έχουν

Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχει αποδειχθεί να μεσολαβήσει ογκογενετικότητας, χημειο-αντίσταση, ραδιο-αντίσταση και μετάσταση, που προτείνουν ότι πρέπει να θεωρηθεί θεραπευτικούς στόχους. Επειδή διαφοροποιούνται θυγατρικά κύτταρα τους δεν είναι πλέον ογκογόνο, να παρακινηθεί η διαφοροποίηση των ΚΕΠ μπορεί να είναι μία από τις στρατηγικές που μπορούν να εξαλείψουν ΚΕΠ. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ATOH1 μπορεί να προκαλέσει την διαφοροποίηση του γαστρικού καρκίνου βλαστικών κυττάρων (GCSCs). Real time PCR και ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι ATOH1 προκλήθηκε κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης των GCSCs. Επιπλέον, η φακοϊό επαγόμενη υπερέκφραση του ATOH1 σε GCSCs και σε κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου που προκαλείται σημαντικά τη διαφοροποίηση, η μειωμένη πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό σφαίρα, και μειωμένη

in vivo

σχηματισμό όγκων στα μοντέλα υποδόρια ένεση και μετάσταση στο ήπαρ ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ATOH1 να θεωρηθεί για την ανάπτυξη μιας θεραπείας διαφοροποίησης για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Χαν ME, Μπεκ SJ, Kim SY, Kang CD, OH SO (2015) ATOH1 μπορεί να ρυθμίσει το Ογκογονικότητα του καρκίνου του στομάχου Τα κύτταρα με διέγερση της διαφοροποίησης του καρκίνου βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10.1371 /journal.pone.0126085

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Gianpaolo Papaccio, Δεύτερο Πανεπιστήμιο της Νάπολης, Ιταλία

Ελήφθη: 3 του Σεπτεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 30 του Μάρτη 2015? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού εκτός από τα δεδομένα αλληλουχίας RNA τα οποία είχαν κατατεθεί στο δημόσιο αποθετήριο. (GEO Αριθμός προσχώρησης: GSE46597)

Χρηματοδότηση: το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Βίο και Ιατρικής Τεχνολογίας Πρόγραμμα Ανάπτυξης (2012M3A9C6050213) και βασική επιστημονική έρευνα, Ίδρυμα (2012R1A1A3010521) του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών (NRF), που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MEST) και, επιχορήγηση από το Εθνικό R & amp? D Πρόγραμμα για τον έλεγχο του καρκίνου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (0.920.050) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μετά την καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) αρχικά απομονώθηκε από ασθενείς με λευχαιμία, είχαν απομονωθεί από πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του γαστρικού καρκίνου [1,2,3,4,5,6]. Οι ΚΕΠ προταθεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος, επειδή μπορούν να μεσολαβήσουν ογκογονικότητα, χημειο-αντίσταση, ραδιο-αντίσταση και μετάσταση [7,8,9]. Συμβατική θεραπεία κατά του καρκίνου, κυρίως οι στόχοι που πολλαπλασιαζόμενα μη-ΚΕΠ, γεγονός που εξηγεί τη συχνή υποτροπή του καρκίνου [9]. Η κακή πρόγνωση των ασθενών με μεγαλύτερο πληθυσμό CSC, ενθαρρύνει επίσης την ανάπτυξη θεραπευτικών που στοχεύουν ΚΕΠ [10].

Ένα από τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ είναι ότι μπορούν να διαφοροποιηθούν σε θυγατρικά κύτταρα τα οποία δεν είναι πλέον ογκογόνο, για παράδειγμα, , έχουν ΚΕΠ από κόλον και του στομάχου καρκίνων διεγερθεί για να διαφοροποιηθούν από τον ορό [5,6]. Αυτό σημαίνει ότι η υπόθεση CSC διαφέρει ριζικά από την παραδοσιακή κλωνική υπόθεση επέκταση. Περαιτέρω, η ιεραρχική σχέση μεταξύ ΚΕΠ και τα θυγατρικά τους κύτταρα μπορεί να εξηγηθεί από επιγενετικών μηχανισμών που μπορούν να εφαρμοστούν σε φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα [11,12]. Επιπλέον, το μικροπεριβάλλον μπορεί να επηρεάσει την διαφοροποίηση των ΚΕΠ [13], και αυτό χαρακτηριστικά μπορούν να αξιοποιηθούν για την ανάπτυξη θεραπευτικών ουσιών.

