Αφηρημένο

Τα ισοθειοκυανικά από φυτά της τάξης

Brassicales

θεωρούνται ελπιδοφόρες χημειοθεραπευτικών φυτοχημικά. Ωστόσο, η επιλεκτική κυτταροτοξικότητα τους για τον καρκίνο του ήπατος έχει ελάχιστα ερευνηθεί. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε συστηματικά την χημειοθεραπευτική δραστικότητα του 4-μεθυλοθειοβουτύλιο ισοθειοκυανικό (MTBITC). Επιλεκτική τοξικότητα διερευνήθηκε με σύγκριση επίδρασή της στην καρκίνο του ήπατος κύτταρα και υποπληθυσμών χημειοθεραπεία τους σε φυσιολογικά πρωτογενή ηπατοκύτταρα και φέτες του ιστού του ήπατος. Επιπλέον, σε μια πρώτη εκτίμηση, η

in vivo

ανεκτικότητα του MTBITC διερευνήθηκε σε ποντικούς. Διακοπή της ανάπτυξης σε επαγωγή G2 /M και της απόπτωσης ήταν εμφανής σε όλες τις

in vitro

μοντέλα καρκίνου αντιμετωπίζονται με MTBITC, συμπεριλαμβανομένων πληθυσμούς με καρκίνο έναρξη χαρακτηριστικά. Αυτό διαπιστώθηκε ανεξάρτητη από TP53? Ωστόσο κυτταρικού θανάτου καθυστέρησε σε ρ53 διακυβεύεται κύτταρα σε σύγκριση με WT-ρ53 κύτταρα, τα οποία οφειλόταν πιθανώς σε διαφορική ΒΗ3 μόνο γονιδιακή ρύθμιση i. μι. Noxa και ανταγωνιστής του Α1. Σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα, καμία απόπτωση ή νέκρωση θα μπορούσαν να ανιχνευθούν μετά από επαναλαμβανόμενη χορήγηση έως και 50 μΜ MTBITC. Στα ποντίκια, εφαρμόζεται στοματικά MTBITC ήταν καλά ανεκτή πάνω από 18 ημέρες θεραπείας για μέχρι 50 mg /kg /ημέρα, η υψηλότερη δόση που δοκιμάστηκε. Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να δείξουμε εδώ ότι η επίδραση δολοφονία MTBITC έχει μια καθορισμένη εκλεκτικότητα για τα καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του ήπατος και την κυτταροτοξικότητα της ισχύει ακόμη και για χημειοθεραπεία του καρκίνου έναρξη κύτταρα. Η μελέτη μας θα μπορούσε να χρησιμεύσει για την καλύτερη κατανόηση των χημειοθεραπευτικών ιδιοτήτων των ισοθειοκυανικών σε ανθρώπινα ηπατικά που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Lamy E, Hertrampf Α, Herz C, Schüler J, Ερλάχερ Μ, Bertele D, et al . (2013) προκλινική αξιολόγηση της 4-μεθυλθειοβουτυλ Ισοθειοκυανική για τον Καρκίνο του ήπατος και του καρκίνου βλαστικών κυττάρων με διαφορετικά p53 Κατάσταση. PLoS ONE 8 (8): e70846. doi: 10.1371 /journal.pone.0070846

Επιμέλεια: Manlio Vinciguerra, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 7 Μάη, 2013? Αποδεκτές: 23 Ιουν 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: ΕΛ. Είναι χρηματοδοτήθηκε από μια ακαδημαϊκή επιχορήγηση από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Fond και το Υπουργείο Επιστημών, Έρευνας και Τεχνών Baden-Württemberg, Γερμανία. Α Β υποστηρίχθηκε για τη μελέτη αυτή με επιχορήγηση από τον Alexander von Humboldt Ίδρυμα Υποτροφιών για πεπειραμένους ερευνητές. Η χρέωση επεξεργασίας άρθρο χρηματοδοτήθηκε από το Γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (DFG) και το Πανεπιστήμιο Άλμπερτ Λούντβιχ, Φράιμπουργκ στον εκδοτικό πρόγραμμα Χρηματοδότησης Ανοικτή Πρόσβαση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Torsten Giesemann και η Τζούλια Schueler είναι μισθωτοί της Oncotest GmbH. Αυτή η εργασία δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου του πεπτικού συστήματος στη Νοτιοανατολική Ασία και την υποσαχάρια Αφρική? αυξημένη συχνότητα εμφάνισης είναι επίσης παρατηρήσει στο βιομηχανοποιημένο κόσμο [1]. Η πρόγνωση για τους ασθενείς με μείζονα ή πολυεστιακή HCC είναι κακή, με το ποσοστό επιβίωσης 5 έτους είναι λιγότερο από το 5% [2]. Αυτό οφείλεται κυρίως στην μη ανταπόκριση σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία στη θεραπεία του HCC και διαταραγμένη λειτουργία ΤΡ53 έχει αναγνωριστεί ως σημαντικός παράγοντας για το σκοπό αυτό [3]. ΤΡ53 είναι ένας βασικός παράγοντας στην αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση [4] και ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια καταστολής όγκων σε HCC [5]. Επιπλέον, η έννοια ότι υψηλά ανθεκτική στη θεραπεία του καρκίνου βλαστικά κύτταρα (ογκογενή κύτταρα, TIC) παίζουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεση ηπατοκυτταρικού καρκινώματος έχει συλλάβει πρόσφατα πολλή προσοχή. TIC είναι σε θέση να αυτο-ανανέωση, διαφοροποίηση και διατήρηση της ανάπτυξης των όγκων και την ετερογένεια. Κοινό αντικαρκινικές θεραπείες, όπως ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία δεν εξαλειφθεί το μεγαλύτερο μέρος των εξαιρετικά ανθεκτικό TIC [6]. Έτσι, ψάχνουν για εναλλακτικές στρατηγικές θεραπείας που επηρεάζουν αποτελεσματικά αυτά τα υποπληθυσμών, ξεπερνώντας έτσι την αντίσταση του όγκου και δεν στηρίζονται σε άθικτο p53 για τον καρκίνο θανάτωση των κυττάρων είναι υψίστης σημασίας [7].

