Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNAs (miRNAs) παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση, είτε ως ογκοκατασταλτικό ή ως ογκογόνο miRNA, ανάλογα με διαφορετικούς τύπους όγκων. Μέχρι σήμερα, οι επιστήμονες έχουν λάβει σημαντική ποσότητα γνώσεων όσον αφορά την miRNAs σε καρκίνο του παγκρέατος. Ωστόσο, η έκφραση και η λειτουργία των miR-371-5p σε καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει σαφώς καθορισθεί. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο του miR-371-5p στον καρκίνο του παγκρέατος και η σύνδεσή της με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Μέθοδοι

Η έκφραση του miR-371 -5p εξετάστηκε σε αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (PDAC) και των παρακείμενων κανονική παγκρεατική ιστούς τους (ANPT) ή σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές με qRT-PCR. Η ένωση του miR-371-5p έκφρασης με τη συνολική επιβίωση προσδιορίστηκε. Ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση των SW-1990 και τα κύτταρα Panc-1, επιμολυσμένα με miR-371-5p μιμείται ή αναστολέα, αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Η ογκογενετικότητας αξιολογήθηκε μέσω πειράματα ποντίκια ξενομόσχευμα. αλληλεπιδράσεις υποστηρικτής miR-371-5p αναλύθηκαν από χρωματίνης δοκιμασίες ανοσοκαταβύθισης (μάρκας). Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με κηλίδα Western.

Αποτελέσματα

Το επίπεδο έκφρασης του miR-371-5p ήταν δραματικά ρυθμίζεται αυξητικά στις κλινικές PDAC ιστούς σε σύγκριση με ANPT. Ασθενείς με υψηλή έκφραση του miR-371-5p είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από αυτούς με χαμηλή έκφραση του miR-371-5p. Η in vitro και in vivo δοκιμασίες έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-371-5p οδήγησε σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αύξηση της ανάπτυξης του όγκου, η οποία σχετίζεται με αναστολέα της ανάπτυξης 1 (ING1) μειορρύθμιση. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι ING1, με τη σειρά του, ανέστειλε την έκφραση του miR-371-5p στην περιοχή του υποκινητή.

Συμπεράσματα

μελέτη μας δείχνει μια νέα ING1-miR-371-5p ρυθμιστικών βρόχος ανάδρασης, η οποία μπορεί να έχει έναν κρίσιμο ρόλο στη PDAC. Έτσι miR-371-5p μπορεί να αποδειχθεί μια νέα προγνωστικός παράγοντας και θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Αυτός D, Miao Η, Xu Υ, Xiong L, Wang Υ, Xiang H, et al . (2014) MiR-371-5p Διευκολύνει καρκίνο του παγκρέατος πολλαπλασιασμό των κυττάρων και Μειώνει την επιβίωση του ασθενούς. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10.1371 /journal.pone.0112930

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 10 Ιουλίου 2014? Αποδεκτές: 16 Οκτ 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την καινοτομία των Επιστημών και TechnologyCommission του Δήμου Shenzhen (Αρ JCYJ20140414103937769). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, datacollection και την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

PDAC είναι ένα εξαιρετικά κακοήθη φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από ταχεία εξέλιξη, πρώιμη μετάσταση και σε περιορισμένη ανταπόκριση στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Παρά περισσότερα από 10 χρόνια από την FDA εγκεκριμένες θεραπευτικές αγωγές και μεγάλες βελτιώσεις στην ιατρική περίθαλψη, έχει παρατηρηθεί καμία σημαντική επίδραση στην PDAC επιβίωση των ασθενών [1]. Τώρα είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις ΗΠΑ με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 5% ετησίως [2]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να εντοπιστούν βιοδεικτών που θα προωθούν την έγκαιρη διάγνωση και επιτρέπει εξατομικευμένες στρατηγικές θεραπείας για τους ασθενείς που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο PDAC.

Η ανάπτυξη και η εξέλιξη της PDAC είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, που περιλαμβάνει την απελευθέρωση των πολλαπλών γονίδια που είναι απαραίτητα στην κυτταρική βιολογικές διεργασίες. μεταγραφικών παραγόντων (ΤΡ) και miRNAs είναι εμφανή ρυθμιστές για τη γονιδιακή έκφραση [3]. Κατά τα τελευταία 10 χρόνια, miRNAs είναι ιδιαίτερα σημαντικές σε όλες σχεδόν τις μελέτες ανάπτυξης όγκων επειδή μπορούν να είναι στόχοι των γονιδιωματικών βλαβών, που ελέγχεται από κλασικό σήματα όγκου, και οι ίδιοι παρόν ως τάξη των ογκογονιδίων ή καταστολέων όγκων [4]. Πρόσφατα, έχουν miRNAs προταθεί να συνδέεται στενά με PDAC ογκογένεση [5].

miRNAs είναι μικρές (21-24 nt) μη-κωδικοποίησης μόρια RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων με τη δέσμευση χαλαρά συμπληρωματικές αλληλουχίες στο 3 ‘ -untranslated περιοχή των mRNAs στόχο να καταστείλει τη μετάφραση ή την πρόκληση mRNA διάσπαση [6]. Η ανακάλυψη των miRNAs έχει ρίξει νέες ιδέες σχετικά με τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης και γήρανση, και έχει επίσης συμβάλει στην αντιμετώπιση των ασθενών, συμπεριλαμβανομένης της διάγνωσης και της θεραπείας [7].

Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν αποσαφηνιστεί οι ρόλοι πολλών miRNAs σε καρκίνο του παγκρέατος [8], καμία μελέτη δεν έχει ασχοληθεί με το ρόλο του miR-371-5p. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το miR-371-5p ήταν σημαντικά αυξημένα σε γαστρικό καρκίνο (GC) ασθενείς και ρυθμίζονται ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) πολλαπλασιασμό των κυττάρων από την επιτάχυνση της G1 /S μετάβαση [9], [10]. Ειδικά, περαιτέρω επικύρωση έδειξε ότι ορό miR-371-5p, ως νέο βιοδείκτη, είχε μεγάλες δυνατότητες σε διακρίσεις ασθενείς GC από υγιείς μάρτυρες [9]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι miR-371-5p μπορεί επίσης να είναι ένα νέο μηχανισμό που συμβάλλει στην αύξηση της PDAC κίνδυνο να διαταραχθεί εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω στόχευσης γονιδίων που σχετίζονται με τον κύκλο του κυττάρου. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, συγκρίναμε τις miR-371-5p προφίλ έκφρασης μεταξύ των ιστών PDAC και ANPT. Εμείς εδώ δείχνουν ότι miR-371-5p έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε PDAC ιστούς σε σύγκριση με ANPT, που είχε ως αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αύξηση της ανάπτυξης του όγκου. Έτσι, miR-371-5p μπορεί να αποδειχθεί μια νέα προγνωστικός παράγοντας και θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές PDAC SW-1990 και Panc-1 ελήφθησαν από το κινεζικό Κέντρο για Type Culture Collection (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml θειική στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C συμπληρωμένο με 5% CO2.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Δοκιμασία

ΜΤΤ [3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] – δοκιμασία που βασίζεται εκτελέστηκε για να εκτιμηθεί η επίδραση του miR-371-5p επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PDAC. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΐ μέσου) και επωάζονται για 24 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2. κύτταρα PDAC επιμολύνθηκαν με miR-NC, miR-371-5p, miR-ελέγχου, αντι-miR-371-5p, NC-siRNA ή ING1-siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστήριο (ϋίβ Technologies) για 1, 2, 3 και 4 ημέρες, αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με πλήρες μέσον χρησιμοποιήθηκαν ως τυφλό έλεγχο. Στο τέλος της καλλιέργειας, 20 μικρολίτρα των 5 mg /ml ΜΤΤ (Sigma, USA) προστέθηκε ανά φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 150 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου (Sigma, USA). Τέλος, η οπτική πυκνότητα προσδιορίστηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας σύστημα δοκιμασίας πολλαπλών μικροπλάκα (Polarstar OPTIMA, Germany). Σε κάθε δοκιμασία, πέντε παράλληλα φρεάτια έγιναν και τα αποτελέσματα συνελέγησαν ως ο μέσος όρος του περισσότερα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος western.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, το περιεχόμενο DNA ανά διπλούν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FACSort Cellquect (BD Biosciences, USA). PDAC κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων όλη τη νύκτα και επιμολύνθηκαν με miR-NC, miR-371-5p, miR-con, αντι-miR-371-5p, NC-siRNA, ή siRNA ING1-για 48 ώρες, αντίστοιχα.

στο τέλος της καλλιέργειας, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 75% παγωμένης αιθανόλης όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) που περιέχει 50 μg /ml RNase Α (DNase δωρεάν) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και αναλύθηκαν με φθορισμό διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων (Becton Dickinson, USA). Τα κύτταρα διεγείρονται στα 488 nm, και η εκπομπή συλλέχθηκε μέσω ενός φίλτρου 630 nm. Συνολικά, 20.000 κύτταρα συλλέχθηκαν από το κάθε δείγμα. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε με υπολογισμό της αναλογίας των κυττάρων σε G0 /G1, S, G2 και στάδια /M. Σε κάθε ανεξάρτητο πείραμα, τρία παράλληλα φρεάτια έγιναν, και οι διαδικασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα που λήφθηκαν παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD.

δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή

Εν συντομία, τα θραύσματα της 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’-UTR) του mRNA ING1 περιέχει το υποτιθέμενο (WT) ήσαν ενισχύθηκε με PCR από γονιδιωματικό DNA, και το προϊόν της PCR υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα pGL3-ελέγχου (Promega, USA) αμέσως κάτωθεν του γονιδίου λουσιφεράσης. Για την κατασκευή μεταλλάγματος pGL3-ING1 (MU), το κιτ μεταλλαξογένεσης QuickChange τοποκατευθυνόμενη (Stratagene) χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση έξι μεταλλάξεις σημείου στην περιοχή UTR του WT-pGL3-ING1. Το πλασμιδιακό DNA αλληλουχία για την αυθεντικότητα.

Για την δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με 300 ng του pGL3-ING1-WT ή κατασκευάσματα pGL3-ING1-Μουτ και pcDNA3-miR-371-5p ή αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα συνεπιμολύνθηκαν με 50 ng ρΡΙ_-ΤΚ πλασμίδιο που εκφράζει λουσιφεράση της Renilla (Promega, USA). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega, USA). Σχετική λουσιφεράση μετρήσεις έγιναν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του διπλού συστήματος δοκιμασίας λουσιφεράσης Reporter (Promega, USA) χρησιμοποιώντας ένα μετρητή φωταύγειας. Οι επιμολύνσεις έγιναν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές σε ανεξάρτητα πειράματα. MiR-371-5p αναστολέα, siING1 και αρνητικών μαρτύρων τους (NC) αγοράστηκαν από Panagene Inc (Κορεατικά) και Σάντα Κρουζ (ΗΠΑ), αντίστοιχα. Αλληλουχίες ήταν ως εξής: αναστολέας miR-371-5p: 5′-TTTTAACATTGCACT-3 ‘. Ad-ING1 αδενοϊό (Cat #: 1601) και τον έλεγχο Ad-GFP αδενοϊού του (Cat #: 1700) αγοράστηκαν από την Vector Biolabs (ΗΠΑ)

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA. απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, USA). 2 μg συνολικών RNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας τα miR-371-5p ειδικούς εκκινητές αντίστροφης μεταγραφής (Ribobio, Κίνα) χρησιμοποιώντας πολυ-Α πολυμεράση βασίζονται First-Strand Synthesis kit (Takara Bio, Japan) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και η σχετική έκφραση του miR-371-5p προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Takara, Κίνα). U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Η μέθοδος δέλτα-Ct χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις αναλύσεις πραγματικού χρόνου δεδομένα PCR. Στην ημι-ποσοτική RT-PCR, τα τελικά προϊόντα PCR μετά από ορισμένο αριθμό κύκλων ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 2% που ακολουθείται από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκαν υπό υπεριώδη ακτινοβολία. Εκκινητές για miR-371-5p: RT εκκινητή, 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 ‘? Προς τα εμπρός, 5’-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 ‘. Εκκινητές για U6 snRNA: RT εκκινητή, 5’-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 ‘? Προς τα εμπρός, 5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 ‘.

δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (chip) θα

ING1 σύνδεση με τον υποκινητή του miR-371-5p ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση chip. δοκιμασία ChIP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ΕΖ-chip από την Millipore (Millipore, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, περίπου 3 × 10

6 Panc-1, που έχουν μολυνθεί είτε με Ad-GFP-ING1 ή αδενοϊούς Ad-GFP συνδέθηκαν εγκάρσια με τη χρήση 1% φορμαλδεΰδη (Bio-Rad, USA) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από απόσβεση με 0,125 Μ γλυκίνη και λύθηκαν σε ρυθμιστικό ChIP λύσης (150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 50 mM Tris (ρΗ 8.0), 0.1% δεοξυχολικό, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg /ml πεπστατίνη, 1 μg /ml απρωτινίνη και 1 μg /ml λευπεπτίνη). Τα εκχυλίσματα σε υπερήχους έξι φορές για 9 s το καθένα και προϊόντα λύσης γυρίζονται με φυγοκέντρηση στις 14.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Από αυτό το δείγμα, 150 μΙ χρησιμοποιήθηκε ως είσοδο. Τα υπερκείμενα immunoprecipiated είτε με αντι-ING1 ή με IgG ποντικού (αρνητικός έλεγχος) σε 4 ° C για 4 ώρες, που ακολουθείται από πρωτεΐνη G Sepharose (Sigma, USA) για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν διαδοχικά με 1 ml ρυθμιστικού λύσης ChIP δύο φορές, Chip ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με 500 mM NaCl δύο φορές και με LiCl /διάλυμα απορρυπαντικού (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 250 mM LiCl, 0.5% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EDTA) δύο φορές και τέλος με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mM Tris και 1 mM EDTA, ρΗ 8,0). Τα σφαιρίδια εκλούσθηκαν με τη χρήση 1% SDS και διαλύματος διττανθρακικού νατρίου 0,1 Μ. Η είσοδος και τα δείγματα διαλύτη έκλουσης ήταν αντίστροφης διασυνδεδεμένη με χρήση NaCl για 5 ώρες στους 65 ° C. Το DNA από τα δείγματα απομονώθηκε με φαινόλη-χλωροφόρμιο, που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης. Ο υποστηρικτής πρόσδεση ελέγχθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που εκτείνονται τα ανάντη περιοχές του miR-371-5p ξεκινήσει sites, αλληλουχίες εκκινητών: τσιπ ING1, F: 5′-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 ‘? R: 5’-TAC ACACCTATAATCCCTGC–3 ‘? Τσιπ αρν-F: 5’- ACGGCCAACATGCTCAGG-3 ‘? R: 5’- TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 ‘

