Αφηρημένο

τροποποίησή της με SUMO είναι μια μετα-μεταφραστική ουβικιτίνης-πρωτεΐνης τροποποίηση μονοπατιού που ρυθμίζει σημαντικές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της δομής των χρωμοσωμάτων, η λειτουργία κινητοχώρος , χρωμόσωμα διαχωρισμός, τα πυρηνικά και υπο-πυρηνικών οργάνωση, τη μεταγραφή και την επιδιόρθωση βλαβών του DNA. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η οδός SUMO είναι απορρυθμισμένη σε καρκίνο, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η διαφοροποίηση της οδού αυτής μπορεί να έχουν θεραπευτικό δυναμικό. Για να διερευνηθεί η σημασία του μονοπατιού SUMO στο πλαίσιο του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη όγκου, εφαρμόσαμε φακοϊό που βασίζεται RNAs μικρή φουρκέτα (shRNA) προς knockdown γονίδια οδού SUMO σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Τα siRNAs για SAE2 και UBC9 μειωμένη δραστηριότητα SUMO σύζευξη και ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Να διερευνά αυτές τις παρατηρήσεις, δημιουργήσαμε δοξυκυκλίνη επαγώγιμων όρους κυτταρικές σειρές shRNA για SAE2 να επιτευχθεί οξεία και αναστρέψιμη SAE2 νοκ ντάουν. Υπό όρους νοκ ντάουν SAE2 στην U2OS και HCT116 κύτταρα επιβράδυνε την ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

, και SAE2 νοκ ντάουν που προκαλείται από πολλαπλές τερματικό αποτελέσματα συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, ενδοαναδιπλασιασμό και γήρανση. Πολυπύρηνα κύτταρα έγινε σε γήρανση και χρωματίστηκαν θετικά για το δείκτη γήρανση, SA-β Gal, και εμφανίζονται αυξημένα επίπεδα ρ53 και ρ21. Σε μια προσπάθεια να εξηγήσει αυτές φαινοτύπων, επιβεβαιώσαμε ότι η απώλεια της δραστηριότητας της οδού SUMO οδηγεί σε απώλεια της SUMOylated τοποϊσομεράσης ΙΙα και την εμφάνιση των γεφυρών χρωματίνης που μπορεί να βλάψει την ορθή κυτταροκίνηση και να οδηγήσει σε πολυπυρήνωση. Επιπλέον, νοκ ντάουν της SAE2 προκαλεί διακοπή των πυρηνικών οργάνων PML που μπορούν να προωθήσουν περαιτέρω την απόπτωση ή γήρανση. Σε μια

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου HCT116, υπό όρους SAE2 νοκ ντάουν έντονα μειωμένη ανάπτυξη του όγκου. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η οδός SUMO απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, εμπλέκοντας το μονοπάτι SUMO ως θεραπευτικός στόχος δυναμικό του καρκίνου.

Παράθεση: Ο X, Riceberg J, Pulukuri SM, Grossman S, Shinde V, Shah P, et al. (2015) Χαρακτηρισμός της απώλεια της λειτουργίας του SUMO δρόμος για καρκινικά κύτταρα και όγκου διάδοσης. PLoS ONE 10 (4): e0123882. doi: 10.1371 /journal.pone.0123882

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Καρλ Γ Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 24 Νοεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 23 του Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 Απριλίου του 2015

Copyright: © 2015 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Takeda Pharmaceuticals International Co. παρέχεται πλήρης οικονομική στήριξη για το σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, την προετοιμασία του χειρογράφου, και τους μισθούς για τους συγγραφείς XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, και NB, κατά τη διάρκεια του χρόνου, όταν διεξήχθησαν μελέτες. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Takeda Pharmaceuticals International Co. παρέχεται πλήρης οικονομική στήριξη για το σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, την προετοιμασία των το χειρόγραφο και τους μισθούς για τους συγγραφείς XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, και NB, κατά τη διάρκεια του χρόνου, όταν διεξήχθησαν μελέτες. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

τροποποίησή της με SUMO είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία τροποποίησης της πρωτεΐνης ουβικιτίνης-όπως που ρυθμίζει ένα διαφορετικό σύνολο των βιολογικών διεργασιών [1, 2]. SUMO (μικρό ουβικιτίνης σχετίζονται τροποποιητής) πρωτεϊνών είναι ~ 10 kD ουμπικουϊτίνης-όπως πρωτεΐνες που συνδέονται ομοιοπολικά στο υπόστρωμα υπολείμματα λυσίνης μέσω μιας ενζυματικής αλληλουχίας ανάλογο με πρωτεΐνη ουβικουϊτινίωση. Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί τέσσερις οικογένεια SUMO πρωτεΐνες: SUMO1-SUMO4. SUMO1-SUMO3 εκφράζονται παντού σε όλους τους τύπους ιστών, ενώ SUMO4 εκφράζεται κυρίως στο νεφρό, λεμφαδένες και σπλήνα [1]. Οι ώριμες μορφές SUMO2 και SUMO3 είναι 97% ταυτόσημες και μόνο το μερίδιο ~ 50% ομολογία αλληλουχίας με SUMO1. SUMO1 είναι συζευγμένο με πρωτεΐνες στόχους ως μονομερές, ενώ SUMO2 και SUMO3 μπορεί να σχηματίσει πολυ αλυσίδες SUMO ως αποτέλεσμα των υπολειμμάτων λυσίνης που υπάρχουν δέκτη στο Ν άκρο. Η λειτουργία του SUMO4 είναι λιγότερο σαφής ως αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι δεν υποβάλλονται σε επεξεργασία σε μια ώριμη, συζεύξιμη μορφή όπως και οι άλλες ισομορφές SUMO [1, 2].