Τα ισοθειοκυανικά (ITC) από φυτά της Για

Brassicales

είναι σήμερα μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της πιθανής εφαρμογής τους στην πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου. Πολυάριθμες έρευνες δείχνουν ότι φυσικά ITC και τα συνθετικά ανάλογά τους επιβραδύνουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τόσο

in vitro

και

in vivo

[8], [9]. Το πιο σημαντικό, δείχθηκε πρόσφατα ότι ITC μπορεί να καταστείλει αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) -θετικό TIC του μαστού [10] και του προστάτη [11]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της ITC κατά TIC άλλων οργάνων, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος, έχει ακόμη να προσδιοριστεί. Σε γενικές γραμμές, οι πληροφορίες σχετικά με την κυτταροτοξικά και κυτταροστατικά δυναμικό των ITC επί καρκινικών κυττάρων του ήπατος είναι σπάνια [12] – [14]. Είναι προϋπόθεση ότι οι πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες εμφανίζουν χαμηλή τοξικότητα σε κανονικό όγκο περιβάλλοντα ιστό, υπάρχει ακόμα μόνο πολύ περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με τις επιπτώσεις των ΤΠΕ σε υγιείς ιστούς. Εδώ περιγράφουμε την αντινεοπλασματική δράση των 4-μεθυλοθειοβουτύλιο ισοθειοκυανικό (MTBITC, erucin) και επιλεκτική θανάτωση του κυττάρων όγκου και TIC μέσω μιας ρ53-ανεξάρτητο μηχανισμό. MTBITC λαμβάνεται από την ενζυματική υδρόλυση του glucoerucin, απομονωμένο από είδη φυτών πυραύλων (

Eruca sativa Mill

. Και

Diplotaxis tenuifolia L

.). Επιπλέον, προέρχεται

in vivo

με μεταβολική αναγωγή του ισοθειοκυανικού σουλφοραφάνη, η οποία είναι χαρακτηριστική του μπρόκολου (

Brassica oleracea L.

). Για τις μελέτες μας, χρησιμοποιήσαμε ένα σύνολο

in vitro

μοντέλα που αποτελείται από κυτταρικές σειρές HCC, χημειοθεραπεία TIC, πρωτογενή φυσιολογικά ηπατοκύτταρα και φέτες του ιστού του ήπατος ακριβείας-cut (PCLS) που προέρχονται από ασθενείς για τη μελέτη του καρκίνου εκλεκτική κυτταροτοξικότητα των MTBITC . Τα ευρήματά μας στη συνέχεια τεκμηριώθηκε περαιτέρω από μηχανιστικές μελέτες σε διαφορετική ενεργοποίηση TP53 οδού κατά την αγωγή MTBITC. Βασισμένο σε μας

in vitro

αποτελέσματα ερευνήσαμε τελικά την ανεκτικότητα του MTBITC σε ένα μοντέλο ποντικού.

Ηθικοί Υλικά και Μέθοδοι

Η

Κανονική ηπατοκύτταρα ήταν που λαμβάνονται από ασθενείς μετά από γραπτή συγκατάθεση τους από το Τμήμα Χειρουργικής του Πανεπιστημίου Freiburg Medical Center, στη Γερμανία. Αυτό το μέρος είχε εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Freiburg (Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg /ηθική προμήθεια του Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). Για πειράματα τεμαχισμό των ιστών, ανθρώπινου ήπατος και resectates όγκου ήπατος ελήφθησαν από ασθενείς μετά από έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση τους από το Τμήμα Γενικής, σπλαγχνική & amp? Χειρουργική επέμβαση μεταμόσχευσης, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Tübingen, Γερμανία. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und π.μ. Universitätsklinikum Tübingen /ηθική της Επιτροπής της ιατρικής σχολής του Eberhard-Karls-University και το Πανεπιστήμιο Κλινική Νοσοκομείου Tuebingen). πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του γερμανικού νόμου περί Ζώων (Tierschutzgesetz) και σύμφωνα με τους αριθμούς άδεια του Regierungspräsidium Freiburg, Γερμανία G-10/05 και 35 έως 9185,64 /1. την υγεία των ζώων εξετάστηκε πριν από την τυχαιοποίηση για να εξασφαλιστεί ότι επιλέχθηκαν μόνο τα ζώα χωρίς συμπτώματα της νόσου για να εισάγετε τις διαδικασίες δοκιμών. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, τα ζώα παρακολουθήθηκαν δύο φορές ημερησίως όσον αφορά τον εφοδιασμό γενική κατάσταση, τροφή και νερό.