κηλίδος Western

Τα κύτταρα λύθηκαν με 1% RIPA ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ χλωριούχο νάτριο 8.0,150 mM, 1. % ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο, 2 mM EDTA) που περιέχει 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την BCA Assay Kit (Pierce). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό γάλα, που ακολουθείται από μια ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα έδειξε κουνελιού. Η μεμβράνη πλύθηκε τρεις φορές σε TBST και μετά επωάζονται με ένα δεύτερο αντίσωμα. Τέλος, το δεσμευμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε με χημειοφωταύγεια με αντιδραστήριο ανίχνευσης το ECL (Pierce). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH ή β-ακτίνης.

In vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος παγκρεατικού καρκίνου

Panc-1 κύτταρα από μετρίως διαφοροποιημένα PDAC επιμολύνθηκαν σταθερώς με miR-371 -5p ή πλασμίδιο ελέγχου miR-NC. Τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ PBS (1 χ 10

7 κύτταρα), και ενέθηκαν υποδορίως σε 4 εβδομάδων αρσενικά BALB /c γυμνά ποντίκια (

n

= 10 /ομάδα) . Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο περιβάλλον χωρίς για 5 εβδομάδες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν. Ο όγκος του όγκου

V

υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μήκος του

L

και πλάτος

W

, σύμφωνα με την εξίσωση

V

= 0,4

LW

2. Η χρήση των άτριχων ποντικών συμμορφωθεί με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων και την μελέτη εγκρίθηκε από Φροντίδας Ζώων και Χρήση Επιτροπής του Νότιου Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Ασθενείς και ιστοί όγκου

Ένα σύνολο των 60 ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών ιστών (PC) και να συνδυαστούν κανονική δίπλα του παγκρέατος ιστούς (NP) ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης σε Baoan Νοσοκομείο (Shenzhen, Κίνα) μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και Δεκεμβρίου 2010. Η διάγνωση βασίστηκε σε παθολογικές ενδείξεις. Επιπλέον ένα επιπλέον 15 ζεύγη PDAC και δείγματα ελέγχου συλλέχθηκαν από ασθενείς κατά τη διάρκεια χειρουργικής εκτομές και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο. Όλες οι 75 ασθενείς που παρέχονται γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών τους και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Νότιας Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Η στατιστική ανάλυση

Οι ενώσεις του miR-371- 5P έκφραση με τα κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά αναλύθηκαν με τη χρήση των Chi-square ή Mann-Whitney τεστ. Η καμπύλη επιβίωσης κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μαθητή

t-test

. ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση συσχέτισης Spearman του. Όλες οι τιμές πιθανοτήτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα two-tailed test και στατιστική σημαντικότητα που συνάπτονται σε

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0,01,

*** P & lt? 0.001? # Αντιπροσωπεύει καμία στατιστική σημασία. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS (έκδοση 17.0) του λογισμικού (SPSS Inc., USA). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD).

Αποτελέσματα

Η αναβάθμιση του miR-371-5p σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς συνδέεται με την επιβίωση

Για να προσδιοριστεί η επίπεδα έκφρασης του miR-371-5p σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, miR-371-5p ανιχνεύθηκε σε όλα τα 15 ζεύγη των παγκρεατικών ιστών καρκίνου και συμφωνημένα noncancerous παγκρεατικούς ιστούς τους χρησιμοποιώντας μια μέθοδο qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ιστούς PC έδειξε σημαντικά υψηλότερη έκφραση του miR-371-5p σε σύγκριση με εκείνη των ιστών ΝΡ (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, η ανάλυση επιβίωσης Kapan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με miR-371-5p θετική έκφραση (Σχήμα 1Β) είχαν σημαντικά χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με αρνητική έκφραση (Σχ.1 Γ). Η πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox έδειξε ότι το miR-371-5p έκφρασης (κίνδυνοι αναλογία [HR] = 2.748, 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI] = 1,211 – 5,914, P = 0,03), ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την συνολική επιβίωση.

