μια ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που παρεκκλίνοντα υπερεκφράζεται από την ανθρώπινη μαστού και άλλα καρκινώματα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ο μετασχηματισμός των ινοβλαστών αρουραίου από το ογκογόνο υπομονάδα MUC1-C συνδέεται με μεσολαβεί η ΑΚΤ αυξήσεις στην πρόσληψη της γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή, σύμφωνα με την διέγερση της γλυκόλυσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C συνδέεται άμεσα με PKM2 στο Β- και C-τομείς. Αλληλεπίδραση μεταξύ της MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή Cys-3 και το PKM2 C-τομέα Cys-474 βρέθηκε να διεγείρει δραστικότητα PKM2. Αντιστρόφως, υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μεσολάβηση φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C σε Tyr-46 ανατίθενται σύνδεση προς PKM2 Lys-433 και ανέστειλαν δραστικότητα PKM2. Σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού, αποσιώπηση MUC1-C συσχετίστηκε με μειώσεις στην πρόσληψη της γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή, επιβεβαιώνοντας εμπλοκή MUC1-C στην ρύθμιση της γλυκόλυσης. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του EGFR μεσολάβηση του MUC1-C σε καρκινικά κύτταρα του μαστού συνδέθηκε με μειώσεις στην δραστικότητα PKM2. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η υπομονάδα MUC1-C ρυθμίζει γλυκόλυση και ότι η απάντηση αυτή ανατίθεται εν μέρει από PKM2. Έτσι, η υπερέκφραση της MUC1-C ογκοπρωτείνης σε ποικίλα ανθρώπινα καρκινώματα θα μπορούσε να έχει σημασία για το αποτέλεσμα Warburg αερόβια γλυκόλυση

Παράθεση:. Kosugi Μ, Ahmad R, Alam Μ, Uchida Υ, Kufe D (2011) MUC1-C ογκοπρωτεΐνης Ρυθμίζει γλυκόλυση και πυροσταφυλική κινάση m2 δραστηριότητα στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (11): e28234. doi: 10.1371 /journal.pone.0028234

Επιμέλεια: Rebecca Berdeaux, Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστημών Υγείας Κέντρο στο Χιούστον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 4 Νοέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 28, Νοεμ, 2011

Copyright: © 2011 Kosugi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις CA97098, CA42802 και CA100707 απονέμεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: DK κατέχει μετοχές σε γένος Ογκολογίας και είναι σύμβουλος στην εταιρεία. Γένος Ογκολογίας κατέχει αιτήσεις για διπλώματα ευρεσιτεχνίας για τα πεπτίδια κυττάρου-διεισδυτική, όπως GO-203, εν λειτουργία μπλοκ MUC1-C και η εταιρεία έχει ένα σχετικό πεπτίδιο υπό κλινική ανάπτυξη. Δεν υπάρχουν στο εμπόριο προϊόντα να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα διακρίνονται από την κανονική τους ομολόγους τους από μεταβολικές διαφορές που περιλαμβάνουν αυξημένη χρησιμοποίηση της γλυκόζης από αερόβια γλυκόλυση. Αυτό το χαρακτηριστικό των κακοήθων κυττάρων, γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, συσχετίζει ένα υψηλό ποσοστό κατανάλωσης γλυκόζης με ενισχυμένη παραγωγή γαλακτικού παρουσία οξυγόνου [1]. Αερόβια γλυκόλυση σε καρκινικά κύτταρα έχει συνδεθεί με αυξημένη έκφραση του γλυκολυτικά γονίδια [2], [3]. πυροσταφυλική κινάση (ΡΚ) είναι ένα από τα προς τα πάνω ρυθμισμένη γλυκολυτικών γονιδιακά προϊόντα που καταλύει την παραγωγή του πυροσταφυλικού και του ΑΤΡ από φωσφοενολοπυροσταφυλικό (PEP) και ADP. Υπάρχουν τέσσερα ισοένζυμα PK, Μ1, Μ2, L και R. Το Μ1 ισομορφή εκφράζεται στα περισσότερα ενήλικα κύτταρα. Η ισομορφή Μ2 (PKM2), μια παραλλαγή ματίσματος του Μ1, βρίσκεται σε εμβρυονικά κύτταρα, ορισμένα φυσιολογικά κύτταρα πολλαπλασιαζόμενα και καρκινικά κύτταρα [4]. Ετερογενή πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτείνες συνδέονται με PKM1 mRNA και παρεμποδίζουν μάτισμα του [5]. Μετατρέποντας έκφραση PKM2 να PKM1 στα καρκινικά κύτταρα αντιστρέφει το αποτέλεσμα Warburg και σχετίζεται με την απώλεια ογκογένεσης, προσδιορίζει τη σημασία του PKM2 για αερόβια γλυκόλυση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [6]. Η διακριτή περιοχή του PKM2, σε σύγκριση με PKM1, λειτουργίες στην ενεργοποίηση αλλοστερική του ενζύμου με φρουκτόζη-1,6-διφωσφορικής (FBP) [7] και την αδρανοποίηση του από φωσφοτυροσίνη πρωτεΐνες που περιέχουν [8], [9]. Υπό αυτές τις συνθήκες, η ρύθμιση της δραστικότητας PKM2 υπαγορεύει το μεταβολισμό της γλυκόζης σε πυροσταφυλικό, το οποίο μετατρέπεται από γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) σε γαλακτικό ή χρησιμοποιείται από το μιτοχονδριακό τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) κύκλος [10]. Αυτά τα ευρήματα υποστήριξαν έτσι την ανάγκη να κατανοήσουν πληρέστερα τα σήματα που ρυθμίζουν αερόβια γλυκόλυση και τη δραστηριότητα PKM2 σε κακοήθη κύτταρα.