τροποποίησή της με SUMO είναι μια δυναμική και αναστρέψιμη τροποποίηση της πρωτεΐνης. πρόδρομοι Nascent SUMO πρωτεολυτικά επεξεργασία από SUMO-ειδική isopeptidases (sentrin-ειδικές πρωτεάσες? SENPs) για να αποκαλύψει ένα c-τερματικό κατάλοιπο γλυκίνης. Αυτές οι ώριμες πρωτεΐνες SUMO ενεργοποιείται από το Ε1 ετεροδιμερές SAE1 (AOS1) -SAE2 (SUMO ένζυμο ενεργοποίησης 2 ή Uba2) σε ΑΤΡ-εξαρτώμενη αντίδραση που προάγει σχηματισμό θειοεστερικού δεσμού μεταξύ του c-τερματική γλυκίνη SUMO και κυστεΐνη σε SAE2. SUMO στη συνέχεια μεταφέρεται στην καταλυτική κατάλοιπο κυστεΐνης του μοναδικού ενζύμου UBC9 Ε2 (επίσης γνωστή ως UBE2I). Τέλος, SUMO Ε3 λιγάσες, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών της οικογένειας PIAS, RanBP2 και Polycomb μέλος της ομάδας PC2 [1], διευκολύνουν το σχηματισμό ενός δεσμού ισοπεπτιδικού μεταξύ του SUMO ΝΜΣ και ένα κατάλοιπο λυσίνης στόχο στο υπόστρωμα. Η κανονική τοποθεσία SUMO-τροποποίηση περιέχει το συναινετικό μοτίβο ΨKxE (όπου το χ αναφέρεται σε οποιοδήποτε αμινοξύ, Ψ είναι ένα αλειφατικό διακλαδισμένο αμινοξύ). Τροποποίησή της με SUMO είναι μια δυναμική διαδικασία που τελικά αντιστρέφεται από πρωτεάσες SUMO, ή SENPs, οι οποίες επιτρέπουν την επαναχρησιμοποίηση των πρωτεϊνών SUMO για τους επόμενους κύκλους σύζευξη [2]. Παρόμοια με την ubiquitin περιοχές αλληλεπίδρασης που σχετίζονται με την οδό ουμπικουϊτίνης, SUMO αλληλεπιδρώντας μοτίβα (SIMS) έχουν ταυτοποιηθεί που προωθούν πρωτεΐνη τροποποίησή της με SUMO ή να ενισχύσει SUMO εξαρτώμενη αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Κανονικού SIMs χαρακτηρίζονται γενικά από μια σύντομη έκταση υδρόφοβων υπολειμμάτων με συναινετική αλληλουχία ή /και φωσφορυλιωμένα υπολείμματα σερίνης [3]. Η πιθανή βιολογική χρησιμότητα των πολλαπλών SUMO Ubls σε συνδυασμό με την επικράτηση της κάρτες SIM μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει τη μεγάλη ποικιλία των βιολογικών διεργασιών στις οποίες εμπλέκεται η τροποποίησή της με SUMO.

Οι βιολογικές συνέπειες του τροποποίησή της με SUMO περιλαμβάνουν αλλαγές στην υποκυτταρική εντόπιση, μεταβάλλεται σε πρωτεΐνες αλληλεπίδραση πρωτεΐνης, αλλοιωμένη δραστικότητα και τη σταθερότητα του υποστρώματος [1, 2]. Πολυάριθμες στόχοι SUMO έχουν ταυτοποιηθεί μέσω των κυττάρων και βιοχημικές μελέτες και πολλά από αυτά τα υποστρώματα εμπλέκονται σε βασικές κυτταρικές διεργασίες και δομών, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού κύκλου, δομής των χρωμοσωμάτων και του διαχωρισμού, ριβοσωμική βιογένεση, πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφοράς, υπο-πυρηνική δομή, την επιδιόρθωση του DNA, και γονιδιακή έκφραση [4-8]. Αρκετοί παράγοντες μεταγραφής, όπως KAP1, SP3, p300, c-Jun και c-Myb, έχουν αναφερθεί ως υποστρώματα SUMO οπότε τροποποίησή της με SUMO είναι ικανός να προωθήσει τόσο μεταγραφική ενεργοποίηση και καταστολή [6, 7, 9]. Επιπλέον, SUMO εμπλέκεται στην πυρηνική μεταφορά μέσω του τροποποίησή της με SUMO εξαρτάται πυρηνικού πόρου εντοπισμό των RanGAP1, η οποία επιτρέπει τη διατήρηση του GTP κλίση RAN που είναι σημαντικό για την ενεργό πυρηνική εισαγωγή και την εξαγωγή [4]. Εντός του πυρήνα, τροποποίησή της με SUMO αναφέρεται επίσης να παίξει σημαντικό ρόλο στην PML πυρηνικό σώμα (ΝΒ) σχηματισμό και την πρόσληψη των πρωτεϊνών που σχετίζονται PML συμπεριλαμβανομένων Daxx και SP100 [10, 11].

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον από τη σκοπιά του καρκίνου είναι η ουσιαστική απόδειξη ότι τροποποίησή της με SUMO είναι σημαντική για ένα πλήθος διεργασιών κρίσιμης σημασίας για μίτωση. Σε

S

.

cerevisiae

, cohesin είναι SUMOylated, και τροποποίησή της με SUMO είναι απαραίτητη για την αδελφή χρωματιδικές συνοχής [12]. Η μιτωτική κινάση Aurora Β, τοποϊσομεράσης ΙΙα, και πολλές κεντρομερική και κινητοχώρου πρωτεΐνες αναφέρονται επίσης υποστρώματα SUMO [13]. Βλαστοκύστες που απομονώνονται από έμβρυα νοκ-άουτ του ποντικιού Ubc9 εμφανιστεί hypocondensed ελαττώματα χρωματίνης και το χρωμόσωμα διαχωρισμού [14]. Παρόμοιες επιδράσεις στο χρωμόσωμα διαχωρισμού έχουν επίσης παρατηρηθεί σε γενετικές μελέτες στο

S

.

cerevisiae

, ψάρια-ζέβρες και Drosophila, προτείνοντας έναν εξελικτικά συντηρημένο ρόλο για SUMO στη μίτωση. Περιέργως, οι μελέτες στη Drosophila δείχνουν ότι διαιρούμενα κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην απώλεια SUMO λειτουργίας της οδού σε σχέση με μη διαχωριστική, διαφοροποιημένα κύτταρα [15].