(α) Μέσο επίπεδο έκφρασης του miR-371-5p σε ανθρώπινα δείγματα PDAC (

n

= 15) και η κανονική του παγκρέατος ιστούς (

n

= 15). miRNA αφθονία εκτιμήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς U6 RNA. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. (Β και Γ) miR-371-5p επίπεδα έκφρασης και η συνολική επιβίωση μετά από εκτομή του καρκίνου του παγκρέατος με την miR-371-5p -αρνητική έναντι miR-371-5p -θετικό ομάδες. Το miR-371-5p – θετική ομάδα είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από το miR-371-5p -. Αρνητική ομάδα (n = 30 /ομάδα,

P

= 0,021)

Η

miR-371-5p προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η

in vitro

και

in vivo

η

για να διερευνήσουν την επίδραση του miR-371-5p για παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η PDAC κυτταρικές γραμμές με διαφορετικές ποιότητες SW-1990 και Panc-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα miR-317-5p μιμούνται ή αναστολέα (αντι-miR-371-5p) και των αντίστοιχων NCs τους. Η ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι οι miR-371-5p μιμείται προκάλεσε αύξηση 14,42 και 6,47 φορές του miR-371-5p έκφραση σε PANC-1 και SW-1990 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α). Εν τω μεταξύ, το αντι-miR-371-5p μείωσε το miR-371-5p έκφραση με 3,14 και 3,28 πτυχώσεις σε PANC-1 και SW-1990 κύτταρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Σχήμα 2Β). Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ διεξήχθη σε SW-1990, και Panc-1 κύτταρα που επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα miR-371-5p μιμούνται ή αναστολέα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-371-5p -mimics προωθείται ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου, ενώ η αντι-miR-371-5p ανάπτυξη ανέστειλε κύτταρο όγκου (Ρ & lt? 0,01, Fig.2C και D) Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο αντι-ΜΙΚ 371-5 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναλύσαμε την κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων Panc-1 και SW-1990 που επιμολύνθηκαν με αντι miR-371-5p και τον έλεγχο. Ένα μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων που επιμολύνονται με το αντι-miR-371-5p συσσωρευτεί στην G1 φάση, ενώ ο πληθυσμός S φάση μειώθηκε (Σχ.2Ε). Ωστόσο, ένα αντίθετο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με το miR-371-5p (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η πολλαπλασιαστική αναστολή της αντι-miR 371-5p ήταν εν μέρει οφείλεται σε μια σύλληψη G1 φάσης των δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

(Α και Β) Το επίπεδο έκφρασης του miR-371 -5p δοκιμάστηκε για 48 ώρες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με miR-371-5p μιμείται, αντι-miR-371-5p και των αντίστοιχων ελέγχου (NC, 40 ηΜ) με qRT-PCR. (Γ και Δ) Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών PDAC παροδικά επιμολυσμένα με miR-371-5p μιμείται, miR-371-5p αναστολέα ή του ελέγχου αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ. (Ε) Αντι-miR-371-5p αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων στην G1 όπως εκτιμάται με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (αριστερό πάνελ, **

P

& lt? 0.01, n = 4). Και οι histographs εκπρόσωπος του κυτταρικού κύκλου (anti-miR-NC vs αντι-miR-371-5p) παρουσιάζονται (δεξιά πλευρά). (F) Γυμνοί ποντικοί υποδορίως εμβολιάσθηκαν με Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-371-5p πλασμίδιο ή το πλασμίδιο ελέγχου miR-NC, σε λαγόνες τους. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική των όγκων που σχηματίζονται σε 10 ποντίκια. (G) Καμπύλες ανάπτυξης του όγκου του όγκου. Το γράφημα είναι αντιπροσωπευτική της ανάπτυξης του όγκου, 5 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± S.D. (

n

= 10).

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν miR-371-5p είχε εμπλακεί σε ογκογένεση, ένα σταθερό miR-371-5p -overexpression κυτταρική γραμμή και τον έλεγχο κυτταρική σειρά εγχύθηκαν υποδορίως στα γυμνά ποντίκια, και με τη σειρά, η δράση ανάπτυξης όγκου μετρήθηκε. Όταν συλλέχθηκαν οι όγκοι, ο μέσος όγκος των όγκων που προέρχονται από το miR-371-5p ομάδα ήταν μεγαλύτερος σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχ.2F που και G,

P

& lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα του miR-371-5p υπερέκφραση in vitro και έντονα πρότεινε ότι το miR-371-5p θα μπορούσε να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC.

