Αφηρημένο

Η θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) με φάρμακα που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), π.χ., gefitinib και erlotinib, τελικά θα αποτύχει λόγω της ανάπτυξης των δευτερογενών μεταλλάξεων όπως Τ790Μ στο EGFR. Στρατηγικές για να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση είναι, επομένως, επιτακτική ανάγκη. Σε αυτή τη μελέτη, συνθέσαμε μια δωδεκάδα νέων αναλόγων gefitinib και αξιολογούνται τα αποτελέσματά τους επί L858R /Τ790Μ-EGFR που φιλοξενούν τα κύτταρα NSCLC, και ανέφερε ότι ένα από αυτά τα μιμητικά gefitinib, Ν- (2-βρωμο-5- (τριφθορομεθυλο) φαινυλο) – 6-μεθοξυ-7- (3- (πιπεριδιν-1-υλ) προποξυ) κιναζολιν-4-αμίνη (εφεξής, V1801), προκάλεσε την απόπτωση των κυττάρων NSCLC και ξεπέρασε gefitinib αντοχή σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα NCI-H1975. Αν και V1801 μόνο μετρίως ανέστειλε δραστικότητα κινάσης του EGFR, είναι αισθητά επαγόμενη την έκφραση του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Noxa, και Noxa φίμωσης μείωσε σημαντικά V1801-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων NCI-H1975. Είναι έδειξε ότι V1801 παρενέβαινε με την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής c-Myc και την οδό ρυθμίζεται εξωκυτταρικό σήμα κινάση (Erk). V1801 σε συνδυασμό με αναστολέα πρωτεασώματος bortezomib εξασκείται αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα NCI-H1975 πιθανόν λόγω ενισχυμένες επαγωγή έκφρασης Noxa. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα ανάλογα gefinitib με ασθενή EGFR ανασταλτική δραστικότητα μπορεί να ξεπεράσει τα ναρκωτικά αντίσταση μέσω ενεργοποίησης BH-3 μόνο προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, και V1801 μπορεί να έχει θεραπευτικές δυνατότητες για NSCLC

Παράθεση:. Zhang Β, Jiao J , Liu Υ, Guo LX, Zhou Β, Li GQ, et al. (2012) Gefitinib Αναλογική V1801 επάγει την απόπτωση των Τ790Μ EGFR-υπόθαλψη καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα από πάνω ρύθμιση της BH-3 Μόνο Πρωτεΐνη Noxa. PLoS ONE 7 (11): e48748. doi: 10.1371 /journal.pone.0048748

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 27 του Φεβρουαρίου 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Νοέμβρη του 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα Κλειδί για τη βασική έρευνα (2012CB910800, 2010CB833200, 2010CB529201), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (Νο 81071930, 81171925, 20972160 και 21172220), η Ειδική Ίδρυμα του Προέδρου και το Έργο κλειδί της γνώσης Πρόγραμμα Καινοτομίας της κινεζική Ακαδημία Επιστημών (KSCX1-YW-R-26 και KSCX2-YW-R-235), και το Εθνικό Μείζονος Επιστημονικής και Τεχνολογικής Πρόγραμμα Drug Discovery (2009ZX09103-101). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του πνεύμονα είναι η μία από τις πιο συχνές νεόπλασμα σε όλο τον κόσμο, η οποία περιλαμβάνει 17% του συνόλου των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 23% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο στους άνδρες [1]. Θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα προσδιορίζεται από τον ιστολογικό τύπο και το στάδιο κατά τη διάγνωση, και κυρίως περιλαμβάνει τη χειρουργική επέμβαση, η θεραπεία διπλή πλατίνα, ακτινοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία, με μόνο το 15% του συνολικού ποσοστού επιβίωσης πέντε χρόνων για όλα τα στάδια συνδυασμένη [2]. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) -targeting παράγοντες περιλαμβανομένων EGFR-ειδικά αντισώματα και αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) όπως gefitinib και erlotinib, ωφελήσει ένα ποσοστό των ασθενών ιδιαίτερα εκείνων ποτέ-καπνού και ασιατικής προέλευσης [3] – [5] . Ωστόσο, η θεραπεία με gefitinib και erlotinib τελικά θα αποτύχει λόγω της ανάπτυξης της επίκτητης αντίστασης στα φάρμακα που προκύπτουν από ενίσχυση του ΜΕΤ πρωτο-ογκογονιδίου ή το θρεονίνη-to-μεθειονίνη υποκατάσταση αμινοξέος στη θέση 790 (Τ790Μ) του EGFR, που ανιχνεύεται σε το 50% των κλινικώς ανθεκτική ασθενών [6], [7]. Η μετάλλαξη Τ790Μ στο EGFR επηρεάζει το υπόλειμμα φύλακα στην καταλυτική περιοχή της κινάσης που αποδυναμώνει την αλληλεπίδραση των αναστολέων με τον στόχο [6]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι Τ790Μ μετάλλαξη είναι μια «γενική» μετάλλαξη αντίστασης που θα μειώσουν την ισχύ οποιουδήποτε αναστολέα ΑΤΡ-ανταγωνιστική κινάσης [8]. Σε Τ790Μ κύτταρα EGFR-φιλοξενούν, η αναστολή του EGFR από σήμερα διαθέσιμα δεύτερης γενιάς EGFR-TKIs δεν είναι επαρκής για να αποτρέψει φυσιολογικά η εμφάνιση κυττάρων τα οποία εξακολουθούν να εξαρτώνται από EGFR σηματοδότησης [9]. Ως εκ τούτου, οι στρατηγικές για την αντιμετώπιση EGFR ΤΚΙ αντίσταση παραμένουν πρακτικές ανάγκες, προκειμένου να παρατείνει το χρόνο επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

