Αφηρημένο

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η πιο θανατηφόρα από τις γυναικολογικές κακοήθειες, οφείλεται εν μέρει σε κλινικά απόκρυφη μετάσταση του. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τη διάδοση και EOC εισβολή μπορεί να παρέχει νέους στόχους για αντιμεταστατική θεραπείες ή νέες μεθόδους για την ανίχνευση της μεταστατικής νόσου. Το στρατόπεδο-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (PKA) συχνά απορυθμίζεται σε ΕΓΚ. Επιπλέον, η δραστηριότητα PKA και υποκυτταρικού εντοπισμού από την A-κινάσης αγκύρωσης πρωτεΐνες (AKAPs) είναι σημαντικοί ρυθμιστές του κυτταροσκελετού της δυναμικής και της μετανάστευσης των κυττάρων. Έτσι, επιδιώξαμε να μελετήσει το ρόλο του ΡΚΑ και ΑΚΑΡ λειτουργία τόσο μετανάστευση EOC κυττάρων και εισβολή. Χρησιμοποιώντας το πλάσμα μεμβράνη-σκηνοθεσία PKA βιοαισθητήρα, pmAKAR3, και μια βελτιωμένη δοκιμασία μετανάστευσης /εισβολής, δείχνουμε ότι PKA ενεργοποιείται στην αιχμή των αποδημητικών SKOV-3 κύτταρα EOC, και ότι η αναστολή των μπλοκ δραστηριότητας PKA SKOV-3 κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, δείχνουν ότι ενώ η δραστικότητα της ΡΚΑ εντός αιχμή αυτών των κυττάρων διαμεσολαβείται από την αγκύρωση του τύπου II ρυθμιστικές υπομονάδες ΡΚΑ (RII), η αναστολή της πρόσδεσης του είτε RI ή RII ΡΚΑ υπομονάδων μετανάστευση μπλοκ κυττάρων. Σημαντικά, έχουμε επίσης δείξει – για πρώτη φορά – ότι η δραστηριότητα ΡΚΑ ρυθμίζεται προς τα πάνω στην αιχμή του SKOV-3 κύτταρα κατά την διάρκεια εισβολής ενός τρισδιάστατου εξωκυττάρια μήτρα και, όπως φαίνεται για τη μετανάστευση, αναστολή είτε δραστικότητας ΡΚΑ ή ΑΚΑΡ μεσολάβηση PKA μπλοκ αγκύρωσης εισβολή μήτρα. Αυτά τα δεδομένα είναι τα πρώτα που αποδεικνύουν ότι η εισβολή εξωκυτταρικής μήτρας από καρκινικά κύτταρα εκμαιεύει την ενεργοποίηση του ΡΚΑ εντός της επεμβατικής αιχμή και ότι τόσο δραστηριότητα ΡΚΑ και αγκύρωσης απαιτούνται για εισβολή μήτρας. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ένα ρόλο για τη δραστηριότητα PKA και ΑΚΑΡ στην EOC μετάσταση

Παράθεση:. McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) πρωτεϊνικής κινάσης Α Δραστηριότητα και Αγκύρωση απαιτούνται για τον καρκίνο των ωοθηκών μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10.1371 /journal.pone.0026552

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 16 του Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 28 Σεπτεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 Οκτ του 2011

Copyright: © 2011 McKenzie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε με επιδότηση # R01GM074204 (σε AKH) από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Γενικών Ιατρικών Επιστημών (https://www.nigms.nih.gov) και από μεταδιδακτορικός υπότροφος (για να SLC) από το Κέντρο Καρκίνου του Βερμόντ και της λίμνης Champlain Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (https://www.vermontcancer.org). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες και έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας από όλους τους γυναικολογικούς καρκίνους [1]. Περίπου το 80% των ασθενών με νόσο παρούσας προχωρημένο στάδιο και λιγότερο από 25% αυτών των γυναικών θεραπεύονται. EOC αποτελεί τη συντριπτική πλειοψηφία (& gt? 90%) των κακοηθειών των ωοθηκών και είναι μοναδικό σε κλινικά απόκρυφη τη διάδοση και τη μετάσταση του [2]. Σε αντίθεση με τα περισσότερα άλλα είδη καρκίνου, τη διάδοση του ΕΓΚ διαμέσου του αγγειακού συστήματος και του σχηματισμού μεταστάσεων πραγματικά άπω είναι ένα σπάνιο φαινόμενο. κύτταρα EOC ρίξει από τον πρωτογενή όγκο στην επιφάνεια της ωοθήκης και απολέπιση στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Η ανατομική τοποθέτηση των ωοθηκών διευκολύνει τοπική εξάπλωση του ΕΓΚ, η οποία μπορεί να προκύψει από την άμεση μετανάστευση και εισβολή καρκινικών κυττάρων και σε παρακείμενα όργανα, καθώς και μέσω μεταφοράς αποφλοιωμένα κύτταρα όγκου σε ολόκληρη την περιτοναϊκή κοιλότητα με κανονική ροή περιτοναϊκό υγρό [2] , [3]. Λόγω αυτής της μοναδικής και κλεμμένες τρόπο διάδοσης, οι προσπάθειες στην ανάπτυξη μεθόδων για την έγκαιρη ανίχνευση του ΕΓΚ υπήρξαν σε μεγάλο βαθμό ανεπιτυχείς [4], [5], [6]. Παρά κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπείες συνδυασμό και στρατηγικές για τον προσδιορισμό βιολογικών δεικτών στον ορό, οι τοπικές και διαδίδονται χημειοθεραπεία κύτταρα παραμένουν και τελικά να ευδοκιμήσουν, που οδηγεί στην υψηλή υποτροπής και & lt? 25% πενταετές ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με ΕΓΚ [3], [5], [7], [8], [9]. Έτσι, η καλύτερη κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που διέπουν EOC διάδοση και την εισβολή έχει τη δυνατότητα να έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην πορεία της νόσου.

