Αφηρημένο

XB130 είναι ένα πρόσφατα χαρακτηρίζεται πρωτεΐνη προσαρμογέα που αναφέρθηκε για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου του θυρεοειδούς, αλλά ο ρόλος του στην εξέλιξη της άλλα είδη καρκίνου, όπως γαστρικό καρκίνο (GC) παραμένει άγνωστη. Κατά συνέπεια, διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης XB130 και την πρόγνωση των ασθενών GC. Τα θέματα ήταν 411 ασθενείς με GC στα στάδια Ι έως IV. έκφραση XB130 εξετάστηκε σε χειρουργικά δείγματα του GC. Η ανάλυση Kaplan-Meier και το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η προγνωστική σημασία της XB130 για την επιβίωση και την επανάληψη. Επιπλέον, τα κύτταρα GC σταθερά επιμολυσμένα με XB130 μικρή φουρκέτα RNA καθορίστηκαν για να αναλύσει την επίδραση του XB130 στην ευαισθησία της χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο XB130 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης ήταν ανιχνεύσιμα σε φυσιολογικούς ιστούς γαστρικό. Ο συνολικός χρόνος επιβίωσης των ασθενών σταδίου IV και την περίοδο απαλλαγμένη από την ασθένεια μετά από ριζική εκτομή του GC στο στάδιο ασθενείς Ι-ΙΙΙ ήταν σημαντικά μικρότερη όταν ανοσοϊστοχημική χρώση για XB130 ήταν χαμηλή απ ‘ότι όταν χρώση υψηλό (και τα δύο

σ

Στην πραγματικότητα, είναι γνωστό ότι η ογκογένεση μπορεί να προκύψει από μεταβολές των πολλαπλών γονιδίων και πρωτεϊνών, ενώ XB130, η πρωτεΐνη προσαρμογέας με περισσότερους από έναν λειτουργικό τομέα, μπορεί να επηρεαστεί από πολλαπλούς ανάντη και κατάντη παράγοντες. Ως εκ τούτου, είναι πολύ πρόωρο να εκτιμηθεί αν ένα γονίδιο ή μια πρωτεΐνη είναι ογκογόνο ή όχι απλά βασίζοντας την έκφρασή του σε κλινικά δείγματα, αν και ο τελευταίος έκανε υπαινιγμό κάποιες ενδείξεις. Στην πραγματικότητα, προς τα κάτω ρύθμιση των XB130 στην GC μπορεί να θεωρηθεί ως αντισταθμιστικές ρυθμίσεις, επειδή ορισμένοι καταστολείς των όγκων θα πρέπει να κινητοποιηθούν για να αντισταθεί XB130 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του GC. Παρομοίως, αναφέρθηκε ότι η έκφραση της ρ53 καταστολέα του όγκου ήταν υψηλότερη σε πτωχά διαχωριζόμενες GC σε σχέση με καλά διαφοροποιημένο αυτές [10], ενώ στις αρχές γαστρικών καρκίνων με χαμηλά επίπεδα απόπτωσης, αυξημένη έκφραση του Bcl-2 και p53 ήταν περισσότερο πιθανό για την προώθηση μετάσταση [11], [12].

XB130 μπορεί να είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο, η οποία διατηρεί σε φυσιολογικό ιστό. Όπως πρωτο-ογκογονίδια μπορεί να συμβάλει στη διατήρηση της φυσικής λειτουργίες της κυτταρικής ανανέωσης και ανοδική μετανάστευση στην κανονική στομάχι. Εν τω μεταξύ, υπάρχει και ένα άλλο σύνολο που ρυθμίζουν γονίδια που εμποδίζουν την κανονική κυτταρική υπερ-πολλαπλασιασμό και μεταπλασία. Ωστόσο, μόλις disequilibrated η microecological ισορροπία, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η μετάσταση είναι εκτός ελέγχου, κατά συνέπεια, οδηγεί σε καρκινογένεση [13]. Αυτή η κλασική θεωρία του πρωτο-ογκογονιδίου μπορεί να δώσει μια αποδεκτή εξήγηση γιατί φυσιολογικό ιστό με τέτοια έκφραση υψηλής XB130 παραμένει «υγιές». Είναι γνωστό ότι πολλά γονίδια και τα μονοπάτια σηματοδότησης παίξει pro-ογκογόνο ή αντι-ογκογόνο ρόλους σε ένα πλαίσιο-εξαρτώμενο τρόπο, έτσι δεν είναι ασυνήθιστο ότι το ίδιο γονίδιο μπορεί να εξασκεί διαφορετική δράση σε διαφορετικά στάδια ή σε διαφορετικούς τύπους ιστών της ανάπτυξης του καρκίνου [ ,,,0],14], [15], [16]. Στην παρούσα μελέτη, αν και δεν αγγίζουν τις λειτουργίες της XB130 στο κανονικό γαστρικό ιστό, το θέμα αυτό είναι ενδιαφέρον, καθώς και χρειάζονται περαιτέρω έρευνα.

