Αφηρημένο

απέδειξαν πρόσφατα ότι τα καρκινικά κύτταρα που ανακάμψει από βλάβες εμφανίζουν αυξημένη αερόβια γλυκόλυση, ωστόσο, το μοριακό μηχανισμός με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν τη ζημιά και να δείξει αυξημένη αερόβια γλυκόλυση παραμένει άγνωστη. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι ποικίλα καρκινικά κύτταρα που επιβιώνουν υποξικές ή πολλαπλασιασμό ταχεία κυτταρική οξειδωτική βλάβη εμφάνισης, και να αναπτύξουν ανοχή σε βλάβες που συνδέονται με την αυξημένη παραγωγή υδρόθειου (H

2δ) ο οποίος οδηγεί προς τα πάνω ρύθμιση του νικοτιναμιδίου φωσφοριβοσυλτρανσφεράση (Nampt). Συνεπής με την ύπαρξη ενός H

2S-Nampt ενεργητικός κυκλώματος, ζημιά ανακτηθούν τα καρκινικά κύτταρα, H

2S, Nampt και ΑΤΡ εμφανίζουν παραγωγή μια σημαντική συσχέτιση. Επιπλέον, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με Η

2S δότη, NaHS, αυξάνει συντονισμένα Nampt και τα επίπεδα ΑΤΡ, και προστατεύει τα κύτταρα από προκαλούμενη από φάρμακο βλάβη. Αναστολή της κυσταθειονίνης βήτα συνθάσης (CBS) ή κυσταθειονάσης (CTH), ένζυμα τα οποία οδηγούν γενιά H

2S, μειώνει την παραγωγή Nampt ενώ η καταστολή των Nampt μονοπατιού από FK866, μειώνει H

2S και τα επίπεδα ΑΤΡ. Βλάβη ανακτηθέντα κύτταρα απομονώθηκαν από όγκους αναπτύχθηκαν υποδορίως σε αθυμικά ποντίκια επίσης εμφανίζουν αυξημένη παραγωγή H

2S, Nampt και τα επίπεδα ΑΤΡ, συνδέεται με αυξημένη γλυκόλυση και ταχεία διάδοση. Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι μετά την ανάρρωση από ενδεχόμενες θανατηφόρα βλάβη, H

2S-Nampt κατευθύνει δαπάνη ενέργειας και αερόβια γλυκόλυση σε καρκινικά κύτταρα, οδηγεί σε εκθετική ανάπτυξη τους και προκαλεί ένα υψηλό βαθμό ανοχής σε βλάβες. Ταυτοποίηση της H

2S-Nampt ως μονοπάτι υπεύθυνο για την επαγωγή της ανοχής βλάβης σε καρκινικά κύτταρα μπορούν να δώσουν λαβή αντίσταση στη θεραπεία και προσφέρει την ευκαιρία για τη στόχευση αυτή την οδό ως μέσο στη θεραπεία του καρκίνου

Citation.: Sanokawa-Akakura R, Ostrakhovitch ΕΑ, Akakura S, Goodwin S, Tabibzadeh S (2014) AH

2S-Nampt εξαρτημένων Ενεργειακά κύκλωμα είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωση και κυτταρο-προστασίας από βλάβες στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (9): e108537. doi: 10.1371 /journal.pone.0108537

Συντάκτης: Stefan Strack, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2014? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Τα τελευταία χρόνια, έχει δειχθεί ότι gasotransmitters, το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), το μονοξείδιο του άνθρακα (CO) και υδρόθειου (H

2δ), παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του αγγειακού τόνου, άμυνα του ξενιστή έναντι των παθογόνων, neuromodulation, απόπτωση, και το μεταβολισμό της ενέργειας στα κύτταρα των θηλαστικών [1]. Μεταξύ αυτών των αερίων μορίων, H

2S παράγεται κατά το μεταβολισμό αμινοξέων από τις οδούς trans-θειάφισμα και κυστεΐνη αποθείωσης [2]. Η ενδογενής H

παραγωγή 2S καταλύεται από τρία ένζυμα, κυσταθειονίνης βήτα συνθάσης (CBS), κυσταθειονάσης (CTH), επίσης γνωστή ως κυσταθειονίνης γ-λυάση, και 3-μερκαπτοπυρουβική θειοτρανσφεράση (MST) [3] – [5].

H

2S λειτουργεί ως διεγέρτης της κυτταρικής βιοενεργητική, συμβάλλει στην αυξημένη εξάρτηση των καρκινικών κυττάρων επί της γλυκολυτικής οδού για παραγωγή ΑΤΡ και προάγει την αγγειογένεση και κυτταροπροστασία [6] – [8]. H

2S προστατεύει τα κύτταρα από το οξειδωτικό στρες [9], μπορεί να επηρεάσει κυτταρικές αποκρίσεις σε τραυματισμούς [10], [11] και δείχθηκε ότι παρουσιάζουν και τα δύο προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα [12] – [14]. Αν και μερικοί πρότειναν ότι H

2S έχει αντικαρκινικές επιδράσεις [15], άλλοι ανέφεραν ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των HCT116 και SW480 του παχέος καρκινικά κύτταρα [16]. Fu

et al.

