Αφηρημένο

Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με βιολογικούς μηχανισμούς που καθορίζουν την ασθένεια οντότητα μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου στο ήπαρ (CRCLM) χωρίς καλές κλινικές παραμέτρους για την εκτίμηση της πρόγνωσης. Για τα τελευταία λίγα χρόνια, η κατανόηση της σχέσης μεταξύ των χαρακτηριστικών του όγκου και τοπική ανοσολογική απόκριση έχει αποκτήσει ιδιαίτερη προσοχή. Λαμβάνοντας υπόψη τις πολύπλευρες ρόλους των Β-κυττάρων με γνώμονα τις απαντήσεις, έχουμε ως στόχο να διευκρινίσει το ανοσολογικό αποτύπωμα της Β λεμφοκυττάρων στο μεταστατικό χώρο, την διαπλοκή με τα μακροφάγα, και προγνωστική σημασία τους. Εδώ παρουσιάζουμε νέο αλγόριθμο που επιτρέπει να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ του τοπικού ανοσολογική ικανότητα του ασθενούς-ειδικά και της κλινικής έκβασης. Η πλατφόρμα απεικόνισης μικροσκοπία με βάση χρησιμοποιήθηκε για την αυτοματοποιημένη σάρωση των τμημάτων ιστού μεγάλης κλίμακας και επακόλουθη ποιοτικές και ποσοτικές αναλύσεις του ανοσοποιητικού υποτύπων κυττάρων χρησιμοποιώντας δείκτες γενεαλογίας και στρατηγική αναγνώριση μονού κυττάρου. Τα αποτελέσματα δείχνουν μαζική διήθηση των CD45-θετικών λευκοκυττάρων περιορίζεται στο μεταστατικό σύνορα. Αναφέρουμε για πρώτη φορά τη συσσώρευση του CD20-θετικών Β λεμφοκυττάρων στον όγκο – διεπαφή ήπατος που περιλαμβάνει το κύριο πληθυσμό εντός των μεγάλων CD45-θετικά συσσωματώματα. Εντυπωσιακά, λειτουργικά ενεργά, που προκαλείται από ενεργοποίηση απαμινάσης της κυτιδίνης (AID) βρέθηκαν -θετικό έκτοπη δομές λεμφικών να συναρμολογούνται εντός του μεταστατικού περιθώριο. Επιπλέον, η CD20 με βάση το σύνολο δεδομένων αποκάλυψε μια ισχυρή προγνωστική δύναμη: ασθενείς με υψηλή περιεκτικότητα σε CD20 και /ή έκτοπη θύλακες είχαν σημαντικά χαμηλότερο κίνδυνο για υποτροπή της νόσου, όπως αποκαλύπτεται από μονοπαραγοντική ανάλυση (p & lt? 0,001 για τις δύο) και σε μοντέλα προσαρμόζονται για κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές (ρ & lt? 0.001 και ρ = 0,01, αντίστοιχα), και έδειξαν παρατεταμένη συνολική επιβίωση. Σε αντίθεση, CD68 χρώση που προέρχονται από το σύνολο δεδομένων δεν έδειξε κάποια συσχέτιση με την κλινική έκβαση. Στο σύνολό τους, θα ορίσουν το μέγεθος των Β λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που οργανώνονται σε έκτοπη θύλακες, ως νέα προγνωστικός δείκτης που είναι ανώτερη από κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Ευρήματα τονίζουν αντι-καρκινικές ρόλο των κυττάρων με γνώμονα μηχανισμού (ες) Β και έτσι δείχνουν ένα νέο τρόπο σκέψης σχετικά με πιθανές στρατηγικές θεραπείας για ασθενείς CRCLM

Παράθεση:. Meshcheryakova Α, Tamandl D, E Bajna, Stift J , Mittlboeck Μ, Svoboda M, et al. (2014) Β κύτταρα και έκτοπη Ωοθυλακική Δομές: Μυθιστόρημα παίκτες στο Anti-Tumor Προγραμματισμός με Προγνωστικοί ρεύματος για ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (6): e99008. doi: 10.1371 /journal.pone.0099008

Επιμέλεια: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Γαλλία

Ελήφθη: 29 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 9 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Meshcheryakova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το ταμείο αυστριακή Science (FWF? https://www.fwf.ac.at/) έργα P22441-B13 και P23228-Β19 γερμανικά μάρκα. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο εξακολουθεί να αποτελεί θεραπευτική πρόκληση, παρά τις πρόσφατες βελτιώσεις στη συστηματική θεραπεία συμπεριλαμβανομένων των εξελίξεων στην κυτταροτοξική και στοχευμένων παραγόντων [1], [2] και διεπιστημονική διαχείριση. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με βιολογικούς μηχανισμούς που καθορίζουν την πρόγνωση της ασθένειας αυτής και θα μπορούσε να θεωρηθεί ως σημεία εισόδου για νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Επιπλέον, δεν υπάρχουν κλινικές παράμετροι διαθέσιμες για την εκτίμηση πρόγνωση επιβίωσης των ασθενών μετά εκτομή ήπατος. Ωστόσο, υπάρχουν στοιχεία για να θεωρηθεί ορθοκολικό καρκίνο του ήπατος μεταστάσεις (CRCLM) ως ένα ανοσογόνο τύπος καρκίνου του αφού αυξημένη πυκνότητα των Τ λεμφοκυττάρων στο μεταστατικό περιθώριο με αντι-καρκινική Τ-κυττάρων τελεστές καθοδηγείται μηχανισμοί δείχθηκε ότι είναι προγνωστικά σημαντικές [3].