Η βλεννίνη 1 πρωτεΐνης (MUC1) υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκινωμάτων και ορισμένων αιματολογικές κακοήθειες, καθιστώντας ένα από τα πιο κοινά μεταβολές σε ανθρώπινους καρκίνους [11]. MUC1 εκφράζεται ως δύο υπομονάδες που σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές στην κυτταρική μεμβράνη. Η μεγάλη MUC1 Ν-τερματική υπομονάδα (MUC1-Ν) είναι τοποθετημένη εξωκυτταρικά και περιέχει τις γλυκοσυλιωμένες διαδοχικές επαναλήψεις που είναι χαρακτηριστικές της οικογένειας βλεννίνης. Η MUC1 Ο-τερματικό υπομονάδα (MUC1-C) καλύπτει την κυτταρική μεμβράνη και περιέχει μια 58 αμινοξέων εξωκυτταρικό τομέα και ένα 72 αμινοξέων cytoplamic τομέα [11]. Το εξωκυτταρικό πεδίο MUC1-C αλληλεπιδρά με γαλεκτίνης-3 και με τον τρόπο αυτό σχηματίζει σύμπλοκα στην κυτταρική επιφάνεια με τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [12]. Η ενεργοποίηση του EGFR είναι με τη σειρά του συνδέεται με τη φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C [11]. Σημαντικά, η υπερέκφραση της υπομονάδας MUC1-C, και ειδικότερα της κυτταροπλασματικής περιοχής, είναι επαρκής για να επάγει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και ογκογονικότητα [13], [14]. Με υπερέκφραση της MUC1 σε καρκινικά κύτταρα, η υπομονάδα MUC1-C συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και απευθύνεται στον πυρήνα, όπου συμβάλλει στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [11]. Από αυτή την άποψη, MUC1-C-επαγόμενη μεταμόρφωση συνδέεται με την ενεργοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται με τον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση [15], [16]. MUC1-C προκαλεί επίσης μια υπογραφή που σχετίζεται με το μεταβολισμό των λιπιδίων και την προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που ρυθμίζουν τη σύνθεση της χοληστερόλης οξύ και λιπαρά [17]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι MUC1-C ενεργοποιεί την PI3K- & gt? Akt μονοπάτι [18], [19], η οποία με τη σειρά της διεγείρει δραστικότητα του γλυκολυτικών ενζύμων, εξοκινάση και phosphofructose κινάσης. Υπάρχει, ωστόσο, δεν είναι γνωστό σύνδεση μεταξύ MUC1-C και της γλυκολυτικής οδού.

Οι παρούσες μελέτες αποδεικνύουν ότι MUC1-C εμπλέκεται στη ρύθμιση της πρόσληψης γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγής σε MUC1-C-επαγόμενη μεταμόρφωση του αρουραίος ινοβλάστες και σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C αλληλεπιδρά άμεσα με PKM2 και ρυθμίζει δραστηριότητα PKM2. Η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C περιέχει ένα κατάλοιπο Cys που δεσμεύεται με την PKM2 C-τομέα Cys-474 και διεγείρει δραστικότητα PKM2. Αντίθετα, ο EGFR-φωσφορυλιωμένο MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή αλληλεπιδρά με τον PKM2 C-πεδίου σε Lys-433 και αναστέλλει PKM2. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η υπερέκφραση της MUC1-C σε καρκινικά κύτταρα συμβάλλει στη ρύθμιση της αερόβιας γλυκόλυσης.