Κατά συνέπεια, η επαγωγή της διαφοροποίησης είναι μια στρατηγική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εξάλειψη ΚΕΠ. Οι ρυθμιστές Επιγενετικές προταθεί ότι επάγει διαφοροποίηση τους, για παράδειγμα, οι αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) έχουν δειχθεί να επάγουν διαφοροποίηση των ΚΕΠ σε λευχαιμία που προκλήθηκαν από πρωτεΐνες σύντηξης, όπως, ΑΜΙ 1-ΕΤΟ και PML-ΚΑΚα [14,15 ]. Επιπλέον, όλα-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) μπορεί να επάγει τη διαφοροποίηση των ΚΕΠ σε οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL) μέσω C παράγοντες /ΕΒΡ [16,17], παράγοντες μεταγραφής άγριου τύπου, όπως, C /EBPα, μπορεί να επάγεται διαφοροποίηση σε ανθρώπινο AML και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και σε ποντίκι

in vivo

μοντέλα [17,18,19,20]. Σε γαστρικό καρκίνο, σουραμίνη έχει δειχθεί ότι επάγει διαφοροποίηση ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου [21].

ATOH1 είναι μια βασική έλικα-βρόχος-έλικα (bHLH) παράγων μεταγραφής ομόλογη προς την ατονική Drosophila [22]. Ενεργοποιεί E κουτί εξαρτώμενη μεταγραφή σε συνεργασία με E47 [23]. HES1, ένα μόριο στο σηματοδοτικό μονοπάτι Notch, μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του [24]. Knock-out μελέτες ποντικών έχουν δείξει ότι ATOH1 παίζει κρίσιμο ρόλο στην παραγωγή παρεγκεφαλίδας νευρώνες κοκκίων, τριχωτά κύτταρα έσω ωτός, interneurons νωτιαίου μυελού, κύτταρα Merkel στο δέρμα και εντερικό εκκριτικά κύτταρα [25]. Είναι ενδιαφέρον, ATOH1 έχει συσχετιστεί με διάφορα είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [25].

Για την ανάπτυξη μιας νέας θεραπείας διαφοροποίηση σε γαστρικό καρκίνο, αναλύσαμε τις αλλαγές έκφραση στα επίπεδα mRNA κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των γαστρικών βλαστικών καρκίνο κύτταρα (GCSCs). Διαπιστώθηκε ότι κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των GCSCs, το επίπεδο έκφρασης του ATOH1, η οποία είναι σημαντική για τη διαφοροποίηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [26,27], ήταν σημαντικά αυξημένη. Επιπλέον, η επαγωγή της ATOH1 σε γαστρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές και σε GCSCs μείωσε σημαντικά ογκογονικότητα τους σε μοντέλα μετάστασης υποδόρια ένεση και το ήπαρ

Υλικά & amp.? Μέθοδοι

γαστρικού καρκίνου βλαστικών κυττάρων πολιτισμών

Η γαστρική καρκινικούς ιστούς ανακτήθηκαν μετά από γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο Πουσάν Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (PNUH) και Πουσάν Εθνικό Πανεπιστήμιο Yangsan Νοσοκομείο (PNUYH ). Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από Εθνικό Συμβούλιο Pusan ​​University Hospital-Institutional Review (PNUH-IRB) και Πουσάν Εθνικό Συμβούλιο κριτική Νοσοκομείο-Θεσμικών Πανεπιστήμιο Yangsan (PNUYH-IRB). Γαστρικό καρκινικά βλαστικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], και προκλήθηκαν προς διαφοροποίηση με την προσθήκη 5% FCS σε μέσα αντί των αυξητικών παραγόντων.

Culture κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου

γαστρικό καρκίνο κύτταρα (SNU 1, SNU 16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-Ν87) καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 100

μg

/κ.εκ πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένο εκκολαπτήριο. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από Κορέας γραμμή Τράπεζας Κυττάρων (Σεούλ, Κορέα).