Χημικά

DMSO, βεραπαμίλη-υδροχλωρική, δεξαμεθαζόνη, erysoline, αιθανόλη, ιωδιούχου προπιδίου (PI) και ουδέτερο κόκκινο (NR) αποκτήθηκαν από την Sigma Aldrich (Steinheim, Γερμανία). Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM), ορό εμβρύου μόσχου (FCS), θρυψίνη 10 Χ (25 mg /ml), θρυψίνης-ΕϋΤΑ 10 × (5 mg /ml), Hanks ισορροπημένο ρυθμιστικό άλας (HBSS, χωρίς Ca και Mg) και ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, χωρίς Ca και Mg) ήταν από ΡΑΑ Laboratories GmbH (Coelbe, Germany). Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (/S P) διάλυμα και Hoechst 33342 διαλύματος (10 mg /ml), RPMI 1640, ινσουλίνη-τρανσφερίνης-Selen (ITS), κολλαγενάση τύπου IV, και 5,5 ‘, 6,6’-τετραχλωρο-1 , 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1) ήταν από την Life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Γερμανία), WST-1 αντιδραστηρίου από τη Roche (Mannheim, Germany). Accumax αγοράστηκε από eBioscience (Φρανκφούρτη, Γερμανία), κολλαγόνο G από Schubert & amp? Weiss (Μόναχο, Γερμανία), Κολλαγενάση CLS II από Biochrom (Βερολίνο, Γερμανία) και EDTA από Serva Ηλεκτροφόρηση (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). CaCl

2, Γλυκόζη, EGTA, οξικό οξύ (100% καθαρότητα), Roti®-φαινόλης /χλωροφορμίου /Isoamylalkohol και χλωροφόρμιο /Isoamylalkohol αποκτήθηκαν από τον Carl Roth (Karlsruhe, Germany), καμπτοθεκίνη (CPT) από Tocris (Eching, Γερμανία), κασπάση 3/7 αντιδραστήριο GLO από την Promega (Mannheim, Germany) και Triton Χ-100 από την Merck (Mannheim, Germany). Rompun 2%, και xylazinchloride αγοράστηκαν από την Bayer (Leverkusen, Γερμανία), Ketanest 10% και ketaminiumchloride από Essex Tierarznei (München, Germany). 4-μεθυλθειοβουτυλ ισοθειοκυανικό (MTBITC, erucin) συντέθηκε από το Ινστ. Οργανικής Χημείας, Πανεπιστήμιο του Giessen, Γερμανία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Βαλινομυκίνη αγοράστηκε από την Fluka, (Buchs, Ελβετία). ITC διαλύθηκαν σε αποστειρωμένο DMSO.

HCC κυτταρικές σειρές, απομόνωση και καλλιέργεια του HCC μοσχεύματα και τα ηπατοκύτταρα

κυτταρικές σειρές HCC.

HepG2 (WT-53) και Hep3B ( null-p53) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την Συλλογή γερμανική μικροοργανισμών και κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ), Braunschweig, Γερμανία. κύτταρα Huh-7 (mut-p53) που αρχικά ιδρύθηκε από Nakabayashi et al. [16] ήταν ευγενική προσφορά από τον H. Blum (University Medical Center Freiburg, Γερμανία). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 15% (HepG2) ή 10% (Huh7, Hep3B) FCS και 1% Ρ /δ σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C μέχρι 70% συρροής και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με τρυψίνη. επαλήθευση γραμμή κυττάρων έγινε με μικροσκόπιο τον έλεγχο της μορφολογίας των κυττάρων και την πραγματοποίηση ανάλυσης καμπύλη ανάπτυξης σε τακτική βάση. Μόνο τα κύτταρα σε αριθμό πέρασμα τέσσερα να χρησιμοποιούνται οι δέκα. Η κυτταρική καλλιέργεια, επιπλέον, βρέθηκαν αρνητικά για τη μόλυνση του μυκοπλάσματος.

HCC μοσχεύματα.

Ανθρώπινο ήπαρ όγκου ενοφθαλμισμών (LIXF, καρκίνο του ήπατος ξενομόσχευμα Φράιμπουργκ), που αρχικά ιδρύθηκε από Oncotest GmbH, Γερμανία, αναπτύχθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφεται αλλού [17]. Μοσχεύματα απεστάλησαν στο εργαστήριο μας αμέσως μετά την επέμβαση, αποφεύγοντας ψύξη ή άλλους χειρισμούς. Η διαδικασία για την προετοιμασία των πολιτισμών ήταν σύμφωνα με Patrawala

et al.

[18].

Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα.

Κανονική ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν μέσα σε 2 ώρες. Η αξιολόγηση της μη νεοπλασματικών ηπατικό παρέγχυμα διεξήχθη από έναν ανώτερο παθολόγο με εμπειρία στο ήπαρ παθολογία. Τα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνική δύο σταδίων διάχυση κολλαγενάσης σύμφωνα με ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο από Guguen-Guillouzo

et al.

[19] και Strom

et al.

[20]. Τα κύτταρα στη συνέχεια τελικά επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 15% FCS, 2 mM L-γλουταμίνη 1% Ρ /δ, 1% ITS, 100 ηΜ δεξαμεθαζόνης και καλλιεργούνται σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 20 ώρες.

ποντικού ηπατοκύτταρα.

ποντικού ηπατοκύτταρα πρόσφατα απομονωμένα με παρόμοια τεχνική διάχυσης που περιγράφεται για τα ανθρώπινα ηπατοκύτταρα και καλλιεργούνται σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 10 h.

ακριβείας-cut ιστών φέτες (PCLS)

Ο τεμαχισμός αρχίσει εντός μίας ώρας από την εκτομή σε vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Γερμανία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] φέτες επωάστηκαν σε οξυγονωμένο μέσο Ε του William που περιέχει 25 mM γλυκόζη και 50 μg /ml γενταμυκίνη (Lonza Bioscience, Verviers, Βέλγιο) σε ένα οξυγονωμένο ατμόσφαιρα (80% οξυγόνο, 5% CO

2).