Λόγω της εξάρτησης της διάδοσης ΕΓΚ και μετάσταση στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή , εργαστήριο μας προσπαθεί να κατανοήσει τους μηχανισμούς που διέπουν αυτές τις διαδικασίες σε ΕΓΚ. μετανάστευση των κυττάρων είναι μια ιδιαίτερα διέταξε διαδικασία που απαιτεί συντονισμένη προσπάθεια μεταξύ πολλών πρωτεϊνών σε διακριτά υποκυτταρικά περιοχές [10], [11], [12]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η εξαρτώμενη από cAMP πρωτεϊνική κινάση (ΡΚΑ) είναι σημαντική για την κυτταρική μετανάστευση και τον ηγετικό δυναμική άκρη σε έναν αριθμό κυττάρων [13], [14], [15]. ΡΚΑ είναι ένα ετεροτετραμερείς κινάση που μπορεί να υπάρχει σε δύο ισομορφές, τύπου-Ι και τύπου-ΙΙ, ανάλογα με την ισομορφή των ρυθμιστικών (RI και RII) υπομονάδα που συνδέονται με το ολοένζυμο. ΡΚΑ έχει πολυάριθμες στόχους που σχετίζονται με ακτομυοσίνης κίνηση βασίζεται κυττάρου [16] και οι πρώιμες μελέτες έδειξαν ότι υπερ-ενεργοποίηση ή αναστολή του ΡΚΑ ανέστειλε χημειοτακτική κυτταρική μετανάστευση [16], [17], [18]. Αυτή η φαινομενικά αντιφατικό ρόλο για ΡΚΑ διευκρινίστηκε από την απόδειξη ότι, εκτός από την συνολική δραστηριότητα, εντόπιση της ΡΚΑ σε υποκυτταρικές χώρο, που προκαλείται μέσω της σύνδεσης του ΡΚΑ R υπομονάδων να κινάση αγκύρωσης πρωτεΐνες (AKAPs? [19], [20]) , ρυθμίζει κυτταρική μετανάστευση [13], [21], [22]. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι ΡΚΑ υπομονάδες και δραστηριότητα και οι δύο εμπλουτίζονται σε προεξέχων δομές που βρίσκονται στην αιχμή των μεταναστευτικών κυττάρων [13], [21], [22]. Επιπλέον, ευρεία αναστολή του τύπου Ι και τύπου-ΙΙ αγκύρωσης (

δηλαδή

αγκύρωση μέσω RI ή υπομονάδων RII) σε γενικές γραμμές [13], [21], ή ειδική αναστολή των μεμονωμένων πρωτεϊνών αγκύρωσης (

π.χ.

ΑΚΑΡ-Lbc? [22]), αναστέλλει τη μετανάστευση. Αυτές και άλλες αναφορές (αναθεωρηθούν [23], [24]), καθορίζει τη σημασία του εντοπισμού δραστηριότητας ΡΚΑ σε διακριτές υποκυτταρικές θέσεις κατά τη διάρκεια της κανονικής μεταναστευτικών κυτταρικές διεργασίες.

Υπογραμμίζοντας τη δυνητική σημασία της PKA στην παθογένεση του καρκίνου των ωοθηκών είναι οι παρατηρήσεις που δραστηριότητα PKA και την έκφραση υπομονάδας συχνά απορυθμίζεται σε ΕΓΚ. Η έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της ΡΚΑ [25] και τη ρυθμιστική υπομονάδα RI [26], [27], [28] συσχετίζεται με προχωρημένο στάδιο ή /και πιο επιθετική EOC. Επιπλέον, τα επίπεδα του mRNA του AKAP3 (

aka

AKAP110 ή ινώδης πρωτεΐνη ελύτρου του 90 kDa (FSP90)) σε όγκους των ωοθηκών θετικά συσχετίζονται με το στάδιο της νόσου και την κακή πρόγνωση [29], [30], ενώ δύο άλλοι AKAPs – AKAP1 (

aka

AKAP149) και AKAP13 (

aka

ΑΚΑΡ-LBC) – επίσης φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω στο βλεννώδες EOC (Α Howe, αδημοσίευτες παρατηρήσεις από Oncomine). Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, η λειτουργική PKA σημασία και σηματοδότησης ΑΚΑΡ σε μεταστατικά κύτταρα EOC δεν έχει διερευνηθεί επαρκώς.

Δεδομένης της σημασίας της PKA και ΑΚΑΡ λειτουργία για την μετανάστευση των κυττάρων και απορρύθμισης τους στην EOC, διερευνήθηκε η χωρική ρύθμιση της δραστηριότητα PKA στο θέμα της μετάβασης EOC κύτταρα και αποφασισμένη αν δραστηριότητας ΡΚΑ και αγκύρωσης απαιτούνται για τη μετανάστευση των κυττάρων του ΕΓΚ. Εδώ, αναφέρουμε ότι η δραστηριότητα PKA είναι up-ρυθμίζεται στην αιχμή των κυττάρων ΕΓΚ όχι μόνο κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης, αλλά και κατά τη διάρκεια της εξωκυττάριας μήτρας εισβολής, καθώς και. Περαιτέρω, η αναστολή της δραστικότητας ΡΚΑ και κυτταρική μετανάστευση ΑΚΑΡ μπλοκ λειτουργία EOC και εισβολή. Οι παρατηρήσεις αυτές καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, τη σημασία της PKA αγκύρωσης για την εισβολή της μήτρας και αποδείξει τη σημασία της χωρικά οργανωμένη δραστηριότητα PKA στη μετανάστευση και την εισβολή – και έτσι ίσως μετάσταση – κυττάρων ΕΓΚ

Υλικά και Μέθοδοι.