Αποφυγή απόπτωση είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου, και την απόπτωση στόχευση έχει γίνει ένας καρκίνος θεραπευτική στρατηγική [10 ]. Τα κρίσιμα ρυθμιστές απόπτωσης, CLL Β κυττάρων /λεμφώματος-2 (BCL-2) και την οικογένεια πρωτεϊνών του, μπορεί να χωριστεί σε προ- και αντι-αποπτωτικά μέλη, καθώς και οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών μπορούν να υποδιαιρεθούν σε προαποπτωτικά πρωτεΐνες και ΒΗ3-μόνο υποοικογένειες, με βάση την δομική ομοιότητα τους από διάφορα ομολογίας Bcl-2 (ΒΗ) [11], [12]. Noxa είναι ένα BH3-μόνο πρωτεΐνη η οποία εμπλέκεται στην απόπτωση που σχετίζεται με βλάβη του DNA, υποξία ή έκθεση σε αναστολείς πρωτεασώματος [13] – [15]. Έκφραση Noxa σε κύτταρα Hela προωθεί έντονα την κυτταρική απόπτωση, ενώ το κλείδωμα του ενδογενούς Noxa καταστέλλει προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [16]. Συσσώρευση Noxa ευαισθητοποιεί απόπτωσης με σύνδεση προς και εξουδετέρωση του αντιαποπτωτικών πρωτεΐνη Mcl-1, οδηγώντας στην απελευθέρωση και την επακόλουθη ενεργοποίηση του Βαχ (BCL2 σχετιζόμενη Χ πρωτεΐνη) ή ΒΑΚ (BCL2-ανταγωνιστή /killer) από Ββχ /Bak-Mcl-1 σύμπλοκο [13], [17], [18]. Εκτός από το ρόλο της στην απόπτωση, Noxa ρυθμίζει επίσης διάφορες κυτταρικές λειτουργίες σε αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο και το μεταβολισμό [19], [20]. Η απόπτωση που σχετίζεται με την ενεργοποίηση Noxa επιτυγχάνεται πρωτίστως μέσω μεταγραφικής αυξορρύθμιση από ρ53, E2F1, HIF1α, c-myc, ATF3, και εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (Erk) μονοπατιού [14] – [16], [21] – [23]. Ωστόσο, η ταυτότητα των κρίσιμων ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες και ο μηχανισμός δράσης τους μετά από θεραπεία με ποικίλες αποπτωτικά ερεθίσματα παραμένουν ανεπίλυτα πλήρως.

Για διαλογή παραγόντων για την αντιμετώπιση gefitinib-αντίσταση, εμείς εδώ συντεθεί ένα αριθμός των νέων gefitinib δομικών αναλόγων και δοκιμάζονται ανασταλτικές επιπτώσεις τους στη δραστηριότητα της κινάσης του EGFR και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NCI-H1975 [24], οι οποίες φιλοξενούν L858R /Τ790Μ-EGFR [6], [7], [25] και άγριου τύπου MET χωρίς γονιδιωματικής ενίσχυση [26] που είναι ανθεκτικά στο gefitinib και erlotinib. Βρήκαμε ένα μιμητικό gefitinib, Ν- (2-βρωμο-5- (τριφθορομεθυλ) φαινυλ) -6-μεθοξυ-7- (3- (πιπεριδιν-1-υλ) προποξυ) κιναζολιν-4-αμίνη (εφεξής, V1801), μέτρια ανέστειλε τη δράση κινάσης EGFR αλλά σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται σε Τ790Μ EGFR-φιλοξενούν τα κύτταρα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) in vitro και in vivo. Δείξαμε επίσης ότι πάνω ρύθμιση Noxa κρύβεται κάτω δραστηριότητας V1801 για κύτταρα NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Πράκτορες

Τα ανάλογα gefitinib (Πίνακας 1) συντέθηκαν από τη χημεία μας ομάδα, και το

N

– (3-χλωρο-4-φθορο-φαινυλ) -7-μεθοξυ-6- (3-μορφολιν-4-υλπροποξυ) κιναζολιν-4-αμίνη (gefitinib) αγοράστηκε από J & amp? Κ Chemical Ltd. Όλες οι ενώσεις διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για να κάνουν στοκ συγκέντρωση 10 mM και διατηρήθηκε στους -20 ° C. Η 3- (4,5-dimethylthiahiazozy1) -3,5-δι-phenytetrazoliumromide (ΜΤΤ) αγοράστηκε από την Sigma. Bortezomib επιτεύχθηκε από την Millennium Pharmaceuticals Inc. Η αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο κιτ (PI) Ανίχνευση απόπτωση λήφθηκε από BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

