Αφηρημένο

Ιστορικό

Ανθρώπινο σουλφατάση 1 (hSulf-1) είναι μια ηπαρίνη ταπεινωτική endosulfatase που desulfates πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης κυτταρικής επιφάνειας (HSPGs) στην εξωκυττάρια μήτρα και αρνητικά διαμορφώνει σύνδεσης ηπαρίνης αυξητικού παράγοντα και κυτοκινών σηματοδότηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αλλά hSulf-1 η λειτουργία είναι πιο περίπλοκη, και μοριακός μηχανισμός της δεν έχει γνωστή.

Κύρια Ευρήματα

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις λειτουργίες του hSulf-1 γονίδιο στη ρύθμιση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα υποδοχέα (VEGFR) σηματοδότησης, μια σειρά από φορείς που εκφράζουν hSulf-1, hSulf-1 μικρό φουρκέτα RNA (shRNA) και VEGFR-2 shRNA δημιουργήθηκαν. hSulf-1 επανέκφραση μπορούσε downregualte το VEGFR-2 φωσφορυλίωσης και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών και ηπατοκυτταρικού. Εξόντωση hSulf-1 έκφραση με hSulf-1 shRNA αύξησαν την ανάκτηση υψηλών επιπέδων φωσφορυλιωμένης VEGFR-2 και της έκφρασης knockdown VEGFR-2 από τον υποδοχέα VEGFR-2 shRNA ανέστειλε την δραστηριότητα πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

in vitro

σε κάποιο βαθμό. Σε ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς, η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη σαφώς μετά από ενέσεις αδενοϊού που εκφράζουν hSulf-1, με τα ποσοστά αναστολή όγκου από 46,19% και 49,56% σε μοντέλα όγκου των ωοθηκών και ηπατοκυτταρικής, αντίστοιχα. hSulf-1 μείωσε σημαντικά την πυκνότητα των μικροαγγείων του όγκου.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι hSulf-1 επανέκφραση τόσο στην ωοθηκών και του ηπατοκυτταρικού καρκίνου κύτταρα επάγει αντικαρκινική αποτελεσματικότητα υποβαθμίζοντας τη φωσφορυλίωση του VEGFR- 2 και την καταστολή της αγγειογένεσης. Ως εκ τούτου, hSulf-1 με τη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης θα μπορούσε να είναι μια λογική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Ji W, Yang J, Wang D, Cao L, Tan W, Qian H, et al. (2011) hSulf-1 Gene Εκθέματα Αντικαρκινική Αποτελεσματικότητα μέσω Αρνητικά Ρύθμιση VEGFR-2 Σηματοδοσίας σε ανθρώπινους καρκίνους. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10.1371 /journal.pone.0023274

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Απριλίου του 2011? Αποδεκτές: 11 του Ιούλη 2011? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Ji et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (81071866, 30872998). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs) σε εξωκυτταρική μήτρα είναι σημαντικά συστατικά για τη ρύθμιση της σύνδεσης ηπαρίνης σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα, όπως αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF), επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και τον αυξητικό παράγοντα των ηπατοκυττάρων (HGF) [1], [2]. Η θείωση του

N-ακετυλογλυκοζαμίνης

κατάλοιπα HSPGs είναι κρίσιμη για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των συνδετών παράγοντα και υποδοχέα κινασών τυροσίνης τους στην κυτταρική επιφάνεια [3]. Ανθρώπινα σουλφατάση 1 (hSulf-1) χαρακτηρίσθηκε να είναι μια ηπαρίνη ταπεινωτική endosulfatase που λειτουργεί για να αποσουλφωμένο HSPGs κυτταρική επιφάνεια και αρνητικά διαμορφώνουν αυξητικού παράγοντα και κυτοκινών σηματοδότηση [4]. hSulf-1 πρωτεΐνη εκφράζεται ευρέως σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά αδρανοποιείται σε πλειονότητα διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, π.χ., τον ωοθηκικό, του μαστού, του παγκρέατος, νεφρική, ηπατική, κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα [5] – [7]. Η απώλεια της ετεροζυγωτίας, η μεθυλίωση του DNA CpG νησίδων και τροποποιήσεις των ιστονών, ενδεχομένως, είναι οι κύριοι λόγοι για hSulf-1 αδρανοποίηση σε καρκίνους του ανθρώπου [8], [9]. Η παραλλαγή ηπατικού πυρηνικού παράγοντα 1 (vHNF1), που κωδικοποιείται από παράγοντα μεταγραφής 2 γονίδιο (TCF2, HNF1beta), αναφέρθηκε επίσης να ρυθμίζουν αρνητικά hSulf-1 σε καρκίνο των ωοθηκών [10]. Re-έκφραση της hSulf-1 σε καρκινικά κύτταρα αποτελεσματικά καταλήγει σε μία μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς και μία αύξηση της ευαισθησίας σε χημειοθεραπεία απόπτωσης [11]. Επομένως, τα αναφερόμενα δεδομένα πρότειναν ότι hSulf-1 κανονικά λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου.