είναι γενικά αποδεκτό ότι οι συμπαγείς όγκοι αποτελούν ένα παράδειγμα του ιστού, όπου κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, είτε διαμένουν είτε διεισδύοντας, θα μπορούσε να πάρει ενεργοποιούνται ανωμάλως επηρεάζοντας έτσι την κλινική πορεία της νόσου [4], [5]. Ωστόσο, συμπαγών όγκων διαφορετικής προέλευσης μπορεί να ποικίλει σημαντικά σε σύνθεση λευκοκυττάρων. Δεδομένης συνεισφορά οποιουδήποτε τύπου κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος – κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs), τα βοηθητικά κύτταρα Τ (Th), ρυθμιστικά κύτταρα Τ (Treg), κύτταρα ΝΚ, δενδριτικά κύτταρα, μονοκύτταρα /μακροφάγα κύτταρα γράμμωσης, και υποσύνολα των Β-κυττάρων – το ιστών θα μπορούσε να θεωρηθεί ειδικούς μηχανισμούς για κάθε αντίστοιχο τύπο του όγκου που συνδέει την ανοσολογική ικανότητα του ασθενούς-ειδικά και την κλινική έκβαση. Για να περιγράψει καλύτερα ο καρκίνος τύπου που δόθηκε και ασθενή προσανατολισμό ετερογένεια στο ποσό ή /και τύπους διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και τα σχέδια κατανομής τους εντός του όγκου, καθώς και τις συνακόλουθες εκδηλώσεις κλιμακωτή να δημιουργήσει όγκο που συνοδεύουν ανοσολογική απόκριση, μια νέα ορολογία που ήταν ολοκληρωμένη όπως

το ανοσοποιητικό τοπίο

,

το ανοσοποιητικό contexture, η Immunoscore, η immunome

, και

ο κύκλος του καρκίνου-ασυλία

[4], [6] – [8 ]. Από τη μία πλευρά, συμπαγείς όγκους γενικά χαρακτηρίζονται ως ανοσοκατασταλτικά με βάση πολλαπλά μηχανισμούς δικτύωσης, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των ανοσοκατασταλτικών οδών και των σημάτων, επαγωγή της ανοχής προς αντιγόνα όγκου και την πρόσληψη των ανοσοκατασταλτικών κυττάρων όπως τα κύτταρα Treg, μυελοειδή προερχόμενα κατασταλτικά κύτταρα, και από όγκο συναφείς μακροφάγα (ΤΑΜ) [9] – [11]. Από την άλλη πλευρά, οι μελέτες επικεντρώνονται πάνω σε κύτταρα Τ πρότεινε μια ισχυρή αντι-ογκική δυναμικό των CD8-θετικών CTLs σε ασθενείς με διάφορους τύπους καρκίνου [12]. Αξίζει να σημειωθεί, ότι υπάρχει ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της πυκνότητας των διηθήσεων με κυτταροτοξικά και Τ-κυττάρων μνήμης φαινοτύπων και παρατεταμένη επιβίωση των ασθενών με πρωτοπαθή και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου [3], [13] – [16].

λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τον λειτουργικό ρόλο του όγκου /στρώματος διηθητικά κύτταρα Β σχετικά με τους μηχανισμούς που διέπουν προ- έναντι προγραμματισμού αντινεοπλασματική νεοπλασματικών ιστών. Η ποικιλία των δράσεων των Β-κυττάρων με τη μεσολάβηση περιλαμβάνει την εκκίνηση εξαρτώμενο από αντιγόνο Τ-κυττάρου, τα μηχανήματα για την παραγωγή ανοσοσφαιρινών, έκκριση κυτοκινών και χημειοκινών που μεσολαβούν (προάγουν ή αναστέλλουν) τη διαφοροποίηση των κυττάρων και της φλεγμονής [17] συμβάλλοντας έτσι στην ασθένεια παθογένεση μέσω εξαρτώμενης από αντίσωμα και ανεξάρτητη από τους μηχανισμούς [18] – [22]

Πρόσθετες σχετικά νέα πτυχή που συνδέει βιολογία κυττάρων Β και φλεγμονή βασίζεται στην ανακάλυψη του βλαστικού κέντρου (GC) -όπως δομές εκτός της δευτεροβάθμιας. λεμφοειδή όργανα. Πράγματι, πολλαπλές μελέτες έχουν αποδείξει την ύπαρξη έκτοπης ωοθυλακίου δομών (που ονομάζεται επίσης τριτοταγείς δομές λεμφοειδή) σε θέσεις χρόνιας φλεγμονής εντός διαφορετικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει τάξη μεταγωγής ανοσοσφαιρινών και σωματικών εκδηλώσεις υπερμετάλλαξη να λάβει χώρα τοπικά υπό τον έλεγχο του που προκαλείται από ενεργοποίηση απαμινάσης κυτιδίνης (AID) ([23] – [26], αναθεωρούνται στο [13], [27], [28]). Είναι σημαντικό ότι, εκτός από καλοήθεις ιστούς με χρόνιες φλεγμονώδεις διεργασίες, έκτοπη θυλακιώδη δομές έχουν αναφερθεί σε ορισμένους τύπους των συμπαγών όγκων. Η παρουσία τριτοταγών δομών λεμφοειδών μελετήθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου και βρέθηκε να σχετίζεται με ευνοϊκά κλινική έκβαση? είτε πυκνότητα των ώριμων DCs [29], ή, επιπροσθέτως, η πυκνότητα του ωοθυλακίου Β κυττάρων [30] χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η προγνωστική επίδραση των δομών τριτογενή λεμφοειδών. Έκτοπη θυλακιώδη δομές επίσης ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς με διηθητικό καρκίνωμα του πόρου του μαστού, γεγονός που υποδηλώνει μια

in situ

αντιγόνο οδηγείται Β-κυττάρου απόκριση σε μια ποικιλία από όγκο μαστού και αντιγόνα που σχετίζονται [31]. Όσον αφορά τις πρωτογενείς καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), σε μια πιλοτική μελέτη, έκτοπη ωοθυλακίων δομές είχαν προβλεφθεί από το ανοσοποιητικό σειρά γονιδίων προφίλ και επιβεβαιώθηκε από ανοσοχρώση [32].