Η

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: αντι-β-ακτίνης (Sigma)? αντι-Casp-9 (C9), αντι-Casp-8 (1C12), αντι-Casp-3 (3G2), αντι-PARP, αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ, αντι-EGFR (L858R), αντι-STAT3 , αντι-φωσφο-STAT3 (Cell Signaling)? αντι-ο-Μγο, αντι-Noxa, αντι-φωσφο-ΕΟΡΚ (Y1173), αντι-ρΑΚΤ και ΑΚΤ (Santa Cruz Biotechnology)? αντι-ERK2 (Abcam)? αντι-κουνελιού ή δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού (Pierce). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κιτ ανίχνευσης χημιφωταύγειας Western (Cell Signaling).

Κυτταρική καλλιέργεια

Το κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-H1975, Α549 και HCC827 ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection. Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Gibco /BRL, Grand Island, ΝΥ), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη. NCI-H1975 και HCC827 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη.

παρασκεύασμα RNA και RT-PCR

Το συνολικό RNA των κυττάρων απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen) και η μέθοδος εκχύλισης φαινόλης-χλωροφορμίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (2 μα) ανοπτήθηκε με τυχαία εναύσματα στους 65 ° C για 5 λεπτά. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ 1ο κλώνος cDNA Synthesis (Fermentas). Για την ενίσχυση PCR, εκκινητές είναι ως εξής: ακτίνη, προς τα εμπρός εκκινητής: 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC’-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής: 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACATC’-3′? Puma, προς τα εμπρός εκκινητή: 5′-GTCCTCAGCCCTCGCTCT-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-CTAATTGGGCTCCATCTCG-3 ‘? Bim, προς τα εμπρός εκκινητή: 5’-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3 ‘? Bcl-XL, εμπρόσθιος εναρκτήρας: 5’-GGTGGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-GGAAAGCGTAGACAAGGAGATGC-3 ‘? Mcl-1, προς τα εμπρός εκκινητής: 5’-CACGAGACGGTCTTCCAAGGCATGCT-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή: 5’-CTAGGTTGCTAGGGTGCAACTCTAGGA-3 ‘? Noxa, προς τα εμπρός εκκινητή: 5’-AAGAAGGCGCGCAAGAAC-3 ‘? αντίστροφο εκκινητή:. 5’-CGTGCACCTCCTGAGAAAAC-3 ‘

Western

δοκιμασία κηλίδος

Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, πλήρης αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ) και καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση για να ληφθεί χον κυτταρικά λύματα. Ίσες ποσότητες των δειγμάτων διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα υποδεικνύεται [27].

Παρασκευή κυτταροπλασματικά κλάσματα

Για την ανίχνευση του κυτοχρώματος c απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια, κυτταροπλασματικά κλάσματα συλλέχθηκαν από κύτταρα NCI-H1975 μετά από επώαση με 0,1 mg /ml διγιτονίνη για 3 λεπτά στους 37 ° C σε κυτοσόλιο ρυθμιστικού λύσης (0.01% διγιτονίνη, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ σε 1 × PBS σε ρΗ 7.4). Μετά από φυγοκέντρηση, τα κλάσματα του υπερκειμένου (κυτταροπλασματική κλάσμα) και το σφαιρίδιο που περιέχει τα μιτοχόνδρια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Εκτίμηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με V1801 ή gefitinib για υποδεικνύεται Οι συγκεντρώσεις και χρονικά σημεία. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με αποκλεισμό trypan blue χρωστικής [27]. Εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από χρώση με Hoechst 33258 στα 10 μg /ml για 10 λεπτά, ο κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica).

In vitro δοκιμασίες κινάσης EGFR

In vitro κινάσης ανασταλτική ικανότητα προσδιορίσθηκε με τη χρήση της ADP-Glo ​​™ δοκιμασίας κινάσης Kit και EGFR ένζυμο κινάση System (Promega), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασίες siRNA

χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο HiPerFect Transfection (Qiagen, Crawley, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια siRNA. Οι αλληλουχίες siRNA ήταν 5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3 ‘(Noxa siRNA1), 5′-AACUUCCGGCAGAAACUUC-3′ (Noxa siRNA2), και 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(αρνητικός έλεγχος (NC) siRNA), 5’-CAGAAATGTCCTGAGCAAT- 3 ‘(c-Myc siRNA1), 5′-AAGGTCAGAGTCTGGATCACC-3’ (c-Myc siRNA2).