Για να ερευνηθεί το ρυθμιστικό ρόλο της hSulf-1 σε ανάπτυξη δέσμευσης ηπαρίνης παράγοντας σηματοδότησης σε ανθρώπινους καρκίνους, οι προηγούμενες μελέτες που προσδιορίζονται ότι hSulf-1 έκφραση μπορεί να μειώσει τον καταρράκτη φωσφορυλίωσης μιας σειράς κινασών, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (ERK), που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάση πρωτεϊνικής κινάσης ( ΜΕΚ), κινάση σερίνης /θρεονίνης (ΑΚΤ) μετά από κατεργασία με εξωγενώς προστιθεμένων παραγόντων ανάπτυξης, και που ακολουθείται από την αδρανοποίηση των οδών κατάντη σηματοδότησης [6], [11], [12]. hSulf-1 εμπλέκεται επίσης στην αναστολή της αυτοκρινούς μεσολάβηση φωσφορυλίωση του EGFR-ΕΚΚ σε κύτταρα καρκίνου του μαστού που προκαλείται από στέρηση ορού, και η αναστολή της αυτοκρινούς σηματοδότηση EGFR-ΕΚΚ με hSulf-1 έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1, ένα μειωμένο κλάσμα S φάση και ένα αυξημένο κλάσμα G2-M, και τελικά οδηγεί στην αναστολή της κυτταρικής επιβίωσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [7]. Ως εκ τούτου, η απώλεια της hSulf-1 σε καρκίνους και καρκινικές κυτταρικές γραμμές συνδέεται με ρύθμιση προς τα πάνω του αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση με ενισχυμένη φωσφορυλίωση της κινάσης, και ο φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης υποδοχέα έχουν εμπλακεί στην προαγωγή της καρκινογένεση και την ανάπτυξη των καρκίνων.

Επιπλέον, η αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και τον υποδοχέα VEGF (VEGFR) εμπλέκονται σε hSulf-1-μεσολαβούμενη καταστολή των καρκινικών κυττάρων [6]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι hSulf-1 μπορεί να παρουσιάσει αντικαρκινική δραστικότητα με αναστολή της αγγειογένεσης στους περισσότερους ανθρώπινους καρκίνους. Η οικογένεια VEGFR περιέχει τρία μέλη, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (ΚΟΚ /Flk-1) και VEGFR-3 (Flt-4), τα οποία είναι διαμεμβρανικών υποδοχέων κινάσης τυροσίνης που ρυθμίζουν το σχηματισμό του αίματος και του λεμφικού σκαφών. Μεταξύ αυτών των τριών υποδοχέων, VEGFR-2 αναγνωρίζεται γενικά να έχει ένα κύριο ρόλο στη μεσολάβηση VEGF-επαγόμενη απόκριση που ρυθμίζει άμεσα την αγγειογένεση του όγκου [13]. Σε αυτή τη μελέτη, με την κατασκευή διαφόρων φορέων που φέρουν το γονίδιο hSulf-1, hSulf-1 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) ή VEGFR-2 shRNA, θα παρέχονται στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η hSulf-1 επανέκφραση παρουσίασε μια αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων με προς τα κάτω ρύθμιση VEGFR-2 σηματοδότηση και οι δύο στον καρκίνο των ωοθηκών και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος γραμμές. Η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της hSulf-1 επίσης επικυρωθεί σε ωοθηκών και ηπατική ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς.

Αποτελέσματα

Απενεργοποίηση του hSulf-1 είναι ένα κοινό μοριακό γεγονός σε πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων και εμπλέκει σε VEGFR-2 σηματοδότηση

Η πρωτεΐνη hSulf-1 εκφράζεται ευρέως σε φυσιολογικούς ιστούς και λειτουργεί για να ρυθμίζουν αρνητικά σηματοδότηση παράγοντα ανάπτυξης. Για να επιδειχθεί η απενεργοποίηση του στην πλειοψηφία των διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, εξετάσαμε την έκφραση hSulf-1 σε πολλούς τύπους ανθρώπινων δειγμάτων καρκίνου με ανοσοϊστοχημεία. Στα επιθηλιακά κύτταρα των φυσιολογικών ιστών, hSulf-1 ήταν θετικό με θετικό ρυθμό 100,0%. Αλλά στην αντίστοιχη καρκίνους τους, hSulf-1expression κατεστάλη προφανώς. Τα θετικά ποσοστά hSulf-1 ήταν 23,1% (6/26), 16,7% (2/12), 31,8% (7/22), 11,1% (1/9), 44,4% (8/18) στο ηπατοκυτταρικό, του μαστού, του στομάχου, του νεφρικού και του κόλου, αντίστοιχα (Εικ. 1Α).