Υπάρχουν αναδυόμενες συνδέσεις μεταξύ των πρωτεϊνών τροποποίησή της με SUMO και του καρκίνου. Σε οθόνες RNAi γονιδιώματος σε επίπεδο, αρκετά συστατικά μονοπάτι SUMO βαθμολογήθηκαν ως απαραίτητα γονίδια για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [16]. Τόσο

UBC9

και

SENP1

απαιτούνται για την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ποντικιού [14, 17]. Επιπλέον, το ένζυμο SUMO Ε1 (SAE1 /2), αναγνωρίστηκε ως συνθετικό θανατηφόρος με c-myc σε μια οθόνη RNAi γονιδίωμα πλάτους και SAE2 απαιτείται για την ανάπτυξη του Myc-εξαρτώμενου καρκίνου του μαστού σε ποντικούς [18]. Συνεπής με αυτό το εύρημα, μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε απώλεια τροποποίησή της με SUMO που προκαλείται από την ταχεία υποχώρηση της Myc με γνώμονα λέμφωμα [19]. Αυξημένα επίπεδα UBC9 έχουν παρατηρηθεί σε πολλές κακοήθειες και σχετίζονται με φτωχότερη έκβαση του ασθενούς? συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του προστάτη, των ωοθηκών, του καρκίνου του μαστού και μελάνωμα [20-24]. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα του SUMO Ε1, SAE, έχει επίσης αναφερθεί ότι σχετίζεται με χειρότερη έκβαση στον καρκίνο του μαστού. Τα ευρήματα αυτά δικαιολογούν την περαιτέρω αξιολόγηση των ενζύμων τροποποίησή της με SUMO οδού ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους ογκολογία.

Επικύρωση τη δυνατότητα να βρείτε μικρά διαμορφωτές μόριο της οδού SUMO, αναστολείς του ΣΑΕ και UBC9 [25-28] έχουν αναφερθεί αν και κανένας είναι σήμερα σε κλινική ανάπτυξη. Ωστόσο, ένας αναστολέας ενός ενζύμου που σχετίζονται Ε1, το ένζυμο ενεργοποίησης Nedd8 (ΝΑΕ), είναι σε κλινική ανάπτυξη [29, 30]. Αυτός ο αναστολέας, MLN4924 (pevonedistat), συνδέεται στη θέση σύνδεσης του αδενυλική ΝΑΕ-Nedd8 θειοεστέρα και χρησιμοποιεί ένα μηχανισμό υποβοηθούμενης υπόστρωμα της αναστολής σύμφωνα με την οποία ΝΑΕ καταλύει το σχηματισμό ενός προϊόντος προσθήκης Nedd8-MLN4924 που δρα ως ένας ισχυρός αναστολέας του ενζύμου. SAE δείχθηκε να είναι ικανά να σχηματίζουν ενώσεις προσθήκης ένωσης SUMO με ένα μη ειδικό αναστολέα Ε1 (ένωση 1), καταδεικνύοντας βιοχημική απόδειξη της έννοιας ότι το ΣΑΕ θα μπορούσαν να στοχευθούν με τον τρόπο αυτό [31].

Δεδομένου η αναδυόμενη σχέση μεταξύ πρωτεΐνη τροποποίησή της με SUMO και καρκίνου, επιδιώξαμε να χαρακτηρίσει τις επιπτώσεις της απώλειας της λειτουργίας της οδού SUMO στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη όγκου. Εφαρμόσαμε σταθερή και εξαρτάται από τα συστήματα shRNA να knockdown το SUMO Ε1 και Ε2 ένζυμα, SAE2 και UBC9, σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και SAE2 σε μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου. SUMO μονοπάτι knockdown οδήγησε σε πολλαπλές τερματικό αποτελέσματα συμπεριλαμβανομένης γήρανση και την απόπτωση, η οποία οδήγησε σε ισχυρή σύλληψη πολλαπλασιασμό και θάνατο των κυττάρων σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα. Να μελετήσει πιθανούς μηχανισμούς, που επιβεβαίωσε την απώλεια TopoIIα τροποποίησή της με SUMO και διατάραξη της PML NBS σε HCT116. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν απώλεια τροποποίησή της με SUMO καθυστερήσει την εξέλιξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, υποδηλώνοντας οδός SUMO είναι ένας πιθανός στόχος της ογκολογίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

HCT116, U2OS και Hela κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. HCT-116 και U2OS κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με θερμοαπενεργοποιημένο 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με θερμοαπενεργοποιημένο 10% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα p300 ελήφθησαν από τον Dr. Ron Hay και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορρό εμβρύου μόσχου, 0,5 mg /ml G418 (Geneticin) και 0.5 mg /ml ζεοκίνη.

Όλες οι κυτταρικές γραμμές μολύνθηκαν να εκφράσει μια μη-στόχευσης shRNA, SAE2 shRNA ή UBC9 shRNA χρησιμοποιώντας συσκευασμένα λεντοϊού σωματίδια (Sigma αποστολή shRNA βιβλιοθήκη κλώνος #: SAE2 SH1: TRCN0000007470? SH2 SAE2: TRCN0000007472? SH1 Ubc9: TRCN0000007205? SH2 Ubc9: TRCN0000007206? Ubc9 SH3: TRCN0000011077). Μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη για 2 ημέρες, αφήνεται να αναρρώσουν για 24 ώρες και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για western blot και μια ποικιλία δοκιμασιών ανάπτυξης. κύτταρα P300 λύθηκαν για να μετρηθεί δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας με Steady-Glo σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega).