ING1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-371-5p και να συμμετέχουν στην miR-371-5p επάγουν την προώθηση της PDAC κύτταρα πολλαπλασιασμού

για να διερευνήσουν τις δυνατότητες στόχο μέσω του οποίου ο miR-371-5p προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, πήραμε πλεονέκτημα της βιοπληροφορικής να προβλέψουμε το υποτιθέμενο miR-371-5p στόχους. Και οι δύο Σάρωση και Miranda συστήματα Target προέβλεψε ING1, ένα κλειδί ογκοκατασταλτικό, να είναι ένας πιθανός στόχος του miR-371-5p. Για να επαληθευθεί αν miR-371-5p άμεσα στοχευμένες miR-371-5p mRNA σε όγκους PDAC και κυτταρικές σειρές, in vitro και in silico ανάλυση διεξήχθησαν. Κατ ‘αρχάς, αντι ελέγχου miR-371-5p ή μετασκευάστηκε σε SW-1990 και Panc-1 κύτταρα, και βρήκαμε ότι ανέστειλε την έκφραση του miR-371-5p αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ING1 και στις δύο γραμμές (Εικ. 3Α). Στη συνέχεια, miR-371-5p μιμητικό ή ελέγχου επιμολύνθηκε στα παραπάνω 2 κυτταρικές γραμμές. Βρήκαμε ότι η αναγκαστική έκφραση του miR-371-5p μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης ING1 στις δύο κυτταρικές σειρές με συνέπεια (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-371-5p μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με μειούμενες PDAC έκφρασης ING1 in vitro.

(Α) έκφραση ING1 σε SW-1990 και Panc-1 κύτταρα μετά την επιμόλυνση με αντι miR -371-5p, ή miR-371-5p μιμείται ή ελέγχου ανιχνεύεται με western αποτύπωση. (Β-Ι) ING1 ανιχνεύθηκε από qRTPCR σε 50 καρκίνου του παγκρέατος (PC) σε ιστούς και ταίριαζαν με τα γειτονικά noncancerous παγκρέατος ιστούς (NP). Η αφθονία ING1 ομαλοποιήθηκε έναντι GAPDH. (Β-II) Η σχέση μεταξύ ING1 και miR-371-5p έκφραση εξερευνήθηκε από συσχέτισης Spearman στις 50 PDAC ιστούς. έκφραση ING1 σχετίστηκε αρνητικά με miR-371-5p σε 50 ιστούς όγκων PDAC. (C) Προβλεπόμενη επακόλουθη σύζευξη του στόχου 3′-UTR περιοχή του ING1 (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένα) και miR-371-5p ώριμη ακολουθία. Η δραστικότητα λουσιφεράσης με την παρουσία και των δύο άγριου τύπου ING1 3′-UTR ή μεταλλαγμένες και miR-371-5p συγκρίθηκε με τον έλεγχο. (D) στύπωμα Western διεξήχθη για να αναλυθεί έκφραση ING1 σε σι ING1 επιμολυσμένα κύτταρα Panc-1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός ποσοτικό έλεγχο. (Ε) Επίδραση siING1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία MTS. (F) Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με NC, miR-371-5p αναστολέα ή αναστολέα miR-371-5p και siING1, και στη συνέχεια δοκιμασία MTS εκτελέστηκε.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρυθμιστικό σχέση μεταξύ miR-371-5p και ING1, εξετάσαμε την έκφραση του ING1 σε PDAC δείγματα (PC) και τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς τους (ΝΡ). Χρησιμοποιώντας qRT-PCR, βρήκαμε ότι το μέσο επίπεδο της έκφρασης ING1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ιστούς PC σε σύγκριση με εκείνη των ιστών NP (Σχ. 3Β-Ι). Μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ ING1 και miR-371-5p εκφράσεις σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς (συσχέτιση Spearman, το r = -0,4802) και των παρακείμενων ιστών noncancerous (r = -0,4103, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) (Σχ. 3Β-ΙΙ).

για να αξιολογηθεί η ικανότητα σύνδεσης στην 3’UTR του ING1 miR-371-5p, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία λουσιφεράσης και παρατηρείται σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης με την παρουσία του miR-371-5p – ING1 σε SW-1990 κυττάρων, σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 3C). Για να επικυρώσετε το αν ING1 ήταν άμεσο στόχο του miR-371-5p, έχουμε μεταλλαχθεί τις θέσεις στην 3’UTR του ING1 δεσμευτική miR-371-5p και παρατηρείται απώλεια της καταστολής (Σχ. 3C). Στο σύνολό τους, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ING1 ήταν ένα άμεσο στόχο του miR-371-5p.