Προσδιορισμός Φαρμάκου Επίδραση στα καρκινικά κύτταρα

για τα πειράματα, τα καρκινικά κύτταρα ήταν seeded, συμπληρωμένο με μέσο καλλιέργειας και επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ταπήτιο εκτέθηκαν σε ITC για 24 ώρες έως 96 ώρες. Για την έκθεση & gt? 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας, που περιέχει ITC αντικαταστάθηκε κάθε 24 ώρες

Ανίχνευση κυτταροτοξικότητα

Ουδέτερη δοκιμασία κόκκινο διατήρηση

Η ουδέτερη δοκιμασία κόκκινο κατακράτηση.. καθορίζει συσσώρευση της ουδέτερης ερυθράς βαφής σε λυσοσώματα των βιώσιμων, μη τραυματισμένα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκε ως μια άλλη παράμετρος για την ανίχνευση του κυτταρόσταση /κυτταροτοξικότητας. Μετά την ένωση της έκθεσης, τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ώρες με βαφή NR (50 μg /ml) διαλυμένο στο αντίστοιχο μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν απαλά με προθερμασμένο PBS και 150 μΙ μέσου στερέωσης (EtOH: AcCOOH: απιονισμένο νερό, 50%: 1%: 49%) που ακολουθήθηκε από ήπια ανακίνηση για 20 λεπτά. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός Tecan.

Ανίχνευση της απόπτωσης και διακοπή αύξησης

Caspase δοκιμασία διάσπασης 3/7.

Διέγερση απόπτωσης σε κυτταρικές γραμμές και πρωτογενή κύτταρα προσδιορίστηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας Caspase3 /7-Glo (Promega, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

απόπτωση σε φέτες ιστού ήπατος προσδιορίστηκε με επώαση με 50 μΜ

N

ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp-αμινομεθυλοκουμαρίνη (Ac-DEVD-AMC? Biomol, Αμβούργο, Γερμανία) σε ρυθμιστικό δοκιμασίας (50 mM HEPES, ρΗ 7.4, 1% σακχαρόζη, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT). Η διάσπαση του υποστρώματος μετρήθηκε κινητικά με φασματοφθορομετρία. Κασπάσης 3/7 δραστηριότητα προσδιορίστηκε ως η κλίση των προκυπτόντων γραμμικές παλινδρομήσεις και εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού ανά λεπτό.

Αξιολόγηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΜΜΡ).

Για την ανίχνευση των αλλαγών στο ΜΜΡ στο επίπεδο του ενός κυττάρου, το λιπόφιλο κατιόν JC-1 χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [14].

περιεχόμενο SubG1 DNA και του κυτταρικού κύκλου διανομής.

Για την ανίχνευση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου , χρησιμοποιήθηκε χρώση ΡΙ του DNA μετά την υλική ενσωμάτωση, όπως περιγράφεται αλλού [14].

Ανίχνευση νέκρωσης

ιωδιούχου προπιδίου (PI) πρόσληψη δοκιμασία.

Η δοκιμασία βασίζεται για την ποσοτικοποίηση των PI βάφονται νεκρωτικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, μετά την ένωση την έκθεση, ΡΙ (2 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό συνεχή ανακίνηση. Στη συνέχεια, οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν στις 189 g (3 λεπτά, RT). Η ποσότητα του ενδοκυτταρικού φθορισμού ΡΙ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών Tecan σε Ex:.. 525 nm /Em595 nm

προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH για φέτες ιστού

Το ποσοστό των γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) απελευθέρωσης στο υπερκείμενο ως υποκατάστατο για την ακεραιότητα της μεμβράνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία LDH Mono-Ρ (Analyticon, Lichtenfels, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα της LDH που απελευθερώνεται στην υπερκείμενο προσδιορίστηκε και ομαλοποιήθηκε ως προς το περιεχόμενο πρωτεΐνης των μεμονωμένων φετών, το οποίο προσδιορίζεται με μία δοκιμασία BCA Pierce (Thermo Scientific, Dreieich, Γερμανία).

Απομόνωση και Ανάλυση Side Πληθυσμός (SP ) κύτταρα

SP και μη SP κύτταρα αναλύθηκαν και απομονωμένα από κύτταρα Huh7 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα Huh7 θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και ένα εκατομμύριο κύτταρα /ml επαναιωρήθηκαν σε DMEM w /o ερυθρό φαινόλης που περιέχει 2% FCS και 10 mM HEPES. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 20 μg /ml Hoechst 33342 μόνο του ή μαζί με βεραπαμίλη (50 μΜ) στους 37 ° C για 90 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με παγωμένο HBSS που περιέχει 2% FCS και 10 mM HEPES. Ανάλυση και ταξινόμηση των SP και μη SP κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας MoFlo (DakoCytomation). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με HBSS, μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε MTBITC και στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

Ανίχνευση Aldehydedehydrogenase

Η έκφραση του ενζύμου Aldehydedehydrogenase (ALDH) αναλύθηκε με χρήση του κιτ ALDEFLUOR από StemCell Technologies (Grenoble, Γαλλία) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ως θετικός μάρτυρας, ο αναστολέας ΑΙ_ϋΗ ϋΕΑΒ, η οποία παρέχεται στο κιτ, χρησιμοποιήθηκε.

Κυττάρου Μετανάστευσης (μηδέν) Δοκιμασία

Ο προσδιορισμός μηδέν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [23]. Φως μικροσκοπικές εικόνες αποκτήθηκαν για κάθε δείγμα αναλύθηκαν ποσοτικά με τη χρήση του J Image λογισμικού υπολογιστών (https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). Για κάθε εικόνα, οι αποστάσεις μεταξύ μία πλευρά του μηδέν και το άλλο μετρήθηκε. Με τη σύγκριση των εικόνων από το χρόνο 0 έως το τελευταίο χρονικό σημείο (72 ώρες) την απόσταση του κάθε κλείσιμο μηδέν λήφθηκε και το μισό χρόνο για το κλείσιμο gab υπολογίζεται.

τηλέφωνο Συγχρονισμός από στέρηση ορού και DMSO

για τον συγχρονισμό των κυττάρων σε G0 /G1, το μέσο απομακρύνθηκε από τα κύτταρα HepG2 και αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς FCS για 96 h. Μετά από αυτό το διάστημα, τα κύτταρα είτε εκτέθηκαν σε DMSO ή MTBITC για άλλες 24 ώρες σε μέσο που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις FCS. Τα κύτταρα μετά συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για τη διανομή περιεχομένου DNA τους.

Σε μία δεύτερη σειρά πειραμάτων, 2% DMSO προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας των προσκολλημένων αναπτυσσόμενων κυττάρων HepG2 για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα τροφοδοτούνται με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει είτε DMSO ή MTBITC για 24 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για τη διανομή του περιεχομένου του DNA τους.

In vivo

ανεκτικότητα της MTBITC

Crl: NU-Foxn1mice (γυμνούς ποντικούς) αγοράστηκαν από την Charles River, Erkrath, Γερμανία και λαμβάνεται στο μικροαπομονωτές σε συνθήκες φραγής. Η αγωγή έγινε με ημερήσια από του στόματος καθετηριασμό με έκδοχο ή MTBITC αιωρούνται σε όχημα για 18 ημέρες.

Gene Expression Ανάλυση της ρ53 χρησιμοποιώντας ποσοτική Real Time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με το RNeasy μίνι κιτ απομόνωσης από Qiagen (Hilden, Germany), που ακολουθείται από ένα στάδιο καθαρισμού με τη χρήση της RNase-free κιτ από την Qiagen DNase (Hilden, Germany). Ένα σύνολο των 2 μg RNA από κάθε δείγμα που χρησιμοποιείται για την παραγωγή cDNA χρησιμοποιώντας το First Strand cDNA Synthesis Kit από Fermentas (St. Leon-Rot, Γερμανία). Τα δείγματα cDNA αραιώθηκαν στη συνέχεια 1:2 να 1:5 και ενισχύθηκαν με την LightCycler FastStart DNA κύριο

PLUS SYBR Green Ι Kit από την Roche (Mannheim, Germany). cDNA ρ53 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας νόημα 5′-CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 ‘, και αντινόημα 5′-TCATAG GGCACCACCACACT-3′ ολιγονουκλεοτίδια τα οποία παράγουν ένα θραύσμα 371 bp. Το cDNA βήτα-μικροσφαιρίνης γονίδιο αναφοράς ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας νόημα 5’-AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 ‘και 5′-αντινόημα ACGGCAGGCATACTCATCTT-3’ ολιγονουκλεοτίδια τα οποία παράγουν ένα θραύσμα 248 bp. Όλα τα ζεύγη εκκινητών σταυρό ιντρονίου /εξονίου τα όρια και ως εκ τούτου, τα προϊόντα της PCR δεν αντιπροσωπεύουν γενωμικού DNA μόλυνση. Οι συνθήκες PCR ήταν: πρώτα 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 10 s, 59 ° C για 10 s και 72 ° C για 30 s. Τα προϊόντα ενίσχυσης ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό Lightcycler 2.0 από τη Roche, Mannheim, Germany, με την παρασκευή ενός πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας γνωστές αραιώσεις του προτύπου cDNA. Για την κανονικοποίηση της έκφρασης του mRNA p53 για τις διαφορές δείγματος προς δείγμα στην είσοδο του RNA, την ποιότητα του RNA, και την αντίστροφη μεταγραφάση αποδοτικότητα, το γονίδιο αναφοράς βήτα-μικροσφαιρίνη ενισχύθηκε παράλληλα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Gene ανάλυση έκφρασης χρησιμοποιώντας ένα Array μονοπάτι σηματοδότησης

απομόνωση RNA από 10

6 κύτταρα ανά δείγμα πραγματοποιήθηκε με το RT

2 qPCR -Grade κιτ απομόνωσης RNA (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το RT

2 PCR Array First Strand Synthesis Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου του μονοπατιού ανθρώπινης σηματοδότησης ρ53 RT

2 Array Profiler ™ (αρ .: ΠΑΥ-027, SABioscience, Frederick, Maryland, USA) έγινε χρησιμοποιώντας ένα MyiQ μονόχρωμο Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad, München, Germany). Για την ανάλυση των δεδομένων το web-based RT

2 Profiler ™ PCR Array Ανάλυση Δεδομένων χρησιμοποιήθηκε. Τα δεδομένα αναλύθηκαν από το «2

-ΔΔCt μέθοδος», χρησιμοποιώντας το λογισμικό που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Για κάθε γονίδιο, πολλαπλή μεταβολή υπολογίστηκε ως η διαφορά στην έκφραση γονιδίων μεταξύ δύο ομάδων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Protein Ανάλυση με ανοσοστύπωση

Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται από τον Bradford [24]. Για ανοσοστύπωση, 20 μg πρωτεΐνης αναμείχθηκαν με έτοιμα ρυθμιστικό δείγματος που περιέχει SDS, συμπληρωμένο με 0.5% β-μερκαπτοαιθανόλη. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli [25]. Η γέλη στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με κηλίδωση δεξαμενής. Οι μη ειδική θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με 5% γάλα χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά σε TBS /Τ και επωάζονται με πρωτογενές, και στη συνέχεια με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) -επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα ή όλη τη νύχτα. Μετά την επώαση του αντισώματος, οι πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν ανιχνεύθηκαν με τεχνική χημειοφωταύγειας. Μια ψηφιακή εικόνα του Western Blot συλλήφθηκε από μια κάμερα CCD. προσεγγίσεις Μέγεθος ελήφθησαν με σύγκριση των χρωματισμένες ζώνες με εκείνη ενός προτύπου πρωτεΐνης φορτώνεται κατά την ηλεκτροφόρηση. Η διαδικασία επαναλήφθηκε για την δομική πρωτεΐνη β-ακτίνης.

Η σίγαση του ρ53 με RNAi

κύτταρα HepG2 συλλέχθηκαν με κατεργασία τρυψίνης και 2,5 χ 10

5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιμόλυνση με αντίστροφη Transpass R1 (χωρίς .: M2551S) από ΕΕΦ (Φρανκφούρτη α. M., Γερμανία). Για την επιμόλυνση, 10 μΐ TransPass R1 αναμείχθηκαν με 240 μΐ DMEM και επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την προσθήκη του siRNA ολιγομερών (ρ53 συντόμευσης siRNA Mix, No .: N2011S, ΝΕΒ, Φρανκφούρτη ένα M., Γερμανία?. Ελέγχουν siRNA γάτα. . δεν SC-37007, Σάντα Κρουζ βιοτεχνολογίες, Santa Cruz, USA? φλουορεσκεΐνη συζευγμένο siRNA ελέγχου, καμία .: N2100S, ΕΕΦ, Φρανκφούρτη ένας M., Γερμανία) σε τελική συγκέντρωση 25 nM, ακολουθούμενο από ένα άλλο στάδιο επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. για 15 λεπτά 250 μΙ συμπλόκου μορφομετατροπής στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κάθε φρεάτιο και HepG2 κύτταρα που περιέχουν DMEM + 15% FCS w /o αντιβιοτικών στη συνέχεια επωάστηκαν με το σύμπλοκο για 24 ώρες κάτω από τυποποιημένες συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και συμπληρώνεται με φρέσκο ​​ϋΜΕΜ που περιέχει 15% FCS για άλλες 24 ώρες πριν από την έκθεση στη δοκιμαζόμενη ουσία για 24 ώρες.

RT-MLPA και qPCR

ΚΤ- MLPA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης του mRNA των μελών οικογένειας Bcl-2. RNA από κύτταρα HepG2 και Hep3B απομονώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. RT-MLPA (MRC Holland, κιτ RM002, R011-C1) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ειδικά mRNA ήταν αντιστρόφως μεταγράφονται σε cDNA και δεσμεύονται από δύο ολιγονουκλεοτίδια κατά συνέπεια συνδέθηκε με μία θερμικά σταθερή λιγάση. Κάθε ανιχνευτής δημιουργεί μια προϊόν ενίσχυσης του μοναδικού μήκους που χωρίζονται από τριχοειδή sequencer (Genescan). Η ανάλυση διεξήχθη με GeneMapper (Applied Biosystems). Το άθροισμα όλων των κορυφών δεδομένων ορίστηκε στο 100% για την εξομάλυνση των διακυμάνσεων μεταξύ των διαφόρων δειγμάτων, και μονές κορυφές υπολογίστηκαν σε σχέση με το 100%. Ανάλυση της ρύθμισης του mRNA των Bcl-2 και BMF δεν ήταν δυνατή για τεχνικούς λόγους.

Ανάλυση Δεδομένων

Τα αποτελέσματα υπολογίζονται με τη χρήση Graphpad Prism 5.0 λογισμικό (La Jolla, CA). Η τιμή διάμεση συγκέντρωση αναστολής αύξησης (IC50) υπολογίστηκε μετά από κανονικοποίηση της ανταποκρίσεως και λογαριθμικό μετασχηματισμό με την ακόλουθη εξίσωση: Υ = 100 /(1 + 10

∧ ((LogIC50-X) * Hillslope)). ανάλυση διακύμανσης μεταξύ των ομάδων έγινε με μονόδρομη ANOVA και η σημασία της διαφοράς μεταξύ ομάδων ελέγχου και θεραπείας αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Dunnett πολλαπλό τεστ σύγκρισης. Οι διαφορές με p ≤ 0,05 (*) ή p≤0.01 (**) θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Η κυτταροτοξικότητα της ITC στο συκώτι Tumor Cells σύγκριση με τα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα

Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία κατακράτησης NR για την αξιολόγηση των MTBITC κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. Αυτή η δοκιμασία έχει αναφερθεί ως υψηλής ευαισθησίας παράμετρος κυτταροτοξικότητα [26]. Μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση απώλεια βιωσιμότητας, όπως προσδιορίζεται με εξασθενημένη ικανότητα συγκράτησης λυσοσωματικής NR παρατηρήθηκε σε όλες τις δοκιμασμένες καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία MTBITC για 24 ώρες (Σχήμα 1Α). Σε αντίθεση, σε ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, καμία σχετική απώλεια βιωσιμότητας παρατηρήθηκε εντός 24-72 ώρες κατεργάζεται με & lt? 50 μΜ MTBITC (Σχήμα 1Β). Σε ποντικού ηπατοκύτταρα, MTBITC προκάλεσε κάποιες διαδικασίες διεύρυνσης της ουδέτερης-κόκκινο συσσωρεύοντας χωρητικότητα λυσοσώματα μετά από 72 ώρες θεραπείας MTBITC (Σχήμα 1Β). Με βάση τα αποτελέσματα που προέρχονται μετά από θεραπεία MTBTIC 24 ώρες, οι τιμές IC50 υπολογίζονται με 23.18 μΜ (HepG2), 20,89 μΜ (Huh7), 31,97 μΜ (Hep3B), 13,11 μΜ (LIXF), 72.09 (ανθρώπινα ηπατοκύτταρα) και 47.81 (μυϊκό ηπατοκύτταρα) .