κλωνογονική δοκιμασία

Μετά την επώαση με V1801 (3 μΜ) ή gefitinib (3 μΜ ) για 12 ώρες, ένας προσδιορισμός αποικίας μαλακού άγαρ διεξήχθη. Για το σκοπό αυτό, σε επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα εναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS και χαμηλού σημείου τήξεως 0,3% αγαρόζη (Amresco, Solon, ΟΗ) και στη συνέχεια επιστρώνεται επάνω σε ένα στερεοποιημένο στρώμα από RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS και 0,6% αγαρόζης σε πλάκα 35 mm (5.000 κύτταρα /πλάκα) εις τριπλούν. Μετά από 2 εβδομάδες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν σε 90% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma). Η μονάδες σχηματισμού με περισσότερα από 100 κύτταρα αποικία μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός [28].

δείκτη συνδυασμού

Η αλληλεπίδραση μεταξύ των ενώσεων ποσοτικοποιήθηκε με προσδιορισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίζεται από τον Chou-Talalay εξίσωση [29], [30]. Η γενική εξίσωση για την κλασική ισοβολόγραμμα δίνεται από: CI = (D) 1 /(Dx) 1+ (D) 2 /(Dx) 2. Όταν Dx υποδεικνύει την δόση μιας ένωσης μόνης απαιτείται για να παραχθεί ένα αποτέλεσμα, (D) 1 και (Δ) 2 είναι οι δόσεις των ενώσεων 1 και 2, αντίστοιχα, απαραίτητες για την παραγωγή του ίδιου αποτελέσματος σε συνδυασμό. Από αυτήν την ανάλυση, οι συνδυασμένες επιδράσεις των δύο ενώσεων μπορούν να συνοψιστούν ως εξής: CI & lt? 1 δεικνύει συνεργισμό? CI = 1 υποδηλώνει προσθετικό αποτέλεσμα? και CI & gt? 1 δείχνει ανταγωνισμό

Μοντέλα ποντικών

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Ινστιτούτου Ζωολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, με το αναγνωριστικό έγκριση. της AEC2011030205. Όλοι οι ποντικοί που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο περιβάλλον χωρίς. κύτταρα NCI-H1975 (2.5 × 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Όταν όγκος φτάσει σε ένα ψηλαφητό μέγεθος, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (η = 11 για κάθε ομάδα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με V1801 (30 mg /kg /ημέρα), gefitinib (30 mg /kg /ημέρα) ή ελέγχου του οχήματος για 3 εβδομάδες. Τα ζώα θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έχουν φτάσει τα 2 cm ή εάν τα ποντίκια φάνηκε ετοιμοθάνατο να αποφευχθούν οι περιττές νοσηρότητα στους ποντικούς. Κατά τη στιγμή του θανάτου των ζώων, οι όγκοι αποκόπηκαν? κύτταρα διαχωρίστηκαν και λύθηκαν για κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-Noxa και αντισώματος αντι-ακτίνης αντισώματα. έκφραση Noxa κατόπιν ποσοτικά με ανάλυση πυκνομετρίας και ομαλοποιήθηκε έναντι ακτίνη έκφραση.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά.

P

τιμές μικρότερες από 0,05 υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις των μιμητικών gefitinib σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και τη δραστηριότητα της κινάσης του EGFR

Σε αυτό το έργο, δεκατέσσερα ανάλογα gefitinib συντέθηκαν με την ανταλλαγή των θέσεων των C5 και C6 υποκαταστατών και μεταβάλλοντας το C4-αμινο λειτουργικότητα του πυρήνα κιναζολίνης του gefitinib, και των αποτελεσμάτων τους σε κύτταρα ΝΟΙ-H1975 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας gefitinib ως έλεγχος (Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών των ενώσεων, V1801, V1802 και V1807 βρέθηκαν να επιδεικνύουν πολύ περισσότερο ισχυρή κυτταροτοξικότητα εναντίον κυττάρων NCI-H1975 από gefitinib, και V1801 είναι το πιο ισχυρό ένα, του οποίου η τιμή IC50 3 μΜ είναι περισσότερο από τρεις πτυχώσεις χαμηλότερη από εκείνη του gefitinib ( Τραπέζι 1). Γενικά, η εισαγωγή ενός τμήματος τριφθορομεθυλανιλίνης στη θέση C4 του πυρήνα κιναζολίνης είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για τη βελτίωση της κυτταροτοξικότητας. Ένας υποκαταστάτης βρωμίου στη θέση της C2 ‘βρέθηκε να είναι μια κατάλληλη τροποποίηση για υψηλότερη δραστικότητα (V1801 vs. V1802, V1805 και V1808). Επιπλέον, η χαρακτηριστική ομάδα πιπεριδίνης στο τερματικό του C6-υποκαταστάτη των ενώσεων αυτών είναι επίσης ανώτερη σε σύγκριση με την αντίστοιχη μορφολίνη, κυκλοεξάνιο, αζιδο, τριαζολίου και τετραζολίου λειτουργικότητες.

Χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ -2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), δείξαμε ότι V1801 εμφανίζονται σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις κατά της διάδοσης των NCI-H1975 (Εικ. 1α) και φυσικού τύπου EGFR εκφράζουν Α549 (Σχ. 1β) κύτταρα με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Με trypan blue ανάλυση αποκλεισμού, βρήκαμε ότι V1801 μειώνεται ταχέως βιώσιμος NCI-H1975 (Σχ. 1γ) και Α549 (Σχ. 1 d) κυττάρων σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Εκτιμήσαμε επιδράσεις V1801 για δραστικότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων, και ανέφερε ότι, σε σύγκριση με gefitinib ή ελέγχου του οχήματος, V1801 ανέστειλε δραστικά τον κλωνογόνο δραστηριότητα των κυττάρων NCI-H1975 (Σχ. 1ε και 1στ).

(α , β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib ή V1801 για 48 ώρες, και αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. (C, d) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib ή V1801 για ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία και αξιολογήθηκε από trypan blue ανάλυση αποκλεισμού. (Ε) προσδιορισμό σχηματισμού Soft-άγαρ αποικία για τα κύτταρα NCI-H1975 αγωγή με ή χωρίς V1801 ή gefitinib. (Στ) Η ποσοτικοποίηση των εστιών καταμέτρησης. Η μέση + SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων παρουσιάζεται. (G, h) NCI-H1975 (g) και HCC827 κύτταρα (h) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με V1801 ή gefitinib για 12 ώρες, λύθηκαν και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Δοκιμάσαμε τα αποτελέσματα αυτών των αναλόγων gefitinib σε EGFR και έδειξε ότι V1801, V1802 και V1805 ασκείται μέτρια ανασταλτική δράση στην δραστικότητα κινάσης EGFR (Πίνακας 1). V1801 είχε IC

50 για EGFR πολύ υψηλότερη από εκείνη της gefitinib (701,9 nM έναντι 11,2 nM? Πίνακα 1), υποδεικνύοντας ότι οι νέες τροποποιήσεις που έγιναν στην αναλογική V1801 είναι εφαρμόσιμες αλλά λιγότερο ανώτερη για την αναστολή της δράσης της κινάσης του EGFR. Με ανάλυση κηλίδας Western σε κύτταρα ΝΟΙ-H1975, τόσο gefitinib και V1801 απέτυχε να μειορυθμίζουν φωσφορυλιωμένο EGFR (ρ-EGFR) (Εικ. 1 g), ενώ στα κύτταρα HCC827 gefitinib ευαίσθητα, gefitinib αλλά όχι V1801 επαγόμενη de-φωσφορυλίωση του ρ -EGFR (Εικ. 1 Η). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν V1801 θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου του EGFR σηματοδότησης αναστολή οδού.

V1801 επάγει την απόπτωση των κυττάρων NSCLC σε κασπάσες-εξαρτώμενο τρόπο

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν V1801 ή όχι επάγει απόπτωση των κυττάρων. Με Hoechst χρώση 33258, ήταν έδειξε NCI-H1975 κυττάρων V1801 προκαλείται συμπύκνωση χρωματίνης και κατακερματισμό που αποτελούν τυπικά αποπτωτικά πυρηνικό μορφολογικές αλλαγές (Εικ. 2α). Ένα ιωδιούχο αννεξίνης V /προπίδιο (ΡΙ) -χρώση και κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες επιβεβαίωσαν ότι η θεραπεία με V1801 για 24 ώρες επαγόμενη απόπτωση σε NCI-H1975 και κυττάρων Α549 (Σχ. 2β). Με ανάλυση κηλίδος Western, η θεραπεία V1801 βρέθηκε να οδηγήσει σε αξιοσημείωτη αύξηση στην ενεργό μορφή της κασπάσης-9, κασπάσης-8 και κασπάσης-3 και διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) σε κύτταρα NCI-H1975 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2c) και σε κύτταρα Α549 (Εικ. 2d). Όταν τα κύτταρα NCI-H1975 προ-αγωγή με έναν αναστολέα παν-κασπάσης βενζυλοξυκαρβονυλ-Val-Ala-Asp φθορομεθυλοκετόνη (z-VAD.fmk? 20 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από κατεργασία με V1801 στα 3 μΜ για 12 ώρες, V1801- απόπτωση που επάγεται καταστάλθηκε (Σχ. 2Ε), υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης καταρράκτη είναι απαραίτητη για V1801-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα gefitinib-αντίσταση.

(α) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib ή V1801 για 24 ώρες, και αξιολογείται με δοκιμασία Heochst33258. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib ή V1801 για 24 ώρες, και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αναλύθηκε με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής. (Γ) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με V1801 ή gefitinib (3 μΜ), λύθηκαν, και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Δ) τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με V1801 ή gefitinib (3 μΜ) για 24 ώρες, λύθηκαν και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Ε) τα κύτταρα NCI-H1975 προ-αγωγή με z-VAD-fmk (20 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από κατεργασία με V1801 στα 3 μΜ για 12 ώρες, και τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκαν με Annexin V /χρώση ΡΙ και η ροή ανάλυση κυτταρομετρίας. Η μέση + SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων παρουσιάζεται. **

