Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών μη κωδικεύοντα μόρια RNA τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους και τους μηχανισμούς του miR-140 σε ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Βρήκαμε ότι miR-140 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές. Τόσο κέρδος-of-λειτουργίας και μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι miR-140 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC, μετανάστευση, και εισβολή in vitro. Σημαντικά, η υπερέκφραση του miR-140 καταστέλλεται αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε γυμνούς μοντέλα ποντικιών. Ολοκληρωμένη ανάλυση εντόπισε IGF1R ως άμεσο και λειτουργικό στόχο του miR-140. Νοκ ντάουν της IGF1R αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή που μοιάζει με εκείνη του miR-140 υπερέκφραση, ενώ η υπερέκφραση του IGF1R εξασθενεί τη λειτουργία των miR-140 σε κύτταρα NSCLC. Μαζί, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία του miR-140 και IGF1R στην ανάπτυξη και εξέλιξη της NSCLC

Παράθεση:. Yuan Υ, Shen Υ, Xue L, Ανεμιστήρας Η (2013) miR-140 καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων και μετάσταση της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα από Στόχευση ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 υποδοχέα. PLoS ONE 8 (9): e73604. doi: 10.1371 /journal.pone.0073604

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 26, 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η υπ ‘αριθμόν ένα αιτία καρκινογόνες. σχετίζονται θανάτου παγκοσμίως, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει τουλάχιστον το 80% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα [1,2]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου αυτού, το συνολικό ποσοστό θνησιμότητας των NSCLC παραμένει υψηλό, και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών σχετίζεται με NSCLC είναι μια μελαγχολική 11% [3]. Δεδομένου αυτού, μια καλή κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη NSCLC χρειάζεται επειγόντως.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών μη κωδικεύοντα μόρια RNA που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση των γονιδίων στόχων είτε με την υποβάθμιση του mRNA ή μεταγραφική αναστολή [4]. miRNAs μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση μιας ευρείας ποικιλίας των γονιδίων στόχων? Ως εκ τούτου, εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, διαφοροποίησης και μετανάστευσης [5-7]. Πρόσφατα, αυξανόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι μη φυσιολογική έκφραση του miRNAs συσχετίζεται με μια ποικιλία καρκίνων, και ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου [8,9]. Στον καρκίνο του πνεύμονα, πολλαπλές miRNAs, όπως ας-7 οικογένεια, miR-200, miR-486 και miR-146a έχουν ταυτοποιηθεί ως καταστολείς των όγκων [10-14]? Από την άλλη πλευρά, miR-31, miR-212 και miR-196a βρέθηκαν να προωθήσει NSCLC καρκινογένεση [15-17].

miR-140 έχει προσελκύσει πολλή προσοχή, διότι ασχολείται με την ανάπτυξη και την πρόοδο διαφόρων τύπων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, οστεοσάρκωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [18-20]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι λειτουργίες miR-140 ως ογκοκατασταλτικού ρόλο σε αυτούς τους καρκίνους? Ωστόσο, με τις γνώσεις μας, τους ρόλους του και τις πιθανές μηχανισμοί NSCLC παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε τα πρώτα στοιχεία για το ρόλο του miR-140 στο NSCLC ογκογένεση και την εξέλιξη, και εν μέρει αποσαφηνίζει τον μοριακό μηχανισμό που διέπουν αυτό το αποτέλεσμα. Βρήκαμε ότι miR-140 ρυθμίζεται μειωτικά σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του miR-140 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και μετάσταση των κυττάρων NSCLC. Επιπλέον, προσδιορίσαμε IGF1R ως γονίδιο στόχος του miR-140 και επιβεβαίωσε ότι miR-140 ασκεί την επίδρασή του επί της αναστολής της ανάπτυξης του όγκου και τη μετάσταση με προς τα κάτω ρύθμιση IGF1R. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν ένα μυθιστόρημα ρόλο του miR-140 ως καταστολέας των όγκων σε NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ασθενών και κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο NSCLCs και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς τους (τουλάχιστον 5 cm μακριά από πρωτοπαθή όγκο) ελήφθησαν από 30 ασθενείς σε Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan (Σαγκάη, Κίνα). Οι ιστοί καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Ιατρική Ηθική και Ανθρωπίνων Κλινική Επιτροπής Trial σε Zhongshan Νοσοκομείο. Πέντε NSCLC κυτταρικές γραμμές (Α549, SK-MES-1, Η157, Η520 και Η460) και μία φυσιολογική πνευμονική βρόγχων επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής BEAS-2Β αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Thermo Scientific HyClone, Πεκίνο, Κίνα) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 mg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 υγρή ατμόσφαιρα στους 37 ° C.