Πολιτισμού 293FT κυτταρική σειρά

293FT κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός και 0,1 mM ΜΕΜ μη απαραίτητα αμινοξέα (ΝΕΑΑ), 1 mM ΜΕΜ πυροσταφυλικό νάτριο (και τα δύο από τη SIGMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA), 6 mM Ε-γλουταμίνη (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA), και 1% Pen-Strep σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα.

αλληλούχιση RNA και ανάλυση δεδομένων

Βιβλιοθήκη παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη IlluminaTruSeq RNA Sample Kit Prep και η αλληλουχία του χρησιμοποιώντας το Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, CA, USA) για να δημιουργήσει 76 bp ζεύγη τέλος διαβάζει. Ακολουθία διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν σε ένα ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς 19 χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C 2 [PubMed ID 19289445]. έκφραση του mRNA μετρήθηκε ως RPKM (Διαβάζει Ανά κιλοβάσεων ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει) από μοναδικά χαρτογραφηθεί διαβάζει χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο REFSEQ hg19 και το πακέτο HTSeq (https://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). αρχεία κρεβάτι παρήχθησαν χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C 2. Όλα τα RNA δεδομένα αλληλουχίας κατατέθηκαν στο δημόσιο αποθετήριο (GEO προσχώρησης Αριθμός: GSE46597)

πραγματικού χρόνου PCR

Εξαγωγή του RNA και σε πραγματικό χρόνο έγιναν PCR. με τη χρήση ενός ρεύματος SYBR Green PCR Master Mix και μία 7500 ανιχνευτή αλληλουχία ΑΒΙ Prism (αμφότερα από την Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν (εμπρός και πίσω, αντίστοιχα) είχαν ως εξής: δείκτες διαφοροποίησης? CA1, 5′-TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG-3 ‘και 5′-ΚΔ TCA GAG Γ.Ο.Σ. GGG TTG GGC G-3′? SSTR2, 5’-CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG-3 ‘και 5′-CAG TGT GAC ATC ΤΤΤ GCT ΤΤΤ CCG C-3′? CHGA, 5’-GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C-3 ‘και 5′-TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT -3′? PGC2, 5’-ΤΟΟ ΚΔ ACC ΟΤΟ CTC TGT CCG-3 ‘και 5′-ACT CCA GGA CCA TGC GGT TGA GG -3′? MUC5AC, 5’-TCA CAC GGT ΚΔ GCC CAC AGA G-3 ‘και 5′-ACC ΚΔ GCA TCT CAG AGC CCC-3′? ATP4B, 5’-ΟΑΑ AGC CCA GCC CCA CTA CAG C-3 ‘και 5′-TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3′? Βλαστική ικανότητα δείκτες? CD44, 5’-GCC ΤΟΟ GGA CTC TGC CTC GT-3 ‘και 5′-AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3′? LGR5, 5’-GAG CTG ΚΔ TCC AAC CTC AG-3 ‘και 5′-CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC-3′? BMI1, 5’-ΤΟΟ TTG CCC ΑΤΤ GAC AGC GG -3 ‘και 5′-ΑΑΑ ΑΑΤ CCC GGA AAG AGC AGC CG-3′? και c-myc, 5’-ACA CCC GAG CAA GGA ΚΕΔ GA-3 ‘και 5′-CGC GGG ΑΓΓ CTG CTG GTT TTC-3′? ATOH1, 5’-CCC CTT CCA GCA AAC ΑΟΟ TG-3 ‘και 5′-ACG GGA ΤΑΑ CAT TGC GCA GC-3′? GAPDH 5’-GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC-3 ‘και 5′-ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC-3’. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να τυποποιήσει τα επίπεδα εισόδου cDNA

ανάλυση Western blot

ανάλυση κηλίδος Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα:. ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής )? CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ΜΟ, USA)? c-myc, κασπάσης-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)? διασπασμένη κασπάση 3, κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση-9 (Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA)? ρ21, αντίσωμα β-ακτίνης (Abcam, Cambridge, MA, USA) και HRP-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ, USA).