P

& lt?. 0.01

Η

V1801 up-ρυθμίζει Noxa στον NSCLC κύτταρα

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός δράσης της V1801, τα αποτελέσματά της για το έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεϊνών (Bcl-XL και Mcl-1) και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Noxa, Puma και ΒΙΜ) της οικογένειας Bcl-2 ελέγχθηκαν σε κύτταρα NSCLC με ανάλυση RT-PCR. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι V1801 αύξησε έντονα την έκφραση των Noxa σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3α). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το αποτέλεσμα της V1801 σε επίπεδο πρωτεΐνης του Noxa, και βρέθηκε ότι η θεραπεία με V1801 στα 3 έως 4 μΜ για 24 ώρες αισθητά πάνω ρυθμισμένα Noxa σε κύτταρα NCI-H1975 (Σχ. 3β). Σε κύτταρα NCI-H1975 κατεργάζεται με V1801 σε 3 μΜ για 3 έως 6 ώρες, Noxa δραστικά αυξημένη (Σχ. 3c). Σε Α549, HCT116, BGC823 και SGC7901 κύτταρα, η θεραπεία με V1801 στους 3 έως 6 μΜ για 24 ώρες και πάνω ρυθμισμένα Noxa (Σχ. 3d). Ωστόσο, gefitinib απέτυχε να πλειορύθμιση Noxa σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3α έως 3δ), υποδεικνύοντας ότι αυτές οι δύο ενώσεις έχουν εντελώς διακριτούς μηχανισμούς στην επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

(α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης του

Noxa

,

Puma

,

Bim

,

Bcl-xl

, και

Mcl-1

σε επίπεδο mRNA σε κύτταρα NCI-H1975 αγωγή με gefitinib (3 μΜ) ή V1801 (3 μΜ) για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. (Β) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με V1801 στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες, λύθηκαν και αναλύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Noxa. (Γ) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με V1801 στα 3 μΜ για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, λύθηκαν και αναλύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Noxa. (Δ) έδειξε κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με V1801 ή gefitinib για 24 ώρες, λύθηκαν και αναλύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. (Ε) τα κύτταρα NCI-H1975 επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή ειδικά siRNA Noxa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς V1801 (3 μΜ) για 24 ώρες, λύθηκαν, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε. (Στ) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με siRNA και επεξεργάστηκε με V1801 όπως περιγράφεται στο (ε), στη συνέχεια αναλύθηκαν με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής. (Ζ) τα κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib ή V1801, λύθηκαν και δοκιμασίες κηλίδος Western ανοσοκαταβύθισης /διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (H, i) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με V1801 ή gefitinib για 24 ώρες, λύθηκαν, κυτοσολίου και μιτοχονδριακή κλάσματα απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση, και κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα (h). Η έκφραση του κυτοχρώματος C ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση πυκνομετρίας και ομαλοποιήθηκε έναντι GAPDH ή Hsp75 (Ι).

Η

απαιτείται πάνω ρύθμιση Noxa για V1801-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων NSCLC

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του στην V1801-επαγόμενη απόπτωση, Noxa σίγησε με ειδικά siRNA (Σχ. 3e), και τα κύτταρα κατόπιν V1801 αναλύθηκαν με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε ότι knockdown του Noxa εξασθενημένου σημαντικά V1801-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων NCI-H1975 (Εικ. 3f), υποδεικνύοντας ότι τα πάνω ρύθμιση του Noxa είναι απαραίτητη για V1801-επαγόμενη απόπτωση. Ωστόσο, Noxa σίγηση δεν θα μπορούσε να καταργηθεί εντελώς V1801 επαγόμενη απόπτωση κυττάρων (Σχ. 3f), υποδηλώνοντας ότι άλλοι παράγοντες μπορεί να εμπλέκονται σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που προκλήθηκε από αυτή την αναλογική gefitinib.

Noxa μπορεί άμεσα δεσμεύουν Mcl-1 και ανταγωνιστικά απελευθερώνουν Bim ή Bak από αυτό ανταγωνιστής απόπτωση, που οδηγεί σε δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και την έναρξη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [18], [31]. Πραγματοποιήσαμε συν-ανοσοκατακρήμνιση και δοκιμασίες κηλίδος Western σε V1801-επεξεργασμένα κύτταρα ΝΟΙ-H1975, και διαπίστωσαν ότι V1801 αλλά όχι gefitinib ενισχυμένη Mcl-1-Noxa συγγένεια δέσμευσης (Σχ. 3G). Στη συνέχεια εξετάστηκε η υποκυτταρική εντόπιση του κυτοχρώματος c με στύπωμα Western, ενώ η έκφραση του κυτοχρώματος C ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση πυκνομετρίας και ομαλοποιήθηκε έναντι GAPDH ή Hsp75. Βρήκαμε ότι σε κύτταρα NCI-H1975 αγωγή με V1801 (3 μΜ), αλλά όχι gefitinib (3 μΜ) για 24 ώρες, το κυτόχρωμα c μερικώς μετατοπιστεί από μιτοχόνδρια προς κυτοσόλιο (Εικ. 3 ώρες και θ). Αυτά τα αποτελέσματα απεικονίζουν ότι η αυξημένη έκφραση του Noxa προκαλεί απόπτωση που επάγεται από V1801 μέσω μονοπατιού μιτοχόνδρια.