Για να διαλευκανθεί αν η αυξητική δράση του miR-371-5p επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση καταστολή των ING1 στα κύτταρα PDAC, η εξετάστηκε επίδραση της ING1 στην κυτταρική ανάπτυξη. Πρώτον, τα κύτταρα Panc-1 επιμολύνθηκαν με siRNA κατά ING1 ή τον έλεγχό του, και στη συνέχεια, εξετάσαμε την κυτταρική ανάπτυξη με τη δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 3D). ΜΤΤ αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η γονιδιακή σίγηση του ING1 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, η ανασταλτική δράση του αναστολέα miR-371-5p επί της κυτταρικής ανάπτυξης αντιστράφηκε όταν η έκφραση ING1 ήταν knockdown (Σχήμα 3F). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά έδειξαν ότι ING1 είναι λειτουργικά σημαντικός στόχος του miR-371-5p που εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC.

ING1b ρυθμίζει miR-371-5p έκφραση

Η ING οικογένεια του τύπου II καταστολείς όγκων χρησιμεύσουν ως οι δύο επιγενετικών «αναγνώστες» και στοχεύουν τρανσφεράσης των ιστονών ακετυλο (HAT) και αποακετυλασών των ιστονών (HDAC) «συγγραφείς» της επιγενετικής κώδικα ιστονών [11]. Η πρωτεΐνη ING1 έχει επίσης εμπλακεί στη ρύθμιση των επιπέδων miRNA [12]. Για να προσδιοριστεί κατά πόσο ING1 ρυθμίζει miR-371-5p έκφρασης, τα κύτταρα Panc-1 μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει GFP μόνο του ή με αδενοϊό που εκφράζει τόσο GFP και ING1. MiR-371-5p επιβεβαιώθηκε να μειωθεί σημαντικά και επαναλήψιμα σε απάντηση ING1 υπερέκφραση (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο σχήμα 4Β, σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA), ένα αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα, αυξημένη miR-371-5p έκφραση σημαντικά σε κύτταρα Panc-1, η οποία είναι συνεπής με επιγενετική ρύθμιση από ING1 ως μέρος της HDAC1 και HDAC2 συγκροτήματα. Ωστόσο, SAHA δεν άλλαξε έκφραση ING1. ανάλυση τσιπ ING1 έδειξε ότι ING1 συνδέεται με την περιοχή υποκινητή του miR-371-5p (4Γ), υποδεικνύοντας ότι ING1 ρυθμίζει άμεσα miR-371-5p έκφρασης. Έτσι, ING1 ρυθμίζει επιγενετικώς miR-371-5p έκφραση σε PDAC.

(Α) Η έκφραση του miR-371-5p στο Panc-1 κύτταρα σε απάντηση ING1 υπερέκφραση για 48 hs, προσδιορίστηκε από ποσοτική πραγματικού . -Time δοκιμασίες PCR (άνω πάνελ ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (**

P

& lt?.. 0.01, η = 5) (κάτω πίνακας) κηλίδα Western διεξήχθη για να αναλυθεί έκφραση ING1 (Β) miR -371-5p επίπεδο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR σε Panc-1 κύτταρα σε απόκριση προς κατεργασία με τον αναστολέα HDAC σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (άνω πάνελ, *

P

& lt? 0,05, η = 5) (κάτω πίνακας) κηλίδα Western διεξήχθη για να αναλυθεί έκφραση ING1 (Γ) κύτταρα μολυσμένα με GFP ελέγχου αδενοϊό ή με το ίδιο ιό που κωδικοποιεί επίσης ING1 συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα και προετοιμάζονται για chip.. ανάλυση με τη χρήση αντισωμάτων έλεγχο ή ING1. PCR προϊόντα ανοσοκατακρήμνισης έδειξε ότι ING1 συνδέεται με την ανοδική περιοχή του miR-371-5p.

η

Συζήτηση

Μια πλήρης κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν έναρξη παγκρεατικού όγκου και προόδου είναι σημαντικό για τα νέα προγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν στη βελτίωση της έκβασης των ασθενών με καρκίνο. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, miRNAs αναδύονται ως μια νέα κατηγορία των ρυθμιστικών γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες όγκους [13]. Εδώ, θα παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι το miR-371-5p διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε παγκρεατικά ογκογένεση. Είναι συχνά ρυθμίζεται αυξητικά στην PDAC. Σταθερά, miR-371-5p υπερέκφραση είναι εμφανώς σχετίζεται με την επιβίωση δυσμενείς των ασθενών, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι κακό προγνωστικό παράγοντα. Η θετική σχέση του miR-371-5p επίπεδα με πολλαπλασιασμό υποστηρίζει την ιδέα ότι ενεργεί ως ογκο-miRNA.