Αν πρότυπο έκφρασης XB130 μπορεί να χρησιμεύσει ως υποκατάστατο πρόβλεψης δείκτη της χημειοθεραπείας απάντηση, θα παρέχει επίσης μια εξήγηση για την πρόγνωση. Επί του παρόντος, φθοροπυριμιδίνη παράγωγα που βασίζονται και έχουν πλατίνα σχήματα συνδυασμών ένωση που βασίζεται γίνει αποδεκτή ως συμβατική θεραπεία πρώτης γραμμής για GC [17], ενώ η ιρινοτεκάνη, ένας αναστολέας τοποϊσομεράσης Ι, χρησιμοποιείται ως θεραπεία δεύτερης γραμμής [18], και σισπλατίνη έχει έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό στη θεραπεία του προχωρημένου, ανεγχείρητο GC [19]. Στην παρούσα έρευνα, οι μελέτες χημειοθεραπευτικά ευαισθησίας βασίζοντας επίπεδο έκφρασης XB130 πραγματοποιήθηκαν. Σε κύτταρα GC, XB130 knockdown υποδεικνύεται καλύτερη ανταπόκριση στη σισπλατίνη και ιρινοτεκάνη, αλλά με μικρότερη ευαισθησία σε 5-FU. κλινικά δεδομένα μας έδειξαν μικρότερο συνολικό χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς με 5-FU σε επεξεργασία με χαμηλή έκφραση του XB130, γεγονός που υποδηλώνει ότι XB130 μειορρύθμιση μειώνει την δυνατότητα ανταπόκρισης σε 5-FU, η οποία μπορεί να είναι μια άλλη εξήγηση για την κακή πρόγνωση σε ασθενείς με χαμηλή έκφραση του XB130 σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ. Τα ευρήματά μας σε κυτταρική σειρά GC εμπλέκουν ότι στις προηγμένες GCs, τα περισσότερα από τα οποία χαρακτηρίστηκε από XB130 χαμηλή έκφραση, μπορεί να ωφεληθούν περισσότερο από την σισπλατίνη και ιρινοτεκάνη, εκτός από 5-FU. Δεδομένης της ετερογενούς γονιδιωματική φόντο όπως η διαφορετική έκφραση του XB130 σε GC, είναι πιθανό ότι ορισμένοι πληθυσμοί θα μπορούσαν να επωφεληθούν από ιρινοτεκάνη ή /και σισπλατίνη όπως προτείνεται στο κυτταρικό πείραμα μας, και είναι χρήσιμο για περαιτέρω έρευνα. Περαιτέρω υποψήφιους έρευνες μπορεί να προσδιορίσει κατά πόσον μπορούν να χρησιμοποιηθούν πρότυπα έκφρασης XB130 για να βοηθήσει διαστρωμάτωση των ασθενών σε διαφορετικά πολυτροπικές θεραπευτικές αγωγές.