Έδειξε ότι το Ca

2 + αιτίες διέγερση αυξημένη έκφραση CTH και αυξάνει H

2S και ΑΤΡ παραγωγής [17]. Αποδείχθηκε ότι η ενδογενής H

παραγωγή 2S οδηγείται από 3-MST συμπληρώνει και εξισορροπεί τις κυτταρικές βιοενεργειακό και διατηρεί τη ροή ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια [18]. Οι Παχέος καρκινικά κύτταρα έχουν δειχθεί ότι εμφανίζουν τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση του CBS και αυξημένο σχηματισμό H

2S, που κατευθύνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση σε καρκίνο του παχέος εντέρου [6].

Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα όγκου μπορεί ανακτήσει από πιθανή θανατηφόρα βλάβη που προκαλείται από υποξία, οξέωση, ή με ακτινοβολία και φαρμακευτική αγωγή [19] – [22]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι τα καρκινικά κύτταρα που ανακάμψει από βλάβες που προκαλούνται από υποξία, οξέωση και γλυκόζη στέρηση δείχνουν μιτοχονδριακό αναδιαμόρφωση, αυξημένη αερόβια γλυκόλυση, και εμφανίζουν υψηλό ποσοστό ATP παραγωγής [23]. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνήσει το ρόλο της H

2S στη διαδικασία ανάκτησης των καρκινικών κυττάρων από βλάβες. Κατεστραμμένα καρκινικά κύτταρα εξαντλήσουν τον ενεργειακό εφοδιασμό τους, λόγω των μηχανισμών επιδιόρθωσης. Τόσο ΑΤΡ και NAD

+ (Νικοτιναμίδιο αδενίνη δινουκλεοτίδιο) είναι οι κύριες πηγές ενέργειας. Νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλτρανσφεράση (Nampt), ένα ένζυμο που απαιτείται για NAD συνθετική οδός διάσωσης [24], είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση του ενεργειακού εφοδιασμού κυτταρική. Επομένως, εξετάσαμε το ρόλο της Nampt σε συνδυασμό με H

2S σε καρκινικά κύτταρα που ανακάμψει από βλάβες. Έχουμε αποδείξει ότι η H

2S ελέγχει την ανάκτηση των καρκινικών κυττάρων από τη ζημία από τη ρύθμιση Nampt κατευθυνόμενη αλλαγή στην ενεργειακή δαπάνη, η οποία οδηγεί την έγκριση της αερόβια γλυκόλυση και την αύξηση της ΑΤΡ και NAD

+ σύνθεσης. Η αλληλεπίδραση H

2S και Nampt παρέχει τα καρκινικά κύτταρα υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και υψηλό βαθμό ανοχής σε βλάβη.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η

2O

2, NaHS, βλεομυκίνη,

O

– (καρβοξυμεθυλ) υδροξυλαμίνη ημιυδροχλωρικής (CHH) DL-προπαργυλογλυκίνη (PAG) και FK866 αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) . Αντισώματα έναντι CBS (Α-2), CTH (G-1) και β-ακτίνη (C-2) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι Nampt (βισφατίνης, PBEF) και Βαχ αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Αντίσωμα έναντι γ-Η2ΑΧ αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Δευτερεύουσα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας αγοράστηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories (Baltimore, ΡΑ).

Κυτταροκαλλιέργεια

HepG2, MDA-MB-231 και MDA-MB-435S ελήφθησαν από την ATCC ( Manassas, VA) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 2 mM γλουταμίνη, 25 mM γλυκόζη και 10% ορό εμβρύου μόσχου, σε 37 ° C επωαστή με 5% CO

2. Βλάβη προκλήθηκε σε καρκινικά κύτταρα από υποξία, στέρηση γλυκόζης και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Για την επαγωγή της υποξίας (DR

H), τα κύτταρα επωάστηκαν για 18 ώρες σε 1% O

2. Για στέρηση γλυκόζης (DR

G-), τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες σε ένα μέσο χωρίς γλυκόζη παρουσία 5% CO

2. Για την επαγωγή της ζημίας από το υπεροξείδιο του υδρογόνου (DR

H2O2), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 800 μΜ H

2O

2 για 3 ώρες.

Τα πειράματα σε ζώα

φροντίδα των ζώων και όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν μετά την έγκριση των επιτροπών φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Irvine (πρωτόκολλο # 2012 έως 3042). Οκτώ εβδομάδων αθυμικά γυμνά (ηυ /ηυ) αρσενικών ποντικών (n = 10) αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories (San Diego, CA). Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή ισοφλουρανίου πριν από την έγχυση των κυττάρων όγκου. Κάθε ποντικός έλαβε 1 × 10

κύτταρα 5 όγκου σε ένα συνολικό όγκο 100 μΙ υποδορίως σε τέσσερις περιοχές στα μέσα της κοιλιακής και χαμηλότερες περιοχές πλευρό. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν 2 φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια του πειράματος ανάπτυξη του όγκου. Είκοσι ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εισπνοή διοξειδίου του άνθρακα όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν με το μέγεθος των 10-15 mm σε διάμετρο. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν για απομόνωση των βιώσιμων καρκινικών κυττάρων (Τ

V) ή βλάβη ανακτηθεί κύτταρα από

in vivo

αυξηθεί όγκου (Τ

DR).