HCT116 και U2OS κύτταρα με γενετική μηχανική για να περιέχουν ένα φορέα που εκφράζει ένα Tet-διεγέρσιμο προαγωγό μη στόχευση shRNA ή φουρκέτα στόχευσης ανθρώπινο SAE2. Για αυτά τα κύτταρα, το shRNA ήταν ένα 22-μερές στέλεχος-βρόχος κλωνοποιείται υπό τον έλεγχο ενός Tet-επαγόμενο υποκινητή και μπαλάκι στον φορέα pTRIPZ (Open Biosystems). Τα τροποποιημένα γραμμές δημιουργήθηκαν με σταθερή μεταγωγή με τα συσκευασμένα βραδέος ιού σωματιδίων. Μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη για 2 ημέρες, αφήνεται να αναρρώσουν για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 ug /ml δοξυκυκλίνη (Sigma). SH1: TATTCCTACTTTCAATACAGCA? SH2: TTCAATTTGGACATCTGGTGCT? SH3: TTGACTTTGTACTTCAGCCCAG? SH4:. TTTACATCTAGAACCTGCTGGT

ανάλυση Western

λύματα ολόκληρων κυττάρων ή εκχυλίσματα όγκων κλασματώθηκαν με μη-αναγωγική SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα προς SAE2 (για κυτταρολύματα: πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού που παράγεται από τη Millennium , το αντίσωμα ελέγχθηκε σε κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν SAE2? για εκχύλισμα όγκου: epitomics T0083, κουνέλι), Ubc9 (epitomics 2426 έως 1, κουνέλι), SUMO1 (epitomics S2227, κουνέλι), SUMO2 /3 (Cell Signaling Technologies 4971, κουνέλι), RanGAP1 (ab2081 Abcam, κατσικίσιο), p53 (Τεχνολογίες κυτταρική σηματοδότηση 9282, κουνέλι), ρ21 (Santa Cruz SC-397, κουνέλι), διασπασμένη κασπάση 3 (Τεχνολογίες Cell Signaling 9661, κουνέλι), TopoIIα (Cell Technologies 12286, κουνέλι σηματοδότηση) . Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1: 1000. Δευτερογενής HRP-σημασμένο αντισώματα κατσίκας σε IgG (Millipore, αραίωση 1: 2000) χρησιμοποιήθηκαν για RanGAP1 πρωτογενές αντίσωμα και κηλίδες αναπτύχθηκαν με αντιδραστήριο ECL (Amersham). Για άλλα πρωτογενή αντισώματα, το δευτερεύον αντίσωμα ήταν Alexa-680-σημασμένο αντίσωμα σε IgG κουνελιού /ποντικό (Invitrogen, αραίωση 1: 5000) και οι κηλίδες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Li-Cor Odyssey υπέρυθρη απεικόνιση. Τουμπουλίνης (Sigma) κηλιδώθηκε για ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Ανοσοφθορισμός και την πυρηνική απεικόνιση

HCT-116 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πολυ-ϋ-λυσίνη γυάλινες καλυπτρίδες (BD Biosciences) με μέσο + ή-δοξυκυκλίνη και επωάστηκαν για 5 ημέρες. Για τη χρώση PML, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 3 λεπτά, διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και πάλι με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 5 λεπτά και πλύθηκαν σε PBS. Για τη χρώση Daxx, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 2,5 min πρώτα, και μετά μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά και πλύθηκαν σε PBS. Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Blocking Reagent (Roche) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και κηλιδώθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα: PML (Santa Cruz sc-966), Daxx (Santa Cruz sc-7152) σε Blocking Reagent όλη τη νύχτα σε 4 βαθμό. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με Alexa 488-συζευγμένη κατσίκας αντι-ποντικού IgG (1: 2000? Invitrogen) ή Alexa IgG 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1: 2000? Invitrogen) σε Blocking Αντιδραστήριο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου . Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (1: 10.000, Invitrogen) για 5 λεπτά και πλύθηκαν σε PBS. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες με Vectashield (Vector Laboratories). Σημασμένα με φθορισμό κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon TE 300 και οι εικόνες συλλήφθηκαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Hamamatsu).

διάδοσης και του κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Μετά την επιλογή, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε έξι φρεατίων (2000 κύτταρα /φρεάτιο) με μέσο + ή-δοξυκυκλίνη και επωάστηκαν για 12 ημέρες. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 4% παρα-φορμαλδεΰδη και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα 0,5% κρυσταλλικού ιώδους για τον προσδιορισμό της παρουσίας αποικιών κυττάρων.

HCT116 κύτταρα που φιλοξενούν tet-διεγέρσιμο φουρκέτες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δοξυκυκλίνη για 6 ημέρες και συλλεγέντα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% για όλη τη νύχτα αιθανόλη στους 4 ° C. Σταθερή κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθεί η αιθανόλη, και τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε ιωδιούχο προπίδιο και ΚΝάση Α σε PBS για 1 ώρα σε πάγο προστατευμένο από το φως. κατανομές κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur, Becton Dickinson) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Winlist (Verity).

χρώση SA-β-ΟαΙ εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης γήρανση (Abcam) σύμφωνα με τις οδηγίες κατασκευής.

U2OS κύτταρα κατεργασμένα με 7 ημέρες δοξυκυκλίνη σημάνθηκαν με BrdU για 0,5 ώρα, και G1, S και G2 /M πληθυσμών μετρήθηκαν με το κιτ ροής BrdU APC (BD Biosciences). Αντιπροσωπευτικά δεδομένα φάνηκε από ανεξάρτητα πειράματα.

πειράματα όγκων ξενομοσχεύματος

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Θεσμική Animal Care and Use Επιτροπή Takeda Ογκολογίας Εταιρείας (IACUC) (πρωτόκολλο 09-011). ηλικίας 8 εβδομάδων θηλυκός NCR ηυ /ηυ ποντικούς (Taconic Farm Inc.) χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις μελέτες in vivo. Όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε περίοδο εγκλιματισμού τουλάχιστον 3 ημέρες πριν από αυτά χρησιμοποιούνται για τυχόν πειραματικούς σκοπούς (4 ποντίκια στεγάστηκαν ανά κλουβί). Για όλες τις διαδικασίες που εκτελούνται σε αυτή τη μελέτη, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας επαγωγή ενός μίγματος ισοφλοράνη /οξυγόνου 4-5% σε ένα θάλαμο κουτί και στη συνέχεια διατηρήθηκε σε 1-2% ισοφλοράνη /οξυγόνου. Η σωστή καταστολή των ζώων επιβεβαιώθηκε από τα δάχτυλα τσίμπημα. Για τις μελέτες της προόδου της ανάπτυξης του όγκου, τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με 2 χ 10

6 HCT116 ή ΗΤ29 κύτταρα που φιλοξενούν μη στόχευση ή SAE2 Τα siRNAs υποδορίως στο δεξιό πλευρό, και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μετρήσεις δαγκάνα (για κάθε ομάδα, σύνολο 4 -6 ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν). Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε μέση περίπου 200 mm

3, τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ακτινοβολημένα 0,0625% δοξυκυκλίνη διατροφής (Lab δίαιτα) συνεχώς, η οποία προέβλεπε 1-6 mg της Dox ανά ποντικό /ανά ημέρα. RFP απεικόνισης φθορισμού πραγματοποιήθηκε σε αναισθητοποιούνται τα ζώα χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης Xenogen πριν και μετά άρχισε δοξυκυκλίνη δίαιτα. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, κάθε ζώο που πληροί τα ακόλουθα κριτήρια απομακρύνθηκαν από τη μελέτη και την ευθανασία: 1. Η απώλεια βάρους: Το σωματικό βάρος όλων των ζώων παρακολουθήθηκε σε όλη τη μελέτη και τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία αν προκύπτουν απώλεια βάρους 15% μεταξύ των παρατηρήσεων. 2. Το μέγεθος του όγκου: Αν ο όγκος του όγκου έφθασε το 10% του σωματικού βάρους, το μέγεθος του όγκου είναι μεγαλύτερη από 2 εκατοστά έρχεται σε επαφή με το φαγητό, το ποτό, την ούρηση, αφόδευση ή το περπάτημα. 3. έλκος /νέκρωση του θέση του όγκου. 4. Παράλυση: Απώλεια της λειτουργίας είτε σε πρόσθιων ή οπίσθιων άκρων. 5. Άλλα κριτήρια που θα ξεκινήσει καθημερινή παρακολούθηση και την ευθανασία, αν δεν ανταποκρίνεται στην ανακουφιστική θεραπεία περιλαμβάνει: Αφυδάτωση, υποθερμία, ανώμαλη αναπνοή, το χαμηλό επίπεδο δραστηριότητας, προφανή πόνο, και τη γενική κακή κατάσταση του σώματος. Στο τέλος της μελέτης, όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με χρήση ασφυξία CO2 ακολουθούμενο από θωρακοτομή για να επιβεβαιώσει το θάνατο.

Αποτελέσματα

Lentivirus βασίζεται γονίδιο μονοπάτι SUMO knockdown αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vitro

για να επιβεβαιωθεί ότι η οδός SUMO είναι απαραίτητη για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, εφαρμόσαμε ένα φακοϊό σύστημα που βασίζεται shRNA σε νοκ ντάουν σταθερά γονίδια οδού SUMO σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Δύο ανεξάρτητες Τα siRNAs που στοχεύουν SAE2 (SUMO Ε1) ή UBC9 (SUMO Ε2) μολύνθηκαν σε κύτταρα U2OS (Σχήμα 1Α). Με ανοσοαποτύπωση, SAE2 Τα siRNAs (SH1 και SH2) αποτελεσματικά μειωμένο επίπεδο της πρωτεΐνης SAE2 και, κατά συνέπεια, κάτω-ρυθμίζονται τα επίπεδα UBC9-SUMO θειοεστέρα (Σχήμα 1Α), υποδεικνύοντας αναστολή SUMO Ε1 λειτουργικά διαταραγμένη ενεργοποίηση SUMO Ε2. Ομοίως, δύο UBC9 shRNA (SH1 και SH2) μείωσε τόσο το συνολικό UBC9 και τα επίπεδα θειοεστέρα UBC9 SUMO (Σχήμα 1Α). Σε συμφωνία με τα μειωμένα επίπεδα SUMO Ε1 και Ε2, παρατηρήσαμε μειωμένα επίπεδα SUMO2 /3 συζευγμένες πρωτεΐνες (Σχήμα 1Α, κάτω πλαίσιο), υποδεικνύοντας SAE2 και UBC9 Τα siRNAs είναι λειτουργικά αναστολή τροποποίησή της με SUMO στα κύτταρα.

(Α) SAE2 ή UBC9 νοκ ντάουν μειωμένη δραστηριότητα SUMO οδού. κύτταρα U2OS είχαν σταθερά μολυνθεί με φακοϊό εκφράζει Τα siRNAs, που επιλέγονται με πουρομυκίνη και ανοσοκηλιδώ για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. SH1 και SH2 ​​είναι δύο Τα siRNAs για κάθε γονίδιο. (Β) SAE2 ή UBC9 νοκ ντάουν de-κατασταλεί μια SUMO-κατασταλτική δημοσιογράφος. Σταθερό κύτταρα U2OS φιλοξενούν ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης SUMO-κατασταλτικά (κύτταρα P300) μολύνθηκαν με υποδεικνύεται Τα siRNAs. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε Ημέρα 5 επιλογή των υστέρων πουρομυκίνη. (C) SAE2 ή UBC9 νοκ ντάουν μειωμένο επίπεδο θειοεστέρα UBC9 στα κύτταρα δημοσιογράφος p300. αναστολή (D) SUMO κατέστειλε το σχηματισμό αποικιών. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και χρωματίστηκαν για κρυσταλλικό ιώδες μετά από 12 ημέρες.