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

RNA εκχυλίστηκε από ιστούς και κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση των ώριμων miRNAs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Μια δύο σταδίων qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε με ειδικούς εκκινητές για miR-140 σχεδιάστηκε από την Applied Biosystems. U6 snRNA ενισχύθηκε ως εσωτερικό έλεγχο. αναλύσεις qRT-PCR για

IGF1R

και

β-ακτίνης

διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Takara Bio, Dalian, Κίνα). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: IGF1R πρόσθιος εκκινητής, 5′-GAGAAGGAGGAGGCTGAATACCG-3 ‘? IGF1R αντίστροφο εκκινητή 5’-GTGATGTTGTAGGTGTCTGCGGC-3 ‘? β-ακτίνης πρόσθιο εκκινητή, 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘? και β-ακτίνης αντίστροφο εκκινητή 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του πραγματικού χρόνου PCR μηχανή ΑΒΙ 7900. Η σχετική έκφραση του κάθε γονιδίου υπολογίστηκε και ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδος σε σχέση με U6 snRNA ή β-ακτίνης.

μόλυνση Lentivirus και ολιγονουκλεοτίδιο διαμόλυνση

Ο πρόδρομος miR-140 και IGF1R siRNA αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (Rockville, Maryland, USA). Η ακολουθία προ-miR-140 και η αλληλουχία IGF1R siRNA κλωνοποιήθηκαν σε pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP κατασκευάσματα (Σύστημα Biosciences, California, USA). Η παραγωγή και ο καθαρισμός του λεντοϊού διεξήχθησαν περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Τα κύτταρα στόχοι (1 χ 10

6) μολύνθηκαν με μονάδες μεταγωγής 1 × 10

7 φακοϊό παρουσία 10 μg /mL πολυβρένιο (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Αδειάστε λεντοϊού φορέας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ο αναστολέας miR-140 και του αρνητικού ελέγχου ελήφθησαν από Genepharma (Σανγκάη, Κίνα). διαμόλυνση ολιγονουκλεοτιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

κατασκευή πλασμιδίου και ανιχνεύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης

Η κωδικοποιητική αλληλουχία του IGF1R αγοράστηκε από ΟηΟεηε και κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 (+) για να δημιουργήσει φορείς έκφρασης IGF1R. Η IGF1R άγριου τύπου 3 ‘UTR (WT) ενισχύθηκε με τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-ATACTCGAGTTTCCATGCAACCTCCTTCTGC-3′ (προς τα εμπρός) και 5’-AGCAAGCTTTCCATCTTCCAAGGAGGAGGCT-3 ‘(αντίστροφο). θέσεις ενδονουκλεάσης περιορισμού (

Xho

I /

Hin

Hindlll) ενσωματώθηκαν σε εκκινητές για να διευκολυνθεί η απολίνωση εντός του pGL3 βασικό φορέα (Promega, Madison, WI, USA). Η τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση της αλληλουχίας σπόρων miR-140 στην IGF1R 3′-UTR (Mut) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του QuikChange ™ τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης, το πλασμίδιο ρεπόρτερ συνεπιμολύνθηκε με ένα φορέα λουσιφεράσης Renilla ελέγχου σε Α549 και Η157 κύτταρα παρουσία του είτε miR-140 ή miR-ελέγχου. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, Madison, WI, USA).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, και την κυτταρική απόπτωση αναλύσεις

τα κύτταρα (2 χ 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας και καλλιεργήθηκαν. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα κιτ CCK-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, μολυσμένο ή επιμολυσμένο κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε σε ένα FACScan fl ow κυτταρόμετρο (BD Biosciences, Bedford, MD, USA). δοκιμασίες κυτταρικής απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός αννεξίνης V-FITC /ΡΙ Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). 1 × 10

4 κύτταρα βάφτηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences) εφοδιασμένο με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences).