θεραπεία

MTBITC εξασθενεί επιλεκτικά κύτταρο επιβίωση των ηπατικών κυττάρων όγκου (α) σε σύγκριση με πρωτογενή ηπατοκύτταρα (β). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κατακράτησης NR μετά από έκθεση σε MTBITC για 24-72 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με τον έλεγχο (0,1% DMSO), ράβδοι είναι μέση τιμή + SD, (αριθμός των ανεξάρτητων πειραμάτων δίδεται παρακάτω σχήματα). Θετικός έλεγχος (+), 0,01% Triton Χ-100. ** ≤p & lt? 0,01 σε σύγκριση με το DMSO

Η

Ανάπτυξη σύλληψης και απόπτωση επαγωγής στα ανθρώπινα κύτταρα HCC και φυσιολογικά ηπατοκύτταρα /PCLS

Για να αξιολογήσουν τη φύση της απομείωσης βιωσιμότητας που παρατηρήθηκαν σε MTBITC-. τόνισε κύτταρα HCC, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν αυτό οφειλόταν σε μια στάση στην ανάπτυξη των κυττάρων, αποπτωτικών ή νεκρωτικών διαδικασιών (σχήμα 2 και 3). Αναλύσαμε πρώτα τα κύτταρα για κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση ως ειδικός δείκτης απόπτωσης. Εντός 24 h, MTBITC επάγεται σημαντική απόπτωση σε 25 μΜ, αλλά μόνο σε κύτταρα (HepG2) p53-wt? καμία αύξηση θα μπορούσε να δει στα κύτταρα, κύτταρα p53-mut (Huh7) ρ53-ηυΙΙ (Hep3B) ή LIXF (Σχήμα 2Α). Κανονική ηπατοκύτταρα παρέμεινε ανεπηρέαστη από την αγωγή, όπως διερευνήθηκε σε ανθρώπινα ή ποντικού κύτταρα σε 24 h (Σχήμα 2C). Δεν μπορέσαμε να βρούμε σημάδια που MTBITC προκάλεσε μια νεκρωτική αντίδραση σε κακοήθη ή φυσιολογικά κύτταρα, ακόμη και στα 50 μΜ, όπως προσδιορίζεται με χρώση των κυττάρων ΡΙ (εικόνα 2β και δ). Όροι επανειλημμένη έκθεση (έως 72 ώρες), όπως θα συνέβαινε υπό χημειοθεραπεία, δεν ευαισθητοποιήσει περαιτέρω υγιή ηπατικά κύτταρα σε απόπτωση (Σχήμα 2γ) ή νέκρωση (εικόνα 2d). Οι παρατηρήσεις που έγιναν στην κανονική ηπατοκύτταρα περαιτέρω επαληθεύεται με χρησιμοποίηση PCLS. Αυτό το

ex vivo

μοντέλο επιτρέπει την κάλυψη της πολυπλοκότητας της δομής του ήπατος και την πολλαπλότητα των μεταβολικών, ομοιοστατική, ενδοκρινικό και βιομετατροπή λειτουργίες. Ως εκ τούτου, αντανακλά καλύτερα το υψηλό επίπεδο βιολογικής οργάνωσης του οργάνου [27]. Η έκθεση των PCLS έως 25 μm MTBITC δεν αύξησε την απόπτωση (Σχήμα 2Ε) ή νέκρωση (εικόνα 2f) ποσοστό σε υγιή ιστό, αλλά μάλλον αυτό καταστέλλεται, σε σύγκριση με τον έλεγχο φέτες. Σε αντίθεση, ο θετικός έλεγχος, 1 μg /ml ακτινομυκίνη D σε συνδυασμό με 100 ng /ml TNF προκαλούσε βαθιά ηπατική απόπτωση (Σχήμα 2Ε).

Επίδραση της MTBITC στην απόπτωση (a, c, και e) ή νέκρωση (b, d και f) επαγωγή σε κακοήθη και υγιή κύτταρα. επαγωγή απόπτωσης Διακριτή εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δραστικότητα κασπάσης 3/7 μετά από αγωγή των κυττάρων με MTBITC για 12 έως 72 ώρες. Θετικός έλεγχος (+): 10 μΜ CPT ή σταυροσπορίνη (A, C), 1 μg /ml ακτινομυκίνης D /100 ng /ml TNF (ActD /TNF) (ε). επαγωγή νέκρωση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ειδική πρόσληψη ΡΙ σε απομονωμένα κύτταρα (Β και D) ή απελευθέρωση LDH από PCLS (στ). Θετικός έλεγχος (+): 0,2% Triton Χ-100. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε σχέση με το διαλύτη (0.1% DMSO). Οι στήλες είναι μέσες + SD, (αριθμός των ανεξάρτητων πειραμάτων δίδεται παρακάτω σχήματα?. Πειράματα σε PCLS διεξήχθησαν εις τριπλούν).