Η

Για να μετρηθεί ποσοτικά η αναστολή τροποποίησή της με SUMO σε SAE2 ή UBC9 knockdown σε κύτταρα, εφαρμόσαμε μια δοκιμασία ρεπόρτερ που βασίζεται σε κύτταρα για να μετρηθεί δραστηριότητα SUMO. Εμείς αξιοποιηθεί σταθερή κύτταρα U2OS με SUMO κατασταλτική λουσιφεράσης [5]. Τα κύτταρα εξέφρασαν μια πρωτεΐνη σύντηξης Ν-άκρου GAL4-Ρ300 (που αναφέρεται ως GAL4-p300N στη συνέχεια) και στέγαζε ένα θέση δέσμευσης GAL4 μπροστά από τον υποκινητή ενός γονιδίου λουσιφεράσης. p300 Ν-άκρο περιέχει δύο γνωστές θέσεις τροποποίησή της με SUMO. Όταν SUMOylated, GAL4-p300N στρατολογεί μεταγραφικοί καταστολείς του στην ιστοσελίδα GAL4 η οποία αναστέλλει τη μεταγραφή λουσιφεράσης. De-τροποποίησή της με SUMO της GAL4-p300N de-καταστέλλει την λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, SAE2 Τα siRNAs και UBC9 Τα siRNAs αυξημένο σήμα λουσιφεράσης σε σύγκριση με ένα μάρτυρα shRNA. Να συμπίπτει, τα επίπεδα της πρωτεΐνης SAE2 και UBC9 ήταν αποτελεσματικά μειωθεί σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 1Γ), επιβεβαιώνοντας ότι SAE2 και UBC9 νοκ ντάουν μειωμένη λειτουργική δραστηριότητα τροποποίησή της με SUMO.

Για να μελετηθεί η επίδραση της αναστολής του SUMO στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, είμαστε επιχρυσωμένο κύτταρα U2OS εκφράζουν SAE2 ή UBC9 Τα siRNAs και εκτελείται μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας 2D. Όπως φαίνεται στο Σχ 1Δ, SAE2 και UBC9 Τα siRNAs (SH1 και SH2) ισχυρώς μπλοκάρει το σχηματισμό αποικιών

in vitro

. Μετρήσαμε επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων με τη δοκιμασία διπλασιασμού πληθυσμού. Συνεπής με το Σχ 1Δ, SAE2 knockdown είχε σαν αποτέλεσμα επιβραδυνόμενη πληθυσμό κυττάρων διπλασιασμού (S1A Εικ). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε HCT116 και HeLa κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η τροποποίησή της με SUMO είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Υπό όρους SAE2 νοκ ντάουν εξασθενεί δραστηριότητα SUMO οδού

Όταν αυξάνεται κύτταρα U2OS με SAE2 Τα siRNAs, έχουμε παρατηρήσει ότι τα κύτταρα που επιβίωσαν μετά από πολλαπλές διόδους έδειξε μια πολύ χαμηλότερη SAE2 knockdown σε σύγκριση με την πρόωρη κύτταρα πέρασμα, υποδεικνύοντας ότι η SUMO τα siRNAs αρνητικά επιλεγεί σε αυτό πολλαπλασιαζόμενα κυτταρικό πληθυσμό. Για να επιτευχθεί οξεία και ρυθμίσιμο SAE2 knockdown, δημιουργήσαμε τέσσερα miR30 που βασίζεται SAE2 Τα siRNAs (SH1-SH4) [32] με ένα RFP (κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) ανταποκριτή κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή TRE. Ο φορέας λεντοϊού έχει επίσης ένα τρανσενεργοποιητή rtTA για να σχηματίσουν ένα tet-on shRNA σύστημα που είναι επαγώγιμο με δοξυκυκλίνη (Dox) [32]. κύτταρα U2OS μολύνθηκαν με την υπό όρους SAE2 Τα siRNAs και επεξεργάστηκε με Dox για 5 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α (άνω πάνελ), μετά από θεραπεία Dox, υπό όρους SAE2 Τα siRNAs μειώνεται αποτελεσματικά επίπεδα SAE2 και SAE2-thioster ενώ ελέγχου shRNA (γ) δεν επηρέασε το επίπεδο της αφόρτιστη και θειοεστέρα SAE2. Με ανοσοκηλίδωση για UBC9, δείξαμε ότι υπό όρους SAE2 knockdown μειωμένα επίπεδα των θειοεστέρων UBC9-SUMO (Σχήμα 2Α, μεσαίο πλαίσιο). Μέσω της παρακολούθησης του ρεπόρτερ RFP συν-εκφράζεται από τον υποκινητή TRE, ανιχνεύσαμε επαγωγή RFP μετά κατεργασία Dox για 36 ώρες (S2 Σχήμα), υποδεικνύοντας αποτελεσματική επαγωγή του tet-on shRNA σύστημα.

(Α) κύτταρα U2OS μολύνθηκαν με Dox επαγώγιμο SAE2 τα siRNAs (SH1-SH4) ή ελέγχου shRNA (γ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox για 5 ημέρες (+) ή χωρίς αγωγή (-). lystes πρωτεΐνη ανοσοστυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. Τουμπουλίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. (BD) κύτταρα U2OS εκφράζουν όρους SAE2 Τα siRNAs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Dox και ανοσοαποτύπωση με RanGAP1 (Β), SUMO1 (C) και /3 (Δ) αντισώματα SUMO2.