επούλωση των πληγών και την εισβολή δοκιμασίες

η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασίες επούλωσης τραύματος. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε 100% συρροή. Τα τραύματα παρήχθησαν στην κυτταρική μονοστιβάδα χρησιμοποιώντας μια πλαστική ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Η εξάπλωση του κλεισίματος τραύματος παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο. Για προσδιορισμούς εισβολής, 1 × 10

5 κυττάρων σε μέσα άνευ ορού προστέθηκαν στο ανώτερο θάλαμο ενός ενθέτου προεπικαλυμμένα με Matrigel (BD Bioscience). Η κάτω θάλαμος γέμισε με DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης απομακρύνθηκε, ενώ τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσω της μεμβράνης βάφτηκαν με 20% μεθανόλη και 0,2% crystal violet, απεικόνιση, και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

κηλίδωση Western

ανάλυση κηλίδωσης Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό RIPA συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και ποσοτικοποιηθεί με τη μέθοδο BCA (Beyotime, Jiangsu, Κίνα). Προϊόντα λύσης (25 μg) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Whatman, Maidstone, UK). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 5% άπαχο ξηρό γάλα διάλυμα και, στη συνέχεια, ανοσοστυπώθηκαν νύχτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια IGF1R και β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Μετά την πλύση, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με HRP. Σήματα έγιναν ορατά με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια Plus Kit (GE Healthcare).

Τα πειράματα σε ζώα

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας για τα πειράματα σε ζώα του Πανεπιστημίου Fudan επιτροπής Animal Care, Σαγκάη, Κίνα. Για τις δοκιμασίες ανάπτυξης όγκου, κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με είτε το miR-140 που υπερεκφράζουν lentivirus ή το φακοϊό ελέγχου ενέθηκαν υποδορίως στα δεξιά ωμοπλάτες γυμνών ποντικών (5-εβδομάδων BALB /c-nu /nu, 5 ανά ομάδα, 1,5 × 10

6 κύτταρα για κάθε ποντίκι). Οι ποντικοί παρατηρήθηκαν επί 5 εβδομάδες σχηματισμό όγκου. Ο όγκος του όγκου (V) παρακολουθούνταν σε εβδομαδιαία βάση και υπολογίζεται με τον τύπο: V = 0,5 × μήκος × πλάτος

2. Για in vivo δοκιμασίες μετάσταση, 1.5 × 10

6 Α549-miR-140 ή Α549-miR-έλεγχος κύτταρα εγχύθηκαν μέσα στην ουραία φλέβα γυμνών ποντικών (5 ανά ομάδα). Μετά από 6 εβδομάδες, τα ποντίκια θανατώθηκαν, και πνεύμονα μεταστατικό αποικισμός παρακολουθήθηκε και ποσοτικοποιούνται.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Student

t-test

κατά τη σύγκριση μόνο δύο ομάδες ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης κατά τη σύγκριση περισσότερες από δύο ομάδες. Η συσχέτιση μεταξύ του miR-140 και η έκφραση IGF1R αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης Spearman του.

P

60120.3751±0.0291SexMale210.3972±0.04810.5377Female90.4226±0.0352Smoking statusNo80.4219±0.03930.1834Yes220.3723±0.0436HistologyAC160.3854±0.05020.3670SCC140.3578±0.0440StageI70.5539±0.03570.0059II130.3737±0.0406III100.3005±0.0251MetastasisNo130.4932±0.04560.0008Yes170.3104±0.0413Table 1. Η σχέση μεταξύ miR-140 έκφρασης και κλινικοπαθολογική παραμέτρων σε NSCLC.

CSV Λήψη CSV

miR-140 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC in vitro

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο του miR-140 στην ανάπτυξη των NSCLC, κατασκευάσαμε πρώτα ένα φορέα λεντοϊού που εκφράζει καθιερώσει σταθερές κυτταρικές σειρές miR-140, και συμβολίζεται ως Α549-miR-140 και Η157-miR-140 μετά από λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό. Η επιτυχής υπερέκφραση του ώριμου miR-140 σε αυτά τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (Σχήμα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η υπερέκφραση του miR-140 κατέστειλε σημαντικά την κυτταρικό πολλαπλασιασμό των Α549 και Η157 κυττάρων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα τους ελέγχους τους. miR-140 υπερέκφραση βρέθηκε επίσης ότι επάγει κυτταρική απόπτωση σε Α549 και Η157 κύτταρα (Σχήμα 2C). Σε σύμφωνο με τα αποτελέσματα αυτά, miR-140 υπερέκφραση προκάλεσε συσσώρευση των κυττάρων στο G1 φάση, και μείωσε τον αριθμό των κυττάρων σε φάση S σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2D). Σε αντίθεση, knockdown του miR-140 χρησιμοποιώντας αντι-miR-140 σε κύτταρα H520 προωθούνται κυτταρική ανάπτυξη, ενώ καμία σημαντική αλλαγή στην κυτταρική απόπτωση κυτταρικού κύκλου και ανιχνεύθηκε (Σχήμα S1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-140 είναι σε θέση να ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη NSCLC.