(Α) Τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων καρκίνων και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους, σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλδεΰδης για 6 ώρες, παραφινώδη ενσωματωμένο, και κομμένο σε 5 μm πάχους τομές για hSulf-1 ανοσοϊστοχημεία. Τα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) ήταν αρνητικά για hSulf-1 έκφρασης, οι οποίες περιβάλλονται από κύτταρα hSulf-1-θετικός ήπατος. Ο καρκίνος του μαστού, γαστρικό καρκίνο και σαφής κύτταρα νεφρικού καρκινώματος ήταν όλα αρνητικά, και ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα ήταν θετικά για hSulf-1 έκφραση? αρχική μεγέθυνση χ 200 (άνω πάνελ). Τα ποσοστά hSulf-1-θετικών κυττάρων σε όλα τα δείγματα μετρήθηκαν εντός 5 πεδία υψηλής ισχύος (αρχική μεγέθυνση χ 400) κάτω από μικροσκόπιο, και έδειξε σε ιστογράμματα (κάτω πίνακας)? * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. (Β) Έκφραση του VEGFR-2, συμπεριλαμβανομένων των Τ-VEGFR2 και π-VEGFR2, σε 26 περιπτώσεις HCC ανιχνεύτηκε με ανοσοϊστοχημεία? αρχική μεγέθυνση χ 400 (αριστερό πάνελ). Τα θετικά ποσοστά κυττάρων σε 6 hSulf-1-θετικά και 20 hSulf-1-αρνητικά HCC μετρήθηκαν εντός 5 πεδία υψηλής ισχύος (αρχική μεγέθυνση χ 400) κάτω από μικροσκόπιο, και έδειξε σε ιστογράμματα (δεξί πάνελ)? * Ρ & lt?. 0.05

Η

Η προφανής επίδραση των hSulf-1 είναι να μειωθεί η καταρράκτη φωσφορυλίωσης μιας σειράς κινασών τυροσίνης υποδοχέα, η οποία καταδείχθηκε σε VEGF και VEGFR σηματοδότηση [6]. Ως εκ τούτου, διερεύνησαν την έκφραση της συνολικής VEGFR-2 (t-VEGFR2) και φωσφορυλιωμένο VEGFR-2 επί Tyr1175 (ρ-VEGFR2

Tyr1175) σε δείγματα όγκου (Εικ. 1Β). Μεταξύ 26 περιπτώσεις ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, υπάρχει μια προφανής μείωση του ρ-VEGFR2

επίπεδο Tyr1175 στην hSulf-1-θετικός ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα από ότι στο hSulf-1-αρνητικών ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Ρ & lt? 0,05), αλλά καμία διαφορά της έκφρασης Τ-VEGFR2 μεταξύ τους (Ρ & gt? 0,05).

αδενοϊού μεσολάβηση hSulf-1 επανέκφραση ρυθμίζει προς τα κάτω την φωσφορυλίωση του VEGFR-2 σε καρκινικά κύτταρα

Για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα της μόλυνσης αδενοϊό, BEL-7404 καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με τον αδενοϊό Ad5 ελέγχου-EGFP που φέρει ένα γονίδιο ανταποκριτή ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (EGFP) και παρατηρήθηκαν σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Τα ποσοστά του EGFP-θετικών κυττάρων ήταν 42.67 ± 12.25% και 86.33 ± 26.48% κατά πολλαπλότητες μόλυνσης (ΜΟΙ) 5 και 10 ρίυ /κύτταρο, αντίστοιχα (Εικ. 2Α).

(Α) BEL- 7404 κύτταρα μολύνθηκαν με τον αδενοϊό Ad5 ελέγχου-EGFP σε ΜΟΙ 5 και 10 pfu /κύτταρο, και παρατηρήθηκαν τα ποσοστά EGFP-θετικών κυττάρων κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού, αρχική μεγέθυνση × 400. (Β) RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση hSulf-1 έκφραση που προκαλείται από τον αδενοϊό Ad5-hSulf1. 1, Κύτταρα μολυσμένα με Ad5-hSulf1 σε ΜΟΙ 10 ρίυ /κύτταρο? 2, Κύτταρα μολυσμένα με Ad5-hSulf1 σε ΜΟΙ 10 ρίυ /κύτταρο και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με hSulf-1 φορέα shRNA σε συγκέντρωση 20 μg /10

5 κύτταρα? 3, γονικών κυττάρων. (C) Έκφραση hSulf-1, t-VEGFR2 και ρ-VEGFR2

Tyr1175 ταυτοποιήθηκε με κηλίδωση Western. φωσφορική γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για να δείξει τα επίπεδα έκφρασης του ρ-VEGFR2

Tyr1175 σε καρκινικά κύτταρα, κανονικοποιημένη με την πυκνότητα GAPDH. Οι στήλες είναι ο μέσος όρος των τριών χωριστών αναλύσεων? μπάρες = SD? ** P & lt?. 0.01

Η

Οι γονικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, SKOV3 και BEL-7404, ήταν αρνητικά για hSulf-1 έκφρασης. Μετά από 48 ώρες μετά τη μόλυνση του Ad5-hSulf1 σε ΜΟΙ 10 ρίυ /κύτταρο, τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για hSulf-1, και ο hSulf-1 shRNA μπορούσε αρνητική ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης hSulf-1 (Σχ. 2Β). Εφόσον το γονίδιο hSulf-1 μπορεί να μειώσει τη φωσφορυλίωση των κινασών που εμπλέκονται σε πολλές οδούς σηματοδότησης αυξητικού παράγοντα, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του t-VEGFR2 και ρ-VEGFR2

Tyr1175. Σε σύγκριση με τα γονικά καρκινικά κύτταρα, το επίπεδο του ί-VEGFR2 παρέμεινε καμία αλλαγή στις Ad5-hSulf1 μολυσμένα κύτταρα. Ωστόσο, το επίπεδο της ρ-VEGFR2

Tyr1175 είχε μια προφανή μείωση μετά τη μόλυνση του Ad5-hSulf1. Όταν η hSulf-1 shRNA διαμολύνθηκε στην Ad5-hSulf1 μολυσμένα κύτταρα καρκίνου, hSulf-1 έκφραση επανα-αναστέλλεται, και το περιεχόμενο της ρ-VEGFR2

Tyr1175 ανακτηθεί σχεδόν στα κανονικά επίπεδα (Σχ. 2C).