Η

Για να μελετήσει κατά πόσο εξαρτάται SAE2 Τα siRNAs καταστέλλεται τροποποίησή της με SUMO σε κύτταρα, μετρήθηκε σύνολο συζυγών SUMO καθώς και το γνωστό γονίδιο στόχος SUMO RanGAP1 [4] στο κύτταρο knockdown SAE2. Και οι δύο συζυγών SUMO1 και SUMO2 ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα νοκ ντάουν SAE2 την ημέρα 5 με θεραπεία Dox (Σχήμα 2C και 2D, + λωρίδες Dox, SH2 και SH3). Επιπλέον, μετά από οξεία knockdown SAE2, το επίπεδο της SUMOylated RanGAP1 μειώθηκε σε 5 ημέρες μετά την θεραπεία Dox και η μείωση κορυφώθηκε την ημέρα 8 (Σχήμα 2Β). Αυτή η παρατήρηση είναι συνεπής με αναφέρθηκε παρατεταμένη μισή ζωή του SUMO τροποποιημένων RanGAP1 [33]. Δοκιμάσαμε επίσης την υπό όρους σύστημα shRNA στα κύτταρα HCT116 και παρατηρούνται παρόμοια οξεία νοκ ντάουν της SAE2 και συνοδεύεται αναστολή τροποποίησή της με SUMO (S3 Εικ). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπό όρους Τα siRNAs μπορεί οξεία γκρεμίζω SAE2 να μετριάσει δραστηριότητα οδού SUMO στα καρκινικά κύτταρα.

Υπό όρους ΣΑΕ νοκ ντάουν επαγόμενη απόπτωση, ενδοαναδιπλασιασμό και γήρανση

Για την αντιμετώπιση πώς οξεία επιπτώσεις νοκ ντάουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SAE2

in vitro

, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικιών σε Dox αντιμετωπίζονται HCT116 και τα κύτταρα U2OS εκφράζουν όρους SAE2 Τα siRNAs (Σχήμα 3Α). Συνεπής με σταθερή knockdown, θεραπεία Dox σημαντικά μπλοκάρει το σχηματισμό αποικιών σε τρεις ομάδες SAE2 Τα siRNAs (SH2-SH4), αλλά όχι στην ομάδα ελέγχου shRNA (σχήμα 3Α και S4A σχήμα).

(Α) κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν με Dox επαγώγιμων SAE2 Τα siRNAs ή τον έλεγχο shRNA (ctrl). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε μέσο που περιέχει Dox (0,5 ug /ml) και χρωματίστηκαν για κρυσταλλικό ιώδες μετά από 12 ημέρες. (Β) Νοκ ντάουν του ΣΑΕ επάγει απόπτωση. Υπο πληθυσμός G1 αναλύθηκε με FACS με και χωρίς θεραπεία Dox. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν τ.α. (C) SAE2 νοκ ντάουν που προκαλείται κυτταρική γήρανση. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για δραστικότητα SA-β-Gal μετά από 9 ημέρες θεραπεία Dox. (D) χρώση ΡΙ και FACS ανάλυση των κυττάρων HCT116 εξής SAE2 knockdown. υποδείχθηκε sub G1 και κυτταρικό πληθυσμό mutil-πυρηνοποιημένα.

Η

Για να διερευνήσει τους πιθανούς φαινοτύπους που προωθούν SAE2 νοκ ντάουν μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης, έχουμε προσδιορίστηκαν δείκτες απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα νοκ ντάουν SAE2. Με χρώση ΡΙ και κυτταρομετρία ροής, παρατηρήσαμε αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων υπο-G1 σε HCT116 κύτταρα κατά όρους SAE2 knockdown (Σχήμα 3Β), υποδηλώνοντας ορισμένα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση. Με δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU, παρατηρήσαμε μειωμένη ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε SAE2 κύτταρα knockdown U2OS (S4B Εικ). Εκτός από την απόπτωση και μειωμένη κυτταρική αύξηση, ξεκινώντας από 6 ημέρες μετά την συνεχή θεραπεία Dox, SAE2 κύτταρα knockdown HCT116 έδειξε επίσης ένα πολυ-εμπύρηνων φαινότυπο με διευρυμένη και επίπεδη μορφολογία που παρατηρείται συνήθως σε κύτταρα σε γήρανση. Αυτός ο κυτταρικός πληθυσμός χρωματίζονται θετικά για δραστικότητα β-SA-Gal (Σχ 3C), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα έχουν ξεκινήσει ένα πρόγραμμα γήρανση. Επιπλέον, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου πυρηνικού DNA σε Dox κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν αυξημένη περιεκτικότητα 8Ν DNA από κύτταρα HCT116 που φιλοξενούν SAE2 Τα siRNAs, γεγονός που υποδηλώνει ότι εξασθενημένη τροποποίησή της με SUMO οδηγεί σε ενδοαναδιπλασιασμό (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μειώνεται τροποποίησή της με SUMO οδηγεί σε μιτωτική ελάττωμα απομείωση κυτταροκίνηση, που πιθανόν συμβάλλει στην παρατηρούμενη απόπτωση και γήρανση.