Αντιδραστήρια και Cell Culture

SKOV-3 και COS-7 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε ελεύθερο αντιβιοτικών τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% (κατ ‘όγκο /νοί) ορού εμβρύου μόσχου (FBS). ΟΑΥ-80 κύτταρα ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Andrew Godwin (Τμήμα Μοριακής Ογκολογίας, Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase) και διατηρήθηκαν σε ένα μείγμα 1:01 αντιβιοτικά χωρίς Medium 199: MCDB-105 συμπληρώνεται με 4% FBS και 0.2 U /ml ινσουλίνη χοίρου. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2. DMSO, κυτοχαλασίνη D και μπλε τρυπάνης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). GM6001 ελήφθη από την Millipore (Billercia, ΜΑ). Ελεύθερο ερυθρού φαινόλης Matrigel και ανθρώπινης ινονηκτίνης αποκτήθηκαν από ΒΟ Biosciences (Bedford, ΜΑ). Η φαρμακολογική αναστολή της δραστηριότητας ΡΚΑ επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Η89 ή mPKI (Biomol). Η89 είναι ένα ισοκινολόνη που ανταγωνίζεται με ΑΤΡ για δέσμευση με ΡΚΑ? παρά τη διαδεδομένη χρήση και μεγάλη ισχύ, παρουσιάζει μόνο μέτρια ειδικότητα για PKA [31]. mPKI, μια εξαιρετικά ειδικός αναστολέας ΡΚΑ είναι ένα μυριστοϋλοποιημένες κύτταρο διαπερατό πεπτίδιο που περιλαμβάνει την ανασταλτική περιοχή ψευδο-υποστρώματος (αμινοξέα 14-27) του ενδογενούς Πρωτεΐνης Κινάσης έναν αναστολέα πρωτεΐνης (PKI) [14]. Φαρμακολογική αναστολή της PKA αγκύρωσης επιτεύχθηκε με τη χρήση StHt31 (Promega), ένα stearated πεπτίδιο που περιλαμβάνει την περιοχή δέσμευσης PKA R-υπομονάδα από Ht31 (

aka

ΑΚΑΡ-LBC)? Έτσι, StHt31 δρα ως ένα κύτταρο-διαπερατό ανταγωνιστικός αναστολέας της αλληλεπίδρασης μεταξύ ενδογενών AKAPs και τόσο RII και, σε κάπως υψηλότερες συγκεντρώσεις, RI ΡΚΑ υπομονάδες [32], [33]. Οι γενετικές αναστολείς της δραστηριότητας ΡΚΑ και του τύπου Ι ή τύπου ΙΙ PKA αγκύρωσης που περιγράφεται παρακάτω.

πλασμίδια και διαμόλυνση

Το πλασμίδιο που κωδικοποιεί mCherry-συγχωνευμένο με την PKA αναστολέα της πρωτεΐνης PKI (βλέπε παραπάνω ) έχει περιγραφεί προηγουμένως [14], ενώ πλασμίδια που κωδικοποιούν GFP συγχωνευμένο με τους αναστολείς τύπου Ι ή τύπου-ΙΙ αγκύρωσης (RI διασπαστή αγκύρωσης (RIAD? [34]) και superAKAP

-σε silico

(sAKAP

είναι

? [32], αντίστοιχα), καθώς και τα αντίστοιχα κωδικοποιημένο (

scr

) αρνητικοί έλεγχοι, παρήχθησαν χρησιμοποιώντας φωσφορυλιωμένων ολιγονουκλεοτιδίων 5 ‘(Invitrogen) που παρατίθενται στον πίνακα S1 Συγκεκριμένα,. συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια ανοπτήθηκαν, δημιουργώντας 5 ‘

Sal

Ι και 3′

BamH

Ι κολλώδη άκρα, στη συνέχεια συνδέθηκε απευθείας εντός

Sal

I /

BamH

Ι-χωνευμένο pEGFP-C1 (Clontech). εκδοχές mCherry του RIAD και sAKAP

είναι

παρήχθησαν με αντικατάσταση του

Nhe Ι-

BamH

Ι θραύσμα που κωδικοποιεί EGFP στην αντίστοιχα πλασμίδια με το

Nhe

Ι

BamH

θραύσμα από pmCherry-C1. Για την επιμόλυνση και παροδική έκφραση των πρωτεϊνών, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Fugene6 (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 6 μΐ Fugene6 προστέθηκαν σε 100 μΙ ορού και αντιβιοτικών DMEM ελεύθερο συνοπτικά στροβιλίστηκαν και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Ένα σύνολο 1,5 μg DNA προστέθηκε στο μίγμα, εν συντομία στροβιλίζονται, και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Το μίγμα στη συνέχεια προστέθηκε στάγδην σε ένα δίσκο 35 mm που περιείχαν κύτταρα σε μεταξύ 80-90% συρροή, αφέθηκε να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 λεπτά, στη συνέχεια επέστρεψε στον επωαστήρα. Όλα τα πειράματα έγιναν μεταξύ 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

ανοσοφθορισμού

Για την οπτικοποίηση της ακτίνης, ινονεκτίνη, παξιλλίνη και ΡΚΑ του Rla και RIIα υπομονάδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% φορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά, διαπερατά για 10 λεπτά σε PBS που περιέχει 0,25% Triton Χ 100, αποκλείστηκαν με PBS που περιείχε 3% BSA είτε για 1 h σε RT ή τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-φιβρονεκτίνης (1:400, BD Transduction) , αντι-παξιλλίνη (1:500, BD Transduction), αντι-ΡΚΑ ΚΙα ή RIIα (Genetex 1:200 και BD Transduction 1:200 αντίστοιχα) πρωτογενή αντισώματα για 1 ώρα σε RT. Μετά την πλύση 3 χ 5 λεπτά με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa-594 δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο γαϊδάρου (Invitrogen, 1:400) και Alexa-488 συζευγμένο φαλλοϊδίνη (Invitrogen, 1:100) για 1 h σε RT. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες μικροσκοπίου (Fisher) χρησιμοποιώντας ένα μικρό όγκο Permafluor έγκλεισης (Thermo Scientific). εικόνες επιφθορισμού συλλήφθηκαν όμως 10, 20, 40, και οι στόχοι 60X σχέδιο Apo σε Nikon Eclipse ΤΕ-2000E ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα φθοροφόρου-ειδικά φίλτρα (Chroma Technology Corp, Rockingham, VT) και μια κάμερα CoolSnap HQ (Photometrics, Tucson , ΑΖ), που ελέγχεται από στοιχεία) λογισμικό (Nikon.