Διερευνώντας τους μηχανισμούς που διέπουν V1801 επαγόμενη Noxa ανοδική ρύθμιση

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι το p53, c-Myc και E2F1 μπορεί μεταγραφικά αυξάνουν την έκφραση Noxa μέσω άμεσης σύνδεσης με Noxa υποκινητή [32]. Ελέγξαμε την έκφραση αυτών των παραγόντων μεταγραφής, και ανέφερε ότι μόνο το c-Myc ρυθμίζεται αυξητικά σε κύτταρα NCI-H1975 κατεργάζεται με V1801 στα 3 μΜ για 3 ώρες (Σχ. 4α). Να καθορίσει το ρόλο της στην V1801 που προκαλείται Noxa up-ρύθμιση και την απόπτωση των κυττάρων NCI-H1975, c-Myc σίγησε από συγκεκριμένες siRNA (Σχ. 4β). Βρήκαμε ότι το c-Myc φίμωση ελαφρώς κατέστειλε V1801-προκάλεσε έκφραση Noxa (Εικ. 4γ) και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NCI-H1975 (Εικ. 4d). Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, η c-Myc αναστολέα 5- (4-αιθυλο-βενζυλιδενο) -2-θειοξοθειαζολιδίν-4-όνη (10,058-F4) [33] χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει τη λειτουργία της μεταγραφής c-Myc. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 10 058-F4 καταστέλλεται μερικώς V1801 επαγόμενη Noxa ανοδική ρύθμιση (Εικ. 4ε) και κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα NCI-H1975 (Εικ. 4στ).

(α) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με gefitinib (3 μΜ) ή V1801 (3 μΜ) για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, λύθηκαν, και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης κυττάρων NCI-H1975 επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή ειδικές siRNA c-Myc και αντι-ο-Μγο αντίσωμα. (Γ) κύτταρα NCI-H1975 επιμολυσμένα με ειδικά siRNA c-Myc υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς V1801, λύθηκαν, και κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Δ) τα κύτταρα NCI-H1975 επιμολυσμένα με ειδικά siRNA c-Myc υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς V1801, και αξιολογούνται με χρώση /ΡΙ Anexin V και κυτταρομετρία ροής. (Ε) τα κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη πρωτόκολλα για 24 ώρες, λύθηκαν, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε. (Στ) τα κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη πρωτόκολλα για 24 ώρες, και αξιολογούνται με δοκιμασία ΜΤΤ. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η σισπλατίνη μπορεί να ρυθμίζουν Noxa στο Erk εξαρτάται από τη μόδα, και την αναστολή της ERK από siRNA ή μικρά U0126 ένωση αναστολέα σημαντικά εξασθενημένο σισπλατίνη που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο καθώς και έκφραση Noxa [15]. Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της V1801 επί Erk, και βρήκαν ότι σε κύτταρα NCI-H1975 κατεργάζεται με V1801 στα 3 μΜ για 12 ώρες, το φωσφο-ΕΚΚ (ρ-Erk) αυξήθηκε (Σχ. 5α). Επεξεργασμένα με V1801 για 24 h επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω τους μετατροπείς φωσφο-σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής 3 (ρ-STAT3) αλλά όχι φωσφο-Ρακ-σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση (ρ-Akt) (Σχ. 5α). Ήταν έδειξε ότι θα μπορούσε να εξασθενήσει U0126 V1801-επαγόμενη έκφραση Noxa (Σχ. 5β) και ελαφρά (p = 0.06) μειωμένη V1801-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων NCI-H1975 (Εικ. 5c).

(α) NCI -H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib (3 μΜ) ή V1801 (3 μΜ) για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, λύθηκαν, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε. (Β) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη πρωτόκολλα για 12 ή 24 ώρες, λύθηκαν, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε. (Γ) κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη πρωτόκολλα για 24 ώρες, και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αξιολογήθηκε με χρώση Αηηβχίη V /PI και κυτταρομετρία ροής. (Δ) τα κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με BOR και /ή V1801, και στη συνέχεια αξιολογείται με δοκιμασία ΜΤΤ. (Ε) τα κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με V1801 (2 μΜ), gefitinib (2 μΜ), BOR (10 ηΜ), ή συνδυασμούς τους για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

μανδύα-λεμφώματος κυττάρων, ενεργοποίηση Noxa απαιτείται για την προκαλούμενη πρωτεοσωμικού αναστολέα bortezomib απόπτωσης [13]. Δοκιμάσαμε το συνδυασμένο αποτέλεσμα των V1801 και bortezomib σε κύτταρα NCI-H1975 και διαπίστωσε ότι η βορτεζομίμπη σε 10 έως 15 Nm σημαντικά ενισχυμένη V1801 (2 μΜ) -οφειλόμενο αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχ. 5d). Μια ανάλυση του δείκτη συνδυασμού (CI) [29], [30] έδειξαν ότι οι τιμές CI ήταν λιγότερο από 1, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι δύο παράγοντες θα μπορούσε να ασκήσει συνεργιστικά αποτελέσματα επί κυττάρων NSCLC. Σε μοριακό επίπεδο, δείξαμε ότι η θεραπεία των κυττάρων NCI-H1975 με V1801 και bortezomib οδήγησε σε ενισχυμένη πάνω ρύθμιση του Noxa και ενεργοποίηση Casp-3 και διάσπαση της PARP (Σχ. 5e). Ωστόσο, η αυξητική ρύθμιση του π-Erk επάγεται από V1801 ήταν ελαφρώς εξασθενημένος από bortezomib (Σχ. 5e).