αδενοϊού μεσολάβηση hSulf-1 επανενεργοποίηση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Επειδή η απώλεια του hSulf-1 είναι ένα κοινό μοριακό γεγονός σε πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων, εμείς επανενεργοποιηθεί έκφραση hSulf-1 από μόλυνση από αδενοϊό που φέρει το γονίδιο hSulf-1 σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές και εξετάζονται τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Σε σύγκριση με τον αδενοϊό Ad5 ελέγχου-EGFP, Ad5-hSulf1 εξασκείται μια προφανή επίδραση αναστολής επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων με ΜΟΙ-εξαρτώμενο τρόπο. Όταν MOI ήταν περισσότερο από 20 pfu /κύτταρο, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε κάτω του 50% στο Ad5-hSulf1 μολυσμένα καρκινικά κύτταρα, ενώ, η κυτταρική βιωσιμότητα ήταν μεγαλύτερη από 80% στον Ad5-EGFP μολυσμένα καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Α).

(Α) και SKOV3 BEL-7404 καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με Ad5-hSulf1 σε διαφορετικές ΜΟΙ. Ad5-EGFP χρησιμοποιήθηκε ως αδενοϊό ελέγχου. (Β) SKOV3 και BEL-7404 καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με VEGFR-2 φορέα shRNA σε συγκέντρωση 20 μg /φρεάτιο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση VEGFR-2 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western και κυτταρική βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Ο αρνητικός μάρτυρας shRNA (Ctrl-shRNA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας? * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. (C) BEL-7404 καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με Ad5-hSulf1 σε ΜΟΙ 10 pfu /ml και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με VEGFR-2 φορέα shRNA σε συγκέντρωση 20 μg /10

5 κύτταρα, στη συνέχεια, VEGFR-2 έκφρασης και κύτταρο βιωσιμότητα εντοπίστηκαν. BEL-7404 γονικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να αντιπροσωπεύει το μέγιστο ποσό της κυτταρικής ανάπτυξης για την παραγωγή της επί τοις εκατό βιωσιμότητα? * P & lt? 0,05? ** Ρ & lt?. 0.01

Η

Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων επιμολύνθηκαν με τα διανύσματα που περιέχουν το VEGFR-2 shRNA και αρνητικός έλεγχος shRNA σε συγκέντρωση 20 μg /φρεάτιο. Η έκφραση του VEGFR-2 εξετάσθηκε με κηλίδωση Western, και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ). Σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο shRNA, ο VEGFR-2 shRNA ανέστειλε έκφραση VEGFR-2 και μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κάποια έκταση (Σχ. 3Β). Για να αποδειχθεί αν VEGFR-2 knockdown υπό συνθήκες hSulf-1 υπερέκφραση έχει το ίδιο αποτέλεσμα στην βιωσιμότητα των κυττάρων, BEL-7404 καρκινικά κύτταρα, τα οποία μολύνθηκαν με Ad5-hSulf1 σε ΜΟΙ 10 ρίυ /κύτταρο, επιμολύνθηκαν με VEGFR-2 διάνυσμα shRNA σε συγκέντρωση 20 μg /10

5 κύτταρα για να knockdown την έκφραση του VEGFR-2 (Εικ. S1), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BEL-7404 κυτταρικής βιωσιμότητας μετά την επιμόλυνση του VEGFR-2 shRNA περαιτέρω μειώθηκε στην πλαίσιο της hSulf-1 επίδραση (Σχ. 3C).

μεσολάβηση αδενοϊού γονιδιακής θεραπείας hSulf-1 επιδεικνύει μια ισχυρή αντικαρκινική αποτελεσματικότητα από αντιαγγειογένεση σε ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς

ενεργοποιήσετε

του hSulf- 1 λειτουργία σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να απενεργοποιήσει το κατάντη αυξητικού παράγοντα μονοπάτια σηματοδότησης, ως εκ τούτου, hSulf-1 είναι ένα νέο στόχο για γονίδιο του καρκίνου θεραπεία. Δια του παρόντος, κατασκευάσαμε ένα φορέα αδενοϊού που εκφράζει το αγρίου τύπου γονίδιο hSulf-1, Ad5-hSulf1. αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του ελέγχθηκε τόσο στην ωοθηκών και ηπατοκυτταρικό ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς (Σχ. 4Α). Μετά εντός του όγκου εγχύσεις των ιών σε μία συνολική δόση 10

9 pfu ανά ποντικό, η καταστολή της ανάπτυξης του όγκου στην ομάδα Ad5-hSulf1 αγωγή ήταν πιο αποτελεσματικό, με τα ποσοστά αναστολή όγκου από 46,19% και 49,56% σε SKOV3 και BEL- 7404 μοντέλα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το τυφλό ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0,01). Δεν υπήρχε διαφορά μεταξύ της αρνητικής ομάδας ελέγχου του ιού και την ομάδα μάρτυρα αναφοράς (Ρ & gt? 0,05).