λεντοϊών κατασκευάσματα και η παραγωγή ενεργού ιού

Για να δημιουργήσετε έναν κλώνο έκφρασης, ακολουθία επαληθεύεται ιικό ORF κλώνοι (ATOH1, IOH34744? Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη) σε φορείς καταχώρηση πύλη μεταφέρθηκαν σε φορέα pLenti7.3-DEST (pLenti7.3/V5-DEST πύλη Vector Kit, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) χρησιμοποιώντας μια αντίδραση LR ανασυνδυασμού (μείγμα ενζύμων LR Clonase II, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Για τον μετασχηματισμό, χρησιμοποιήθηκε One Shot Stbl3 Αρμόδια E. coli (Life Technologies). Μετά συνεπιμόλυνση του κλώνου έκφρασης και το ViraPower Συσκευασία Mix (Life Technologies) στην Κυτταρική Γραμμή 293FT (Life Technologies) για να παραχθεί φακοϊό, λεντοϊού υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Αυτές λεντοϊού αποθέματα χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή GCSCs και γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

συλλογή ιών και πολλαπλασιασμό διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies). Ο ιός ελέγχου δημιουργήθηκε παράλληλα, χωρίς τη συμπερίληψη των ATOH1.

Κατασκευή κυτταρικών σειρών RASSF4-δημοσιογράφος και δοκιμασία λουσιφεράσης

Η Gluc-ON Διοργανωτή Reporter κλώνοι, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί RASSF4-λουσιφεράσης κυτταρικές γραμμές αναφοράς (NCI-Ν87 και SNU216 κύτταρα) και πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή. Η lentivirus περιγράφηκε παραπάνω χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή ATOH1. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Secrete-Pair Gaussia Λουσιφεράσης Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε 72 ώρες μετά την μεταγωγή.

Ξενομοσχεύματος δοκιμασία

Τα κύτταρα αραιώθηκαν σε μια κατάλληλη δόση της ένεσης (1×10

6 κύτταρα), αναμιγνύεται με BD Matrigel (BD Biosciences, CA, USA) σε μία αναλογία 1: 1, και εγχύθηκαν υποδορίως στην ραχιαία πλευρά κάθε πλευρά σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) (n = 5 /ομάδα). Για να ελαχιστοποιηθεί η πειραματική μεταβλητότητα λόγω ατομικών διαφορών σε δέκτες ποντικούς, οι πληθυσμοί των κυττάρων που ήταν να συγκριθούν εγχύθηκαν στις αντίθετες πλευρές του τα ίδια ζώα. Οι όγκοι συλλέχθηκαν μετά από 4 εβδομάδες και τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν. Για το μοντέλο μετάστασης ήπατος, ποντίκια SCID αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κεταμίνης /Ξυλαζίνης συνδυασμό. Στη συνέχεια, οι ποντικοί τέμνονται περίπου 10 mm στο αριστερό υποπλεύρια, η σπλήνα επιβεβαιώθηκε κάτω από το περιτόναιο, το περιτόναιο ανοίχτηκε για περίπου 8 χιλιοστά και η σπλήνα εκτέθηκε πάνω από το περιτόναιο. Τα κύτταρα (5×10

4 κύτταρα /100

μl

) αργά εγχέεται στο σπλήνα ποντικών μέσω μιας βελόνας διαμετρήματος 27 (η = 5 /ομάδα) και, στη συνέχεια, η σπλήνα επιστράφηκε στην κοιλιακή κοιλότητα , το περιτόναιο και η πληγή ράβεται. 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με κύτταρα, οι ποντικοί θανατώθηκαν [37]. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων που εκδίδεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Πουσάν Εθνικό Πανεπιστήμιο-Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση Επιτροπής (PNU-IACUC) ενέκρινε όλες τις πειραματικές διαδικασίες που αφορούν τα ζώα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Πέντε ημέρες μετά από μεταγωγή με φακοϊό, 10

μl

προ-αναμεμιγμένο υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) προστέθηκε σε φρεάτια. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για δύο ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη ELISA (TECAN, Μάνερντορφ, Ελβετία).

Σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

σφαίρες διαχωρίστηκαν σε μονά κύτταρα και επιστρώνονται σε πλάκες 96 φρεατίων σε 0.2 ml όγκους μέσου. Κάθε φρεάτιο της πλάκας 96-φρεατίων περιείχε λιγότερο από 10 κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν και παρακολουθούνται για 5-7 ημέρες. Σφαίρες μεγαλύτερα από 25 μm μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντεστραμμένο μικροσκόπιο και την αποτελεσματικότητα του σχηματισμού σφαίρας συγκρίθηκε.

Ανάλυση δεδομένων

Η μη παραμετρικό Mann-Whitney U-test ή t-test του Student (ασύζευκτα συγκρίσεις) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των εννοιών των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών των δύο ομάδων, και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από πολλαπλές συγκρίσεις Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των εννοιών των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών των τριών ή περισσότερων ομάδων . * Υποδηλώνει τιμή Ρ & lt? 0,05, το οποίο θεωρείται το κριτήριο σημασία. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS, έκδοση 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SDS.

Αποτελέσματα

Πρόκληση ATOH1 κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των GCSCs

Η διαφοροποίηση των GCSCs από ορό έχει προηγουμένως αποδειχθεί [6]. Για να προσδιοριστούν οι παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση, συγκρίναμε τα προφίλ έκφρασης του mRNA των βλαστικών κυττάρων και κυττάρων σε διαφοροποιημένα κυττάρων καταστάσεις με ανάλυση της αλληλουχίας RNA. Πολλοί ογκοκατασταλτικά γονίδια επάγονται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Είναι ενδιαφέρον, ATOH1, ένας μεταγραφικός παράγοντας κρίσιμης σημασίας για τη διαφοροποίηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων, επίσης επάγεται. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η επαγωγή ATOH1 κατά τη διαφοροποίηση, εξετάσαμε μεταβολές στο επίπεδο έκφρασης του ATOH1 με πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση στυπώματος western. Βρήκαμε ως GCSCs πλησίασε τελικά στάδια διαφοροποίησης, η έκφραση του ATOH1 αυξήθηκε (Σχήμα 1).

Η διαφοροποίηση των GCSCs προκλήθηκε με την προσθήκη FBS. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (Α). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση western blot (Β).

Η

Η υπερέκφραση του ATOH1 που προκαλείται από τη διαφοροποίηση των GCSCs

Για τον προσδιορισμό των ρόλων των ATOH1 κατά τη διάρκεια GCSC διαφοροποίηση, μπορούμε να υπερεκφράζεται σε GCSCs χρησιμοποιώντας lentivirus. Για να ελέγξετε καταστάσεις διαφοροποίηση, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων δεικτών για την διαφοροποίηση ή βλαστική ικανότητα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η υπερέκφραση ATOH1 σε GCSCs αύξησε το επίπεδο έκφρασης των διαφόρων δεικτών διαφοροποίησης, αλλά μειώθηκε τα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων βλαστική ικανότητα σημειωτές (Σχήμα 2).

Διάφορα δείκτες διαφοροποίησης (Α) ή βλαστική ικανότητα (Β) ήταν Να εξεταστεί μετά υπερεκφράζουν ATOH1 σε GCSCs με πραγματικού χρόνου PCR (Α, Β) ανάλυση κηλίδος και δυτική (C). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P

& lt? 0.01.

Η

Στη συνέχεια ερευνήσαμε αν ATOH1 θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό ή σχηματισμό σφαίρας. Είναι ενδιαφέρον ότι η υπερέκφραση του ATOH1 μειώθηκαν σημαντικά τα πολλαπλασιασμούς των διαφόρων τύπων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου και ο σχηματισμός σφαίρα με GCSCs (Σχήμα 3).

Κλίμακα ράβδου = 100

μm

. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων *

P

& lt? 0.01.

Η

ATOH1 υπερέκφραση μείωσε

in vivo

ογκογενετικότητας

Για να προσδιορίσετε αν ATOH1 μπορεί να ρυθμίσει το

in vivo

ογκογονικότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο μετάστασης ήπατος που παράγεται από την έγχυση γαστρικό καρκίνο κυττάρων στον σπλήνα (τα κύτταρα στη συνέχεια μετανάστευσαν στο ήπαρ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η υπερέκφραση του ATOH1 μείωσε σημαντικά το σχηματισμό όγκων στο ήπαρ με GCSCs και ΝΟΙ-Ν87 γαστρικών καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 4). Επιπλέον, όταν κάναμε υποδόρια ξενομοσχεύματα, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν (Σχήμα 4).