Μέτρηση H

παραγωγή 2S σε επιπλέον και ενδο-κύτταρα

Μέτρηση της εξωκυττάριας H

επίπεδο 2S έγινε χρησιμοποιώντας Δωρεάν Αναλυτής Radical (TBR4100 και ISO-H2S-2, Παγκόσμια οργάνων ακριβείας, Sarasota, FL) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή . Εν συντομία, ο αριθμός των κυττάρων ρυθμίσθηκε σε 1 χ 10

6 βιώσιμα κύτταρα σε PBS και τα κυτταρικά αιωρήματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε μετρήσεις. Πριν από κάθε μέτρηση, ο αισθητήρας ήταν πολωμένο και βαθμονομείται με την προσθήκη τεσσάρων δειγμάτων του Na

2S απόθεμα διαλύματος στις τελικές συγκεντρώσεις 0,25, 0,5, 1,0 και 2,0 μΜ. Ανίχνευση ενδοκυτταρικής H

2S έγινε με H

2S φθορίζοντα ανιχνευτή HSN2 (ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Michael D. Pluth, Πανεπιστήμιο του Όρεγκον, Τμήμα Χημείας, Eugene, Oregon).

Σύνολο εκχύλιση κυτταρικής πρωτεΐνης και κηλίδωση Western

οι πρωτεΐνες από κύτταρα εκχυλίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM na

3νο

4, 50 mM NaF, και ο αναστολέας πρωτεάσης κοκτέιλ). μετρήσεις πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν με προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad βασίζεται στην Bradford μέθοδο πρόσδεσης της χρωστικής (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).

Λεκιάζοντας ζώνες ανιχνεύθηκαν με ECL Detection ενισχυμένης χημειοφωταύγειας Blotting (Amersham ECL Plus Western αντιδραστήρια GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) χρησιμοποιώντας C-ψήφιο Ψηφιακή Imager (LI-COR, Lincoln, NE) και πυκνομετρική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού myImage ανάλυση (Thermo Scientific). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Κυτταρική βιωσιμότητα μέτρηση

σχετικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΧΤΤ (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα επωάστηκαν με ΧΤΤ και φαιναζίνη (PMS) στους 37 ° C για 2 ώρες και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 και 650 nm ως αναφορά.

Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και ποσοτική PCR ( qPCR)

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας GenElute θηλαστικών Ολικό RNA Miniprep Kit (Siγma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές ειδικά για το ανθρώπινο CBS (προς τα εμπρός: GAACCAGACGGAGCAGACAA? Αντίστροφη: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), για την ανθρώπινη CTH (προς τα εμπρός: AAAGACGCCTCCTCACAAGG? Αντίστροφη: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) και για την ανθρώπινη MTS (προς τα εμπρός: CGCCGTGTCACTGCTTGAT? Αντίστροφη: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας

Taq

5 × Master Mix (New England Biolabs. Ipswich, ΜΑ) με ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 κύκλους με το καθένα σε 94 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 sec, και 68 ° C για 1 λεπτό.

Ποσοτική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού myImage Ανάλυση (Thermo Scientific, New Hampshire). Για την κανονικοποίηση των δεδομένων,

β-ακτίνης

ενισχύθηκε με ειδικούς εκκινητές (προς τα εμπρός: AAGCCACCCCACTTCTCTCT? Αντίστροφη: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ quanti tect SYBR Green ΡΟΚ. qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας τους εκκινητές ειδικούς για το ανθρώπινο NAMPT (προς τα εμπρός: ATC CTG TTC CAG GCT ΑΤΤ CTG? αντίστροφη: CCC CAT ΑΤΤ TTC TCA CAC GCA Τ).

XF (εξωκυττάριο ροή) βιοενεργειακό ανάλυση

XF24 εξωκυττάρια Flux Αναλυτής από Seahorse Βιοεπιστημών (Ν Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για εξωκυττάριο υγρό βιοενεργειακό ανάλυση [25]. Σύμφωνα με το τυπικό

in vitro

συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων, εξωκυττάρια ρυθμός οξίνισης (ECAR) έχει εισφέρει παραγωγή γαλακτικού οξέος που παράγεται από τη γλυκόλυση. Για να εξεταστεί η αερόβια γλυκόλυση, πέντε βιολογικές καλλιέργειες επαναληπτικές ελέγχου (3 χ 10

4) και πέντε ανεξάρτητα δημιουργούνται κύτταρα DR (3 χ 10

4) επιστρώθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας καλλιέργειας XF 24 και τα κύτταρα επωάζονται όλη τη νύκτα στους 37 ° C παρουσία 5% CO

2. Όλες οι καλλιέργειες εξετάστηκαν XFAssay μέσα απουσία του CO

2. Επίπεδο ECAR κανονικοποιήθηκε με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη.

Η ποσοτικοποίηση των Nampt, ΑΤΡ και NAD

+ /NADH

ενδοκυτταρικά επίπεδα Nampt μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα βισφατίνης Ο-τερματικό (Άνθρωπος) ΕΙΑ kit (Phoenix φαρμακευτικά προϊόντα, Belmont, CA, USA). επίπεδα ΑΤΡ στα κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ βιο-φωσφορισμού ATP σωματικά δοκιμασία κυττάρων (FLASC, Sigma-Aldrich Company) και κιτ προσδιορισμού χρωματομετρική ΑΤΡ (Abcam, Cambridge, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. NAD επίπεδα

+ /NADH μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας NAD κιτ

+ δοκιμασία /NADH (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan και Δοκιμασία Συστήματα Bio, Hayward CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επίπεδα Nampt, ΑΤΡ και NAD

+ /NADH κανονικοποιήθηκαν προς την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες.

Στατιστικά

Όλες οι δοκιμασίες έγιναν σε 3-6 επαναλήψεις σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM (τυπικό σφάλμα του μέσου όρου).

σ

τιμές προσδιορίστηκαν με σύγκριση των δεδομένων από την πειραματική έναντι κύτταρα ελέγχου από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα ή έξι αντίγραφα του ίδιου πειράματος. Μέσα και

τιμές ρ

για πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν δι ‘υποβολής των δεδομένων στην δύο tailed t-test. Δεδομένα εμπλέκονται περισσότερες από δύο ομάδες είχαν προσεγγιστεί από μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Bonferroni για post hoc ανάλυση.

σ

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

είναι σ

Οι τιμές που παρουσιάζονται ως & lt? 0,05 (*), & lt? 0.005 (**) ή & lt?. 0.0005 (***)

Αποτελέσματα

Η γενιά της H

2S αυξήσεις σε απάντηση στο στρες

σε αντίθεση με προηγούμενες εκθέσεις στις οποίες H

2S έχει μετρηθεί στο κελί λύμα, χρησιμοποιήσαμε H

2S-ευαίσθητα ηλεκτροδίων για τη μέτρηση της έκλυσης της H

2S από ανέπαφα κύτταρα. Βρήκαμε ότι η ποσότητα του H

2S απελευθερώνεται από κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή που μετρήθηκε σε ομογενοποιημένο εκχυλίσματα κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε σύγκριση με τα επίπεδα του H

2S απελευθερώνεται από κύτταρα και ινοβλάστες 293, τα καρκινικά κύτταρα (HepG2, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435S) παρήγαγε σημαντικά πιο H

2S (Σχήμα 1Α). Έχουμε υποστεί επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα διαφόρων προελεύσεων (ήπατος, του μαστού και των μελανοκυττάρων) σε σκληρές συνθήκες που επικρατούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου, τα οποία όλα οδηγούν σε βλάβη των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων υποξία (

H), στέρηση γλυκόζης (

G-) και υπεροξείδιο του υδρογόνου (

H2O2). Η H

2S παραγωγή αυξήθηκε σε καρκινικά κύτταρα σε απόκριση σε οξύ στρες όπως η υποξία, βλεομυκίνη, υπεροξείδιο του υδρογόνου και στέρηση γλυκόζης (Εικόνα 1Β). Το άγχος που σχετίζονται με αύξηση των H

2S απελευθερώνεται από τα καρκινικά κύτταρα συσχετίστηκε με αύξηση των κυσταθειονίνης βήτα συνθάσης (CBS), ένα από τα ένζυμα που κινεί H

παραγωγή 2S, ταυτόχρονα με την αύξηση του άγχους και την απόπτωση που σχετίζονται με Βαχ και γH2AX , η οποία είναι ένας κρίσιμος παράγοντας της S /G

2 συγκρότημα οδοφράγματος βλάβη του DNA (Σχήμα 1 C, D). Είναι ενδιαφέρον, που προκαλείται από το άγχος ανύψωση H

παραγωγή 2S συσχετίζονται με τη σοβαρότητα της βλάβης (Σχήμα 1 Ε).

(Α) Ποσό H

2S απελευθερώνεται από τα κύτταρα 293, ινοβλάστες (Ινο.), HepG2, MDA-MB-231 και MDA-MB-435S κύτταρα. (Β) Τα επίπεδα του H

2S σε HepG2, MDA-MB-231 και τα κύτταρα MDA-MB-435S Pc υποβληθεί σε υποξία (0,5% O

2, 18 ώρες), η στέρηση γλυκόζης (γλυκόζη μέσο χωρίς, 18 ώρες) ή θεραπεία με μπλεομυκίνη (35 ηΜ, 18 ώρες), Η

2O

2 (800 μΜ, 3 ώρες). Τα δεδομένα εκφράζονται ως επί τοις εκατό του H

2S απελευθερώνεται από μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Γ) Η ενδοκυτταρική CBS και Βαχ (αριστερό πάνελ) εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western σε κύτταρα MDA-MB-435S Pc, και Pc κύτταρα κατεργασμένα με 400 ή 800 μΜ H

2O

2 για 3 ώρες. (Δ) Το επίπεδο των CBS και γH2AX με ή χωρίς θεραπεία με H

2O

2 (800 μΜ, 3 ώρες) σε MDA-MB-435S κύτταρα. πυκνότητα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας β-ακτίνης. (Ε) Ποσό H

2S και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την αγωγή με μια περιοχή συγκέντρωσης του H

2O

2. *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

Η αυξημένη παραγωγή H

2S στα κύτταρα βλάβη ανακτηθεί αυξάνει την ανοχή σε βλάψει

Το σύστημα στο Σχήμα 2Α δείχνει η μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία των ζημιών ανακτάται καρκινικά κύτταρα. Μέσα σε 24 ώρες μετά τη βλάβη, λίγα βιώσιμα κύτταρα παρέμειναν επισυνάπτεται στην φιάλη καλλιέργειας, ενώ πλειονότητα των κυττάρων που αποσπώνται από την επιφάνεια του πολιτισμού. Αλλοιωμένα αποκολληθούν τα κύτταρα εμφανίζουν ένα υψηλό επίπεδο H

2S πιθανόν να περιορίσει την ζημία και μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση δυναμικό (Σχήμα S1). Για να αφαιρέσετε τα μιτωτικά κύτταρα, καλλιεργήσαμε κύτταρα σε νέα δοχεία καλλιέργειας για 24 ώρες. Για την απομόνωση τα κατεστραμμένα κύτταρα που απέτυχε να δεσμεύονται σε δοχεία καλλιέργειας, αλλά είχε τη δυνατότητα να ανακτήσει από βλάβη, μεταφέραμε επιπλέοντα κύτταρα σε νέα δοχεία καλλιέργειας για να επιτρέψει κύτταρα που ανακάμψει από βλάβη να συνδεθεί με τα υποστρώματα καλλιέργειας. Serial εβδομαδιαία περάσματα των επιπλεόντων κυττάρων σε νέα δοχεία καλλιέργειας επέτρεψε την απομόνωση της βλάβης ανακτηθεί κυττάρων με διαφορετικό χρόνο αποκατάστασης. Σε όλο αυτό το έγγραφο, αναφερόμαστε σε αυτά τα κύτταρα, όπως τα κύτταρα βλάβη ανακτηθεί (DR) με προκαθορισμένο χρόνο αποκατάστασης ενός (DR

W1), δύο (DR

W2) ή τρεις εβδομάδες (DR

W3) από βλάβη, ενώ αναφερόμαστε στα γονικά κύτταρα ελέγχου ως Pc κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η μέθοδος αυτή μας επέτρεψε να διαχωρίσει τρεις πληθυσμούς κυττάρων που αντικατοπτρίζουν το χρονικό διάστημα που απαιτείται για την ανάκαμψη. Προκειμένου να εκτιμηθεί κατά πόσον τα κύτταρα που απομονώνονται DR ανακτώνται από βλάβη, εξετάσαμε την έκφραση των προ-αποπτωτικών μόριο, Βαχ. κύτταρα DR έδειξε μια μείωση στην έκφραση Bax σε ένα χρόνο αποκατάστασης τρόπο που εξαρτάται ως ένδειξη της επισκευής, ενώ όπως αναμενόταν, τα κύτταρα PC εκτίθενται σε H

2O

2 για 3 ώρες (οξεία βλάβη) εξέφρασε ένα υψηλό επίπεδο Βαχ (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα που ανακτώνται από βλάβη παρουσίασαν επίσης αυξημένη παραγωγή H

2S σε σύγκριση με τα άθικτα κύτταρα Pc σε ένα χρόνο ανάκτησης εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2C, D). Δεδομένου ότι τα ενδογενή υδρόθειο παράγεται από τρία ένζυμα, CBS, CTH και MST, εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης αυτών των ενζύμων σε κύτταρα Pc και DR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, τα επίπεδα mRNA του CBS και CTH αυξημένη σε κύτταρα DR επίσης σε ένα χρόνο αποκατάστασης εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, MST ήταν απούσα σε κύτταρα PC ή DR. Σε σύγκριση με τη γονική άθικτα κύτταρα PC, τα καρκινικά κύτταρα που ανακτώνται από βλάβη είχε αυξηθεί πρωτεΐνες CBS και CTH σε άμεση συσχέτιση με την περίοδο της ανάκτησης. Μεταξύ των κυττάρων DR, αυτά τα κύτταρα με ένα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα η αποκατάσταση των ζημιών δείχνουν την υψηλότερη πάνω ρύθμιση του CBS και CTH (Σχήμα 2F). CBS ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω μέχρι και 2 φορές μετά την ανάρρωση από βλάβη που προκαλείται από στέρηση γλυκόζης, υποξία και υπεροξείδιο του υδρογόνου (Σχήμα 2G). Σε σύγκριση με τα κύτταρα PC, τα κύτταρα DR δημιουργώντας υψηλότερα επίπεδα H

2S είχαν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και έδειξε ένα υψηλότερο επίπεδο ανοχής στην βλάβη που προκαλείται από τη βλεομυκίνη (Σχήμα 2Η, Ι). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι σε κύτταρα που ανακτώνται από βλάβη, H

παραγωγή 2S θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην αυξημένη ανοχή τους σε ζημιές.

(Α) Ένα σύστημα για την απομόνωση των κυττάρων Ζημιές-ανακύκλωση (DR). (Β) έκφραση Bax σε H

2O

2 αντιμετωπίζονται Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. (Γ) το ποσό του H

2S απελευθερώνεται από DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. Σημασία μεταξύ του υπολογιστή και τρία κελιά DR ήταν

σ

& lt? 0.0005 σε ANOVA στατιστική ανάλυση. (Δ) H

2S χρώση του PC, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα Η2Ο2 W3 HepG2 με 5 μΜ H

2S ανιχνευτή φθορισμού, HSN2. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. ανάλυση (Ε) PCR του

CBS

,

CTH

και

MTS

γονίδια στο Pc, DR

H2O2 W1 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. (F) ανάλυση Western blot του CBS και CTH στο Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. (Ζ) ανάλυση Western blot του CBS στο Pc και DR

H2O2 W1, DR

H W1 και DR

κύτταρα G W1 HepG2. (H) Διάδοση των HepG2 ανακτώνται από H κυττάρων

2O

2, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 ως ποσοστό του ότι στα κύτταρα Pc. (Ι) Βιωσιμότητα του PC, DR

H2O2 W1 και DR

H2O2 W2 HepG2 κύτταρα με και χωρίς αγωγή με βλεομυκίνη. *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