επούλωση πληγών μετανάστευση δοκιμασία

Γυάλινες καλυπτρίδες αποστειρώνονται με διαδοχικές εμβάπτιση σε διαστήματα 30 λεπτών σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (70, 95, 100%) EtOH. Οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν από EtOH και ξηραίνεται στον αέρα στην κουκούλα καλλιέργειας ιστού. Μόλις ξηράνθηκαν, οι στείρες καλυπτρίδες επικαλύφθηκαν σε 20 μg /ml ανθρώπινης ινονηκτίνης αραιωμένο σε αποστειρωμένο PBS είτε όλη τη νύκτα στους 4 ° C ή 2 ώρες στους 37 ° C. Μια συρρέουσα μονοστιβάδα κυττάρων σπάρθηκε σε ECM συζευγμένο καλυπτρίδες και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Ένα τραύμα έγινε στην μονοστιβάδα με απόξεση ένα στείρο ρύγχος πιπέτας Ρ200 απέναντι στα κύτταρα, και οι καλυπτρίδες πλύθηκαν μία φορά με αποστειρωμένο PBS για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών θραυσμάτων. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση ενός στόχου Σχέδιο Αρο 10x στο ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon Eclipse TE-2000Ε, όπως περιγράφεται παραπάνω.

αποκλεισμό trypan blue Δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, ένα μίγμα 1:01 του trypan μπλε (0,4%, Sigma) και μέσο χωρίς ορό που περιείχε 1% BSA προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά αμέσως μετά την αφαίρεση του είτε ντόνατ ή δημιουργία της πληγής στην μονοστιβάδα. Εικόνες ελήφθησαν από την περιφέρεια του δακτυλίου και κατά μήκος όλου του περιθωρίου του τραύματος χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό φακό 10Χ Σχέδιο Αρο στην Nikon Eclipse TE-2000Ε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Κατασκευή φλάντζες σιλικόνης

σαράντα γραμμάρια Sylgard 184 ελαστομερές σιλικόνης (Ellsworth Κόλλες) και 4 g Sylgard 184 ελαστομερές σκληρυντικό ήταν αυστηρά αναμιγνύεται μέχρι θολό με φυσαλίδες. Το θολό μίγμα χύθηκε μέσα σε ένα αποστειρωμένο τρυβλίο των 10 cm καλλιέργειας ιστών σε ένα βάθος 2-4 mm σε ύψος. Φυσαλίδες αφαιρέθηκαν τοποθετώντας το πιάτο σε 850 ml Δέση-Vac δοχείο (Fisher) και την εκκένωση του θαλάμου 60 φορές και επιτρέποντας στον θάλαμο να σταθεί για 10 λεπτά. Αυτό το στάδιο επαναλήφθηκε δύο φορές ή έως ότου το μίγμα ήταν ελεύθερη φυσαλίδων. Το μίγμα σιλικόνης αφέθηκε να σκληρυνθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 48 ώρες ή για μια ώρα σε μια θερμή πλάκα 84 ° C μέχρι να πολυμεριστεί πλήρως. Το πρότυπο σιλικόνη απομακρύνθηκε απαλά από το πιάτο και τοποθετείται σε καθαρή και στεγνή επιφάνεια κατάλληλη για την κοπή. Για την κατασκευή του ντόνατ σχήματος παρέμβυσμα, μια γροθιά βιοψία 6 mm χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ενός κυλίνδρου από σιλικόνη, και μια γροθιά βιοψίας 2 mm χρησιμοποιήθηκε για να κάνει ένα μικρότερο τρύπα στο κέντρο του κυλίνδρου 6 mm. Οι σιλικόνη «ντόνατς» μετά πλύθηκαν σε Liquinox (αραιωμένο 1:10 σε νανοκαθαρό νερό) για 15 λεπτά, ξεπλύθηκαν 10 φορές με νανοκαθαρό νερό, πλύθηκε με 70% EtOH για 15 λεπτά, στη συνέχεια αποθηκεύεται σε φρέσκο ​​70% EtOH μέχρι να χρειαστούν.

ντόνατ μετανάστευση Δοκιμασία /Invasion

Αποστειρωμένες γυάλινες καλυπτρίδες επικαλύφθηκαν με 20 μg /ml ινωδονεκτίνης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Καθαρά, στείρα ντόνατς σιλικόνης αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα πριν από την τοποθέτηση επί του επιχρισμένου με καλυπτρίδες. Μια αλλαγή στην διάθλασης στη διεπαφή ντόνατ-καλυπτρίδα μπορεί να θεωρηθεί ως το ντόνατ εμμένει σε επαφή με σύμμορφη. Υποσυρρέοντα κύτταρα στερούνται ορού τη νύχτα πριν από τη δοκιμασία. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν στο μέσο χωρίς ορό κατάλληλο περιείχε 1% BSA και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε συρροή (6000 κύτταρα /ντόνατ για SKOV-3, COS-7, και ΟΑΥ-80) σε όγκο 10 μΐ χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο άκρο φόρτωσης πηκτής στο κέντρο του σχήματος ντόνατ παρέμβυσμα έτσι ώστε να περιέχει τους μέσα σε ένα περιορισμένο χώρο. Ο αριθμός των κυττάρων που απαιτείται για να σχηματιστεί ένα συρρέουσα μονοστιβάδα εξαρτάται από την ECM θα επιλεγεί, η διάμετρος του εσωτερικού φρεάτιο του ντόνατ, και η ικανότητα διασποράς των κυττάρων, και ως εκ τούτου πρέπει να προσδιορίζεται εμπειρικά για κάθε κυτταρική γραμμή. Αποστειρωμένο PBS προστέθηκαν γύρω από το παρέμβυσμα να αποφευχθεί η εξάτμιση του μικρού όγκου του μέσου. Μετά προσκολλημένο τη διάρκεια της νύχτας, το PBS αναρροφήθηκε, και τα ντόνατς απομακρύνθηκαν προσεκτικά χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη λαβίδα. Οι πυρήνες βάφτηκαν χρησιμοποιώντας Hoescht 33342 πυρηνική χρώση (Invitrogen, 1:2000 σε μέσα) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Το μέσο χρώσης απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε είτε με πλήρες μέσο ή μέσα τα οποία περιέχουν φαρμακολογικούς παράγοντες όπως περιγράφονται στις λεζάντες σχήμα. Για τις δοκιμασίες εισβολή, ο Hoescht-βάφονται μονοστιβάδα επικαλύφθηκε με ελεύθερο ερυθρού φαινόλης Matrigel και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C για να επιτραπεί ο πολυμερισμός. Τα ενσωματωμένα κύτταρα στη συνέχεια συμπληρώθηκαν με πλήρη ή επεξεργασμένα μέσα όπως στη δοκιμασία μετανάστευσης. Οι αρχικές εικόνες αποκτήθηκαν μέσα από μια αντικειμενική 2X PlanApo σε Nikon Eclipse ΤΕ-2000E ανεστραμμένο μικροσκόπιο όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα είτε σε επεξεργασία με 10 ng /ml EGF ή υψηλή ορού (10%) για την τόνωση της μετανάστευσης. Πρόσθετες εικόνες αποκτήθηκαν μετά χρόνους που υποδεικνύονται και την αρχική και την τελική εικόνα ζεύγη κατάσταση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις ενός προσαρμοσμένου γραπτή μακρο ImageJ (DonutQuant διαθέσιμο ως κείμενο S1). Εν συντομία, οι μακρο κέντρα και τα κατώτατα όρια των αρχικών και τελικών εικόνων κατάσταση στη συνέχεια αφαιρεί πολύ-ακραία κύτταρα,