(Α) SKOV3 και BEL-7404 μοντέλα, 5 ποντικοί ανά ομάδα, η καταστολή επίδραση του Ad5-hSulf1 επί του όγκου ανάπτυξη αναλύθηκε, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου ή την αρνητική αδενοϊό ομάδα Ad5-EGFP? Μαύρες κηλίδες στο Χ-άξονα παρουσιάζονται τα χρονικά σημεία των ενέσεων αδενοϊό? ** P & lt? 0,01. (Β) Παθολογική εξέταση των όγκων ξενομοσχεύματος SKOV3. Σύγκριση βάρος όγκου σε μοντέλα SKOV3 (αριστερό πάνελ)? Bar = 1 εκατοστό? ** P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου ή ομάδες Αά5-EGFP. Με αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώσης (ΗΕ) και ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις, οι θετικές ποσοστά κυττάρων για hSulf-1, η πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) μετρούν σημανθεί με CD31 αντισώματος, προσδιορίστηκαν ποσοτικά εντός 5 πεδία υψηλής ισχύος (αρχική μεγέθυνση χ 400) κάτω από μικροσκόπιο. Μετά ενέσεις Ad5-hSulf1, τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για hSulf-1 έκφραση σε κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, η μέτρηση της MVD μειώθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη του στην ομάδα ελέγχου. (C, D) Το σύνολο VEGFR-2 και φωσφορυλιωμένη VEGFR-2 (Γ), και το σύνολο των ΑΚΤ και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (D) ταυτοποιήθηκαν με κηλίδωση Western (αριστερό πάνελ) και ανοσοϊστοχημεία (δεξί πάνελ) σε Ad5-hSulf1 αγωγή SKOV3 ξενομοσχεύματος όγκων, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου και Ad5-EGFP.

η

στο τέλος της περιόδου παρατήρησης, ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα SKOV3 θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Τα βάρη του όγκου της ομάδας Ad5-hSulf1 ήταν χαμηλότερη από εκείνη των άλλων δύο ομάδων (Εικ. 4Β, αριστερό πάνελ). Οι τομές όγκων εγκλεισμένους σε παραφίνη εξετάστηκαν ανοσοϊστοχημικά. Στο κενό ομάδα ελέγχου, τα καρκινικά κύτταρα ήταν αρνητικά για hSulf-1 έκφρασης. Αλλά στην ομάδα Ad5-hSulf1, τα καρκινικά κύτταρα εκ νέου εκφρασμένη πρωτεΐνη hSulf-1. Μία ποσοτική ανάλυση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD) πραγματοποιήθηκε με CD31 ανοσοϊστοχημεία. Οι MVDs σε ιστούς όγκων ήταν 24.67 ± 6.51 και 52.33 ± 12.34 στην Ad5-hSulf1 και ομάδες ελέγχου, αντίστοιχα (Σχ. 4Β, δεξιά πλευρά). Υπήρχε μια σημαντική διαφορά μεταξύ τους (Ρ & lt? 0,05).

Καθώς το γονίδιο hSulf-1 ασκεί μία ευρεία ρόλο στη ρύθμιση πολλαπλές οδούς με αναστολή της φωσφορυλίωσης ενδοκυτταρικών κινασών τυροσίνης η οποία θα μπορούσε να είναι κρίσιμη σε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και αγγειογένεση όγκου, μπορούμε επομένως εξετάστηκε η έκφραση των κατάντη πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων VEGFR-2 και σερίνης /θρεονίνης κινάσης (ΑΚΤ) σε όγκους ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του ρ-VEGFR2

Tyr1175 και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ σε Thr308 (ρ-ΑΚΤ

Thr308) ήταν μειωτικά στην ομάδα Ad5-hSulf1 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 4C, D).

Συζήτηση

Η θείωση του HSPGs κυτταρικής επιφάνειας πιστεύεται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σύνδεσης ηπαρίνης του αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση σε εξωκυτταρική μήτρα [14], [15]. Η πρωτεΐνη hSulf-1 είναι ένα ένζυμο arylsulphatase δραστηριότητα που μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά την κατάσταση θείωση του HSPGs [16]. Ισχυρή απόδειξη έδειξε ότι hSulf-1 κανονικά λειτουργεί για να αποσουλφωμένο HSPGs κυτταρική επιφάνεια και ρυθμίζουν προς τα κάτω τη σηματοδότηση κινάσης τυροσίνης υποδοχέα να καταργήσει αποτελεσματικά την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση [4], [17]. Αυτή η διαδικασία διαδραματίζει ένα ξεχωριστό μέρος στην αναστολή κακοήθους μετασχηματισμού και της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων [18], [19]. Ως εκ τούτου, hSulf-1 θεωρείται ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι hSulf-1 αδρανοποιείται σε πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων μέσω είτε γενετικών μηχανισμών, όπως είναι η διαγραφή και μετάλλαξης, ή μέσω επιγενετική μηχανισμών, όπως μεθυλίωση του DNA και απακετυλίωση ιστόνης [12], [20], [21]. Δείξαμε επίσης ότι ανοσοϊστοχημικώς hSulf-1 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε 87 περιπτώσεις κλινικά δείγματα περιλαμβανομένης της ηπατοκυτταρικής, μαστού, γαστρικό, νεφρική και καρκίνοι του παχέος εντέρου, σε σύγκριση με τα παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς τους. Λόγω των λόγων που hSulf-1 έχει περιπλέξει τις λειτουργίες, και μοριακός μηχανισμός της δεν έχει καλά ακόμη γνωστό, σε αυτές τις μελέτες που εξετάσαμε αν hSulf-1-μεσολαβούμενη αναστολή του VEGFR σηματοδότηση συσχετίζεται με υπερπλασίας και αντιαγγειογένεσης σε καρκίνους.