Λαμβάνοντας υπόψη τα στοιχεία που υποστηρίζουν τη δυνητική συμβολή της διηθούν όγκο Β κύτταρα στην παθογένεση της νόσου, την εξέλιξη και /ή ανάλυση ασθένεια, στοχεύσαμε να διερευνήσει τη Β-κυττάρων με γνώμονα το ανοσοποιητικό έλεγχο σε έναν ασθενή κοόρτη με ορθοκολικό καρκίνο του ήπατος μεταστάσεις (CRCLM). Ωστόσο, ένα γενικό αδύνατο σημείο για την αξιολόγηση της παρουσίας και προγνωστική επίδραση του κατοίκου ή /και διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σε όλη την δείγμα ασθενούς μεγάλης κλίμακας με CRCLM (ή άλλου τύπου συμπλόκου κακοήθους ιστού) είναι η απαίτηση για τους αλγόριθμους ποσοτικοποίηση. Πράγματι, η ανάγκη για την αυτοματοποιημένη, επαναλήψιμη ποσοτικοποίηση του ανοσοποιητικού κυτταρικών πληθυσμών με βάση την ιστολογική αξιολόγηση έχει τονιστεί από την επιστημονική κοινότητα στην περιοχή μεταγραφική έρευνα και ορισμένοι αλγόριθμοι έχουν περιγραφεί [33] – [35]. Το πλέον επιτυχημένο παράδειγμα της ανοσολογικής εκτίμησης βαθμολόγησης βασίζεται στην αναλογία των Τ-κυττάρων υποσύνολα (CD3

+, CD8

+, CD45RO

+, και Granzyme Β

+) σε ασθενείς με πρωτοπαθή ορθοκολικό Καρκίνος. Immunoscore προτάθηκε ως προγνωστικός δείκτης για να χρησιμοποιηθούν σε συνήθεις δοκιμές [36], [37]? να προωθήσει την παγκόσμια χρήση των Immunoscore κινήθηκε η ομάδα εργασίας μεταξύ των 22 διεθνών κέντρων εμπειρογνωμόνων [38].

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα αυτοματοποιημένο σύστημα μικροσκοπίας TissueFAXS με βάση και ένα νεοσύστατο αλγόριθμο για την ανίχνευση και τον ποσοτικό του ανοσοποιητικού κυτταρικών πληθυσμών σε μια μεγάλης κλίμακας υπόδειγμα του CRCLM. Λαμβάνοντας υπόψη τις πολύπλευρες ρόλους των Β-κυττάρων με γνώμονα τις απαντήσεις ιδίως σε περιοχές με χρόνια φλεγμονή, έχουμε ως στόχο να διευκρινίσει τον ασθενή ειδικό αποτύπωμα της Β λεμφοκυττάρων στο μεταστατικό σύνορα με ιδιαίτερη έμφαση αποδίδεται στο φαινόμενο του σχηματισμού έκτοπη θύλακα, τη διασύνδεση μεταξύ των Β κυττάρων και διηθητικά /μακροφάγα κάτοικο, και η αξιολόγηση της προγνωστικής επίδρασή τους.

Υλικό και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Βιέννης (EK-Nr. 1277/2012). Η συγκατάθεση αυτή παραιτήθηκε από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση οφείλεται στην αναδρομική φύση της μελέτης.

Προφίλ των ασθενών της μελέτης

Μια ομάδα ενσωματωμένες σε παραφίνη δείγματα ασθενών με CRCLM ανακτήθηκε εκ των υστέρων από την 65 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα Χειρουργικής, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου της Βιέννης. Πρώτη ομάδα αποτελείται από 14 ασθενείς που είχαν μια εκτομή ήπατος μεταξύ του 2001 και του 2007, είχε metachronous παρουσίαση της μεταστατικής νόσου (χωρίς μεταστάσεις, όταν ο κύριος όγκος διαγνώστηκε) και υποβλήθηκαν σε εκτομή χωρίς προεγχειρητική χημειοθεραπεία (Πίνακας Ι). Το διάμεσο χρόνο παρακολούθησης για αυτή την ομάδα ήταν 50,2 μήνες (95% CI: 33,6 έως 66,8 μήνες). Αυτή η ομάδα των ασθενών μας επέτρεψε να αξιολογηθεί η ανοσολογική αποτύπωμα σε δείγματα χωρίς προηγούμενη θεραπεία. Δεύτερη ομάδα (πάνελ II, n = 51) περιελάμβανε τυχαίως επιλεγμένων ασθενών που έλαβαν χημειοθεραπεία πριν από την εκτομή ήπατος? ημερομηνία ένταξης ήταν μεταξύ 2006 και 2009? το διάμεσο χρόνο παρακολούθησης ήταν 32,2 μήνες (95% CI: 24,4 έως 40,0 μήνες). Ως αποτέλεσμα της τυχαίας επιλογής, ο πίνακας II περιλαμβάνονται εκείνους τους ασθενείς οι οποίοι είχαν βασισμένη σε φθοριοπυριμιδίνη κυτταροτοξική χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με οξαλιπλατίνη (46 ασθενείς) ή με ιρινοτεκάνη (5 ασθενείς). Επιπλέον, όλοι οι ασθενείς έλαβαν bevacizumab ως την προτιμώμενη θεραπευτική αγωγή στο ίδρυμά μας κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Οι ασθενείς έλαβαν την τελευταία χημειοθεραπεία τους 21 ημέρες πριν από την επέμβαση? η τελευταία bevacizumab αγωγή δόθηκε μέχρι 5 εβδομάδες πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Εντός πίνακα II, 19 από 51 δείγματα αξιολογήθηκαν για CD45, ενώ όλα τα δείγματα 51 αξιολογήθηκαν για Β-κυττάρων και μακροφάγων καταγωγές. Για ασθενείς με περισσότερες από μία μετάσταση, επιλογή του καταλληλότερου μετάσταση για χρώση ήταν κατά την αποκάλυψη της παθολόγος? Τυπικά, οι ίδιες δείγμα ιστού το οποίο χρησιμοποιήθηκε για διαγνωστική διαδικασία και απόκριση θεραπεία παρακολούθησης συμπεριλήφθηκε στη μελέτη. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1: Τα δημογραφικά δεδομένα, παθολογική σταδιοποίηση με σύστημα κατάταξης ΤΝΜ, τον αριθμό και το μέγεθος των μεταστάσεων του ήπατος, τη ζωτικότητα των ηπατικών μεταστάσεων (για πάνελ II), ασθένεια διάστημα χωρίς, και δεδομένα για μετεγχειρητική χημειοθεραπεία παρέχονται. Τόσο ημερομηνία επανάληψης και είτε την ημερομηνία θανάτου ή την ημερομηνία δει για τελευταία φορά καταγράφηκαν. Συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ διάγνωσης και θανάτου από καρκίνο σχετίζονται (με 22 καταγεγραμμένες περιπτώσεις θανάτου από καρκίνο σχετίζονται)? υποτροπή δωρεάν επιβίωσης (RFS) ως ο χρόνος μεταξύ διάγνωσης της μετάστασης και της εξέλιξης της νόσου, όπως εκτιμάται από την επανεμφάνιση της μετάστασης ή οποιοδήποτε τύπο όγκου (με 46 καταγεγραμμένες περιπτώσεις υποτροπής της νόσου). Νόσος διάστημα χωρίς (DFI) ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ διάγνωση του πρωτοπαθούς καρκίνου του παχέος εντέρου και του ήπατος μεταστάσεων σε ασθενείς με metachronous ανάπτυξη μεταστατικής νόσου. Ζωτικότητα των ηπατικών μεταστάσεων αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται [39]