Εν ολίγοις, παρούσα μελέτη μας έχει δώσει την πρώτη απόδειξη ότι XB130 ύπαρξη στο γαστρικό ιστό και GC για πρώτη φορά . Έχουμε διαπιστώσει ότι χημειοθεραπευτικών ευαισθησία βασίζοντας αξιολόγησης για την έκφραση XB130 ήταν αρχικά κατευθύνεται, υποδεικνύοντας ότι οι ασθενείς χαμηλή έκφραση XB130 μπορεί να είναι ευαίσθητα σε σισπλατίνη και ιρινοτεκάνη, ακόμη ανώτερος αποδείξεις απαιτεί. Η κλινική προοπτική αυτής της μελέτης περιλαμβάνει (1) XB130 μπορούν να ενεργούν ως GC προγνωστικό βιοδείκτη για τη χαμηλή έκφραση του ενοχοποιώντας για δυσμενή αποτελέσματα? (2) Δεδομένου ότι XB130 χαμηλή εξέφρασε GC ανταποκρίνονται στην σισπλατίνη και ιρινοτεκάνη ανώτερη από 5-φθοριοουρακίλη σε χημειοθεραπευτικά μελέτη της ευαισθησίας μας, την εκτίμηση της έκφρασης XB130 μπορεί να βοηθήσει την καθοδήγηση της κλινικής φαρμακευτικής αγωγής σε GC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Όλα τα 411 ασθενείς είχαν ιστολογικά διαγνωστεί σε Nanfang Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Southern (Guangzhou, Guangdong, Κίνα) από το 2000 έως το 2011. το στάδιο του όγκου ορίστηκε σύμφωνα με την 7η έκδοση του καρκίνου AJCC σταδιοποίηση χρήσης 2010. τα δείγματα για διαγνωστικούς σκοπούς ελήφθησαν με τη συγκατάθεση από τον κάθε ασθενή. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Νοσοκομείου Nanfang, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης για όλους τους ασθενείς ήταν 59,5 (95% CI: 55,5 – 63,5) μήνες. Η κλινικά χαρακτηριστικά και XB130 έκφραση όλων των ασθενών GC περιγράφονται στον Πίνακα 1. Οι ασθενείς του Ι-ΙΙΙ στάδιο GC έγιναν ριζική εκτομή, ενώ οι ασθενείς στο στάδιο IV έλαβαν παρηγορητική λειτουργία.

Πριν από την ανοσοϊστοχημεία ανάλυση, το δείγματα πρωτογενούς ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε 4 μm πάχους τομές, και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Εννέα ζεύγη όγκων και τον καρκίνο-παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς GC σταδίου IV κατανεμήθηκαν τυχαία συλλογή για ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και έξι ζεύγη για ανάλυση στυπώματος western.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος Envision Dako (Dako, Carpinteria, CA) και κουνελιού αντι-XB130 Ab (1:100? Abnove) ακολουθώντας το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την αξιολόγηση XB130, το τμήμα ιστού σαρώθηκε εντελώς να εκχωρήσετε τις βαθμολογίες. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια), ή 3 (ισχυρή). Η έκταση της χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), ή 4 (76% -100%), σύμφωνα με τα ποσοστά των θετικά χρωσμένων περιοχές σε σχέση με το σύνολο της περιοχής καρκίνωμα (ή ολόκληρο το τμήμα για φυσιολογικά δείγματα). Το άθροισμα των βαθμολογιών χρώσης ένταση και έκταση χρησιμοποιήθηκε ως το τελικό σκορ χρώσης (0-7) για XB130. Για το σκοπό της αξιολόγησης της επιβίωσης, οι όγκοι έχουν ένα τελικό σκορ χρώση ≥3 θεωρήθηκαν ότι είναι θετικά. XB130 ανοσοχρώση αξιολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο άτομα τυφλώνονται με τις κλινικές παραμέτρους.

φθορισμού ποσοτική PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Αντίστροφη μεταγραφή του cDNA στη συνέχεια ελήφθη με iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) οδηγίες παρακάτω κατασκευαστή. Όλα τα δεδομένα RNA υποβλήθηκαν σε σχέση με το γονίδιο οικοκυρική β-ακτίνης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt. Ρουτίνα PCR πραγματοποιήθηκε επίσης να εξεταστεί η XB130 έκφραση σε διαφορετικούς όργανο του ανθρώπου και ποντικού (αλληλουχίες εκκινητή στον πίνακα S1).

κηλίδωση Western

Οι ιστοί πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ( PBS) και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρωτεΐνης για 30 λεπτά. Η φυγοκέντρηση διεξήχθη, και το υπερκείμενο που περιέχει πρωτεΐνη διατηρήθηκε. Τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν electrophorectically επί 10% πήγματος SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Immobilon Ρ, Millipore, Bedford, ΜΑ). Στη συνέχεια, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με χρήση κουνελιού αντι-XB130 αντίσωμα (PradoWalnut, CA, USA) και β-ακτίνης (Santa Cruz, CA). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με τη μέθοδο ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham) με ένα δυτικό σύστημα blotting ανίχνευσης (Kodak Digital Science, Rochester, ΝΥ, USA) και ποσοτικοποιήθηκαν με QuantityOne λογισμικό Image v4.6.2.