Η

G2 /M σύλληψης (α έως δ) και την απόπτωση (ε ) επαγωγή μετά την επεξεργασία των κυττάρων HCC με MTBITC, όπως προσδιορίζεται με χρώση ΡΙ των DNA και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Επιπτώσεις της MTBITC ή 0,1% DMSO (διαλύτης) προσδιορίστηκε μετά από 24 ώρες (LIXF) ή 72 ώρες (HepG2, Huh7, Hep3B). Μπαρ είναι μέσες + SD (n = 3).

Η

Στη συνέχεια μέτρησαν την επίδραση της MTBITC στις κυτταρικού κύκλου. Η κορυφή subG1 τον τρόπο αυτό χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της απόπτωσης. Μετά από έκθεση 24 ωρών σε MTBITC, μια ισχυρή εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση G2 /M σύλληψης ήταν εμφανής σε LIXF (σχήμα 3α) και όλες τις κυτταρικές σειρές HCC δοκιμαστεί, αλλά και πάλι χωρίς σαφείς ενδείξεις απόπτωσης σε ρ53-mut ή ρ53-ηυΙΙ κύτταρα (όχι δεδομένα απεικονίζεται). Στη συνέχεια, η ανάλυσή μας επεκτάθηκε σε μια περίοδο 3 ημερών της έκθεσης MTBITC, όπως είχαμε ήδη διαπιστώσει ότι μια παρατεταμένη θεραπεία MTBITC δεν αυξάνει βλάβη στα υγιή κύτταρα. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3b-d, το μπλοκ G2 /M διατηρείται υπό θεραπεία ITC και αυτό ήταν της τάξης ρ53-ηυΙΙ κύτταρα & gt? Ρ53-mut κύτταρα & gt? Ρ53-wt κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι μέσα σε 24 ώρες, p53-απομειωθεί κύτταρα δεν υφίστανται κυτταρικό θάνατο, 72 ώρες θεραπείας με MTBITC προκάλεσε απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 3Ε).

Επίδραση των MTBITC για TIC κύτταρα

στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση των MTBITC επί χημειοθεραπεία κύτταρα SP, που απομονώνονται από κύτταρα Huh7 με τη χρήση της χρωστικής δέσμευσης DNA Hoechst 33342 και κυτταρομετρία ροής. Σε αντίθεση με την κυτταρική σειρά HepG2, η οποία περιείχε λιγότερο από 0.3% των κυττάρων SP, η κυτταρική γραμμή Huh7 περιείχαν κύτταρα SP σε συγκέντρωση περίπου 1,5% και, κατά συνέπεια, χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω πειράματα (Σχήμα 4Α). Κατάλληλη διάκριση SP σε κύτταρα Huh7 πραγματοποιήθηκε με πειράματα ελέγχου αναστολής ABC μεταφορέας χρησιμοποιώντας βεραπαμίλη (Σχήμα 4Α), η οποία μπλοκάρει επιτυχώς Hoechst χρωστική εκροή. Χαρακτηρισμός των κυτταρικών πληθυσμών ταξινομημένα έδειξε ότι i) η ικανότητα των κυττάρων SP να εκρέει Hoechst χρωστική χάνεται κατά το μεγαλύτερο μέρος εντός μιας εβδομάδας σε καλλιέργεια κυττάρων (Σχήμα 4Α), όπως αποδεικνύεται από reanalysis των διαλεγμένων κυττάρων SP. ii) τα κύτταρα SP αυξήθηκε σημαντικά ταχύτερα από ό, τι τα κύτταρα NSP κάτω από τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας, όπως προσδιορίστηκε μετά από 72 (σχήμα 4β). iii) Η μετανάστευση των κυττάρων SP ήταν υψηλότερη από εκείνη του συνολικού πληθυσμού Huh7 κυττάρων, αξιολογήθηκε με τον προσδιορισμό μηδέν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετανάστευση χρησιμοποιήθηκε επίσης ως μία άλλη παράμετρος για τη διερεύνηση της χημειοθεραπευτική δραστικότητα του MTBITC. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4c, μέσα σε 48 ώρες, τα κύτταρα ελέγχου είχαν σχεδόν εντελώς κινηθεί προς το άνοιγμα της νεοσυσταθείσας πολυλογία και έκλεισε το «μηδέν». Αντίθετα, η δημιουργία πλήρους επαφής μεταξύ κυττάρων δεν ήταν ακόμη εμφανής μετά από 72 ώρες σε MTBITC επεξεργασμένα κύτταρα. Προσδιορισμός του ρυθμού μετανάστευσης κυττάρων έδειξε ότι υπό MTBITC κύτταρα SP θεραπείας 44,1 h για να κλείσει με GAB κατά 50%, συγκριτικά κύτταρα 26,2 ώρες. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ευαισθησία φαρμάκου σε όρους αναστολής της ανάπτυξης θα μπορούσε να παρατηρηθεί μετά από αγωγή MTBITC μεταξύ SP και κυττάρων NSP (Εικόνα 4D). περαιτέρω ανάλυσή μας έδειξε ότι MTBITC συλληφθεί μη SP, καθώς και υποκλάσματα SP στο G2 /M και πίεσε τους σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, αν και σε μικρότερο βαθμό σε κύτταρα SP σε σύγκριση με μη-SP ομόλογό τους (Σχήμα 4Ε και F). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ικανότητα των MTBITC να μειώσει το ποσό της ΑΙ_ϋΗ-θετικών κυττάρων από κυτταρικές γραμμές HepG2 και Huh7. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4 g, MTBITC-θεραπεία εξάρτηση από τη συγκέντρωση είχε ως αποτέλεσμα μια κατάργηση αυτού του δείκτη? σολ.