χρώση ρουτίνας.

Η ανοσοχρώση σε τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη και

αξιολόγηση χρώση

εγκλεισμένα σε παραφίνη 4 μm πάχους τομές υποβλήθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Τμήματα των δειγμάτων CRCLM ελήφθησαν για CD45, CD20, AID, IgM, CD138, και CD68. Για την ανίχνευση CD45, ένα κοινό αντιγόνο λευκοκυττάρων, κουνέλι κλωνική αντίσωμα, κλώνος Ε19-G (DB Biotech, Κόσιτσε, SR) χρησιμοποιήθηκε. CD20 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, κλώνος L26, από Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK ή κλωνική αντίσωμα κουνελιού, κλώνος Ε17-P, από DB Biotech, Κόσιτσε, SR) χρησιμοποιήθηκε ως γενικός δείκτης των Β-κυττάρων. Για την ανίχνευση AID, κλωνοποιήσουν ZA001 ποντίκι IgG1-κάπα (Invitrogen, Paisley, UK) χρησιμοποιήθηκε. Τα αντισώματα αντι-AID είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι λειτουργικές σε ανοσοχρώση Raji, λεμφοβλαστοειδή κύτταρα που λαμβάνονται από ένα λέμφωμα Burkitt, και των κυττάρων AID-θετικών σε τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη, συμπεριλαμβανομένων των αμυγδαλών και των ρινικών πολυπόδων 24,40,41. Για την ανίχνευση IgM, ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού χρησιμοποιήθηκε (Acris, Herford, Γερμανία). Για την ανίχνευση CD68, μονοκύτταρα /μακροφάγα χρησιμοποιήθηκε δείκτης γενεαλογία, το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, κλώνος KP1 (Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK). Για τη μέθοδο ανοσοϊστοχημεία, ϋΑΚΟ EnVision +, σύστημα υπεροξειδάσης (ϋΑΚΟ, Glostrup, Δανία) εφαρμόστηκε μετά το πρώτο αντίσωμα. Οι τομές επιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη για την πυρηνική απεικόνιση. Μια φθορίζουσα χρώση με Ig δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού συζευγμένο με Alexa βάφει 488 και 568 (Invitrogen, Paisley, UK) χρησιμοποιήθηκε για χρώση CD45, καθώς και για διπλή χρώση (CD20 και CD68). Πυρηνική αντιχρωματισμός σε αυτή την περίπτωση έγινε με DAPI (Roche, Mannheim, Germany). TissueFAXS (TissueGnostics, Βιέννη, Αυστρία), ένα πλήρως αυτοματοποιημένο σύστημα ανάλυσης ιστών μικροσκόπιο με βάση χρησιμοποιήθηκε για την εξαγορά των νοσούντων ιστών δείγματος και ποσοτική ανάλυση. Η τεχνολογία TissueFAXS αφέθηκε να σαρώσει αυτόματα τα τμήματα ιστού μεγάλης κλίμακας στις λειτουργίες φθορισμού ή φωτεινό πεδίο, επέτρεψε την οπτικοποίηση των δομών των ιστών ακολουθείται από ταυτοποίηση των συγκεκριμένων κυττάρων στο συγκρότημα φυσικό περιβάλλον ιστό και ποσοτική ανάλυση των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων [24], [42], [43]. Έτσι, αυτή η προσέγγιση εφόσον οι μικροσκοπικές εικόνες των ολόκληρα τμήματα μεταστατικό ιστό. Κάθε δείγμα αποτελείτο από 100 ή περισσότερα μεμονωμένα οπτικά πεδία. Ως αντιπροσωπευτικό παράδειγμα, μια περιοχή 400 mm