In vivo

αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των V1801 στο μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος

Δοκιμάσαμε το

in vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της V1801. Για να γίνει αυτό, γυμνοί ποντικοί υποδορίως εμβολιάσθηκαν στο δεξιό πλευρό με 2.5 × 10

6 κύτταρα NCI-H1975 σε 0,1 ml PBS. Όταν οι όγκοι έφθασαν ένα ψηλαφητό μέγεθος, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (η = 11 για κάθε ομάδα) και από του στόματος χορήγηση με V1801 (30 mg /kg /ημέρα), gefitinib (30 mg /kg /ημέρα) ή ελέγχου του οχήματος για 3 εβδομάδες. Περιέργως, βρήκαμε ότι V1801 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με το μάρτυρα φορέα ή gefitinib (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 6Α έως 6C.). Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3 εβδομάδες και τα δείγματα όγκων απομονώθηκαν και απεικονίστηκαν (Σχ. 6c). Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από δείγματα όγκου και δοκιμασία κηλίδος Western διεξήχθη. Βρήκαμε ότι σε δείγματα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με V1801, η έκφραση του Noxa ήταν ρυθμισμένη σε σύγκριση με εκείνη σε δείγματα διαχωρίζονται από ποντικούς οχήματος ή gefitinib ελέγχου (Εικ. 6d και ε). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η χορήγηση του V1801 εμφανίζει τεράστιες θεραπευτικές δυνατότητες.

(α) άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν υποδορίως με κύτταρα NCI-H1975 υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib ή V1801 για 3 εβδομάδες, και οι μετρήσεις πάχος από τις μεγαλύτερες διαμέτρους όγκου ήταν κάθετος γίνεται κάθε δύο ημέρες για να εκτιμηθεί ο όγκος του όγκου. (Β) Οι εικόνες των ποντικών δύο εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας. (Γ) Οι εικόνες των όγκων ξενομοσχεύματος ελήφθη από ποντικούς. Οκτώ αντιπροσωπευτικά όγκους για κάθε ομάδα αγωγής φαίνονται. (D, e) ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης των δειγμάτων όγκου χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα (δ). έκφραση Noxa ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση πυκνομετρίας και ομαλοποιήθηκε έναντι έκφραση ακτίνης (ε).

Η

Συζήτηση

EGFR είναι ένας υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας ενεργοποιείται σε περισσότερο από το ήμισυ των ασθενών με NSCLC, και αυτή η ενεργοποίηση μπορεί να είναι το αποτέλεσμα της πρωτεΐνης υπερέκφραση, αύξηση του αριθμού αντιγράφων γονιδίου, ή γενετικές μεταλλάξεις [2]. αντι-πνευμόνων επιδράσεις του καρκίνου Gefitinib το χαρακτηριστικό να σύνδεση του με το αδενοσίνης θέση σύνδεσης τριφωσφορικής στην περιοχή κινάσης τυροσίνης του EGFR, αναστέλλοντας έτσι τη δράση κινάσης EGFR [3], [5], [34], [35]. Αν και πολλοί ασθενείς ανταποκρίνονται αρχικά στο gefitinib, αντίσταση και όγκο υποτροπή τελικά αναπτυχθεί. Για να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση του φαρμάκου, τα νέα μεταλλαγμένη εκλεκτικούς αναστολείς κινάσης EGFR έναντι EGFR Τ790Μ έχουν αναφερθεί [36], και κιναζολίνες 4-pyrrylamino ως νέα ανάλογα gefitinib συνετέθησαν [37]. Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάζουμε, συνθέτουν και αξιολογούνται μια σειρά από νέα παράγωγα κιναζολίνης ανταλλάσσοντας τις θέσεις των C5 και C6 υποκαταστατών και μεταβάλλοντας το C4-αμινο λειτουργικότητα του gefitinib, και αναφέρουν ότι η ένωση V1801 που έχει μία ομάδα τριφθορομεθυλίου στην C5′- θέση και ένα άτομο βρωμίου στη C2′-θέση της χαρακτηριστικής ομάδας ανιλίνης υποκατεστημένη στην θέση C4 πυρήνα κιναζολίνης υπερνικά αντίσταση gefitinib μέσω πάνω ρύθμιση του Noxa, προτείνοντας μια νέα στρατηγική για την καταπολέμηση των NSCLC με μετάλλαξη EGFR Τ790Μ.