SAE2 shRNA φαινότυπος διασωθεί από ένα μη-silencible cDNA

Για να αποκλειστεί η εκτός στόχου επιπτώσεις της RNAi, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα διάσωσης με siRNA κατασκευές πυρίμαχων cDNA. Κύτταρα που εκφράζουν tet-on shSAE2 μολύνθηκαν με άδειο φορέα, μη silencible άγριου τύπου SAE2 (SAE2

κβ), ή μη silencible ανενεργό SAE2 C173A μεταλλαγμένο cDNA (SAE2

mut). Χωρίς θεραπεία Dox, τα επίπεδα συζυγής SUMO είναι παρόμοια μέσα σε αυτά τα μολυσμένα κυτταρικές σειρές, εξετάστηκαν με κηλίδα western (S5 σχήμα). Μετά από 6 ημέρες συνεχούς θεραπείας Dox, σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου, SAE2

WT διασωθεί εν μέρει κάτω ρύθμιση των SAE2-SUMO και τα επίπεδα θειοεστέρας UBC9-SUMO και εν μέρει αποκατασταθεί SUMO2 /3 συζεύξεις σε shSAE2 κύτταρα που εκφράζουν. Σε αντίθεση, η εκφρασμένη ανενεργό SAE2

mut απέτυχαν να διασώσουν το θειοεστέρα SAE2-SUMO, θειοεστέρα Ubc9-SUMO και τα συζυγή SUMO (Σχήμα 4Α). Όπως περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η μη silencible SAE2 μπορεί λειτουργικά διάσωση της δραστηριότητας SUMO μονοπάτι, θα πραγματοποιηθεί την ίδια δοκιμασία απόπτωσης υπο-G1 και χρώση SA-β-Gal. Η άγριου τύπου SAE2, αλλά όχι το C- & gt? Ένα ένζυμο νεκρός μεταλλαγμένο SAE2, μερικώς διασωθεί shSAE2 επάγεται πολυπυρήνωση και γήρανση, και συνδέονται κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 4Β και 4C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι οι μιτωτική ελαττώματα και φαινοτύπων απόπτωση των SAE2 shRNA πιθανότατα προκαλείται από ανεπάρκεια σε στόχο της δραστηριότητας SUMO οδού.

(Α) κύτταρα HCT116 που εκφράζουν tet-on επαγώγιμων shSAE2 (C = ctrl shRNA, 2 = sh2, 4 = SH4) μολύνθηκαν με τον φορέα, μη silencible άγριου τύπου SAE2 ή μη silencible C- & gt? Ένα ένζυμο νεκρός μεταλλαγμένο SAE2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox για 6 ημέρες. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) μη silencible άγριου τύπου SAE2 διασώζει shSAE2 που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Υπο πληθυσμός G1 αναλύθηκε με FACS. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν τ.α. (C) Α.Ε. β-Gal χρώση των κυττάρων που εκφράζουν ενδεικνυόμενης συνδυασμό ρετροϊό.

Η

Η αναστολή της SUMO μονοπάτι οδηγεί σε decatenation DNA ελάττωμα και αναστάτωση PML NB

Ένα βασικό ερώτημα είναι πώς η απώλεια δραστηριότητας SAE2 οδηγεί σε ενδοαναδιπλασιασμό και την απόπτωση. Μετά από 5 ημέρες συνεχούς θεραπείας με δοξυκυκλίνη, κύτταρα που εκφράζουν SAE2 Τα siRNAs αναπτυχθεί ανώμαλη πυρηνική μορφολογία (Σχήμα 5Α). Τα κύτταρα συχνά αναπτύσσονται διευρυμένη πυρήνες και συνήθως εμφανίζεται πολλαπλών λοβών πυρήνες (Σχήμα 5Α), λεπτές γέφυρες DNA συνδέει δύο πυρήνες (Σχήμα 5Α, βέλος), και μικροπυρήνες (Σχήμα 5Α, κεφαλή βέλους). Η μιτωτική ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένης πολυπολικό άτρακτοι παρατηρήθηκαν επίσης (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υπενθυμίζουν τον φαινότυπο που παρατηρείται με ελάττωμα στο DNA decatenation, όπου η αστοχία διαχωρισμού των πεπλεγμένων χρωμοσωμάτων μπορεί να δημιουργήσει γέφυρες DNA που οδηγούν σε ανώμαλη μίτωση, μειωμένη κυτταροκίνηση και μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα [34]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τοποϊσομεράση ΙΙα (TopoIIα) είναι ένα υπόστρωμα SUMO και τροποποίησή της με SUMO είναι σημαντική για δραστικότητα TopoIIα in vitro [35-37]. Western κηλίδες στα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν έλεγχο ή SAE2 shRNA αποκάλυψε ενδογενώς είδη SUMOylated TopoIIα, και νοκ ντάουν της SAE2 ανέστειλε TopoIIα τροποποίησή της με SUMO (Σχήμα 5C).

(ΑΒ) κύτταρα HCT116 που εκφράζουν tet επαγώγιμων SAE2 shRNA (SH2) ή τον έλεγχο shRNA (Ctrl) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox περιέχει μέσο (0,5 ug /ml) για 5 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ για να δείτε πυρήνες μορφολογία. (Γ) Κύτταρα HCT116 που εκφράζουν tet επαγώγιμη SAE2 shRNA (SH2) ή τον έλεγχο shRNA (Ctrl) υποβλήθηκαν σε αγωγή με Dox για 4 ημέρες, στη συνέχεια, ανοσοστυπώθηκαν με TopoIIα αντίσωμα. (D-Ε) εικόνες ανοσοφθορισμού των κυττάρων HCT116 που φιλοξενούν επαγώγιμη shRNA με 5 ημέρες της αγωγής της Dox. Τα κύτταρα βάφτηκαν με (D) PML ή (Ε) Daxx αντισώματα. (F) SAE2 knockdown σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ρ53. κύτταρα U2OS εκφράζουν όρους SAE2 Τα siRNAs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Dox και ανοσοαποτύπωση με αντισώματα p53 και p21.

Η

Από τροποποίησή της με SUMO εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, και παρατηρήσαμε στοιχεία τόσο απόπτωση και γήρανση, ερευνήσαμε τα αποτελέσματα της SUMO απομείωσης μονοπατιού για PML πυρηνική φορείς. PML πυρηνική φορείς είναι οι διοργανωτές της πυρηνικής μήτρας που ρυθμίζουν βασικές διαδικασίες, όπως η απόπτωση και γήρανση.