2 του δείγματος ιστού συνήθως αποκτώνται για την παρακολούθηση αναλύσεις. Για απόκτηση, ο στόχος 20x /0.5 χρησιμοποιήθηκε (ΕΚ Plan_NeoFluar, Zeiss). σετ φίλτρων ήταν από Chroma TechnologyCorp (DAPI 350/460 nm? FITC /Cy2 470/525 nm? TxRed /Cy5 620/700 nm). Ποσοτική ανάλυση των διηθητικών κυττάρων του ανοσοποιητικού διεξήχθη χρησιμοποιώντας TissueQuest ή λογισμικό HistoQuest (TissueGnostics, Βιέννη, Αυστρία) για ανοσοφθορισμού και για ανοσοϊστοχημική χρώση, αντίστοιχα. Η αξιολόγηση των χρωματισμένων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος διεξήχθη χωρίς γνώση των κλινικών παραμέτρων για κάθε ασθενή. Για τον προσδιορισμό της προγνωστικής συνάφεια, έκτοπη θυλάκια ορίστηκαν με (i) χαρακτηριστικές συμπαγής, στρογγυλά λεμφοειδή συσσωμάτωμα μορφολογία με (ii) μια ελάχιστη διάμετρο 20 κύτταρα, και (iii) την παρουσία του CD20-θετικών Β κυττάρων. Έτσι, όλα τα λεμφοειδή συσσωματώματα που πληρούν αυτά τα κριτήρια ανεξάρτητα από την κατάσταση ενεργοποίησης τους συμπεριλήφθηκαν στην προγνωστικός δείκτης. Έκτοπη ωοθυλακίων δομές υπολογίστηκαν με βάση συγκριτική ανάλυση της χρώσης CD45 και CD20 για κάθε επιμέρους δείγμα από τρεις ανεξάρτητους παρατηρητές με ισχυρή τεχνική πείρα στο μικροσκόπιο. Όλες οι επιμέρους μεταβλητές χρώση που προέρχονται από όλη καθορισμένες περιοχές χρησιμοποιήθηκαν για συσχέτιση με clinicophathological παραμέτρους. Για ορισμένες μεταβλητές χρώση με βάση μερικά δείγματα εξαιρέθηκαν από ποσοτική ανάλυση με βάση την ποιότητα των ιστών και /ή χρώση υποβάθρου? για αυτές τις περιπτώσεις ο ακριβής αριθμός των δειγμάτων υποδεικνύεται στους θρύλους σχήμα.

Η στατιστική ανάλυση

Όσον αφορά τον υπολογισμό δύναμης, με την παραδοχή των δύο όψεων επίπεδο σημαντικότητας Αναλογία κινδύνου 3.0 μπορεί να ανιχνευθεί με μια δύναμη του 90%, εάν οι 35 ενέργειες που παρατηρήθηκαν στο δείγμα. Κατηγορικά δεδομένα περιγράφονται με απόλυτη και σχετικές συχνότητες. διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία chi-τετράγωνο ή δοκιμή τάση chi-τετράγωνο για τακτικό μεταβλητές. Σε περίπτωση αραιών δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν ακριβής δοκιμές. Συνεχής δεδομένα περιγράφονται με μέση ελάχιστη και μέγιστη τιμή. διαφορές Ομάδα αξιολογήθηκαν με δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon ή από t-test στην περίπτωση της κανονικής κατανομής (κανονική κατανομή επετεύχθη μετά λογαριθμικό μετασχηματισμό). Μια ανάλυση της διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις τρεις περιοχές (παραμεθόριες, πύλη τομέα, μακρινό ήπαρ) μέσα σε ασθενείς. Μια προσαρμογή Tukey έγινε για πολλαπλές συγκρίσεις κατά ζεύγη. Οι συσχετίσεις συντελεστές υπολογίστηκαν από συσχέτισης Spearman για τακτικό μεταβλητές και συσχέτισης Pearson για log2 μετατραπεί συνεχείς μεταβλητές. OS και RFS ήταν φαίνεται από γραφικές παραστάσεις Kaplan-Meier και οι διαφορές της ομάδας δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank. Για τακτικός μεταβλητές χρησιμοποιήθηκε μια δοκιμασία log-rank με αποτέλεσμα την τάση. Επιπλέον, οι αναλογίες κινδύνου και τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκαν από τα μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox. τιμές χρώση που προέρχονται από τα log2 μετατραπεί για μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox για να επιτευχθεί προσέγγιση κανονική κατανομή. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο πινάκων και μεταβλητές χρώση με βάση υπολογίστηκαν. Σε περίπτωση μη σημαντικής αλληλεπίδρασης ή αν αμφότερα τα αποτελέσματα για τις δύο πλάκες κατευθύνουν προς την ίδια κατεύθυνση, ένα στρωματοποιημένο μοντέλο παλινδρόμησης Cox χρησιμοποιήθηκε όταν πίνακας Ι και II δεδομένα αναλύονται σε συνδυασμό. μοντέλα παλινδρόμησης πολυμεταβλητή Cox χρησιμοποιήθηκαν για να ρυθμίσετε τις προγνωστικές επιπτώσεις των μεταβλητών χρώση με βάση την κλινική παράμετρος (ες) βρέθηκε να είναι σημαντική στην μονοπαραγοντική παλινδρόμησης Cox. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού SPSS 20 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA)? όλες οι τιμές p δίνεται ως δύο όψεων και p ≤ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αλγόριθμος για το χαρακτηρισμό και την ποσοτική ανάλυση των κατοίκων και διείσδυση ανοσοποιητικών κυττάρων πληθυσμών εντός δείγματα ιστού CRCLM

Για να αναλύσει και να ποσοτικοποιηθεί η παρουσία των κατοίκων και διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μέσα στον ιστό CRCLM ιδρύσαμε έναν αλγόριθμο χρησιμοποιώντας το σύστημα TissueFAXS. Για σύγκριση δείγμα του θα εφαρμοστεί ενιαία στρατηγική κάνοντας υπο-περιοχές στον όγκο – συκώτι σύνορα (περίπου 0,5 × 0,5 mm σε κάθε πλευρά των συνόρων, με μέσο μέγεθος περίπου 30 mm

2) και εντός του ηπατικού ιστού γύρω από το περιοχές της πυλαίας φλέβας (πέντε αντιπροσωπευτικές περιοχές μεγέθους έως 0,25 mm

2) και περιοχές εντός των ιστών του ήπατος μακρινό στην πύλη φλέβες που ονομάζεται ως μακρινό ήπατος στις περιγραφές παρακολούθησης (τρεις αντιπροσωπευτικές περιοχές μεγέθους έως 0,25 mm