Αποτελέσματα

MUC1-C-επαγόμενη μεταμόρφωση συνδέεται με την επαγωγή της αερόβιας γλυκόλυσης

Η υπομονάδα MUC1-C αποτελείται από ένα εξωκυτταρικό πεδίο 58 αμινοξέων (αα), μια διαμεμβρανική περιοχή 28 aa και 72 aa κυτταροπλασματική περιοχή (Εικ. 1Α). Η έκφραση του MUC 1-C κυτταροπλασματική περιοχή (MUC1-CD) σε 3Υ1 ινοβλάστες σχετίζεται με την επαγωγή του σχηματισμού αποικιών σε μαλακό άγαρ και σχηματισμό όγκων σε γυμνούς ποντικούς [13], [14]. Στις παρούσες μελέτες, βρήκαμε ότι MUC1-CD-επαγόμενη μεταμόρφωση του 3Υ1 κύτταρα συνδέεται με μια αύξηση στην πρόσληψη γλυκόζης (Σχ. 1Β) και γαλακτικό παραγωγής (Σχ. 1 C), σύμφωνα με την διέγερση της γλυκόλυσης. Για να αξιολογηθεί, εν μέρει τουλάχιστον, η βάση για αυτή την αντίδραση, μελέτες πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί επιδράσεις στην PKM2. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρξε σημαντική αύξηση της δραστηριότητας PKM2 στην MUC 1-CD μετασχηματισμένο 3Υ1 ινοβλάστες (Σχ. 1D). 3Υ1 /φορέα κύτταρα εκφράζουν PKM2, αλλά όχι PKM1, και MUC1-CD-επαγόμενη μεταμόρφωση δεν είχε εμφανή επίδραση στα επίπεδα PKM2 (Εικ. 1 Ε). Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η δραστηριότητα PKM2 αναστέλλεται με φωσφορυλίωση επί Tyr-105 σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα [9]. MUC1-CD-επαγόμενη μεταμόρφωση δεν συνδέθηκε με μια αλλαγή στην φωσφορυλίωση της Tyr-105 (Εικ. 1 F). Επιπλέον, δεν υπήρχε εμφανής κυτταρική ανακατανομή των PKM2 όπως προσδιορίζεται με ομοεστιακό μικροσκόπιο (Εικ. S1). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση Akt όπως προσδιορίζεται με φωσφορυλίωση σε Ser-473 αυξάνεται σε κύτταρα 3Υ1 /MUC1-CD, σε σύγκριση με αυτή που βρίσκεται στο 3Υ1 /φορέα κύτταρα [18]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η αύξηση της ρ-Akt είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του PKM2, εμείς σιγήσει Akt στην 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 /MUC1-CD κύτταρα (Σχ. 1 g) και μετράται η πρόσληψη γλυκόζης, γαλακτικό παραγωγή και τη δραστηριότητα PKM2. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι φίμωση Akt μειώνει πρόσληψη γλυκόζης τόσο 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 /MUC1-CD κύτταρα (Σχ. 1, αριστερά). Επιπλέον, φίμωση Akt στην 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 κύτταρα /MUC1-CD συσχετίστηκε με μερική μειώσεις στην παραγωγή γαλακτικού (Σχ. 1, δεξιά). Αντίθετα, φίμωση Akt είχε μικρή έως και καθόλου επίδραση στην δραστικότητα PKM2 στα κύτταρα 3Υ1 /MUC1-CD (Εικ. 1θ), υποδεικνύοντας ότι MUC1-CD-διαμεσολαβούμενη επαγωγή της PKM2 δεν εξαρτάται από Akt ενεργοποίηση.

ΈΝΑ. Δομή του MUC1-C υπομονάδας με την εξωκυτταρική περιοχή (ED), διαμεμβρανική περιοχή (ΤΜ) και την αλληλουχία αμινοξέων της κυτταροπλασματικής περιοχής (MUC1-CD). Το μοτίβο CQC και η θέση φωσφορυλίωσης του EGFR τονίζονται. Β και C. 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 /MUC1-CD κύτταρα αναλύθηκαν για πρόσληψη γλυκόζης (Β) και παραγωγή γαλακτικού (C). Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD από πέντε ξεχωριστά πειράματα το καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως nmol /10

6 κύτταρα. Δ Κυτταρολύματα από αρουραίο 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 κύτταρα /MUC1-CD αναλύθηκαν για δραστικότητα PKM2. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που ελήφθη στο 3Υ1 κύτταρα /φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1). t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ρ-τιμές. Ε και F. Προϊόντα λύσεως από 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 κύτταρα /MUC1-CD ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. G-I. 3Υ1 /φορέα και 3Υ1 κύτταρα /MUC1-CD επιμολύνονται με siRNA ελέγχου ή πισίνες για 72 ώρες Akt siRNA. Τα υλικά λύσεως από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-Ακί και αντι-β-ακτίνης (G). Τα αναφερόμενα κύτταρα αναλύθηκαν για πρόσληψη γλυκόζης (Η, αριστερά) και παραγωγή γαλακτικού (Η, δεξιά). Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών αντιγράφων) εκφράζονται ως nmol /10

6 κύτταρα. Τα υλικά λύσεως από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα αναλύθηκαν επίσης για την δραστικότητα PKM2 (Ι). Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών αντιγράφων) εκφράζονται ως δραστικότητα σε σχέση PKM2 σε σύγκριση με εκείνο που λαμβάνεται σε κύτταρα 3Υ1 /φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1).

Η

MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή Cys-3 υπόλειμμα αλληλεπιδρά με PKM2