Τα χαρακτηριστικά που παρατηρούνται σε ασθενείς με PDAC ανακεφαλαιώνει σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. MiR-371-5p-κύτταρα που υπερεκφράζουν αναπτύσσουν μεγάλους όγκους, οι οποίοι επανέρχονται με ενέσεις ενός ειδικού αναστολέα εναντίον της. Μια αντίθετη συμπεριφορά παρατηρείται με miR-371-5p κύτταρα χαμηλής εκφράζουν και την έγχυση του αντίστοιχου μιμούνται RNA. Μέχρι σήμερα, miR-371-5p έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται μόνο σε ηπατοκυτταρικά καρκινώματα, πράγμα που δείχνει ότι η υπερέκφραση του συνδέεται με πιο επιθετικούς όγκους και μια φτωχότερη έκβαση [14], σε συμφωνία με δεδομένα που λαμβάνονται σε PDAC. Ωστόσο, η συμβολή του miR-371-5p σε αυτή τη διαδικασία χρειάζεται περαιτέρω έρευνες.

Η κατανόηση των βιολογικών λειτουργιών των miRNA βασίζεται στην αναγνώριση των σχετικών γονιδίων-στόχων. Ωστόσο, η πρόβλεψη των στόχων των miRNAs είναι ακόμα ένα δύσκολο τομέα της έρευνας. Η πλειοψηφία της αλληλουχίας που ταιριάζουν miRNA-στόχου βασίζεται στην ατελή συμπληρωματικότητα της miRNA με τις 3′-UTRs των mRNAs στόχου. Η απαίτηση για συμπληρωματικότητα των μόνο επτά ή οκτώ νουκλεοτιδίων μπορεί να οδηγήσει σε εκατοντάδες πιθανών στόχων [15]. Μέχρι στιγμής, πολύ λίγα γονίδια στόχους του miR-371-5p έχουν επιβεβαιωθεί σε διάφορα βιολογικά συστήματα.

Εδώ, έχουμε την επικύρωση ING1 ως άμεσο λειτουργικό στόχο της miR-371-5p στο PDAC, προσθέτοντας πληροφορίες για παλαιότερα ανέφεραν τύπους κυττάρων [16]. Η οικογένεια ING του τύπου II καταστολείς όγκων συμβάλλει στην ανάπτυξη διαφόρων όγκων [17]. Αυτή η οικογένεια είναι καλά συντηρημένο και περιλαμβάνει πέντε γονίδια. Μεταξύ αυτών,

ing1

είναι το καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος και κωδικοποιεί τέσσερα πρωτεΐνη ισομορφές [18]. Η οικογένεια της ING καταστολείς όγκων ενεργεί ως αναγνώστες και συγγραφείς της επιγενετικής κώδικα ιστονών, που επηρεάζουν την επιδιόρθωση του DNA, αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, την κυτταρική γήρανση, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [18]. Η υπερέκφραση του ING1 προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 με επακόλουθη απόπτωση, ενώ η καταστολή της έκφρασης αυξημένο σχηματισμό εστίαση αποικία και την ανάπτυξη

in vitro

και του όγκου σχηματισμού

in vivo

[19]. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ING1 δρα ως καταστολέας όγκου παραμένουν ατελώς καθορισμένη.

ING1 ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση μέσω ρύθμισης ακετυλίωση των ιστονών και μεθυλίωσης [20]. ING1 είναι ο κύριος στόχος του αναστολέα HDAC SAHA, και φαίνεται να ρυθμίζει πρωτίστως χρωματίνη συμπύκνωση και στη συνέχεια, η έκφραση των υποσυνόλων των γονιδίων μέσω επιγενετικών μηχανισμών. Επιπλέον, πολλές miRNAs αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από επιγενετικών μηχανισμών [21]. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν miR-371-5p ρυθμίζεται από ING1. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η έκφραση του miR-371-5p είναι επιγενετικώς ρυθμίζεται από ING1 και ότι miR-371-5p αντιστρέφει ένα σημαντικό ποσοστό των ανασταλτικές επιδράσεις της ING1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επιπλέον, αλλαγές στην έκφραση ING1 επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, αναπαράγοντας σε έναν τρόπο αντίστροφο τα αποτελέσματα οφείλονται σε miR-371-5p, όπως καταδεικνύεται περαιτέρω σε δείγματα όγκων. Τα αμοιβαία και αντίστροφη διακυμάνσεις των επιπέδων ING1 παρακάτω miR-371-5p διαμόρφωση αποδεικνύουν σαφώς ότι είναι μηχανιστικά συνδεθεί. Η στενή αλληλεπίδραση μεταξύ ING1 και miR-371-5p περαιτέρω αποδεικνύεται με ταυτόχρονη αποσιώπηση τους: ING1 νοκ ντάουν αντιστρέφει πλήρως τις επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση λόγω miR-371-5p αναστολής, προσδιορίζοντας ως ένα σημαντικό καθοδικός τελεστής του miRNA.