κύτταρα DR εμφανίζουν αυξημένη γλυκόλυση και την ενίσχυση της κυτταρικής Βιοενέργεια

Επειδή τα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα υιοθετήσουν αερόβια γλυκόλυση να προωθήσει μια αυξημένη βιομάζα που ακολουθείται από κύτταρο διαίρεση, εξετάσαμε το επίπεδο των βασικών γλυκολυτικό ενδιάμεσα και τα ένζυμα στα κύτταρα που ανακτώνται από βλάβη. κύτταρα DR έδειξε αυξημένη εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR), το οποίο είναι ένας δείκτης του επιπέδου της γλυκόλυσης (Σχήμα 3Α). κύτταρα DR δημιουργώντας υψηλά επίπεδα H

2S είχε μια καλύτερη βιοενεργητική προφίλ, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη στάθμη της κυτταρικής ΑΤΡ (Σχήμα 3Β).

(Α) ECAR σε κύτταρα HepG2 Pc σε επεξεργασία με ή χωρίς 800 μΜ H

κύτταρα 2O

2 και DR

H2O2 W2 HepG2. (Β) τα επίπεδα ΑΤΡ στο Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. Σημασία μεταξύ του υπολογιστή και τρία κελιά DR ήταν

σ

& lt? 0.005 σε ANOVA στατιστική ανάλυση. (C) NAD

+ επίπεδα Pc HepG2 (με ή χωρίς H

2O

2), DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. NAD

+ ομαλοποιήθηκε με το επίπεδο της συνολικής πρωτεΐνης. Σημασία μεταξύ του υπολογιστή και υπάρχει κύτταρα DR ήταν

σ

& lt? 0.005 σε ANOVA στατιστική ανάλυση. (D) NAD

+ επίπεδα στο Pc και DR

κύτταρα H W1 HepG2. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western των ενδοκυττάριων Nampt και CBS στο PC και ΔΡ

H2O2 MDA-MB-231 κύτταρα. επίπεδα (F) Nampt αξιολογούνται με ELISA σε PC, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. Σημασία μεταξύ του υπολογιστή και τρία κελιά DR ήταν

σ

& lt? 0,05 σε ANOVA στατιστική ανάλυση. (G) Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Nampt και την παραγωγή H

2S και το επίπεδο της ΑΤΡ στο Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2. Σημασία της H

2S και Nampt ήταν

σ

& lt? 0,05, και τη σημασία της ΑΤΡ και Nampt ήταν

σ

& lt? 0,05 σε ANOVA στατιστική ανάλυση. *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

Για να αντιμετωπιστούν αν η καταστολή της γλυκόλυσης εξασθενίζει H

παραγωγή 2S, μετρήσαμε H

επίπεδο 2S στα κύτταρα DR αντιμετωπίζονται με ΚΘ1 αναστολέα, 100 μΜ βρωμοπυροσταφυλικό οξύ, ή αναστολέα LDH-Α, 1 mM οξαμικό νάτριο, για 15 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στο επίπεδο του H

2S μετά από αγωγή είτε με βρωμοπυροσταφυλικό οξύ ή οξαμικό νάτριο, ενώ, όπως αναμενόταν, γλυκολυτική δραστικότητα ουσιαστικά μειωθεί κατά δύο αναστολείς. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι γλυκολυτικών ενζύμων δεν ρυθμίζουν H

Κύκλωμα 2S-Nampt.

Τα κύτταρα ανακτήθηκαν από βλάβη σε μεγάλο βαθμό στηρίχθηκε σε γλυκόλυση ότι η αύξηση της ζήτησης για το NADH /NAD

+. Ως εκ τούτου, ως μέτρο της Βιοενεργειακό κατάσταση, αξιολογήσαμε τα επίπεδα του NAD

+ και NADH. Αν και η οξεία βλάβη οδήγησε σε μείωση του επιπέδου NAD

+, NAD

+ ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκινικά κύτταρα που ανακτήθηκαν από βλάβη που επάγεται από την H

2O

2 και υποξία (Σχήμα 3C, D ? Σχήμα S3). Μειωμένη μορφή NAD

+, NADH, ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα DR (Σχήμα S4).

Nampt, η οποία είναι απαραίτητη για το NAD

+ οδού συνθετικό διάσωσης [24], αυξήθηκε σημαντικά κατά την ανάκτηση σε κύτταρα DR και η αύξηση αυτή συνέπεσε με αυξητική ρύθμιση του H

2S δημιουργώντας CBS (Σχήμα 3Ε). Τα κύτταρα DR με μεγαλύτερο χρονικό διάστημα η αποκατάσταση των ζημιών παρουσίασε τη μεγαλύτερη αύξηση στα Nampt (Σχήμα 3F). Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα Nampt συσχετίζεται τόσο με το επίπεδο του H

2S απελευθερώνεται από κύτταρα (R

2 = 0,9,

ρ

& lt? 0,05) και η ενδοκυτταρική επίπεδο του ΑΤΡ (R

2 = 0,94,

σ

& lt?. 0,05) (Σχήμα 3G)

Μαζί, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα που ανακτώνται από βλάβη δημιουργήσει ένα υψηλό επίπεδο H

2S και Nampt, και ότι εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την παραγωγή H

2S και αερόβια γλυκόλυση για την αποτελεσματική μεταβολισμό τους.