(Α) και Α549 Η157 κύτταρα μολύνθηκαν με miR-140 ή miR-ελέγχου φακοϊό, και η έκφραση του miR-140 αναλύθηκε με qRT-PCR. (Β) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CCK-8). (Γ) προσδιορισμούς κυτταρικής απόπτωσης. ανάλυση (D) του κυτταρικού κύκλου. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

miR-140 καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση NSCLC και την εισβολή in vitro

Ερευνήσαμε περαιτέρω εάν miR-140 θα μπορούσε επίσης να αναστέλλουν την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή στον NSCLC. Χρησιμοποιώντας την πληγή δοκιμασία επούλωσης, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-140 κατέστειλε σημαντικά την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων σε Α549 και Η157 κύτταρα σε σύγκριση με το αντίστοιχο τους ελέγχους τους (Σχήμα 3Α). Ομοίως, transwell δοκιμασίες με Matrigel έδειξε ότι miR-140 μείωσε σημαντικά την επεμβατική ικανότητα των Α549 και Η157 κύτταρα (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, η επούλωση των πληγών και την εισβολή των κυττάρων H520 αυξήθηκε όταν ενδογενή miR-140 σίγησε με αντι-miR-140 (Σχήμα S1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-140 μπορεί να καταστείλει την κυτταρική μετανάστευση NSCLC και εισβολή in vitro.

Ο επούλωσης πληγών δοκιμασίες (Α) και δοκιμασίες εισβολή (Β) του Α549 και κύτταρα που έχουν μολυνθεί με Η157 miR-140 ή φακοϊό miR-ελέγχου. Οι δοκιμασίες εισβολή προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς Transwell με Matrigel. Μεγέθυνση: 100 ×. **

P

& lt?. 0.01

Η

miR-140 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων σε κύτταρα NSCLC σε άτριχα ποντίκια

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η επίδραση της ΜΙΚ 140 επί της ανάπτυξης όγκου NSCLC και μετάσταση in vivo, Α549-miR-140 κύτταρα και τα κύτταρα Α549-miR-ελέγχου εμβολιάστηκαν υποδορίως στο πλευρό γυμνών ποντικών και τα ζώα παρακολουθούνται στενά για την ανάπτυξη του όγκου για 5 εβδομάδες. Τα αποτελέσματα που απεικονίζονται ότι miR-140 που υπερεκφράζουν όγκους ήταν σημαντικά μικρότερη σε μέγεθος και όγκο του όγκου σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου (Σχήμα 4Α και Β). Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της miR-140 υπερέκφραση σε NSCLC μετάσταση in vivo. Α549-miR-140 κύτταρα και τα κύτταρα Α549-miR-ελέγχου ενέθηκαν σε γυμνά ποντίκια με ουραία φλέβα ενέσεις. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 6 εβδομάδες μετά την ένεση, και οι πνεύμονες τους αποκόπηκαν να παρατηρήσει μεταστατικό Nidi στην επιφάνεια τους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, ο αριθμός των οζιδίων μετάστασης πνεύμονα ήταν δραματικά μειωμένη στην ομάδα Α549-miR-140 σε σύγκριση με την ομάδα Α549-miR-ελέγχου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-140 υπερέκφραση μπορεί να καταστείλει την ογκογένεση και τη μετάσταση των κυττάρων NSCLC in vivo.

(Α) Φωτογραφία όγκων που σχηματίζονται. καμπύλη (Β) την ανάπτυξη που έχει αναληφθεί από τη μέτρηση όγκων του όγκου κατά τις υποδεικνυόμενες ημέρες. (Γ) εκπρόσωπος Η &? Ε-χρώση τμήματα των πνευμονικών ιστών που απομονώθηκαν από ποντικούς (100 Χ). Ο συνολικός αριθμός των μεταστατικών αλλοιώσεων στους πνεύμονες μετρήθηκαν. **