Για να προσδιορίσετε αν MUC1-CD αλληλεπιδρά με PKM2 και ως εκ τούτου επηρεάζει τη δραστηριότητά της, οι μελέτες Συνανοσοκατακρήμνιση πραγματοποιήθηκαν με λύματα 3Υ1 /MUC1-CD κυττάρων. Ανάλυση της αντι-PKM2 καθιζάνει με ανοσοστύπωμα με αντι-MUC1-C υποστήριξε την ένωση αυτών των πρωτεϊνών (Σχ. 2Α). Σε πειράματα pull-down GST, η επώαση των 3Υ1 κυτταρολυμάτων /φορέα με GST και GST-MUC1-CD παρείχαν περαιτέρω υποστήριξη για μια αλληλεπίδραση μεταξύ PKM2 και MUC1-CD (Εικ. 2Β). Για την επέκταση αυτές τις παρατηρήσεις σε κύτταρα που εκφράζουν ενδογενή MUC1, μελέτες Συνανοσοκατακρήμνιση πραγματοποιήθηκαν σε προϊόντα λύσης από ανθρώπινο ZR-75-1 κύτταρα καρκίνου του μαστού. Εδώ, PKM2 ήταν ανιχνεύσιμη σε σύμπλοκα με το kDa MUC1-C υπομονάδα (Σχ. 2C) 25-20. πειράματα pull-down με λύματα κυττάρων ZR-75-1 κατέδειξε επίσης δέσμευση του MUC1-CD για να PKM2 (Εικ. 2D). Μελέτες με μεταλλάκτες MUC1-CD διαγραφή έδειξε επίσης ότι η συνεργασία με PKM2 ανατίθεται από MUC1-CD (1-45) και όχι MUC1-CD (46-72) (Εικ. 2D). Η επώαση των GST-MUC1-CD με καθαρισμένο ανασυνδυασμένο His-tagged PKM2 επιβεβαίωσε άμεση δέσμευση του MUC1-CD και PKM2 (Σχ. 2Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι MUC1-CD (1-45) και δεν MUC1-CD (46-72) είναι υπεύθυνη για την άμεση αλληλεπίδραση (Σχ. 2Ε). MUC1-CD περιέχει ένα μοτίβο CQC (αα 1-3) που συμβάλλει στο σχηματισμό της MUC1-C ομοδιμερή (Εικ. 1Α) [20]. Μετάλλαξη του CQC μοτίβο με AQA (C1A /C3A) μπλοκαριστεί δέσμευση της MUC1-CD για να PKM2 (Σχ. 2F). Η δέσμευση του MUC1-CD να PKM2 επίσης καταργήθηκε με την C3A, και όχι ο C1A, μεταλλαγμένο, δεικνύοντας ότι Cys-3 είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση (Σχ. 2F). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η MUC1-C συνεργάτες με PKM2 στα κύτταρα μέσω μιας άμεσης αλληλεπίδρασης διαμεσολαβείται από την MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή καταλοίπων Cys-3.

Α. Τα προϊόντα λύσης από κύτταρα 3Υ1 /MUC1-CD υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με ένα IgG ελέγχου ή αντι-PKM2. Τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. B. Προϊόντα λύσης από 3Υ1 κύτταρα /φορέα επωάστηκαν με GST ή GST-MUC1-CD. Οι ουσίες που απορροφούνται σε σφαιρίδια γλουταθειόνης ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PKM2. Είσοδος των πρωτεϊνών GST αξιολογήθηκε με χρώση με Coomassie blue. C. Προϊόντα λύσεως από ανθρώπινο ZR-75-1 κύτταρα καρκίνου του μαστού ανοσοκαταβυθίστηκαν με έλεγχο IgG ή αντι-PKM2. Τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Δ ZR-75-1 κυτταρολύματα επωάστηκαν με GST, GST-MUC1-CD και τις υποδεικνυόμενες μεταλλάξεις GST-MUC1-CD διαγραφή. Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PKM2. Είσοδος των πρωτεϊνών GST αξιολογήθηκε με χρώση με Coomassie blue. Ε PKM2 επωάστηκε με GST, GST-MUC1-CD και τις υποδεικνυόμενες μεταλλάξεις GST-MUC1-CD διαγραφή. Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PKM2. ΣΤ PKM2 επωάστηκε με GST, GST-MUC1-CD και τις υποδεικνυόμενες μεταλλάξεις GST-MUC1-CD στην οποία Cys-1 και /ή Cys-3 υποκαταστάθηκαν με Ala. Τα προϊόντα απορρόφησης ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PKM2.

MUC1-CD συνδέεται άμεσα με την PKM2 Β-περιοχή Cys-165 και C-περιοχή Cys-474

PKM2 αποτελείται από μία Ν-άκρο (αα 1-43), A1-πεδίο (αα 44-116), Β-περιοχή (αα 117 έως 218), Α2-πεδίο (αα 219-389) και C-πεδίο (αα 390 – 531) [7] (Σχ. 3Α). Η δέσμευση του MUC1-CD ήταν ανιχνεύσιμη με PKM2 (1-218) και PKM2 (390-531), αλλά όχι με PKM2 (219 – 389) (Εικ. 3Β). Περαιτέρω ανάλυση με PKM2 (1-218) μεταλλάξεις διαγραφής έδειξαν ότι MUC1-CD συνδέεται άμεσα με την Β-περιοχή (αα 117-218) και όχι το Ν-άκρο (αα 1-43) ή Α1-πεδίο (αα 44 έως 116 ) (Σχ. 3C). Η PKM2 Β-περιοχή περιέχει δύο κυστεΐνες στις θέσεις 152 και 165. Μετάλλαξη του PKM2 (117-218) Cys-152 σε Αία (C152A) δεν είχε καμία επίδραση στην αλληλεπίδραση με MUC 1-CD (Σχ. 3D, αριστερά). Αντίθετα, η σύνδεση του MUC1-CD και PKM2 (117-218) καταργήθηκε με μετάλλαξη Cys-165 σε Αία (C165A) (Σχ. 3D, δεξιά). Όσον αφορά την PKM2 C-τομέα (αα 390-531), τα υπολείμματα Cys που βρίσκονται στις θέσεις 423, 424 και 474. Η δέσμευση της MUC1-CD να PKM2 (390-531) δεν επηρεάστηκε από τη μετάλλαξή Cys-423 σε Αία ( C423A) (Σχ. 3Ε, αριστερά) ή Cys-424 σε Αία (C424A) (Σχ. 3Ε, μέση). Ωστόσο, η αλληλεπίδραση με MUC1-CD εξασθένισε με μετάλλαξη της PKM2 (390-531) κατάλοιπο Cys-474 σε Αία (C474A) (Σχ. 3Ε, δεξιά). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι οι MUC1-CD Cys-3 υπόλειμμα δεσμεύεται άμεσα με (i) την PKM2 Β-περιοχή Cys-165, και (ii) το PKM2 C-τομέα Cys-474.

A. Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης PKM2 με το Ν-άκρο (Ν) και το Α1, Β-, Α2- και C-τομείς. Επισημασμένο είναι η Cys-165 και τα κατάλοιπα Cys-474. Β και C. MUC1-CD επωάστηκε με GST και τις υποδεικνυόμενες GST-PKM2 μεταλλάξεις διαγραφής. Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C. Είσοδος των πρωτεϊνών GST αξιολογήθηκε με χρώση με Coomassie blue. Δ MUC1-CD επωάστηκε με GST, GST-PKM2 (117-218) και GST-PKM2 (117-218) με τα υποδεικνυόμενα C152A και C165A μεταλλάξεις. Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C. Ε MUC1-CD επωάστηκε με GST, GST-PKM2 (390-531) και GST-PKM2 (390-531) με την υποδεικνυόμενη C423A, C424A και μεταλλάξεις C474A. Οι ουσίες που απορροφούνται από ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C.

Η

φωσφορυλιωμένη MUC1-CD συνδέεται με το PKM2 C-τομέα Lys-433

Η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C είναι φωσφορυλιωμένη σε Tyr -46 με EGFR (Εικ. 1Α) [21]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι ορισμένα πεπτίδια φωσφοτυροσίνης αλληλεπιδρούν με το PKM2 C-τομέα και αναστέλλουν τη δράση της [8]. Για να προσδιορίσετε αν φωσφορυλιωμένη τυροσίνη MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή συνδέεται με PKM2, επωάσαμε πρώτη MUC1-CD και MUC1-CD (Y46F) με EGFR και ΑΤΡ. Ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης με ανοσοστύπωμα με αντι-Ρ-ΤγΓ επιβεβαίωσε φωσφορυλίωση επί Tyr-46 (Σχ. 4Α, αριστερά). Όπως διαπιστώθηκε με MUC1-CD, επώαση του ρ-MUC1-CD με τις μεταλλάξεις διαγραφής PKM2 αποδειχθεί σύνδεση προς PKM2 (1-218) και PKM2 (390-531) (Σχ. 4Α, δεξιά). Η σύνδεση του ρ-MUC1-CD ήταν επίσης ανιχνεύσιμη με PKM2 (390 – 531 /C474A) (Εικ. 4Β), υποστηρίζοντας μια αλληλεπίδραση που δεν διαμεσολαβείται από το υπόλειμμα PKM2 Cys-474. Να επεκτείνει αυτές τις παρατηρήσεις, το μεταλλαγμένο MUC1-CD (C3A), η οποία στερείται δέσμευσης σε PKM2, υποβλήθηκε σε φωσφορυλίωση του EGFR. Σύγκριση των MUC1-CD (C3A) και ρ-MUC1-CD (C3A) επιβεβαίωσε ότι η φωσφορυλίωση του EGFR επάγει σύνδεση προς PKM2 (390 – 531) (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν επίσης σε πειράματα στα οποία πρόσδεση του πλήρους μήκους PKM2 ήταν ανιχνεύσιμη με ρ-MUC1-CD (C3A) και όχι MUC1-CD (C3A) (Εικ. 4D). Η PKM2 C-περιοχή περιέχει ένα κατάλοιπο Lys-433 που είναι απαραίτητη για το πεπτίδιο φωσφοτυροσίνης δεσμευτική [8]. Πράγματι, μετάλλαξη του PKM2 (390-531) Lys-433 σε γλουταμικό (K433E) μερικώς μειωμένη σύνδεση του ρ-MUC1-CD (Εικ. 4Ε). Η επώαση των προϊόντων λύσης των κυττάρων ZR-75-1 με GST-PKM2 (390-531) και GST-PKM2 (390-531 /K433E) κατέδειξε περαιτέρω ότι η δέσμευση σε ενδογενή MUC1-C είναι εν μέρει μειώθηκε κατά την μετάλλαξη K433E (Σχ. 4F) . Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση της MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή Tyr-46 υπολείμματος προσδίδει δεσμευτική για την PKM2 C-τομέα σε Lys-433.

Α. His-tagged MUC1-CD και MUC1-CD (Y46F) επωάστηκαν με EGFR απουσία και παρουσία ΑΤΡ. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-Ρ-ΤγΓ και αντι-MUC1-C (αριστερά). GST και τα αναγραφόμενα GST-PKM2 μεταλλάξεις απαλοιφής επωάστηκαν με EGFR-φωσφορυλιωμένη MUC1-CD (ρ-MUC1-CD) (δεξιά). Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C. Είσοδος των πρωτεϊνών GST αξιολογήθηκε με χρώση με Coomassie blue. Β GST και GST-PKM2 (390 – 531 /C474A) επωάστηκαν με MUC1-CD ή ρ-MUC1-CD. Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C. C. GST και GST-PKM2 (390 – 531) επωάστηκαν με MUC1-CD (C3A) ή EGFR-φωσφορυλιωμένη ρ-MUC1-CD (C3A). Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C. Δ PKM2 επωάστηκε με GST, GST-MUC1-CD (C3A) και EGFR-φωσφορυλιωμένη GST-ρ-MUC1-CD (C3A). Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC 1-C και αντι-ρ-Tyr. Ε και F. GST, GST-PKM2 (390-531) και GST-PKM2 (390-531 /K433E) επωάστηκαν με ρ-MUC1-CD (Ε) ή κυτταρικό λύμα ZR-75-1 (F). Οι ουσίες που απορροφούνται ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C.