δηλαδή

κύτταρα εκτός των κυκλικών μονοστιβάδες που είναι πάρα πολύ μακριά για να μπορεί να αποδοθεί στη μετανάστευση (

π.χ.

κύτταρα που έχουν χαλαρώσει και επέπλευσε από άλλη περιοχή του πιάτου). Μια μάσκα του στο κέντρο, η αρχική εικόνα στη συνέχεια δημιουργήθηκε και προεξέχοντας πάνω από την τελική κατάσταση εικόνα και το σύνολο των πυρήνων έξω από τα σύνορα της αρχικής μάσκας εικόνας υπολογίζονται ως μεταναστεύσει κύτταρα.

FRET Imaging

SKOV-3 κύτταρα που εκφράζουν τον βιοαισθητήρα δραστηριότητα ΡΚΑ, pmAKAR3 [35], [36] ξεπλύθηκαν και διατηρήθηκαν σε Leibovitz L-15 μέσο για απεικόνιση FRET. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν σε μια Nikon Eclipse ΤΕ-2000E μικροσκόπιο με 60 × /1.4 NA σχέδιο Apo ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό και ψύχεται CCD κάμερα. ΚΑΠ, YFP και FRET εικόνες αποκτήθηκαν 10 ώρες μετά την έναρξη της δοκιμασίας. Η εξαγορά ορίστηκε με την έκθεση 700 ms και 2 × 2 binning και για τις τρεις εξαγορές. Εικόνες σε κάθε κανάλι υποβλήθηκαν σε αφαίρεση του υποβάθρου, και οι αναλογίες του κίτρινου-to-κυανό χρώμα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το plugin FRET Analyzer ImageJ. Ψευδοχρωματικές εικόνες δημιουργήθηκαν με τη χρήση «Λόγος» του ImageJ κοιτάζω προς τα πάνω πίνακα. Εικόνες ήταν αφαιρεθεί το υπόβαθρο χρησιμοποιώντας το «Αφαίρεση φόντου» στο ImageJ, με μια ακτίνα κύλισης μπάλα 500.

Αποτελέσματα

δραστηριότητας ΡΚΑ αυξάνεται στην αιχμή της τυχαία μεταναστεύουν SKOV-3 κύτταρα

Προηγούμενη εργασία απέδειξε διακριτά ενεργοποίηση της PKA στο μεταναστευτικό αιχμή πολλών [13], [21], [22], αλλά όχι όλα τα [37] κυτταρικών τύπων. Για να προσδιορίσετε αν PKA ενεργοποιήθηκε στην αιχμή της που μεταναστεύουν κύτταρα του ΕΓΚ, SKOV-3 ανθρώπινα κύτταρα ΕΓΚ επιμολύνθηκαν με pmAKAR3, ένα πλάσμα μεμβράνη-σκηνοθεσία FRET βιοαισθητήρα για τη δραστηριότητα PKA [21], [36], στη συνέχεια απλώνονται σε FN επικάλυψη γυάλινες καλυπτρίδες, διεγείρονται με 10 ng /ml EGF επί 4-6 ώρες (για την προώθηση τυχαία, χημειοκινητικές μετανάστευση), και παρακολουθούνται από την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων. δραστηριότητα ΡΚΑ (όπως υποδεικνύεται από αυξημένα ποσοστά FRET) ήταν, πράγματι, διακριτικά και δυναμικά αυξημένα μέσα στην αιχμή της που μεταναστεύουν SKOV-3 κύτταρα (Εικόνα 1 και Movie S1). Αυτό πρότεινε ότι οι τοπικές αυξήσεις στην δραστηριότητα ΡΚΑ παίζουν ένα ρόλο στη ρύθμιση κορυφαία δυναμική άκρη, και έτσι τη μετανάστευση των ενεργά μεταναστεύουν EOC κύτταρα. Αυτή η υπόθεση υποστηρίχθηκε από νωρίς, διερευνητικές πειράματα στα οποία SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επούλωση πληγών ή μετανάστευση μηδέν δοκιμασίες υπό την απουσία ή παρουσία ευρέως χρησιμοποιούμενοι αναστολείς της δραστηριότητας ΡΚΑ (Η89 και mPKI? Βλέπε Υλικά και Μέθοδοι)) και αγκύρωσης (StHt31? βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Εξέταση της μορφολογίας των κυττάρων λίγο μετά την έναρξη αυτών των δοκιμασιών έδειξαν σημαντικές επιδράσεις αυτών των αναστολέων στην κορυφαία άκρη μορφολογία και τη μετανάστευση (Σχήμα S1). Συγκεκριμένα, μη επεξεργασμένα κύτταρα μετανάστευσαν σε τραυματίες περιοχές αποτελεσματικά και με ευρεία, ruffling ελασματοπόδια (Σχήμα S1A και D). Σε αντίθεση, τα κύτταρα στα οποία δραστικότητα της ΡΚΑ ανεστάλη με τον μη επιλεκτικό Η89 αναστολέας ΡΚΑ ή εξαιρετικά επιλεκτικό αναστολέας mPKI δεν μεταναστεύουν αποτελεσματικά και εισήλθε μόλις το χώρο του τραύματος, που εμφανίζουν οδηγώντας δομές άκρο στερείται βολάν αλλά γεμάτη με εστιακές συμφύσεις – επίκλησης μια κόλλα, εξαπλώνεται φαινότυπο περισσότερες από μία από μετανάστευση (Σχήμα S1B και D). Τα κύτταρα στα οποία ΡΚΑ αγκύρωσης διαταράχθηκε με StHt31 εισήλθε στο χώρο του τραύματος σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι H89- ή mPKI-επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά, σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου, παρουσίασαν πολλαπλές, ασταθώς απέχοντα ruffling άκρα ανά κύτταρο (Σχήμα S1c και D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση ότι η μετανάστευση ΕΓΚ κυττάρων μπορεί να απαιτούν δραστηριότητα PKA και αγκυροβολίας και δικαιολογείται περαιτέρω έρευνα, χρησιμοποιώντας πιο εξελιγμένες προσεγγίσεις και ειδικά αντιδραστήρια.