και οι δύο πρωτογενείς βλάβες και μεταστατικούς όγκους πρέπει να αναπτύξει μια νέα αγγειακή παροχή, προκειμένου να υποστηρίξει την επέκταση των καρκινικών κυττάρων και τη διάδοση. Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα μπορούν να εκφράζουν τόσο VEGF συνδέτη και VEGFR που δρουν με αυτοκρινή βρόχο για να διεγείρουν άμεσα την αγγειογένεση όγκων [22]. Η αγγειογένεση είναι ένα περιοριστικό του ρυθμού στάδιο στην ανάπτυξη του καρκίνου, την εξέλιξη και την μετάσταση. Ο VEGF είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητή αγγειογένεσης, η οποία είναι ευρέως balancedly εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς και κυτταρικούς τύπους, αλλά ιδιαίτερα τα επάνω ρυθμισμένη σε όγκους [23]. Η σύνδεση του VEGF με αποτέλεσμα υποδοχέα της στο αυτοφωσφορυλίωση υποδοχέα και την επακόλουθη ενεργοποίηση μιας σειράς κινασών τυροσίνης, τότε ενεργοποιεί πολλαπλά κατάντη πρωτεϊνών που παίζουν λειτουργικό ρόλο στην κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αγγειακή διαπερατότητα και τη σταθεροποίηση των νέων αιμοφόρων αγγείων [24] – [ ,,,0],26]. Ως εκ τούτου, η φωσφορυλίωση με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης του VEGFR είναι μια σημαντική διαδικασία για τη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου. Επειδή hSulf-1 καταλύει την αποθείωση του HSPGs, ως εκ τούτου επηρεάζει την δεσμευτική ικανότητα των παραγόντων σύνδεσης ηπαρίνης με τους υποδοχείς τους στη EGFR, ERK1 /2, ΜΕΚ, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδούς σηματοδότησης, και πιέζει τη φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης υποδοχέα . Αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης ήταν όλοι που εμπλέκονται στην αγγειογενετική διαδικασία [27] – [29]. Εξαιρετικά θειωμένη HSPGs ενισχύσει την αλληλεπίδραση μεταξύ του VEGF και VEGFR-2, τότε φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τον VEGFR-2. Σε αυτή τη διαδικασία, η έκφραση του VEGF και VEGFR-2 μπορεί να μην επηρεάζεται από θείωση ή αποθείωση του HSPGs [30]. Διαπιστώθηκε ότι η ενίσχυση της φωσφορυλίωσης VEGFR-2 επί Tyr1175 ήταν γνωστό ότι είναι ουσιώδης για τον VEGF-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ σηματοδότησης και την αγγειογένεση [31]. Για να επαληθεύσετε την αρνητική επίδραση της hSulf-1 επί της αγγειογένεσης του καρκίνου, δημιουργήσαμε αδενοϊό που εκφράζει hSulf-1. Αδενοϊού μεσολάβηση έκφραση hSulf-1 όχι μόνο downregualted τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης VEGFR-2, αλλά επίσης παρεμπόδισαν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών και ηπατοκυτταρικού. Εξόντωση hSulf-1 έκφραση με hSulf-1 φορέα shRNA αύξησαν την ανάκτηση υψηλών επιπέδων φωσφορυλιωμένης VEGFR-2, υποδηλώνοντας ότι hSulf-1 ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση του VEGFR-2. Ωστόσο, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

in vitro από

hSulf-1 επανέκφραση μπορεί να οφείλεται κυρίως στην αποθείωση του HSPGs και αδρανοποίησης των πολλών μονοπατιών σηματοδότησης αυξητικού παράγοντα. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται το VEGFR-2 shRNA για σίγαση της έκφρασης του VEGFR-2 σε ωοθηκών και ηπατοκυτταρικό καρκινικά κύτταρα, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε κάποιο βαθμό, αποδεικνύοντας ότι η σηματοδότηση VEGFR-2 συμμετέχει στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, και η επίδραση του αντιπολλαπλασιασμού hSulf-1 σε καρκινικά κύτταρα οφείλεται εν μέρει στην αναστολή του VEGFR-2 σηματοδότηση. Όταν BEL-7404 καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με Ad5-hSulf1 για την εκ νέου εκφράζουν hSulf-1 και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με VEGFR-2 shRNA να σιγήσει έκφραση VEGFR-2, η κυτταρική βιωσιμότητα μειωθεί περαιτέρω, ακριβώς αποδεικνύοντας ότι υπάρχει ένας άλλος μηχανισμός που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση VEGFR-2 και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων στο πλαίσιο της hSulf-1 δράση.