2) ( μια αντιπροσωπευτική εικόνα φαίνεται στο Σχήμα 1, α). Σχεδιασμός μελέτης συνοψίζεται στο διάγραμμα ροής στο σχήμα 1, Β εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές πρώτα χρωματίστηκαν με αντι-CD45 αντισωμάτων για την ανίχνευση όλων των κατηγοριών που κατοικούν ή /και διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σε όλη την δείγμα ασθενούς. Στη συνέχεια, για να καθορίσετε το ανοσοποιητικό κυτταρικών πληθυσμών που υφίστανται διακρίσεις μεταξύ των Β κυττάρων γενεαλογία και την μονοκυττάρων /μακροφάγων (Εικόνα 1, Β). Ποσοτική ανάλυση με χρήση του λογισμικού TissueQuest /HistoQuest εφαρμόστηκε για να προσδιοριστεί η ποσότητα του CD45-θετικού, CD20-θετικά, και CD68-θετικά κύτταρα που βρίσκονται εντός της καθορισμένης παραπάνω τοποθεσίες ενδιαφέροντος. Ο αλγόριθμος υπολογισμού περιγράφεται στο Σχήμα S1. Για να προσδιοριστεί η κλινική σημασία της ανοσολογικής απόκρισης του ασθενούς, ειδικά στην περιοχή της μετάστασης, χρώση που προέρχονται από σύνολα δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για την εναρμόνιση με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων.

(Α) Ορισμός των περιοχών ενδιαφέροντος σε δείγματα ιστών CRCLM να ενοποιήσει η στρατηγική ποσοτικοποίηση μεταξύ των δειγμάτων. Μετά την απόκτηση ενός δείγματος μεγάλης κλίμακας χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο-based σύστημα TissueFAXS, οι περιοχές ενδιαφέροντος ορίστηκαν στον όγκο – συκώτι σύνορα (υποδεικνύεται από ένα

κόκκινη

γραμμή), στο πλαίσιο του ηπατικού ιστού γύρω από τις περιοχές πυλαίας φλέβας (υποδεικνύεται με διακεκομμένη πλατείες στο

πράσινο

) και περιοχές εντός των ιστών του ήπατος μακρινό στην πύλη φλέβες (υποδεικνύεται με διακεκομμένη πλατείες στο

μπλε

). Αξίζει να σημειωθεί ότι το παρόν καθορισμένη στρατηγική για τη χρήση 0.5 × περιοχή 0,5 mm για την ανάλυση του όγκου – συκώτι σύνορα ιδρύθηκε εμπειρικά με βάση την μικροσκοπική αξιολόγηση των τμημάτων CD45-βάφονται δείχνει τη συσσώρευση των λεμφοκυττάρων μέσα σε αυτή την περιοχή? αυτό καθορίζεται ανεξάρτητα για να ταιριάζουν, αλλά η περιοχή ποσοτικού προσδιορισμού που ορίζεται από Halama et [3] al. bar Κλίμακα: 1 mm. (Β) Σχεδιασμός της μελέτης. Ο σχεδιασμός της μελέτης συνοψίζονται από το διάγραμμα ροής συμπεριλαμβανομένης χρώσης με τις καθιερωμένες δείκτες, το ανοσοποιητικό πρότυπο οργάνωσης των κυττάρων, ποσοτικοποίηση και αξιολόγηση της κλινικής σημασίας με ευθυγράμμιση με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων.

Η

Ασθενής ειδικά έκταση και τη διανομή μοτίβο του CD45 -θετικό κύτταρα στη θέση του CRCLM

Gross εξέταση αποκάλυψε μαζική διήθηση των CD45-θετικών κυττάρων περιορίζονται στον όγκο – συκώτι περίγραμμα των μεταστάσεων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται στο Σχήμα 2, Α Διαφορετικά πρότυπα του ανοσοποιητικού συσσωρεύσεις κυττάρων παρατηρήθηκαν μεταξύ των ασθενών και θα μπορούσε να συνυπάρχουν εντός του ίδιου δείγματος στον όγκο – συκώτι σύνορα: μεμονωμένα κύτταρα, διαχέεται κυτταρικών συσσωματωμάτων, και έκτοπη θυλάκια δομές (Σχήμα 2 Β ). Η ποσότητα του CD45-positve κύτταρα σε τρεις περιοχές που παρουσιάζουν ενδιαφέρον παρουσίασαν σημαντικές μεταβλητότητας μεταξύ των ασθενών, όπως προσδιορίζεται με ποσοτική ανάλυση: στα σύνορα που κυμαίνεται από 8% έως 46% (μέσος όρος 19%), εντός του ιστού του ήπατος στη θέση του πύλης φλεβών που κυμαίνονται από 9% έως 56% (μέσος όρος 29%) και εντός του μακρινού ηπατικού ιστού που κυμαίνεται από 4% έως 16% (μέσος όρος 9%)? Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε για πάνελ Ι και πίνακας II μαζί. Σημαντικά, CD45 προερχόμενων σύνολα δεδομένων δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του πίνακα Ι και πίνακας II (Σχήμα S2)

(Α) μαζική διήθηση του CD45-θετικά κύτταρα περιορίζονται στον όγκο -. Συκώτι περίγραμμα των μεταστάσεων. Τα αντιπροσωπευτικά τμήματα των μεταστατικών περιοχών για δύο ασθενείς CRCLM εμφανίζονται (κόκκινο κανάλι για CD45, μπλε κανάλι για πυρήνες /DAPI). Τ: όγκου? L: το συκώτι. μπαρ κλίμακας: 200 μm. (Β) Οι διαφορετικές συνήθειες των κυττάρων συσσωρεύσεις CD45-θετικά στο μεταστατικό σύνορα. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των διαφόρων τύπων του ανοσοποιητικού κυτταρικές διηθήσεις εμφανίζονται: (