H

2S, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, up-ρυθμίζει Nampt, αυξήσεις αερόβια γλυκόλυση και προσφέρει κυτταροπροστασία

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η σημασία της H

2S στην απόκτηση νέων μεταβολικά χαρακτηριστικά, τα κύτταρα Pc υποβλήθηκαν σε θεραπεία με H

2S δότη, NaHS. Παρόμοια με τις παρατηρήσεις μας σε κύτταρα DR (Σχήμα 3Α), η θεραπεία με NaHS ενισχυμένη ECAR σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αυξημένη ΑΤΡ και NAD

+ εξόδου και οδήγησε σε σημαντική αύξηση του επιπέδου των Nampt (Σχήμα 4Α-F). Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι H

2S παρέχει κυτταροπροστασία [8], [26], Pc κύτταρα προ-επεξεργασμένο με NaHS επέδειξαν υψηλότερη αντίσταση σε φθορά που προκαλείται είτε από το υπεροξείδιο του υδρογόνου ή μπλεομυκίνη (Εικόνα 4G).

(Α) ECAR σε κύτταρα HepG2 Pc αγωγή για 48 ώρες με 0, 1, και 100 μΜ NaHS και DR

κύτταρα H W1 HepG2. (Β) Σύγκριση των επιπέδων ΑΤΡ σε PC κύτταρα HepG2 σε αγωγή για 48 ώρες με 0, 10 και 100 μΜ NaHS, DR

κύτταρα H2O2 W1 HepG2 και Pc MDA ΜΒ-231 κύτταρα που κατεργάζονται επί 48 ώρες με 0, 10 και 100 μΜ από NaHS. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό του επιπέδου του ΑΤΡ σε μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Γ) Επίπεδα NAD

+ σε κύτταρα HepG2 και MDA-MB-231 Pc σε επεξεργασία με 0, 10, και 100 μΜ NaHS για 48 ώρες. (Δ) Ανάλυση Western blot της ενδοκυτταρικής Nampt σε κύτταρα MDA-MB-231 Pc αγωγή για 48 ώρες με 0 και 100 μΜ NaHS. (Ε) qPCR ανάλυση του

NAMPT

έκφραση σε κύτταρα HepG2 Pc αγωγή για 48 ώρες με 0 και 100 μΜ NaHS. (F) Η ποσοτικοποίηση του ενδοκυττάριου Nampt με ELISA σε PC κύτταρα HepG2 σε αγωγή για 48 ώρες με 0, 10 και 100 μΜ NaHS. (G) Βιωσιμότητα σε κύτταρα HepG2 προ-θεραπεία για 24 ώρες με 0, 1, και 10 mM του NaHS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε H

2O

2 (800 μΜ) ή μπλεομυκίνη (35 ηΜ, 18 ώρες). Η βιωσιμότητα εκτιμήθηκε με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

Μαζί, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση της H

2S και Nampt οδηγούν σε γλυκόλυση και βιοενεργειακό αλλαγές αποτελούν σημαντικούς μηχανισμούς για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

H

2S-Nampt μονοπάτι ρυθμίζει βιοενεργειακό στα κύτταρα DR

Για να αντιμετωπιστεί περαιτέρω τη σχέση μεταξύ Nampt και H

παραγωγή 2S, κύτταρα DR υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έναν αναστολέα της Nampt, FK866. Η επεξεργασία των κυττάρων με 200 ηΜ FK866 δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων υποδεικνύει την απουσία FK866 κυτταροτοξικότητα σε αυτή τη δόση σε HepG2 (σχήμα S5). Καταστολή της Nampt με αναστολέα της, FK866, καθώς και αναστολή της CTH από D, L-προπαργυλογλυκίνη (PAG), οδήγησε σε μειωμένη H

παραγωγή 2S (Σχήμα 5Α). Συνεπής με μια τέτοια αλλαγή στη H

παραγωγή 2S, η έκφραση και των δύο CBS και CTH εξασθένισε με επεξεργασία των κυττάρων με FK866 (σχήμα 5Β, C). Το επίπεδο της ΑΤΡ επίσης μειώθηκε σημαντικά κατά την κατεργασία των κυττάρων με DR PAG και FK866 (Σχήμα 5D, E). Αυτή η μείωση της ΑΤΡ ήταν σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι η αναστολή της Nampt με FK866 κατέστειλε την παραγωγή του ΑΤΡ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [27]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία των κυττάρων DR με αναστολέα του CBS (CHH) και αναστολέας της CTH (ΠΣΟ) μείωσε Nampt (Σχήμα 5F). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Nampt μπορεί να λειτουργήσει ως διεγερτικό της H

2S-producting ένζυμα και έτσι η παραγωγή της H

2S, ενώ H

2S προκαλεί ανοδική ρύθμιση των Nampt.

(Α ) Ποσό H

2S απελευθερώνεται από DR

κύτταρα H W1 HepG2 αγωγή με αναστολέα CTH, PAG (100 μΜ, 18 ώρες), και ο αναστολέας Nampt, FK866 (200 nM, 24 ώρες). (Β) Ανάλυση Western blot της CBS σε κύτταρα DR εν απουσία και παρουσία FK866 (200 ηΜ, 24 ώρες). (C) Ανάλυση Western blot των CTH σε κύτταρα DR εν απουσία και παρουσία FK866 (200 ηΜ, 24 ώρες). (D) Τα επίπεδα ΑΤΡ DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2 απουσία (-) και παρουσία (+) του PAG (100 μΜ, 18 ώρες). επίπεδα (Ε) ΑΤΡ στο Pc, DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα Η2Ο2 W3 HepG2 με την απουσία και την παρουσία FK866 (200 nM, 24 ώρες). (F) Ανάλυση Western blot της Nampt σε DR

H2O2 W2 και DR

κύτταρα H2O2 W3 HepG2 που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα CBS, CHH (500 μΜ, 18 ώρες) ή αναστολέα CTH, PAG (100 μΜ, 18 ώρες). *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση της H

2S και Nampt και στιχομυθία τους βελτιώσουν βιοενεργειακό αποδοτικότητα και διευκολύνει την ανάκαμψη από βλάβες.