για να αξιολογηθεί η επίδραση της hSulf-1 στην ανάπτυξη του όγκου, θα αντιμετωπίζονται τα ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς με αδενοϊό που εκφράζει hSulf-1. Τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη μετά την αγωγή. Τα ποσοστά αναστολής όγκου ήταν 46.19% και 49.56% σε μοντέλα όγκων των ωοθηκών και ηπατοκυτταρικής, αντίστοιχα. Re-έκφραση της hSulf-1 είχε ως αποτέλεσμα μειορύθμιση της φωσφορυλιωμένης VEGFR-2 και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ, τότε μειώνεται σημαντικά η πυκνότητα των μικροαγγείων του όγκου, υποδεικνύοντας ότι hSulf-1 έκφραση συσχετίστηκε με αντιαγγειογένεσης.

Συμπερασματικά, hSulf-1 είναι ένα σουλφατάση που λειτουργεί στο αποσουλφωμένο HSPGs επιφάνεια του κυττάρου. Μπορεί να αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση κατάντη της κινάσης με ένα ευρύ φάσμα και ρυθμίζουν αρνητικά τη σηματοδότηση κινάσης τυροσίνης υποδοχέα. Η μελέτη αυτή έδωσε μια πειστικά στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι hSulf-1 επανέκφραση τόσο στην ωοθηκών και του ηπατοκυτταρικού καρκινικά κύτταρα εξασθενεί την φωσφορυλίωση του VEGFR-2, τότε καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση, επάγει τελικά αποτελεσματικότητα κατά του όγκου. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι hSulf-1 με τη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης θα μπορούσε να είναι μια λογική προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Εξετάσεις hSulf-1 και VEGFR-2 έκφραση σε κλινικές δειγμάτων καρκίνου

Έκφραση hSulf-1 ανιχνεύτηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 87 περιπτώσεις κλινικά δείγματα καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των 26 ηπατοκυτταρικά καρκινώματα, 12 καρκίνους του μαστού, 22 γαστρικών καρκίνων, 9 νεφρικούς καρκίνους, 18 καρκίνοι του παχέος εντέρου, και παρακείμενο φυσιολογικό τους ιστούς. VEGFR-2, συμπεριλαμβανομένων των Τ-VEGFR2 και ρ-VEGFR2

Tyr1175, ανιχνεύθηκε επίσης σε 26 ηπατοκυτταρικά καρκινώματα με ανοσοϊστοχημεία. Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλδεΰδης για 6 ώρες, εγκλεισμένα σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε 5 μm πάχους τομές για ανοσοϊστοχημεία με ένα αντίσωμα κουνελιού αντι-hSulf-1 (Abcam inc., Cambridge, ΜΑ), ένα αντι-κουνελιού VEGFR-2 αντίσωμα και ένα

Tyr1175 αντίσωμα-φωσφο-VEGFR2 αντι-κουνελιού (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ). Έγκριση για τη χρήση των κλινικών δειγμάτων δόθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας, ο δεύτερος Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και έχουμε λάβει τη γραπτή συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη.

Προετοιμασία των φορέων και αδενοϊούς

το πλασμίδιο pcDNA3.1-hSulf1 που περιέχει το σύνολο μήκους hSulf-1 cDNA και του διανύσματος pSUPER.retro.puro περιέχει το hSulf-1 shRNA (19 ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων που στοχεύουν hSulf-1 cDNA θέσεις 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) είχαν την καλοσύνη να προικισμένος από Viji Shridhar (Τμήμα Πειραματικής Παθολογίας, Mayo Clinic Κέντρο Καρκίνου, Rochester, MN). Ο φορέας pGenesil-1,1 που περιέχει τον VEGFR-2 shRNA (19 ολιγονουκλεοτίδιο ζεύγη στόχευσης VEGFR-2 cDNA θέσεις 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) ή ο αρνητικός μάρτυρας shRNA (19 ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων: gacttcataaggcgcatgc) αγοράστηκαν από την Wuhan Genesil Βιοτεχνολογία, Ltd (Wuhan, Κίνα).

για να ανασυνδυάζεται φορέα αδενοϊού, pcDNA3.1-hSulf1 χρησιμοποιήθηκε για να ενισχυθεί το cDNA hSulf-1 με τους εκκινητές Ρ1 (5′-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 ‘) και Ρ2 (5’ gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 ‘). Το PCR προϊόν υπέστη πέψη με BamHI και SalI, στη συνέχεια εισάγεται στο πλασμίδιο αδενοϊού pDC315 (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) για να δημιουργήσει pDC315-hSulf1. Τα πλασμίδια pDC315-hSulf1 και pDC315-EGFP επιμολύνθηκαν, αντίστοιχα, σε κύτταρα ΗΕΚ293 (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Επιμόλυνσης PolyFect (QIAGEN Inc., Valencia, CA) μαζί με το πλασμίδιο πακεταρίσματος αδενοϊού pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canada). Μετά από ένα ομόλογο ανασυνδυασμό σε κύτταρα ΗΕΚ293, λάβαμε αδενοϊοί που ονομάζεται Ad5-hSulf1 και Ad5-EGFP. Ad5-EGFP χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του ιού. Όλες οι αδενοϊοί ενισχύθηκαν σε ΗΕΚ293 κύτταρα και καθαρίστηκαν με υπερ-φυγοκέντρηση επί χλωριούχου καισίου (CsCl) κλίσεις. Οι ιικοί τίτλοι ανιχνεύθηκαν με την καλλιέργεια ιστών Infectious Dose 50 (TCID50) μέθοδος [32] που συστάθηκε από Qbigene Inc. (IIIkich, Γαλλία), και έδειξε ως μονάδες πληγή που σχηματίζουν ανά χιλιοστόλιτρο (pfu /ml).

κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις

η κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), η κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος BEL-7404 (Ινστιτούτο κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα ) καλλιεργήθηκαν σε μέσα σύμφωνα με τις συστάσεις των παρόχων. Όταν τα κύτταρα ήταν σε λογαριθμική φάση, αυτοί μολύνθηκαν με αδενοϊούς (Ad5-hSulf1 ή Ad5-EGFP) με ΜΟΙ 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 pfu /κύτταρο, και συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη μόλυνση. Τα κύτταρα μολυσμένα με ιό και γονικά κύτταρα επιμολύνθηκαν τους με hSulf-1 shRNA και VEGFR-2 φορείς shRNA χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο Επιμόλυνσης PolyFect (QIAGEN Inc., Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του παρόχου. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, πουρομυκίνη (3 pg /ml) ή G418 (400 μg /ml) προστέθηκε για να επιλέξετε hSulf-1 shRNA επιμολυντές ή VEGFR-2 μορφομετατροπείς shRNA, αντίστοιχα. Μετά συνεχώς καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η σιωπή της έκφρασης γονιδίου-στόχου έχει ελεγχθεί.

In vitro

εξέταση της έκφρασης συσχετικός παράγοντα

Τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων τα γονικά κύτταρα προσβεβλημένα από ιό και shRNA επιμολυσμένα, συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη μόλυνση ή διαμόλυνση. Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από 10

5 κυττάρων με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν hSulf-1 έκφραση με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR), με την P3 εκκινητές (5′-ccaccttcatcaatgcctt -3 ‘) και Ρ4 (5′-ccttgaccagtccaaactgc-3′). Τα ενισχυμένα θραύσματα ήσαν 762 bp. αφυδρογονάση της φωσφορικής γλυκεραλδεϋδης (GAPDH) ενισχύθηκε με την P5 εκκινητές (5’-accacagtccatgccatcac-3 ‘) και Ρ6 (5′-tccaccaccctgttgcttgta-3’) ως ένα εσωτερικό έλεγχο. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από 10

5 κύτταρα με το αντιδραστήριο M-PER θηλαστικών Protein Extraction (Pierce, Rockford, IL) και διερευνήθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33], με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων των αντι-VEGFR -2 και αντι-φωσφο-VEGFR-2

Tyr1175 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ).

η βιωσιμότητα των κυττάρων με ΜΤΤ δοκιμασία

η γονική, ιό μολυσμένων και shRNA επιμολυσμένα κύτταρα αραιώθηκαν σε συγκέντρωση 10

5 κύτταρα /ml, και καλλιεργήθηκαν με πυκνότητα 100 μl /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ χρησιμοποιώντας Κιτ Πολλαπλασιασμού Κυττάρου Ι (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, ΙΝ) όπως περιγράφεται παραπάνω [34]. Μέσος όρος απορρόφησης για κάθε δείγμα εξετάστηκε με έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Model 550, Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan) σε μήκος κύματος 570 nm με ένα μήκος κύματος αναφοράς 655 nm.

Ζωικά μοντέλα και

in vivo πειράματα

SKOV3 και BEL-7404 κύτταρα υποδόρια ένεση στα δεξιά πλευρά των ποντικών BALB /c (ηυ /ηυ) (Σαγκάη Κέντρο Πειραματικής ζώων, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) , 10

7 κύτταρα ανά ποντίκι, για τη δημιουργία ξενομοσχευμάτων. Τρεις εβδομάδες αργότερα, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες: η Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP και ομάδες ελέγχου, 5 ποντίκια ανά ομάδα. Ποντικοί στις ομάδες Ad5-hSulf1 και Ad5-EGFP δόθηκαν 5 εντός του όγκου εγχύσεις, μία ένεση κάθε δεύτερη ημέρα, με συνολική δόση 10

9 pfu ιών ανά ποντικό. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν τον ίδιο όγκο του διαλύματος ιικών διατήρησης (10 mmol /L Tris-HCl ρΗ 8,0, 2 mmol /L MgCl

2, 4% σακχαρόζη). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε τακτική βάση, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο «

μια

×

β

2 × 0.5″, στην οποία

ένα

και

β

αντιπροσωπεύουν τη μέγιστη και την ελάχιστη διάμετρο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο τέλος της περιόδου παρατήρησης, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλδεΰδης για 6 ώρες. Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη διαδοχικές τομές κόπηκαν για την εξέταση της έκφρασης των hSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2

Tyr1175 και t-ΑΚΤ, π-ΑΚΤ

Thr308 με ανοσοϊστοχημεία και western αποτύπωση. Το κουνέλι αντι-φωσφο-ΑΚΤ

Thr308 αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Η τιμή MVD σε ιστούς όγκων διεξήχθη με CD31 ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα αντι-ποντικού αρουραίου CD31 μονοκλωνικού αντισώματος (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Τα θετικά ποσοστά των κυττάρων και την αξία MVD σε όγκους μετρήθηκαν εντός 5 τυχαία πεδία υψηλής ισχύος (αρχική μεγέθυνση χ 400) κάτω από μικροσκόπιο, και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) [35].