α

) μεμονωμένα κύτταρα? (

β

) μεγάλες ανοσοποιητικό συσσωματώματα κυττάρων? (

γ

) εξέχουσα έκτοπη θύλακα. Εκτός από τα νέα εικόνες (

α-γ

, κόκκινο κανάλι για CD45 και μπλε κανάλι DAPI), οι φωτογραφίες των επιμέρους κανάλια περιλαμβάνονται (

d-f

για DAPI?

g-i

για CD45)? τα επιμέρους κανάλια εμφανίζονται σε μαύρο /άσπρο, ενώ τα νέα εικόνες εμφανίζεται με χρώμα. Τ: όγκου? L: το συκώτι. bar Κλίμακα: 50 μm. (C) (

μια

–

γ

) Kaplan-Meier εκτιμήσεις για τους ασθενείς διαστρωμάτωση με βάση τις τιμές CD45 που προέρχονται στα σύνορα. Οι Kaplan-Meier για την RFS βασίζεται σε αξίες CD45 για τον πίνακα I, του πίνακα II, και ο συνδυασμός τους φαίνεται δίνοντας τη διαστρωμάτωση των ασθενών σε ομάδες χαμηλού και υψηλού κινδύνου (υψηλότερα από την διάμεση δείχνει χαμηλού κινδύνου)? p αξία του τεστ log-rank ενδείκνυται. Πίνακας Ι: διάμεσος είναι ίσο με 20,95, κάτω διάμεση n = 6, πάνω από διάμεση n = 7? Πίνακας II: διάμεσος είναι ίση με 17,66, κάτω διάμεσος = 10, πάνω από διάμεση n = 9? πίνακα I + II: διάμεση τιμή είναι ίση με 19.13, κάτω από μέση n = 16, πάνω μεσαίο n = 16 (

δ

) Boxplots των συνόλων δεδομένων CD45 σε ασθενείς χωρίς υποτροπή (Όχι) έναντι των ασθενών με υποτροπή (Ναι ) κατά το χρόνο σημείο 17 μήνες. Η αποκοπής ορίστηκε σύμφωνα με την τελευταία εμφάνιση συμβάν (16,3 μήνες), όπου έχει συμβεί καμία λογοκρισία, με αυτόν τον τρόπο, παρέχοντας σαφή διαχωρισμό από τα λογοκριμένα θέματα (≥32.2 μήνες), όπως απεικονίζονται στο (

β

). Η διάμεση τιμή CD45, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη διαστρωμάτωση των ασθενών σε ομάδες χαμηλού και υψηλού κινδύνου στο οικόπεδο Kaplan-Meier (

β

) υποδεικνύεται με διακεκομμένη γραμμή? p τιμή εμφανίζεται (t-test)

Η

CD45-θετικό κάτοικος ή /και λεμφοκύτταρα που διεισδύουν μέσα στους ιστούς CRCLM:. προγνωστικούς

επίδραση

Για να προσδιοριστεί η κλινική σημασία του ανοσολογικού ειδικό ασθενούς αποτύπωμα, τα σύνολα δεδομένων CD45 που προέρχονται συσχετίστηκαν με υποτροπή επιβίωση χωρίς (RFS) και τη συνολική επιβίωση (OS). Όπως εκτιμάται από την ανάλυση παλινδρόμησης Cox (Πίνακας S1), η παρουσία του CD45-θετικών κυττάρων στον όγκο – συκώτι σύνορα βρέθηκε να δείχνουν μια ισχυρή θετική προγνωστική επίδραση στην RFS στις δύο πλάκες ασθενή (πίνακας Ι: HR = 0,004, 95% CI : & lt? 0,001 – 0,627, p = 0,033? πίνακα II: HR = 0,156, 95% CI: 0,045 – 0,546, p = 0,004) και για τον πίνακα Ι και ΙΙ του πίνακα μαζί (HR = 0,093, 95% CI: 0,028 – 0,305 , p & lt? 0.001)? ο συνδυασμός των συνόλων δεδομένων ήταν δυνατή με βάση πρόσθετες δοκιμές για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο πάνελ και μεταβλητές χρώση με βάση (Πίνακας S2). Επιπλέον, μια υψηλότερη περιεκτικότητα σε CD45 στα σύνορα μεταστατικό βρέθηκε να συσχετίζεται με την καλύτερη OS, αν και με ασθενέστερη προγνωστικούς επίδραση (Πίνακας S1). Όσον αφορά την RFS, οι ασθενείς ήταν υποδιαιρούνται σε ομάδες με ένα υψηλότερο ποσοστό των CD45-θετικών κυττάρων (πάνω από τη μέση) και με ένα χαμηλότερο ποσοστό CD45-positve κύτταρα (μικρότερη ή ίση με τη διάμεση τιμή). Εικόνα 2, C δείχνει τις αντίστοιχες γραφικές παραστάσεις Kaplan-Meier. Ξεχωριστές αναλύσεις του πίνακα Ι και πίνακα II, καθώς και ο συνδυασμός τους έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων υψηλού και χαμηλού κινδύνου (δοκιμασία log-rank: p & lt? 0,001, p = 0,009 και p & lt? 0.001, αντίστοιχα). Όπως καταχωρήσεις είναι παρόντες στην ομάδα χαμηλού κινδύνου πίνακα Ι (n = 7), η αντίστοιχη HR της ανάλυσης παλινδρόμησης Cox τείνει στο άπειρο. Επιπλέον, για τα δεδομένα του πίνακα II, κατανομή των τιμών CD45 που βασίζονται μπορεί να αποδειχθεί σε ασθενείς με και χωρίς υποτροπή της νόσου κατά 17 μήνες όταν έχει συμβεί ακόμη καμία λογοκρισία (Εικόνα 2, C,

δ

). Ασθενείς χωρίς υποτροπή της νόσου έδειξε σημαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα σε CD45 σε σύγκριση με εκείνους με υποτροπή (p = 0,019). Σε αντίθεση με τα σύνορα, ευθυγράμμιση των συνόλων του ήπατος που προέρχονται από τα δεδομένα (περιοχές πυλαία φλέβα και μακρινό ήπατος) δεν αποκάλυψε στατιστικά προγνωστική επίδραση στην RFS ή OS (Πίνακας S1).

Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν μια ισχυρή αντίκτυπο της τοπικής ανοσολογικής απόκρισης του ασθενούς-ειδικά λαμβάνει χώρα στο χώρο της μετάστασης από την κλινική έκβαση των ασθενών CRCLM. Μας δίνει το κίνητρο για να οριοθετηθούν τον αντίκτυπο των μεμονωμένων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος υποσύνολα που αποτελούν τον πληθυσμό των κυττάρων CD45-θετικά χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο ομάδα ασθενών. Κατά συνέπεια, στην παρακολούθηση των πειραμάτων προσδιορίζοντας την Β-κυττάρων και μακροφάγων καταγωγές μια διευρυμένη ομάδα των ασθενών εντός του πίνακα II διερευνήθηκε (n = 51).

Ασθενής ειδικά έκταση και την οργάνωση μοτίβο των CD20-θετικά Β-λεμφοκύτταρα στη θέση της CRCLM

στη συνέχεια, για τον χαρακτηρισμό της Β-κυττάρου γράμμωσης στη θέση CRCLM, τα δείγματα ιστών αναλύθηκαν για CD20-θετικά κύτταρα. Εντυπωσιακά, το κύριο κλάσμα των κυττάρων εντός των μεγάλων CD45-θετικών κυτταρικών συσσωματωμάτων και ιδίως εντός των θυλακίων έκτοπη βρέθηκε να είναι CD20-θετικά Β κύτταρα? Είναι ενδιαφέρον, μόνο ίχνη του CD20-θετικών Β κυττάρων ανιχνεύθηκαν εντός των μη οργανωμένη πληθυσμοί CD45-θετικών λεμφοκυττάρων (Εικόνα 3, Α). Διαφορετικά πρότυπα οργάνωσης των CD20-θετικών κυττάρων παρατηρήθηκαν εντός των τριών περιοχών ενδιαφέροντος. Αντιπροσωπευτικές εικόνες που παρέχονται στην Εικόνα 3, Β στα σύνορα, μονά κύτταρα (Σχήμα 3, Β,

α

) ή /και κυτταρικών συσσωματωμάτων (Σχήμα 3, Β,

b

), και /ή έκτοπη ωοθυλακίων (σχήμα 3, Β,

γ

) ανιχνεύθηκαν. Αξίζει να σημειωθεί, CD20-θετικά Β κύτταρα βρέθηκαν να συσσωρεύονται γύρω από τα νησιά του όγκου (Σχήμα 3, Β,

b

, ένθετο). Μεγάλες αδρανών Β-κυττάρων, καθώς ανιχνεύεται γύρω από τα πύλης φλέβες κοντά στην παραμεθόρια περιοχή, ενώ στο πιο μακρινό πύλη φλέβες παρατηρήθηκαν μεμονωμένα κύτταρα CD20 θετικά (Σχήμα 3, Β,

d

,

e

, αντίστοιχα). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στο πλαίσιο μακρινό ηπατικό ιστό, σε όλη δείγμα μόνο αραιά κατανεμημένα, ενιαίο βρέθηκαν διοργανώσεις (Σχήμα 3, Β,

στ

). Σε συμφωνία, ποσοτικών εκτιμήσεων των τριών περιοχών αποκάλυψε την παρουσία των Β-κυττάρων στον όγκο – σύνορο του ήπατος που κυμαίνονται από 0,3% έως 13% με διάμεση τιμή του 2% και εντός του ήπατος ιστού γύρω από τα πύλη φλέβες που κυμαίνονται από 0,1% έως 36% με διάμεση τιμή 4%? μονό CD20-θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν εντός μακρινό ηπατικού ιστού (διάμεση τιμή των 0,1%)? ανάλυση διεξήχθη για τον πίνακα Ι και II σε συνδυασμό. Επιπλέον, σύγκριση των δύο ομάδων χημειοθεραπεία εντός πίνακας II δεν παρατηρήσαμε σημαντική διαφορά στην κατανομή των τιμών χρώσης που προέρχεται και δεν έχουν καμία ένδειξη για τις διαφορές μεταξύ της ομάδας χημειοθεραπείες (Πίνακας S3). Είναι σημαντικό, η σύγκριση των μεταβλητών CD20 για τον πίνακα Ι και ΙΙ του πίνακα δεν αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές για τις τρεις περιοχές ενδιαφέροντος (Σχήμα S3).

(Α) υποπληθυσμό του CD20-θετικά Β κύτταρα σε μεταστατικά σύνορα. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα του CD45-θετικό (

α

) έκτοπη θύλακα, (

γ

) μεγάλων κυττάρων αδρανών και (

e

) μη οργανωμένη κυτταρικό πληθυσμό και οι αντίστοιχες περιοχές χρώση για CD20 εμφανίζονται (

β

,

d

,

στ

, αντίστοιχα). Ποσοτική ανάλυση έγινε με τη χρήση TissueQuest και HistoQuest λογισμικού? ποσοστό των θετικών κυττάρων υποδεικνύεται. bar κλίμακας: 100 μm. (Β) διαφορετική οργάνωση μοτίβα του CD20-θετικών κυττάρων εντός των τριών περιοχών ενδιαφέροντος. Εκπρόσωπος εικόνες (i) στα σύνορα: (

α

) απλά κύτταρα, (

β

) κυττάρων αδρανών υλικών? εισάγετε: υψηλότερη άποψη δύναμης των CD20-θετικών κυττάρων σε επαφή με τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, (

γ

) έκτοπη ωοθυλακίων δομές? (Ii) γύρω από τα πυλαία φλέβα (

δ

) κοντά στα σύνορα και (

e

) μακρινά στα σύνορα, καθώς και (iii) εντός του ιστού του ήπατος (

f

) δείχνονται. Τ: όγκου? L: το συκώτι. bar Κλίμακα: 50 μm.