SKOV-3 κύτταρα επιμολυσμένα με pmAKAR3, τοποθετήθηκαν πάνω σε φιμπρονεκτίνη επικάλυψη πιάτα όλη τη νύκτα, διεγείρονται με 10 ng /ml EGF για 4-6 ώρες και στη συνέχεια απεικονίζεται από FRET μικροσκοπία. Εικόνες συνελήφθησαν κάθε 30 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια, pseudocolored σύμφωνα με την αναλογία FRET (χρωματική κλίμακα φαίνεται στο πλαίσιο 0 »): πρόκειται για μοντάζ απεικονίζει καρέ 2 λεπτά χώρια. Για το σύνολο της σειράς, δείτε το βίντεο S1. Κλίμακα bar = 5 μm.

Η

μετανάστευση ΕΓΚ κυττάρων ρυθμίζεται από τη δραστηριότητα και την αγκύρωση της PKA

δοκιμασίες μετανάστευσης επούλωση της πληγής, ενώ ανέξοδο και εύκολο να υλοποιηθεί, υποφέρει από αρκετούς περιορισμούς, δεν είναι το λιγότερο των οποίων είναι θανατηφόρα βλάβη στα κύτταρα κατά μήκος του μετώπου δοκιμασίας και την αφαίρεση της υποκείμενης εξωκυτταρικής μήτρας (ECM). Ετσι, ένα πειραματικό κατάσταση που οδηγεί σε αναποτελεσματική μετανάστευση σε αυτή τη δοκιμασία μπορεί να αντανακλά, για παράδειγμα, αυξημένη ευαισθησία σε βλάβη παρευρισκομένων ή αποτυχία να παραχθούν

de novo

πλέγμα επί του οποίου να μεταναστεύσουν. Ως εκ τούτου, για την περαιτέρω και καλύτερη εξερευνήσουν την απαίτηση της δραστηριότητας ΡΚΑ και αγκύρωσης ειδικά για την κυτταρική μετανάστευση EOC, αναπτύξαμε μία βελτιωμένη έκδοση ενός περιγράφηκε προηγουμένως δοκιμασία μετανάστευσης [38] που εύκολα και με ακρίβεια μετράει τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν σε μία ακτινική τρόπο από ένα ορίζεται κυκλική μονοστοιβάδα (Σχήμα 2? βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες). δοκιμασία μας – επινοήθηκε η «δοκιμασία ντόνατ», μετά τις φλάντζες σιλικόνης σε σχήμα ντόνατ που χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της μονοστρωματικής – είναι αξιόπιστη, φθηνή, εύκολη στην εφαρμογή, που ισχύει για σχεδόν οποιοδήποτε τύπο κυττάρων, και επεκτάσιμη να επιτευχθεί σχετικά υψηλή απόδοση και η στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας ένας μικρός αριθμός κυττάρων (~6000), σε σχέση με άλλες συγκρίσιμες δοκιμασίες «απελευθέρωση» (

π.χ.

επούλωση της πληγής δοκιμασίες). Επιπλέον, σε αντίθεση δοκιμασίες επούλωση της πληγής, η προσέγγισή μας μειώνει σημαντικά τόσο την απογυμνωτική της πρωτεΐνης ECM που καλύπτει την επιφάνεια μετανάστευση (Σχήμα S2) και το θανάσιμο τραυματισμό στα κύτταρα επί της περιφέρειας δοκιμασίας (Σχήμα S3). Να αυξηθεί η χρησιμότητα και η ευκολία εφαρμογής της δοκιμασίας, έχουμε αναπτύξει μια ImageJ macro ( «DonutQuant»? Δείτε S1 Κείμενο) για γρήγορα και αυτόματα την ποσοτικοποίηση της μετανάστευσης. Εν συντομία, η μακροοικονομική αφαιρεί μια αρχική, «χρόνος = 0 ‘εικόνα (που λαμβάνονται αμέσως μετά την απομάκρυνση ντόνατ) από ένα μεταγενέστερο ή τελική εικόνα και μετρά τους πυρήνες εκτός του« χρόνου = 0 »περιοχή (Σχήμα 2C και D). Πειράματα με τη χρήση κυτοχαλασίνη D για την αναστολή δυναμική ακτίνη (Σχήμα 2C και D), καθώς και μιτομυκίνη C για την αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου (τα δεδομένα δεν φαίνονται) έχουν επιβεβαιώσει ότι η μετανάστευση δοκιμασία μετρά και όχι απλώς μετατόπιση της μονοστιβάδας με κυτταρική διαίρεση. Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη δοκιμασία για τη μέτρηση της μετανάστευσης σε μια ευρεία ποικιλία τύπων κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων των ΟΗΟ-Κ1, COS7, ΟΑΥ-80, HUVEC, MCF7, ΜΟΡ10Α, MDA-MB-231, MDCK, ΝΙΗ3Τ3, REF52, και SKOV-3) με συγκρίσιμα ευκολία και αποτέλεσμα (Α McKenzie, S. Campbell, Α Howe, αδημοσίευτες παρατηρήσεις).