Η

Η διέγερση της δραστηριότητας PKM2 με MUC1-CD Cys-3

PKM2 είναι αλλοστερικά ενεργοποιείται με σύνδεση του FBP στο Ο-πεδίο [7]. Από δυναμικό λειτουργική σημασία στην αλληλεπίδραση μεταξύ MUC1-CD και PKM2, επώαση του MUC1-CD με PKM2 συσχετίστηκε με μια μέτρια διέγερση της δραστικότητας PKM2 (Εικ. 5Α, αριστερά). MUC1-CD-επαγόμενη διέγερση του PKM2 εξαρτιόταν από τους MUC1-CD Cys-3 μοτίβο στην εν λόγω MUC1-CD (C3A) δεν είχε εμφανή επίδραση στη δραστηριότητα PKM2 (Εικ. 5Α, δεξιά). Όπως φαίνεται προηγουμένως [7], FBP ήταν αποτελεσματική στη διέγερση της δραστηριότητας PKM2 (Εικ. 5Β). Επιπλέον, η προσθήκη των δύο FBP και MUC1-CD είχε ως αποτέλεσμα τουλάχιστον μια αύξηση πρόσθετο (Σχ. 5Β), υποδεικνύοντας ότι MUC1-CD μπορούν να προωθήσουν την ενεργοποίηση PKM2 FBP που προκαλείται. Για την επέκταση αυτών των παρατηρήσεων, επωάσαμε PKM2 με GO-203, ένα πεπτίδιο που περιέχει πολυ-Arg ([R]

9) και το CQCRRKN ​​αλληλουχία MUC1-CD που περιέχει το υπόλειμμα Cys-3 που δείχθηκε παραπάνω, για να δεσμεύουν PKM2 ( Σχ. 5C). GO-203 ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματικό στη διέγερση δραστικότητας PKM2, ενώ ένα πεπτίδιο ελέγχου, που ορίζεται CP-2, στο οποίο το κατάλοιπο Cys-3 υποκαταστάθηκε με Αία (AQARRKN) είχαν μικρή επίδραση (Εικ. 5C). Επιπλέον, η μετάλλαξη του PKM2 Cys-474, αλλά όχι Cys-165, σε Αία οδήγησε σε κατάργηση της GO-203 που προκαλείται από αυξήσεις στη δραστικότητα PKM2 (Σχ. 5D). Η επώαση των PKM2 τόσο με FBP και GO-203 κατέδειξε επίσης ότι GO-203 είναι πρόσθετο με FBP στην επαγωγή της δραστηριότητας PKM2 (Σχ. 5Ε). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των MUC1-CD Cys-3 υπόλειμμα και PKM2 Cys-474 διεγείρει τη δραστηριότητα PKM2.

Α. Η ανασυνδυασμένη PKM2 επωάστηκε απουσία και παρουσία των αναφερομένων συγκεντρώσεων της MUC1-CD (αριστερά) ή MUC1-CD (C3A) (δεξιά) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από πέντε ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα. B. PKM2 επωάστηκε με τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του FBP μόνο, MUC1-CD μόνο, ή FBP και MUC1-CD. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα. ακολουθίες Γ αμινοξέων των GO-203 και CP-2 πεπτίδια. PKM2 επωάστηκε με 100 μΜ GO-203 ή CP-2. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από πέντε ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα. Δ PKM2 και τις δεικνυόμενες μεταλλάκτες PKM2 επωάστηκαν εν απουσία (ανοικτές ράβδοι) και παρουσία 100 μΜ GO-203 (συμπαγείς ράβδοι). Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται απουσία του GO-203. Ε PKM2 επωάστηκε με τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του FBP μόνο, GO-203 μόνο, ή FBP και GO-203. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα.

Η

φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη MUC1-CD αναστέλλει δραστικότητα PKM2

η δέσμευση του τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη πεπτιδίων στο PKM2 C-πεδίου συνδέεται με την αναστολή της PKM2 [8]. Συνεπώς, συγκρίναμε τα αποτελέσματα της MUC1-CD και EGFR-φωσφορυλιωμένη ρ-MUC1-CD στη δραστηριότητα PKM2. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, FBP επαγόμενη διέγερση του PKM2 αυξήθηκε κατά MUC1-CD (Σχ. 6Α). Συγκριτικά, φωσφορυλιωμένη ρ-MUC1-CD ήταν αναποτελεσματική στην αύξηση της δραστηριότητας PKM2 (Σχ. 6Α). Οι μελέτες αυτές με ρ-MUC1-CD, ωστόσο, περιπλέκεται από την πιθανότητα για τόσο διεγερτικές επιδράσεις του Cys-3 και ανασταλτικά αποτελέσματα του ρ-Tyr-46. Κατά συνέπεια, τα πειράματα διεξήχθησαν με τον μεταλλαγμένο MUC 1-CD (C3A), το οποίο είναι αναποτελεσματικό στη διέγερση PKM2. Εδώ, MUC1-CD (C3A) δεν είχε εμφανή διεγερτική επίδραση και EGFR-φωσφορυλιωμένη MUC1-CD (C3A) καταστέλλεται δραστηριότητα PKM2 (Σχ. 6Α). Ως μάρτυρας, ο MUC1-CD (Y46F) μετάλλαξη που είχαν επωαστεί με EGFR και ΑΤΡ είχε μικρό εάν έχει αποτέλεσμα (Σχ. 6Α). Για την επιβεβαίωση αυτών των παρατηρήσεων, συνθέσαμε πεπτίδια που αντιστοιχούν στον έλεγχο και EGFR-φωσφορυλιωμένη MUC1-CD Tyr-46 (YEKV) μοτίβο (Εικ. 6Β). Το πεπτίδιο φωσφο-Tyr-46, αλλά όχι το μη φωσφορυλιωμένη μορφή, αναστέλλεται δραστικότητα PKM2 (Εικ. 6C). Πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης με GO-203 μόνο και σε συνδυασμό με το πεπτίδιο φωσφο-Tyr-46. Υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες, GO-203-επαγόμενη διέγερση της δραστικότητας PKM2 δεν επηρεάστηκε από την φωσφο-Tyr-46 πεπτίδιο (Εικ. 6D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο EGFR-μεσολάβηση φωσφορυλίωση της MUC1-CD στο μοτίβο YEKV αναστέλλει τη δράση PKM2 και ότι GO-203-διέγερση των PKM2 δεν είναι αποκλεισμένη από αυτόν τον μηχανισμό.