συσσώρευση H

2S οδηγεί σε υψηλότερες γλυκόλυση, καλύτερη βιοενεργειακό και αυξημένο πολλαπλασιασμό βλάβη ανακτηθούν τα καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από

in vivo

αναπτυχθεί όγκοι

για να προσδιοριστεί εάν τα κύτταρα παρόμοιο με

in vitro

υπάρχουν παράγονται κύτταρα DR ή μπορούν να παραχθούν σε όγκους, επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν σε αθυμικά γυμνά ποντίκια. Απομονώσαμε βιώσιμα καρκινικά κύτταρα (Τ

V) και (Τ

DR) κύτταρα βλάβη ανακτήθηκαν, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [23]. Τ

DR κύτταρα που απομονώνονται από

in vivo

δημιουργούνται όγκοι έδειξαν την συσσώρευση του H

2S καθώς και η αυξημένη έκφραση του CBS και CTH (Σχήμα 6Α, Β). Παρόμοια με

in vitro

δεδομένα, τα επίπεδα του NAD

+ και Nampt αυξήθηκαν σε Τ

DR κύτταρα σε σύγκριση με τα επίπεδα ανιχνεύθηκαν σε Pc και Τ

V κύτταρα (Σχήμα 6C, ΡΕ). ECAR αυξήθηκε σε Τ

κύτταρα DR και αυτά τα κύτταρα παρουσίασαν καλύτερη βιοενεργητική προφίλ, όπως αποδεικνύεται από αυξημένο επίπεδο ΑΤΡ και ένα υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού (Σχήμα 6Ε-G).

(Α) H

επίπεδα 2S σε Τ

V και Τ

DR κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους HepG2 καλλιεργούνται

in vivo

. (Β) Έκφραση του CBS και CTH σε Τ

V και Τ

DR κύτταρα. (C) NAD

+ επίπεδα σε Τ

V και Τ

DR κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους HepG2 καλλιεργούνται

in vivo

. (Δ) τα επίπεδα Nampt σε Τ

V και Τ

DR κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους HepG2 καλλιεργούνται

in vivo

. (Ε) ECAR σε Τ

V και Τ

DR κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους HepG2 αναπτύχθηκαν

in vivo

εκφράζονται ως το επί τοις εκατό του επιπέδου ECAR σε Pc. (F) το επίπεδο ΑΤΡ σε βιώσιμα κύτταρα όγκου (Τ

V) που απομονώνεται από HepG2 όγκους αναπτύχθηκαν

in vivo

εκφράζονται ως το επί τοις εκατό του επιπέδου ΑΤΡ στο Pc. (G) Πολλαπλασιασμός Τ

V και Τ

DR κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους HepG2 αναπτύχθηκαν

in vivo

εκφράζονται ως το επί τοις εκατό του πολλαπλασιασμού των Pc. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 2 × 10

4 και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 24 και 48 ώρες καλλιέργειας. (H) Ένα σύστημα για την H

2S-Nampt εξαρτάται βιοενεργειακό κυκλώματος. βλάβη των κυττάρων οδηγεί σε αυξημένη H

2S και Nampt που συντονισμένα να οδηγήσει σε μεταβολικές αλλαγές. Αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν εκθετική ανάπτυξη και την ανοχή σε βλάβες. *?

σ

& lt? 0,05, **?

σ

& lt? 0.005, ***?

σ

& lt?. 0.0005

Η

Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα σύστημα σύμφωνα με την οποία τα καρκινικά κύτταρα που ανακτώνται από βλάβες αλλάζουν το μεταβολικό προφίλ τους μέσω up-ρύθμιση του H

2 S μονοπάτι Nampt (Σχήμα 6Η). Έτσι, H

2S-Nampt εξαρτάται ενεργητικός κυκλώματος είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της η ανοχή του στρες, αυξημένη γλυκόλυση, βελτιωμένη βιοενεργειακό και την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Συζήτηση

Η ενδογενής παραγωγή H

2S είναι ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά στα επιθηλιακά του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα, και που προέρχονται από όγκους ενδοθηλιακών κυττάρων [28], [29]. Σύμφωνα με αυτά τα στοιχεία, δείχνουμε ότι τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα (του ήπατος, του μαστού, του δέρματος) παράγουν εγγενώς μεγάλες ποσότητες υδρόθειου ανεξάρτητα από την καταγωγή τους. H

2S αυξάνεται ακόμα περισσότερο σε καρκινικά κύτταρα μετά από οξεία βλάβη που προκαλείται από υποξία, υπεροξείδιο του υδρογόνου και βλεομυκίνη, ή μετά την ανάκτηση από βλάβη, ως αποτέλεσμα της αυξημένης έκφρασης του H

2S παράγουν ένζυμα,

CBS

και

CTH

.