(α) μια σχηματική αναπαράσταση της δοκιμασίας μετανάστευσης ντόνατ στην οποία τα κύτταρα σπέρνονται σε συρροή σε μια εξωκυτταρική μήτρα επικαλυμμένη γυάλινη καλυπτρίδα μέσα σε ένα ντόνατ σχήματος λάστιχο. Αφού τα κύτταρα έχουν σταθερά προσκολλημένα, το παρέμβυσμα αφαιρείται, επιτρέποντας στα κύτταρα να μεταναστεύουν ακτινικά. Οι εικόνες της μονοστιβάδας σταματούν αμέσως μετά την απομάκρυνση ντόνατ και σε κάθε χρονικό σημείο στη συνέχεια η οποία είναι κατάλληλη για να επιτρέψει τη μετανάστευση μιας δεδομένης κυτταρικής γραμμής. Ένα μακρο έθιμο ImageJ χρησιμοποιεί την αρχική εικόνα ως αφαιρετική μάσκα για να προσδιοριστεί ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στην τελική εικόνα που ελήφθησαν στο τέλος της δοκιμασίας. Λεπτομέρειες δίνονται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Μια εικόνα του πέντε παρεμβύσματα ντόνατ σε ένα ενιαίο καλυπτρίδα 25 mm? αυτό επιτρέπει εύκολη εγκατάσταση των επαναληπτικών δοκιμασιών για την αύξηση της απόδοσης και να δημιουργήσει στατιστικά σημαντική δεδομένα. (C) κύτταρα COS-7 υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης ντόνατ σε παρουσία 2 μΜ κυτοχαλασίνης D (cytoD) ή DMSO σαν ένας έλεγχος του οχήματος. Αντιπροσωπευτικές εικόνες που λαμβάνονται κατά την έναρξη (0 h) και τέλος (20 ώρες) της δοκιμασίας, όπως επίσης και συγκαλύπτεται (τελική μείον αρχικό) εικόνων που απεικονίζουν μετανάστευσαν κύτταρα απεικονίζεται. (D) Ο αριθμός των μετανάστευσαν COS-7 κύτταρα υπολογίστηκε με χρήση του μακρο ImageJ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.E. πέντε donuts ανά καλυπτρίδα με τρία ξεχωριστά καλυπτρίδες ανά αγωγή. (* = Ρ & lt? 0.001).

Η

Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία, ερευνήσαμε την επίδραση αναστολής ΡΚΑ ή λειτουργία ΑΚΑΡ στην κυτταρική μετανάστευση EOC με επιμόλυνση SKOV-3 κύτταρα με πλασμίδια που κωδικοποιούν φθορίζουσες πρωτεΐνες (EGFP, mCherry ) συγχωνευμένο στο πεπτίδιο αναστολείς της δραστηριότητας ΡΚΑ ή αγκύρωσης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε την φθορίζουσα πρωτεΐνη mCherry συντηγμένη με την ΡΚΑ πρωτεΐνη αναστολέα ΡΚΙ (mCherry-PKI) για την αναστολή της δραστηριότητας ΡΚΑ [14], και EGFP συντήκεται προς το διαταράκτης αγκύρωσης RI (RIAD) [34] και superAKAP

είναι

(sAKAP

είναι

) [32] πεπτιδίων να διαταράξει ειδικά τύπου Ι και τύπου ΙΙ PKA αγκύρωσης, αντίστοιχα. Πλασμίδια που κωδικοποιούν mCherry μόνη ή EGFP συγχωνευμένο με κωδικοποιημένο RIAD ή sAKAP

είναι

αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Αυτά τα γενετικά κωδικοποιημένα αντιδραστήρια επιτρέπουν εξαίσια ειδικότητα στην αναστολή της δραστηριότητας ΡΚΑ [14] ή την αναστολή της αγκύρωσης τόσο μέσω RI και RII υπομονάδες [32], [34], ενώ επιτρέπει την ανίχνευση και την παρακολούθηση των κατεργασμένων κυττάρων μέσω μικροσκοπίας φθορισμού. Η διάκριση μεταξύ τύπου Ι και τύπου ΙΙ αγκύρωσης είναι πρόσφορα και αναγκαία, όπως τύπου Ι και δραστηριότητα τύπου II PKA μπορεί να ρυθμίσει διακριτών οδών σηματοδότησης [19], [20] και, ενώ έχουν και οι δύο τύποι της PKA ενοχοποιηθεί για τη μετανάστευση στην άλλα συστήματα [13], [21] – [23], [39], ούτε έχουν αξιολογηθεί στο πλαίσιο της μετανάστευσης καρκίνου των ωοθηκών

μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης ντόνατ και μετά. 24 ώρες, ο αριθμός των επιμολυσμένων κυττάρων που μετανάστευσαν, όπως επίσης και ο συνολικός αριθμός των επιμολυσμένων κυττάρων και του συνολικού αριθμού των μετανάστευσαν (επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα) κύτταρα ποσοτικοποιήθηκε (Σχήμα 3). Απόκτηση αυτών των τριών αριθμών επιτρέπει την έκφραση της μετανάστευσης ως το ποσοστό του μετανάστευσαν, τα επιμολυσμένα κύτταρα επί του συνόλου των μετανάστευσαν κύτταρα ( «MX /TM) ή, για τον έλεγχο διαφορών σε αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μεταξύ πλασμιδίων, το ποσοστό των μετανάστευσαν, επιμολυσμένα κύτταρα υπεράνω ο συνολικός αριθμός των επιμολυσμένων κυττάρων ( «MX /ΤΧ). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, SKOV-3 μετανάστευση ήταν σημαντικά εξασθενημένη όταν είτε δραστηριότητα ΡΚΑ (Σχήμα 3Α και Β) ή αγκύρωσης (Σχήμα 3C) αναστάλθηκε με τη χρήση των γενετικών αντιδραστήρια που περιγράφονται παραπάνω. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μετανάστευση αναστάλθηκε σχεδόν εξίσου από διάσπαση αγκύρωσης μέσω είτε RI ή RII υπομονάδες (Σχήμα 3C), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές για την ίδρυση της σημασία τόσο τύπου Ι και τύπου-ΙΙ ΡΚΑ αγκύρωση στη μετανάστευση των άλλων κυτταρικών τύπων [13] [21], [22], [39]. Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν την αναγκαιότητα της δραστηριότητας ΡΚΑ και αγκύρωση για τη μετανάστευση των κυττάρων του ΕΓΚ.

(Α) SKOV-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε κενές mCherry πλασμίδιο ή mCherry-ΡΚΙ, τότε υπόκειται σε μετανάστευση ντόνατ δοκιμασίες. Αντιπροσωπευτικά κατώφλι εικόνες των μετανάστευσαν κυττάρων (μετεγκατάσταση με πυρήνες pseudocolored πράσινο), ο συνολικός πληθυσμός των επιμολυσμένων κυττάρων (διαμόλυνση), και μια επικάλυψη αυτών των δύο εικόνων φαίνονται. Ένθετα απεικονίζουν μεγεθύνσεις των περιοχών που υποδεικνύονται από τα τετράγωνα στα κορυφαία πάνελ. Έτσι, οι συνολικές μετανάστευσαν κύτταρα ( «ΤΜ») απεικονίζεται στο πράσινο, οι συνολικές επιμολυσμένα κύτταρα ( «ΤΧ») απεικονίζεται στο κόκκινο και το κίτρινο πυρήνες απεικονίζουν επιμολυσμένα κύτταρα που μετανάστευσαν, δηλαδή μετανάστευσαν και επιμολυσμένα κύτταρα ( «MX») . (Β) Για τα κύτταρα επιμολυσμένα με είτε κενές mCherry (MCH) ή mCherry-ΡΚΙ (ΡΚΙ), η μέση επί τοις εκατό (± S.E.) της μετανάστευσαν επιμολυσμένων κυττάρων επί του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν ( «MX /TM) υπολογίσθηκε. Για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης, μέσος τοις εκατό (± S.E.) της μετανάστευσαν επιμολυσμένων κυττάρων επί του συνολικού αριθμού των επιμολυσμένων κυττάρων ( «MX /ΤΧ) υπολογίστηκε επίσης. (* = P & lt? 0,05) (C) SKOV-3 κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια που κωδικοποιούν EGFP συγχωνευμένο με αναστολείς του τύπου Ι (RIAD) ή τύπου II (ΑΟΕ) PKA αγκύρωσης, ή των αντίστοιχων ομελέτα τους ελέγχους τους (RIAD scr, ΑΟΕ SCR), τότε υπόκεινται σε προσδιορισμούς μετανάστευσης ντόνατ και ανάλυση όπως περιγράφεται στο (Α και Β). (** = Ρ & lt? 0.001)

Η

Type-II PKA είναι υπεύθυνος για την αιχμή δραστηριότητα PKA κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης

Δεδομένου ότι η δραστηριότητα της PKA εμπλουτίστηκε στην αιχμή της που μεταναστεύουν SKOV- 3 κύτταρα και ότι η αναστολή της δραστηριότητας ΡΚΑ και αγκύρωση μέσω τόσο RI και RII καχεκτική μετανάστευση, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν προπορευόμενη ακμή δραστηριότητα ΡΚΑ προκαλείται μέσω είτε τύπου Ι ή αγκύρωσης τύπου II. Για να εκτιμηθεί η επίδραση της RI- ή RII-ΑΚΑΡ αναστάτωση αγκυροβόλησης στον εντοπισμό της δραστηριότητας ΡΚΑ κατά τη μετανάστευση EOC, SKOV-3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pmAKAR3 και πλασμίδια που εκφράζουν γενετική αναστολείς του τύπου Ι και αγκύρωσης τύπου II Κ-υπομονάδας (RIAD και sAKAP

είναι

, αντίστοιχα) συγχωνευμένο με mCherry. Τα φάσματα φθορισμού mCherry δεν επικαλύπτονται με εκείνα του είτε YFP ή CFP και έτσι επιτρέπουν σε αυτές με φθορισμό σημασμένο διαταράκτες αγκυροβόλησης που πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με FRET μικροσκοπία. Μόλις επιμολυσμένα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης ντόνατ για 10 ώρες, όπου μετά τα κύτταρα απεικονίστηκαν μέσω FRET μικροσκοπία όπως περιγράφηκε παραπάνω. Κύτταρα που εκφράζουν τόσο την αγκύρωση διαταραχή και PKA δημοσιογράφος επιμολυσμένα πλασμίδια απεικονίστηκαν και της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής, YFP, FRET και mCherry εικόνες αποκτήθηκαν. Για να ποσοτικοποιηθεί το ποσοστό κυττάρων που εμφανίζουν πρόσθιου άκρου δραστηριότητα ΡΚΑ, η μέση αναλογία FRET στην αιχμή (FRET

LE? Μετράται 5-25 μm από το μπροστινό μέρος του κυττάρου) μετρήθηκε σε αναλογία με το ποσοστό FRET στο κυτταρόπλασμα (FRET

κυτταροπροστατευτικές? μετράται 25-50 μm από το μπροστινό μέρος του κυττάρου (Σχήμα 4Ε)). τιμές αναλογία ήταν ομαδοποιημένων σε υψηλά (FRET

LE /FRET

κυτταρο ≥1.5), μέτρια (FRET

LE /FRET

κυτταρο μεταξύ 1,2 και 1,5), και όχι (FRET

LE /FRET

κυτταρο & lt? 1.2) αιχμή δραστηριότητα PKA.