Κυτταροκαλλιέργεια

Τα κύτταρα από κυτταρική γραμμή SGC7901 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Hyclone)]. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσα με την παρουσία πουρομυκίνης (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

Σταθερά επιμολυσμένα εγκατάσταση κυτταρικών γραμμών

Τρεις διαφορετικές αλληλουχίες shRNA του XB130 κλωνοποιήθηκαν σε pSuper-Rretro-πουρομυκίνης πλασμιδίου με ένζυμο περιορισμού Bgl II, Hind III (New England Biolabs) και Τ4 DNA λιγκάσης (Takara). Τόσο pSuper-Rretro-puro-shXB130 και pSuper-Rretro-puro κατασκευάστηκαν. pSuper-Rretro-πουρομυκίνης-shXB130 σε συνδυασμό με πλασμίδιο συσκευασία φορέα ή φορέα σκαρφάλωμα ως αρνητικός έλεγχος ήταν συσκευασμένα σε ιό με τη χρήση της μεθόδου του φωσφορικού ασβεστίου. SGC7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια shRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), επαναλαμβάνεται τρεις φορές. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως αναφέρθηκε παραπάνω, και απλές αποικίες επιλέχθηκαν με στύπωση Western και φθορισμό ποσοτικής PCR και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Τρεις shRNA στόχευση XB130 και ένα αγωνίζομαι σχεδιάστηκαν (Πίνακας S2). Τόσο mRNA και πρωτεΐνης έκφραση του XB130 (εκκινητή αλληλουχία στον Πίνακα S1, τα αποτελέσματα της έκφρασης στην Εικόνα S1A, Β) επιβεβαιώθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου και στύπωμα western. αποδοτικότητα μόλυνση αδενοϊός έδειξε στην Εικόνα S1c και D.

Κυτταρική βιωσιμότητα ανάλυση

επεξεργασία με θρυψίνη και σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε αρχική πυκνότητα 0,2 × 10

4 /φρεάτιο, τα κύτταρα καλλιεργούνται και παρατηρήθηκαν σε 1, 3, 5 και 7 ημέρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία μεθύλιο thiazolyltetrazolium (ΜΤΤ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm, με 655 nm σαν το μήκος κύματος αναφοράς. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

εκτίμηση Χημειοθεραπευτικά ευαισθησίας σε κύτταρα GC

Κύτταρα του ελέγχου άγριου τύπου και SH-XB130 καλλιεργήθηκαν στο μέσο με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), σισπλατίνη ή ιρινοτεκάνη με διαφορετικές συγκεντρώσεις. Σαράντα ώρες αργότερα, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε.

Στατιστική ανάλυση

αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM ή διάμεσο. Χρησιμοποιήθηκαν Η chi-square test για τις μεταβλητές κατηγοριών και έλεγχος τ για τις συνεχείς μεταβλητές. Επιβίωση και την επανάληψη ποσοστά υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή σε

σ

τιμή μικρότερη του 0,05.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επικύρωση του αποτελέσματος γονιδιακή σίγηση των μικρών RNAs φουρκέτα της XB130 (sh-XB130) και τη μολυσματική αποτελεσματικότητα των αδενοϊό. XB130 μειωτικά κύτταρα μοντέλα γραμμή επιβεβαιώθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου (α) και αποτύπωμα Western (β). Κύτταρα διαμολυσμένα με φορέα σκαρφάλωμα χρησίμευσαν ως αρνητικός έλεγχος και μη επιμολυσμένα MOCK ως έλεγχος. Ο μολυσματικός αποδοτικότητα του αδενοϊού σε 293FT καλλιεργημένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με φυσιολογικό (γ) και φθορισμού (δ) microscopies. Κύριο θέμα στην Α είναι η καμπύλη ενίσχυσης της PCR πραγματικού χρόνου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s001

(PPT)

Πίνακα S1.

Primer ακολουθίες για Real-time ή ρουτίνα PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

XB130 Sh-RNA ακολουθίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s003

(DOC)