P

& lt?. 0.01

Η

miR-140 ρυθμίζει προς τα κάτω IGF1R με απευθείας στόχευση της 3 ‘UTR

Για την διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους miR-140 εκτελεί τη λειτουργία του, ψάξαμε για τους πιθανούς στόχους του miR-140, χρησιμοποιώντας διαφορετικές υπολογιστικές μεθόδους, όπως TargetScan και Μιράντα. Συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε σε ογκογονίδια. IGF1R ταυτοποιήθηκε ως ένας υποψήφιος στόχος του miR-140, επειδή η συμπληρωματική αλληλουχία του miR-140 ταυτοποιήθηκε σε 3 ‘UTR του με ανάλυση TargetScan (Σχήμα 5Α). Βρήκαμε ότι το μέσο επίπεδο έκφρασης της IGF1R ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς NSCLC από ό, τι ταιριάζει φυσιολογικούς ιστούς (Εικόνα S2). Επιπλέον, μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε από την ανάλυση συσχέτισης Spearman μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-140 και IGF1R mRNA (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, qRT-PCR και ανάλυση Western blotting απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-140 μείωσε σημαντικά την έκφραση του IGF1R σε Α549 και Η157 κυττάρων, και ότι knockdown του miR-140 αυξημένη έκφραση IGF1R σε H520 κύτταρα (Σχήμα 5C και D). Για την επικύρωση εάν IGF1R είναι η άμεση προς τα κάτω στόχος του miR-140, ένα θραύσμα του UTR IGF1R 3 ‘που περιέχει την υποθετική θέση σύνδεσης miR-140 κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. Δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του miR-140 μείωσε σημαντικά την σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των IGF1R-3’UTR σε Α549 και Η157 κύτταρα, αλλά δεν είχε επίδραση επί του μεταλλαγμένου του IGF1R-3’UTR (Σχήμα 5Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-140 ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση IGF1R με απευθείας στοχοθέτηση 3 ‘UTR.

(Α) υποθετικές αλληλουχίες πρόσδεσης του miR-140 στο IGF1R 3′ UTR. Μετάλλαξη παρήχθη στο IGF1R 3 ‘UTR μεταλλάσσοντας 3 nt που αναγνωρίζεται από miR-140. Είτε άγριου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένου (Mut) IGF1R 3 ‘UTR υποκλωνοποιήθηκε εντός του φορέα διπλής λουσιφεράσης. (Β) μια στατιστικά αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του miR-140 και IGF1R mRNA σε ιστούς NSCLC από την ανάλυση συσχέτισης Spearman του. (C, D) η έκφραση της IGF1R σε Α549, Η157 και Η520 κυττάρων μετά από μόλυνση ή διαμόλυνση μετρήθηκε με qRT-PCR και κηλίδωση Western. δοκιμασία Λουσιφεράσης (Ε) σε Α549 και Η157 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-140 και ένα ρεπόρτερ λουσιφεράσης που περιέχει την IGF1R 3’-UTR (WT) ή μία μεταλλαγμένη (Mut). Λουσιφεράσης μετρήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. **

P

& lt?. 0.01

Η

IGF1R εμπλέκεται σε miR-140 που προκαλείται από την καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης NSCLC και εισβολή

Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον ΜΙΚ 140 ασκεί όγκου κατασταλτική λειτουργία του μέσα προς τα κάτω ρύθμιση IGF1R, πραγματοποιήσαμε κέρδος-of-λειτουργίας και απώλεια-του-λειτουργία αναλύσεις. Πρώτον, τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με λεντοϊού κατασκευάσματα που περιέχουν IGF1R siRNA ή τον αρνητικό μάρτυρα. Ανάλυση Western blotting επιβεβαίωσε ότι η έκφραση του IGF1R κατεστάλη (Σχήμα 6Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, IGF1R knockdown ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων, που προκαλείται από τη σύλληψη G1, και αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 6Β, Γ και Δ). Περαιτέρω, δοκιμασίες Transwell έδειξαν ότι IGF1R μειορρύθμιση κατέστειλε την κυτταρική διείσδυση των κυττάρων Α549 (Σχήμα 6Ε). Τα αποτελέσματα αυτά ήταν παρόμοια με τα αποτελέσματα του miR-140 υπερέκφραση. Στη συνέχεια, Α549-miR-140 κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια IGF1R λείπει 3 ‘UTR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, Γ και Δ, η υπερέκφραση του IGF1R διασωθέντων σημαντικά miR-140 που επάγεται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση. Η ανασταλτική δράση του miR-140 στην κυτταρική εισβολή επίσης ανταγωνισμό από IGF1R υπερέκφραση (Σχήμα 6Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι IGF1R είναι ένα λειτουργικό στόχος του miR-140.

κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ειδικές IGF1R si, ή επιμολυσμένα με πλασμίδιο IGF1R λείπει 3 ‘UTR μαζί με miR-140. (Α) ανάλυση Western blotting. (Β) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CCK-8). ανάλυση (C) του κυτταρικού κύκλου. (D) δοκιμασίες κυτταρικής απόπτωσης. δοκιμασίες εισβολής (Ε) Transwell. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

έχουν miRNAs αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου [23,24]. Μεταβολές της έκφρασης miRNAs ενοχοποιηθεί σε σχεδόν όλες τις πτυχές της βιολογίας του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, απόπτωση, μετανάστευση και /ή εισβολή, και μπορούν να λειτουργήσουν είτε ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [25]. Στην παρούσα μελέτη, επικεντρώθηκε σε miR-140, το οποίο έχει υποδειχθεί ότι είναι μια πιθανή καταστολέα όγκου σε ανθρώπινο malignances. Song et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ανέστειλε miR-140 και στις δύο οστεοσάρκωμα και καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές [19]. Πιο πρόσφατα, Yang και συνεργάτες ανέφεραν ότι miR-140-5p είναι σημαντικά μειωμένη σε ιστούς HCC και κυτταρικές γραμμές, και η υπερέκφραση του καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση με στόχευση αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β υποδοχέα 1 και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 9 [20]. Μέχρι σήμερα, όμως, ο ρόλος του miR-140 στο NSCLC καρκινογένεση και οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους miR-140, ασκεί τις λειτουργίες του παραμένουν ασαφείς.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το miR-140 έκφρασης μειώθηκε σημαντικά σε NSCLC ιστούς και κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του miR-140 θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC, επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την ενίσχυση της απόπτωσης, και την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Επιπλέον, miR-140 υπερέκφραση καταστέλλεται σημαντικά κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή in vitro και μετάσταση όγκου in vivo. Κατά συνέπεια, νοκ ντάουν του miR-140 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-140 θα μπορούσε να είναι ένα μυθιστόρημα ογκοκατασταλτικών miRNA στον NSCLC.

Για την διαλεύκανση των υποκείμενων μηχανισμών που εμπλέκονται στην miR-140 που προκαλείται από την αναστολή στην αύξηση του NSCLC και μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε διαφορετικούς αλγόριθμους πρόβλεψης για προβλέψει στόχους γονίδιο για miR-140. Το ογκογονίδιο που μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα αυξητικού παράγοντα-1 (IGF1R), που συχνά υπερεκφράζεται σε πολλές κακοήθειες και λειτουργεί ως σημαντικός ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, και μετάσταση [26-29], έχει χαρακτηριστεί ως κρίσιμο κατάντη στόχου της miR -140, και το συμπέρασμα αυτό υποστηρίζεται από τα ακόλουθα στοιχεία: (Α) συμπληρωματική αλληλουχία του miR-140 εντοπίστηκαν στο 3 ‘UTR της IGF1R mRNA? (Β) υπερέκφραση του miR-140 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα IGF1R στα κύτταρα NSCLC, ενώ νοκ ντάουν της έκφρασης miR-140 enhancedIGF1R? (C) miR-140 υπερέκφραση μείωσε την δραστικότητα ενός ανταποκριτού λουσιφεράσης που περιέχει την άγριου τύπου 3 ‘UTR του mRNA IGF1R? (D) τα ανασταλτικά αποτελέσματα του miR-140 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC, απόπτωση, και εισβολή αντιστράφηκαν από υπερέκφραση IGF1R? (F) IGF1R ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς NSCLC και αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα έκφρασης του miR-140. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι το miR-140 αναστέλλει την ανάπτυξη NSCLC και μετάσταση μέσω ρύθμισης προς τα κάτω IGF1R.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το miR-140 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του miR-140 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση των NSCLC μέσω της άμεσης στόχευσης IGF1R. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η συχνά μειωτικά miR-140 οδηγεί στην αυξημένη έκφραση των IGF1R και με τη σειρά της συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Konckdown του miR-140 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων H520. (Α) κύτταρα H520 επιμολύνθηκαν με αντι-miR-140 ή αντι-έλεγχο, και η έκφραση του miR-140 αναλύθηκε με qRT-PCR. (Β) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CCK-8). (Γ) προσδιορισμούς κυτταρικής απόπτωσης. ανάλυση (D) του κυτταρικού κύκλου. (Ε) Πληγή δοκιμασίες επούλωσης. δοκιμασίες εισβολής (F) Transwell. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073604.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2 .

IGF1R υπερεκφράζεται σε ιστούς NSCLC. Η έκφραση του IGF1R σε ιστούς NSCLC και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων μετρήθηκε με qRT-PCR. **

P

& lt? 0,01

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073604.s002

(ΔΕΘ)