Μετά από 4 εβδομάδες, ελήφθησαν οι μάζες του όγκου και μετρήθηκαν τα βάρη τους (C).

Η

ATOH1 αυξημένη δραστηριότητα RASSF4 υποστηρικτής

Για να επιβεβαιώσει εάν η διαφοροποίηση των GCSCs από ATOH1 επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση μεταγραφική δραστηριότητα της, εξετάσαμε την δράση του υποκινητή ενός γονιδίου-στόχου ATOH1 (RASSF4) χρησιμοποιώντας λουσιφεράση δοκιμασίες [29]. Μετά τον υποκινητή RASSF4, το οποίο σε συνδυασμό με το γονίδιο lucifease, εισήχθη σταθερά στα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (NCI-Ν87 και κυττάρων SNU216), εξετάσαμε επιδράσεις του ATOH1 επί της δραστικότητας της λουσιφεράσης. Η μεταγωγή με ATOH1 αύξησε σημαντικά την δραστικότητα της λουσιφεράσης του RASSF4 υποκινητή. (Σχήμα 5).

Ο υποκινητής RASSF4 σε συνδυασμό με το γονίδιο λουσιφεράσης εισήχθηκε σε NCI-Ν87 και SNU216 κύτταρα. Η μεταγωγή με ATOH1 αύξησε σημαντικά την δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων *

P

& lt? 0.01.

Η

Η συμμετοχή της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου μονοπάτια στα αποτελέσματα της ATOH1

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφερθεί τα μονοπάτια της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου που εμπλέκονται στις επιπτώσεις της ATOH1 για όγκους στον αμφιβληστροειδή [30] και του παχέος εντέρου [25]. Έτσι, εξετάσαμε αν σχετικές πρωτεΐνες συμμετέχουν επίσης στα αποτελέσματα του ATOH1 στον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3Α) και το σχηματισμό σφαίρα (Σχήμα 3Β) στην παρούσα μελέτη. Η αλλαγή στον πολλαπλασιασμό και τον σχηματισμό σφαίρας θα μπορούσε να οφείλεται σε μια πιο αργή κυτταρικού κύκλου, αυξημένο αποπτωτικό ρυθμό, ή και τα δύο.

Βρήκαμε το μεταγωγή με ATOH1 αύξησε το επίπεδο της διασπασμένης κασπάσης-3 και κασπάσης-9- σε GCSCs και κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου (Σχήμα 6), υποδηλώνοντας ότι η ενδογενής οδός της απόπτωσης μπορεί να εμπλέκονται. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης προς τα πάνω ρύθμιση του p21 κατά ATOH1 υπερέκφραση (Σχήμα 6).

Συνολικός και διασπασμένης μορφές της κασπάσης 3 και 9 εξετάστηκαν 2 ημέρες μετά την μεταγωγή με ATOH1 σε κύτταρα ΝΟΙ-Ν87, SNU216 κύτταρα και GCSCs. Η διάσπαση της κασπάσης 3 και 9, up-ρύθμιση του p21 παρατηρήθηκε στα κύτταρα ATOH1-υπερεκφράζεται.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι ATOH1, ένας παράγοντας μεταγραφής HLH , μπορεί να επάγει την διαφοροποίηση των GCSCs, και αυτό οδηγεί σε απώλεια της ογκογονικότητας. ATOH1 υπερέκφραση έχει προηγουμένως δειχθεί ότι επάγει την διαφοροποίηση των εντερικών βλαστικών κυττάρων σε εκκριτικά κύτταρα [24], και ATOH1-null ποντίκια, εκκριτικά κύτταρα δεν παρήχθησαν σε έντερο [26]. Αυτή η επίδραση του ATOH1 στη διαφοροποίηση έχει επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, με την οποία ενήργησε ως καταστολέας όγκου. Επιπλέον, περίπου το 70% των καρκίνων του παχέος, η έκφρασή του έχει αναφερθεί να περιοριστεί από γενετικούς και επιγενετικών μηχανισμών [25,31]. Σε ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα ATOH1 υπερέκφραση μειωμένη πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ και ξενομοσχεύματα [31], και τη διαγραφή του ATOH1 ενισχυμένη καρκινογέννεση σε ποντικούς [25]. Αυτά τα αποτελέσματα συλλογικά υποδηλώνουν ότι ATOH1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θεραπεία διαφοροποίησης για γαστρεντερικούς καρκίνους.