Α. PKM2 επωάστηκε με 10 μΜ ΡΒΡ σε απουσία (έλεγχος) και παρουσία 10 μΜ μη φωσφορυλιωμένου EGFR και φωσφορυλιωμένη MUC1-CD, MUC1-CD (C3A) και MUC1-CD (Y46F). Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα. Β αλληλουχίες των Tyr-46 και φωσφο-Tyr-46 πεπτίδια. Γ PKM2 επωάστηκε με 10 μΜ ΡΒΡ σε απουσία (έλεγχος) και παρουσία 100 μΜ φωσφο-Tyr-46 πεπτιδίου ή Tyr-46 πεπτιδίου. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα. Δ PKM2 επωάστηκε υπό την απουσία (έλεγχος) και παρουσία 20 μΜ GO-203 μόνο, 100 μΜ φωσφο-Tyr-46 πεπτίδιο μόνο ή GO-203 με φωσφο-Tyr-46 πεπτιδίου. Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με το μάρτυρα.

Η

MUC1-C προάγει αερόβια γλυκόλυση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού

Για να προσδιορίσετε αν ενδογενούς MUC1-C επηρεάζει γλυκόλυση, μελετήσαμε ZR-75-1 και MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού με σταθερή αποσιώπηση της έκφρασης MUC1-C (Σχ. 7Α). Προς τα κάτω ρύθμιση της MUC1-C δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα PKM2 ή φωσφορυλίωση επί Tyr-105 (Εικ. 7Α). Σημαντικά, η ανάλυση των δύο ZR-75-1 και MCF-7 κύτταρα έδειξαν ότι αποσιώπηση MUC1-C συνδέεται με μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης (Σχ. 7Β) και μειωμένη παραγωγή γαλακτικού (Σχ. 7C), υποδεικνύοντας ότι MUC1-C προάγει γλυκόλυση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Εκτός από την καταστολή της γλυκόλυσης, φίμωση MUC1-C παρέχει μειώσεις στα ZR-75-1 και MCF-7 σχηματισμού αποικίας (Σχ. 7D).

A. Κυτταρολύματα από ZR-75-1 και MCF-7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερώς μια κενή φορέας ή ένας MUC1siRNA ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. B. Η υποδεικνυόμενη κύτταρα αναλύθηκαν για πρόσληψη γλυκόζης. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως nmol /10

6 κύτταρα. C. Η υποδεικνυόμενη κύτταρα αναλύθηκαν για παραγωγή γαλακτικού. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως παραγωγή σε σχέση γαλακτικού σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1). D. Η υποδεικνυόμενη κύτταρα απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από επώαση για 14 ημέρες. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD από δύο ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν) εκφράζονται ως ο αριθμός των αποικιών σε σχέση με εκείνη που λαμβάνεται με ZR-75-1 ή MCF-7 κυττάρων που εκφράζουν ένα άδειο φορέα (κάθε αποδίδεται τιμή του 1).

επιπτώσεις της MUC1-C στη δραστηριότητα PKM2 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού

οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί αν το αποτέλεσμα της MUC1-C σε αερόβια γλυκόλυση στα κύτταρα του καρκίνου του μαστού συνδέεται με τις αλλαγές στην δραστηριότητα PKM2. Στις 24 ώρες μετά τη διέλευση του ZR-75-1, η δραστικότητα PKM2 μειώθηκε με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης MUC1-C (8Α Σχ., Αριστερά). Αντίθετα, στις 72 ώρες καλλιέργειας, φίμωση MUC1-C συσχετίστηκε με μία αύξηση στην δραστηριότητα PKM2 (8Α Σχ., Αριστερά). Οι παρατηρήσεις αυτές αντιστοιχούσε με την αύξηση του βαθμού της φωσφορυλίωσης τυροσίνης MUC1-C 24 μέχρι 72 ώρες καλλιέργειας (Σχ. 8Α, δεξιά). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα MCF-7 (Σχ. 8Β, αριστερά και δεξιά), υποδεικνύοντας ότι η MUC1-C κατάσταση φωσφορυλίωσης τυροσίνης συμβάλλει στη ρύθμιση της PKM2. Σε αυτή τη συλλογιστική, έγιναν μελέτες για να αξιολογήσουν τις επιπτώσεις της διέγερσης EGF. Κατεργασία των MCF-7 /φορέα κυττάρων με EGF σχετίστηκε με μια αύξηση στην φωσφορυλίωση της MUC1-C σε τυροσίνη (Σχ. 8C, αριστερά). Επιπλέον, EGF διέγερση των MCF-7 /φορέα, αλλά όχι MCF-7 /MUC1siRNA, τα κύτταρα οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση της δραστηριότητας PKM2 (Εικ. 8C, δεξιά). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλιωμένη τυροσίνη MUC1-C καταστέλλει δραστηριότητα PKM2 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού και ότι το αποτέλεσμα αυτό είναι πιο έντονο στην απόκριση σε διέγερση EGF.

Α και Β Τα προϊόντα λύσεως από την ενδεικνυόμενη ZR-75-1 ( Α) και MCF-7 (Β) κύτταρα που συλλέγονται στους αναγραφόμενους χρόνους μετά από πέρασμα αναλύθηκαν για δραστικότητα PKM2 (αριστερά). Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα το καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνο που λαμβάνεται σε κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1). Η ZR-75-1 /φορέα (Α) και κυτταρολύματα MCF-7 /φορέα (Β) επωάστηκαν επίσης με αντι-MUC 1-C και τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (δεξιά). Γ MCF-7 /φορέα και τα κύτταρα MCF-7 /MUC1siRNA αφέθηκαν χωρίς θεραπεία και διεγέρθηκαν με EGF για 5 λεπτά. Τα προϊόντα της λύσης από κύτταρα MCF-7 /φορέα επωάστηκαν με αντι-MUC 1-C και τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (αριστερά). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για δραστικότητα PKM2 (δεξιά). Τα αποτελέσματα (μέσος όρος + SD από τρία ξεχωριστά πειράματα) εκφράζονται ως η σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνη σε μη διεγερμένα κύτταρα MCF-7 /φορέα.

Η

Επιδράσεις της εκφράζει ένα MUC 1 (C3A) μετάλλαξη σε δραστηριότητα PKM2

για να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματα της αποσιώπησης MUC1-C θα μπορούσε να αποδοθεί στην αλληλεπίδραση μεταξύ της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C και PKM2, μελέτες πραγματοποιήθηκαν με κύτταρα HCT116, τα οποία είναι μηδενική για την έκφραση MUC1 και ήταν σταθερά επιμολυνθεί για να εκφράσουν ένα άδειο φορέα, άγριου τύπου MUC1 ή MUC1 με τη μετάλλαξη C3A (Εικ. 9Α). MUC1 και MUC1 (C3A) έκφραση δεν είχε επίδραση επί PKM2 ή επίπεδα ρ-PKM2 (Tyr-105) (Εικ. 9Α). Η πρόσληψη γλυκόζης αυξήθηκε σε HCT116 /MUC1, αλλά όχι HCT116 /MUC1 (C3A), κύτταρα (Σχ. 9Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν κατά τη μέτρηση της παραγωγής γαλακτικού (Σχ. 9C). MUC1, αλλά δεν MUC1 (C3A), η έκφραση συσχετίστηκε επίσης με αυξήσεις στη δραστηριότητα PKM2 (Εικ. 9D). Επιπλέον, όπως φαίνεται προηγουμένως [20], η έκφραση MUC1 συνδέθηκε με αυξήσεις στο σχηματισμό αποικιών HCT116 και αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε από το MUC 1 (C3A) μετάλλαξη (Σχ. 9Ε). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της MUC1-CD και PKM2 εξασθενεί τις MUC1-CD-μεσολάβηση επιπτώσεις στην γλυκόλυση, δραστηριότητα PKM2 και το σχηματισμό αποικιών.

Α. Τα προϊόντα λύσης από κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά ένα άδειο φορέα, άγριου τύπου MUC1 ή MUC1 (C3A) ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. B. Η υποδεικνυόμενη κύτταρα αναλύθηκαν για πρόσληψη γλυκόζης. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως 106 κύτταρα /nmol. C. Η υποδεικνυόμενη κύτταρα αναλύθηκαν για παραγωγή γαλακτικού. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως παραγωγή σε σχέση γαλακτικού σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1). D. Τα υλικά λύσεως από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα αναλύθηκαν για δραστικότητα PKM2. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων καθένα εις τριπλούν) εκφράζονται ως σχετική δραστικότητα PKM2 σε σύγκριση με εκείνο που λαμβάνεται σε κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1). Ε Η υποδεικνυόμενη κύτταρα απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από επώαση για 14 ημέρες. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD από δύο ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν) εκφράζονται ως ο αριθμός των αποικιών σε σχέση με εκείνη που λαμβάνεται με κύτταρα HCT116 /φορέα (αποδίδεται μία τιμή 1).

Η

Συζήτηση

MUC1-C προάγει ογκοπρωτεϊνης γλυκόλυση

πιο καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται από αερόβια γλυκόλυση για την παραγωγή της ενέργειας που είναι απαραίτητη για τις κυτταρικές διεργασίες. Αυτό αλλαγμένη μεταβολισμό, γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, περιλαμβάνει αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης με μειωμένη χρησιμοποίηση του κύκλου TCA, έτσι ώστε πυροσταφυλικού που παράγεται κατά τη γλυκόλυση μετατρέπεται σε γαλακτικό [22].