Σε αντίθεση με την επίδρασή της επί της διαφοροποίησης, ATOH1 μπορεί επίσης να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων και το σχηματισμό όγκων. Κατά τη διάρκεια της παρεγκεφαλίδας ανάπτυξη των ποντικών, ATOH1 βρέθηκε να ξεκινήσει το πρόγραμμα διαφοροποίησης των πρόδρομων ουσιών της παρεγκεφαλίδας κόκκων νευρώνα σε πρώιμο στάδιο (P0). Ωστόσο, σε μεταγενέστερο στάδιο (P5), προώθησε τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων ουσιών [32,33,34]. διαγραφή ATOH1 στο P0, παρεμποδίζει ισχυρά διαφοροποίηση, αλλά διαγραφή του σε μεταγενέστερο στάδιο είχε ως αποτέλεσμα την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση [35]. Αυτές οι διαφορετικές ρόλοι των ATOH1 σε διάφορα στάδια μπορεί να εξηγηθεί με διαφορετικούς targetomes [35]. ATOH1 προωθείται σχηματισμός μυελοβλάστωμα μαζί με το μονοπάτι σηματοδότησης hedgehog Shh [36,37]. Επιπλέον, η έκφραση του βρέθηκε να είναι σημαντικά αυξημένα σε βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι, και εντερική νευροενδοκρινών όγκων [38]. Ως εκ τούτου, για να είναι σε θέση να χρησιμοποιήσουν ATOH1 για θεραπεία διαφοροποίησης, άμεσους στόχους της, που επάγει τη διαφοροποίηση πρέπει να προσδιοριστούν.

Αν και οι εκφραστικές καταστάσεις της ATOH1 έχουν αναφερθεί σε κανονικό γαστρικό βλεννογόνο και το γαστρικό καρκίνο, οι ρόλοι του είναι κακώς χαρακτηρίζεται. ATOH1 εκφράζεται σε φυσιολογικό ανθρώπινο γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα σε χαμηλά επίπεδα [39,40], αλλά η έκφραση της δεν παρατηρήθηκε σε φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα του στομάχου ποντικού [26]. Επιπλέον, ποντικού και ανθρώπου μεταπλαστικών γαστρικό βλεννογόνο έδειξαν έκφραση ATOH1 [41], αλλά η έκφραση της δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων ΜΚΝ74, ΜΚΝ45, KATOIII, και HSC58 [40]. Σε ορισμένους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, είναι υπερεκφράζεται [39]. παθοφυσιολογικές ρόλοι της δεν έχουν ποτέ διερευνηθεί σε γαστρικό καρκίνο. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η επαγωγή της έκφρασης ATOH1 μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και ογκογονικότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Βρήκαμε επίσης την πιθανή συμμετοχή της p21 και μονοπατιού της απόπτωσης στα αποτελέσματα ATOH1 του.

Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν την πιθανότητα ότι το γονίδιο ATOH1 πρέπει να θεωρηθεί ως πιθανός στόχος της θεραπείας για τον καρκίνο του στομάχου. θα μπορούσαν να αναπτυχθούν μικρά μόρια που επάγουν την έκφραση θεραπεία ή γονιδιακή του χρησιμοποιώντας κύτταρα ιό ή στέλεχος. Ειδικότερα, ATOH1 βρέθηκε να επάγει την διαφοροποίηση των γαστρικών βλαστικών κυττάρων του καρκίνου, και ως εκ τούτου, θεραπευτικά στόχευση ATOH1 να είναι σε θέση να εξαλείψουν τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων.