Αφηρημένο

Ιστορικό

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πέμπτη πιο συχνή κακοήθεια και την τρίτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Sorafenib είναι το μόνο φάρμακο για τους ασθενείς με καρκίνο σε προχωρημένο στάδιο ηπατοκυτταρικό (HCC) που έχει αποδειχθεί ότι αποφέρουν όφελος επιβίωσης σε ασθενείς με HCC? Ωστόσο, έχει πολλές παρενέργειες. Έτσι, θα πρέπει να αναπτυχθεί εναλλακτική θεραπευτικές στρατηγικές με βελτιωμένη ασφάλεια και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα για τη διαχείριση του HCC.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Έχουμε αποδείξει ότι ένα απόσπασμα του

Graptopetalum paraguayense

( GP) ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης αρκετών ογκο-πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων AURKA, AURKB, και FLJ10540, σε κύτταρα HCC. Για να απομονώσουν τα δραστικά συστατικά στα εκχυλίσματα GP, είμαστε προετοιμασμένοι κλάσματα εκχυλίσματα και αξιολογηθούν οι επιδράσεις τους στην έκφραση ογκο-πρωτεϊνών στα κύτταρα HCC. Το κλάσμα που ορίζεται HH-F3 εμπλουτίστηκε σε δραστικά συστατικά, παρουσίασαν κυτταροτοξικές επιδράσεις, και κατέστειλε την έκφραση των ογκο-πρωτεϊνών σε κύτταρα HCC. Η δομή της κύριας δραστικής ένωσης σε HH-F3 βρέθηκε να είναι παρόμοια με εκείνη των ενώσεων που προέρχονται από προανθοκυανιδίνης

Rhodiola rosea

. Επιπλέον, μια ξεχωριστή νέα ένωση πλούσια σε 3, 4, 5-τριϋδροξυ βενζυλικό τμήματα αναγνωρίστηκε στα παρασκευάσματα HH-F3. Μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι HH-F3 επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HCC προωθώντας την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου. HH-F3 ενισχυμένη επίσης έκφραση ΡΤΕΝ και μειωμένη ΑΚΤ φωσφορυλίωση σε Ser473 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε κύτταρα HCC. Επιπλέον, ο συνδυασμός της GP ή HH-F3 και sorafenib αναστέλλει συνεργικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Huh7. Η επεξεργασία ενός μοντέλου αρουραίου με diethylnitrosamine (DEN) επαγόμενη από καρκίνο του ήπατος με εκχυλίσματα GP και HH-F3 μειωμένη ηπατική περιεχόμενο κολλαγόνου και ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GP εκχυλίσματα και HH-F3 μπορεί να προστατεύσει το συκώτι με καταστολή της ανάπτυξης του όγκου? ως εκ τούτου, οι ενώσεις αυτές θα μπορούσαν να θεωρηθούν για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Παράθεση:. Hsu W-H, Chang C-C, Huang K-W, Chen Υ-C, Hsu S-L, Wu L-C, et al. (2015) Αξιολόγηση της φαρμακευτικό φυτό

Graptopetalum paraguayense

ως θεραπεία για τον καρκίνο του ήπατος. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10.1371 /journal.pone.0121298

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Yuan-Σύντομα Ho, Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 19, Αυγ 2014? Αποδεκτές: 29, Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη, 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν με αριθμό επιχορήγησης NSC102-2627-Β-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001-, και MOST103-2627-Β-030-001-? το Υπουργείο Οικονομικών Υποθέσεων της Ταϊβάν χορηγεί αριθμούς 99-ΕΚ-17-Α-S1-152, 100-EC-17-Α-S1-152, και 101-EC-17-Α-S1-152)? και με επιχορήγηση από το Υπουργείο Παιδείας, Στόχος για το σχέδιο Top Πανεπιστήμιο (103AC-T503). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο αλκοολισμός, η ιογενής ηπατίτιδα και μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα είναι οι τρεις κύριες αιτίες της χρόνιας ηπατικής φλεγμονής και της ζημίας. Η χρόνια φλεγμονή του ήπατος μπορεί να οδηγήσει σε ηπατική ίνωση, κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), που είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του ήπατος και αντιπροσωπεύει το 70% έως 85% της πρωτογενούς ηπατικής κακοηθειών σε ενήλικες. Περισσότερο από το 80% των ασθενών με HCC διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο της νόσου κατά την οποία η χειρουργική θεραπεία δεν είναι πλέον ενδείκνυται. Σε γενικές γραμμές, οι ασθενείς με ανεγχείρητο ΗΚΚ έχουν κακή πρόγνωση και σπάνια ωφελούνται από χειρουργική θεραπεία, όπως η συστηματική χημειοθεραπεία ή χημειοεμβολισμός [1, 2].

Ανώμαλη σηματοδότησης στο PI3K /PTEN /AKT οδό συμβάλλει στην ανάπτυξη της μια ποικιλία των ηπατικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος (NAFLD), μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH), αλκοολική ηπατοπάθεια (ALD), ιογενής ηπατίτιδα και HCC [3]. Η οδός ΡΙ3Κ /ΡΤΕΝ /ΑΚΤ ενεργοποιείται από το επιγενετικές καταστολή του ΡΤΕΝ και /ή μεταλλάξεις σε ή ενίσχυση των επιμέρους στοιχείων της οδού σε περίπου 40-50% των ασθενών με HCC [4-6]. Πειραματικά, η διαγραφή της ΡΤΕΝ ή η υπερέκφραση ΑΚΤ στο συκώτι των αποτελεσμάτων σε ποντικούς στεάτωση και την ανάπτυξη του όγκου [7, 8]. Αυτές οι πειραματικές παρατηρήσεις υποδεικνύουν έντονα ότι η PI3K /PTEN /οδός ΑΚΤ παίζει σημαντικό ρόλο στην hepatotumorigenesis.

Το sorafenib, ένας αναστολέας της κινάσης πολυ-στόχο που είχε εγκριθεί για τη θεραπεία της HCC το 2007 [9], είναι η μόνο πρότυπο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τους ασθενείς με προχωρημένο στάδιο HCC [10]. Αυτό το φάρμακο έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω της αναστολής της Ras /Raf /μονοπάτι ΜΑΡΚ και την αγγειογένεση αποκλείοντας τόσο VEGFR και PDGFR σηματοδότηση, επιβραδύνοντας έτσι την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων εντός του όγκου [11]. Σε μια διπλή-τυφλή, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη κλινική δοκιμή (RCT) με ένα κύριο τελικό σημείο της συνολικής επιβίωσης [12], sorafenib αύξησε το χρόνο επιβίωσης των ασθενών HCC από 7,9 να 10,7 μήνες [13]. Sorafenib είναι το μόνο φάρμακο που έχει αποδειχθεί ότι αποφέρουν όφελος επιβίωσης σε ασθενείς με HCC? Ωστόσο, έχει πολλές παρενέργειες. Επί του παρόντος, οι θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με προχωρημένο HCC είναι περιορισμένες. Έτσι, θα πρέπει να αναπτυχθεί εναλλακτική θεραπευτικές στρατηγικές με βελτιωμένη ασφάλεια και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα για τη διαχείριση του HCC.

Φυτικά φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί για χιλιάδες χρόνια για τη θεραπεία ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών νόσων και των χρόνιων παθήσεων του ήπατος (συμπεριλαμβανομένης της ηπατίτιδας, της ηπατικής ίνωσης και HCC). Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στο

Graptopetalum paraguayense

(GP), μια παραδοσιακή κινεζική βότανο που έχει πολλά οφέλη για την υγεία. Σύμφωνα με την αρχαϊκή κινεζική συνταγή της GP είναι σε θέση να ανακουφίσει ηπατικές διαταραχές, χαμηλότερη πίεση αίματος, λεύκανση του δέρματος, ανακουφίζει τον πόνο, τη θεραπεία λοιμώξεων, αναστέλλουν την φλεγμονή και να βελτιώσει τη λειτουργία του εγκεφάλου [14-16].

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι τα εκχυλίσματα από τα φύλλα του GP αναστέλλουν τυροσινάση και μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης και τις ελεύθερες ρίζες [14-16]. Αποσπάσματα από το στέλεχος του GP καλλιεργήθηκαν με κύτταρα από την κυτταρική σειρά ανθρώπινου HCC HepG2 έχουν επίσης δειχθεί ότι εμφανίζουν αντιοξειδωτικές και αντι-πολλαπλασιαστικές ιδιότητες [17]. εκχυλίσματα με βάση το νερό του GP έχουν επίσης δειχθεί ότι έχουν αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες που προστατεύουν τα κύτταρα από βλάβες CCl

4-επαγόμενης οξειδωτικής ήπαρ [18]. Δεδομένα από προηγούμενη μελέτη μικροσυστοιχίας προφίλ μας έδειξαν ότι η έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό, κυτταρική ανάπτυξη ή /και τη συντήρηση αποκαταστάθηκε σε σχεδόν κανονικά επίπεδα σε αρουραίους που έλαβαν DMN αγωγή με GP [19]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε επίσης ότι η χορήγηση GP μετριάζονται χημικών που προκαλείται ηπατική βλάβη και ίνωση

in vivo

και κατέστειλε ηπατική κυττάρων αστεροειδή (HSC) και την ενεργοποίηση Kupffer κυττάρων

in vitro

.

Τα προαναφερθέντα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η GP μπορεί να αντιπροσωπεύει μια θεραπευτική επιλογή για την αντιμετώπιση της ηπατικής φλεγμονής και ίνωσης [20]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι GP και κλάσμα HH-F3 της έχουν αντικαρκινικές επιδράσεις στο μοντέλο αρουραίου του diethylnitrosamine (DEN) προκληθείσα καρκίνο του ήπατος. Εμείς στη συνέχεια δείχνουν ότι τα εκχυλίσματα του GP και ΗΗ-F3 επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HCC, υποδηλώνοντας ότι GP και ΗΗ-F3 θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την πρόληψη ή θεραπεία του HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

Huh7 και PLC5 ελήφθησαν από τον Dr. Zhong-Zhe Lin, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν. κυτταρική γραμμή HepG2 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, https://www.atcc.org/en.aspx). κυτταρικές σειρές Mahlavu δόθηκαν από τον Dr. Muh-Hwa Yang, Ινστιτούτο Κλινικής Ιατρικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Yang-Ming, Ταϊβάν. Ανθρώπινα ηπατοκυττάρων αγοράστηκε από ScienCell Research Laboratories (https://www.sciencellonline.com/).

GP και

Rhodiola rosea

εξόρυξη, τον καθαρισμό και τον χαρακτηρισμό

φύλλα GP αλέστηκαν και λυοφιλοποιήθηκε σε μια σκόνη στους -20 ° C και αποθηκεύεται σε buster υγρασία στους 25 ° C πριν από την εκχύλιση. Πρώτον, 1,5 g GP σκόνης στροβιλίστηκε με 10 ml 100% μεθανόλης (MeOH) για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στα 1500

g

για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα διάφορα εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10 ml H

2O, 100% ακετόνη, 100% μεθανόλη, 100% αιθανόλη, 70% αιθανόλη, 50% αιθανόλη, 100% DMSO ή 30 % DMSO. Το εναιώρημα στροβιλίζεται επί 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν δύο φορές σε 1500

g

για 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν πάλι στα 9.300

g

για 5 λεπτά και διηθείται μέσω φίλτρου 0.45 μπι σε απαγωγό στρωτής ροής σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο DMSO 30%, είτε αποθηκεύεται στους -20 ° C ως ένα διάλυμα 150 mg /ml αποθέματος (που αναφέρεται ως το 30% DMSO GP αποσπάσματα) ή κλασματοποιούνται σε τέσσερα κλάσματα (F1-F4) χρησιμοποιώντας Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences ΑΒ, Uppsala, Sweden) στήλη (Μέθοδος Ι). Για την απλοποίηση των πρωτοκόλλων προετοιμασία, την άμεση κάθαρση των 30% DMSO GP αποσπάσματα από το νερό είχε επίσης αναλάβει (Μέθοδος II). Χρωματομετρική δοκιμασίες στο 30% DMSO GP εκχυλίσματα για την αναγνώριση του υδρολύσιμου και συμπυκνωμένες ταννίνες εκτελέσθηκαν [21]. Τα κύτταρα HCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα εκχυλίσματα, και τα επίπεδα πρωτεΐνης AURKA, AURKB και FLJ10540 αναλύθηκαν με κηλίδα Western? ταυτοποιήθηκαν ενεργά μόρια στο κλάσμα F3 (αναφέρεται ως το κλάσμα HH-F3). Το κλάσμα HH-F3 αναλύθηκε περαιτέρω με HPLC με ανιχνευτή UV (Shimadzu SPD-M10A), μια στήλη HPLC κανονικής φάσης (Phenomenex Luna 5υ Silica (2) 100Α, 4.6 χ 250 mm) και

1 Η- και

13C-NMR φάσματα για τον προσδιορισμό της δομή των δραστικών μορίων. εκχυλίσματα GP και το κλάσμα HH-F3 επίσης υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι νερού χρησιμοποιώντας μεμβράνη διαπίδυσης (MWCO 12-14,000) (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) για τη λήψη δραστικών ενώσεων.

Rhodiola rosea

φυτά λυοφιλοποιήθηκαν σε μια σκόνη και να αποθηκευτεί σε ένα buster υγρασία στους 25 ° C πριν από την εκχύλιση. Ένα 1.5 g δείγμα από

Rhodiola rosea

σκόνη διαλύθηκε σε 10 ml H

2O, φυγοκεντρείται στα 1500

g

για 5 λεπτά και διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,45 μπι στην στρωτή κουκούλα ρέουν σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -20 ° C ως 150 mg διαλύματα /ml απόθεμα.

κηλίδος Western

Τα προϊόντα λύσεως των κυττάρων HCC υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE για την επίλυση των εκφρασμένων πρωτεϊνών και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μεταφοράς Bio-Rad. Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με Ponceau S για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα και η ομοιομορφία της μεταφοράς πρωτεΐνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα αποβουτυρωμένο σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και επωάζονται με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές (10 λεπτά κάθε φορά) με 1χ αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει Tween-20 (TBST) και επωάζονται με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 2 ώρες. προστέθηκαν και τα σήματα δευτερεύον αντίσωμα στις μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν με ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας φωτοβόλο Fujifilm LAS4000:? HRP διάλυμα υπεροξειδίου του υποστρώματος /αντιδραστήρια λουμινόλη (αναλογία 1 αναμιγνύονται σε 1 Immobilon Western Χημειοφωταυγές υπόστρωμα, Millipore). Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ΡΤΕΝ, αντι-ΑΚΤ, αντι-p70S6K, αντι-κασπάσης 3 και αντι-PARP (Cell Signaling)? αντι-BCL2, αντι-BCL-XL και αντι-κασπάση 9 (GeneTex)? αντι-AURKA και αντι-AURKB (BD Biosciences)? και αντι-FLJ10540 (Abnova). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:. 1000

Βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (4.000-5.000 κύτταρα /φρεάτιο) για όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το 30% DMSO GP εκχυλίσματα ή κλάσμα HH-F3 για 0, 24, 48, ή 72 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλένονται απαλά 3 φορές με 1χ PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4) και στη συνέχεια επωάστηκαν με 0,5 μg /ml 3- (4,5-cimethylthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ, Sigma-Aldrich) για 2 ώρες. Το μέσο αφαιρέθηκε, και τα βαθιά μπλε κρύσταλλοι διαλύονται με 100% DMSO σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. τιμές OD μετρήθηκαν στα 570 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.

Κυττάρων μετρώντας

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων (10.000-20.000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν για μία νύχτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το κλάσμα HH-F3 για 0, 24, 48 ή 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, κατεργασία με 0,4% trypan blue και μετρήθηκε.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου και κυτταρομετρία ροής

Αφού τα κύτταρα είχαν θρυψίνη και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, αυτοί υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 800

g

για 5 λεπτά. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 70% αιθανόλη σε PBS και φυλάσσονται στους -20 ° C για περισσότερο από 16 ώρες. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 800

g

για 5 λεπτά, και τα σφαιρίδια του κυττάρου επανααιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS που περιέχει 100 μg /ml RNAse Α (Sigma-Aldrich) για 20 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 20 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, Sigma-Aldrich) για 20-30 λεπτά, και η περιεκτικότητα σε DNA μετρήθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό ανάλυσης BD FACSCanto και ροής Jo, αντίστοιχα.

μιτοχονδριακή μεμβράνη

δυναμικό δοκιμασίας

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 5, 5 ‘, 6, 6′-τετραχλωρο-l, 1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1) αγοράστηκε από την Cayman Chemical Co. Τα καλλιεργημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων μαύρα πλακίδια σε πυκνότητα 7000 κύτταρα /φρεάτιο, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς την κλάσμα HH-F3 για 48 ώρες. Το διάλυμα χρώσης JC-1 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναμιγνύονται ήπια στους 37 ° C για 15-30 λεπτά στο σκοτάδι. Οι πλάκες υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 400

g

σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο. Το ρυθμιστικό δοκιμασίας JC-1 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στους 400

g

σε θερμοκρασία δωματίου και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο. Τέλος, JC-1 ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού.

Μέτρηση των επιπέδων του ROS

Η ενδοκυτταρική παραγωγή ριζών υπεροξειδίου (O

2

-) αξιολογήθηκε με υδροαιθιδίνη φθορισμού (ΑΑΤ BIOQUEST, Inc.). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς την κλάσμα HH-F3 για 48 ώρες. Υδροαιθιδίνη (10 μΜ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναμίχθηκε ήπια για 30-60 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Cellular φθορισμός παρακολουθήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 520 nm και μήκος κύματος εκπομπής 610 nm. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του υπεροξειδίου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας διχλωροφθορεσκεϊνης (DCFH) διοξεικό (Marker Gene Technologies, Inc.). Αφού τα κύτταρα είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με το κλάσμα HH-F3 για 48 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με DCFH σε μια τελική συγκέντρωση 20 μΜ σε μέσο χωρίς ορό για 30-60 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι, πλύθηκαν και πάλι με PBS και διατηρήθηκαν σε 200 μΐ μέσου καλλιέργειας. Κυτταρικού φθορισμού παρακολουθήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 528 nm.

Ζώα, το πειραματικό περιβάλλον, και το πρωτόκολλο

Η φροντίδα των ζώων και Χρήση επιτροπή του College of Medicine , Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, ενέκρινε όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα των ζώων του πανεπιστημίου.

χρησιμοποιήθηκαν Εκατόν είκοσι έξι εβδομάδων αρσενικούς Wistar αλμπίνο αρουραίοι (150-180 g). Όλα τα ζώα αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για επτά ημέρες και εφόσον πρότυπη τροφή και νερό

κατά βούληση

κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου.

Οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν στην κανονική ομάδα (Ν = 10), η diethylnitrosamine (DEN) ομάδα (Ν = 30), η ομάδα GP χαμηλή δόση (Ν = 30) ή η ομάδα υψηλής δόσης GP (Ν = 30). Πέντε επιπλέον αρουραίοι περιλαμβάνονται στην ομάδα HH-F3-θεραπεία. Για όλες τις ομάδες, εκτός από την φυσιολογική ομάδα, η μόνη πηγή πόσιμου νερού για 63 ημέρες είναι ένα υδατικό διάλυμα των 100 ppm (ν /ν) DEN (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) που αλλάχθηκε καθημερινά? αρχής γενομένης από την ημέρα 64, οι αρουραίοι εφοδιάσθηκαν με νερό της βρύσης για άλλες 14 ημέρες. Το διάλυμα DEN παρασκευάστηκε κάθε εβδομάδα και αποτελούνταν από έναν εξατομικευμένη δόση υπολογίζεται σύμφωνα με το βάρος κέρδος /ζημία που υπέστη το ζώο σε απόκριση προς την προηγούμενη δόση. όγκοι του ήπατος παρατηρήθηκαν ξεκινώντας την ημέρα 42, και ηπατική ίνωση παρατηρήθηκε ξεκινώντας την ημέρα 63. Κατά την διάρκεια της πειραματικής περιόδου, τα ζώα ζυγίστηκαν εβδομαδιαίως για να υπολογιστεί η αύξηση βάρους? Επιπλέον, η ποσότητα του νερού που καταναλώνεται από τους αρουραίους μετρήθηκε κάθε εβδομάδα. Οι αρουραίοι στην ομάδα χαμηλής δόσης έλαβε 0,6 g /αρουραίο λυοφιλοποιημένης σκόνης GP? οι αρουραίοι στην ομάδα υψηλής δόσης έλαβε 1,8 g /αρουραίο λυοφιλοποιημένης σκόνης GP? οι αρουραίοι στην ομάδα HH-F3 έλαβε 0.036 g /αρουραίο λυοφιλοποιημένης σκόνης HH-F3 κάθε μέρα για τρεις εβδομάδες ξεκινώντας την ημέρα 42.

διαδικασία συλλογής και αξιολόγησης μορφολογική του ήπατος

Όλα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 84. Τα ζώα νήστεψαν όλη τη νύχτα και θυσιάζονται με CO

2 εισπνοή. Μετά οι αρουραίοι είχαν θυσιαστεί, όργανα, το συκώτι και σπλήνες τους ζυγίστηκαν? ένα λαπαροτομία μεσαία γραμμή εκτελέστηκε και οι προϋποθέσεις των οργάνων σημειώθηκαν κατά τη νεκροψία. Όλες λοβών του ήπατος αμέσως συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν διεξοδικά για να περιγράψει την επιφάνεια του ήπατος και να χαρακτηρίζουν την ανάπτυξη των εστιών στο ήπαρ, επίμονη οζίδια (PNS) ή καρκίνο σε κάθε χρονικό σημείο. Στη συνέχεια, το ήπαρ κόπηκε σε τμήματα 5-mm. Όλες οι μακροσκοπικά ορατές οζίδια στην επιφάνεια του ήπατος και στα τμήματα 5 mm μετρήθηκαν και μετρήθηκαν.

όγκου επιβάρυνση αξιολόγηση

Για να καθορίσει την πορεία της ανάπτυξης των όγκων στα ζώα που εκτέθηκαν σε DEN, όλα λοβών του ήπατος αμέσως συλλέχθηκαν, και όλες οι μακροσκοπικά ορατές οζίδια στην επιφάνεια του ήπατος και στα τμήματα 5 mm μετρήθηκαν και μετρήθηκαν. βάρη των όγκων του ήπατος προσδιορίστηκαν με υπολογισμό των ποσών των όγκων όλων των όγκων οζίδια μεγαλύτερη από 3 mm σε διάμετρο για κάθε ζώο? τα βάρη του όγκου κατόπιν συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων.

ρυθμό ροής Bile

Πριν από τη θυσία, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με 80 mg /kg κεταμίνης και της ροής της χολής τους ρυθμός μετρήθηκε με ένα ΡΕ10 σωλήνας πυριτίου τοποθετείται στο χοληδόχο πόρο και συνδέεται με ένα υπολογισμένο σωλήνα πολυαιθυλενίου. ροή Bile μέσα στο σωλήνα μετρήθηκε σε διαστήματα 5-λεπτών.

Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση

Αφού είχε αποστραγγιστεί το αίμα, 5-mm-φέτες πάχους ιστό που περιέχει οι όγκοι αποκόπηκαν από κάθε λοβού του συκώτι. Τμήματα (5 μm) κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστοπαθολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες διαγνωστικά κριτήρια.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA)

Τα δείγματα ήπατος ήταν σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη και τεμαχίσθηκαν σε τμήματα 5-μm. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,03% για 10 λεπτά για την απόσβεση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινης α-SMA ποντικού (1:50 αραίωση, Dako Cytomation, Δανία). Για χρώση α-SMA, οι τομές πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα δευτερεύουσα κουνελιού αντι-ποντικού IgG (αραίωση 1: 200) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι τομές στη συνέχεια αναπτύχθηκαν παρομοίως. Μετά τη χρώση, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη για μικροσκοπία αναλύσεις. Το ποσοστό των α-SMA-θετικών περιοχών (mm

2 /cm

2 του τμήματος ήπατος) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα HC-2500 σύστημα ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής (Fuji Photo Film), το Adobe Photoshop έκδοση 5.0J και Image-Pro Plus έκδοση 3.0.1J

Δοκιμασία για περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη στο ήπαρ

δείγματα ήπατος ζυγίστηκαν, και 20 mg των κατεψυγμένων δειγμάτων υδρολύθηκε σε 20 ml 6 Ν HCl και προσεκτικά έδαφος.? 6 Ν HCl προστέθηκε στη συνέχεια για να ληφθεί ένα συνολικό όγκο 30 ml /mg ιστού. Το έδαφος ιστός υδρολύθηκε στους 120 ° C για 16 ώρες. Μετά από μια σύντομη περίοδο ψύξης σε πάγο και φυγοκέντρηση στα 8000

g

για 10 λεπτά, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τοποθετήθηκε σε ένα νέο σωλήνα? ο όγκος χάνεται στην εξάτμιση αναπληρώθηκε με νερό. Ένας ίσος όγκος 6Ν ΝαΟΗ προστέθηκαν και αναμίχθηκαν, και το ρΗ του διαλύματος ρυθμίστηκε σε ρΗ 4-9 χρησιμοποιώντας χαρτί ηλιοτροπίου. Σαράντα μικρολίτρα εξουδετερωμένο διάλυμα δείγματος προστέθηκε στα φρεάτια μιας πλάκας 96 φρεατίων ELISA και οξειδώνεται χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα που περιέχει 5 ml από 7% χλωραμίνης Τ (Sigma-Aldrich) και 20 ml οξικού ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών /. Προστέθηκε Εκατόν πενήντα ml διαλύματος του Ehrlich. Το τελικό μείγμα επωάστηκε στους 60 ° C για 35 λεπτά και σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά? η απορρόφηση προσδιορίστηκε στη συνέχεια στα 560 nm. Πρότυπα διαλύματα που περιέχουν 100, 80, 60, 40, 20 και 0 mg /ml της αυθεντικής 4-υδροξυ-L-προλίνη (Sigma-Aldrich) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο. Η πρότυπη καμπύλη ήταν γραμμική σε αυτό το εύρος των συγκεντρώσεων (

r

= 0,99). Το ηπατικό επίπεδο υδροξυπρολίνη εκφράστηκε ως mg υδροξυπρολίνης /g υγρού βάρους του ήπατος. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Επίπεδα σημασία αξιολογήθηκαν από δύο ουρών ζεύγη του Student

t-test

ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA).

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Τα αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των διαφόρων παρασκευασμάτων GP για Huh7 και τα κύτταρα Mahlavu

Για να ελέγξετε τις πιθανές βιολογικές επιδράσεις των GP, διάφορα GP εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας νερό, βουτανόλη, ακετόνη, μεθανόλη, 100% αιθανόλη, 70% αιθανόλη, 50% αιθανόλη, 100% DMSO ή 30% DMSO και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ανθρώπινων κυττάρων HCC. Η αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από τα διαφορετικά εκχυλίσματα GP εξετάστηκε. Τα δεδομένα από τους προσδιορισμούς ΜΤΤ έδειξε ότι το 30% DMSO εκχυλίσματα μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα του Huh7 και Mahlavu κύτταρα (Σχ 1Α)? Πιο συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις των 500 και 250 μg /ml είχε σαν αποτέλεσμα 50% αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων (IC

50) 72 ώρες μετά τη θεραπεία για Huh7 και Mahlavu κύτταρα, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β).

Huh7 και τα κύτταρα Mahlavu υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα εκχυλίσματα GP παρασκευαστούν σε νερό, βουτανόλη, ακετόνη, μεθανόλη, 100% αιθανόλη, 70% αιθανόλη, 50% αιθανόλη, 100% DMSO, ή 30% DMSO σε συγκεντρώσεις 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 και 1500 μg /ml για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κατεργασμένων κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Τα 30% DMSO GP εκχυλίσματα συνδέθηκε με τη μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και Huh7 Mahlavu μετά από 72 ώρες. (Β) Huh7 και Mahlavu κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις 0, 250, 500, 750 και 1000 μg /ml του 30% DMSO GP εκχυλισμάτων για 24, 48, και 72 ώρες, και προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθηκαν. Το IC

50 συγκεντρώσεις του 30% DMSO GP εκχυλισμάτων για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και Huh7 Mahlavu ήταν περίπου 500 και 250 μg /ml, αντίστοιχα, μετά από 72 ώρες της θεραπείας. (Γ) HepG2 και Huh7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα εκχυλίσματα GP παρασκευάζονται σε 30% DMSO, ύδωρ ή βουτανόλη (ΒυΟΗ) για 48 ώρες. Τα επίπεδα του AURKA, AURKB και FLJ10540 μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Τα επίπεδα έκφρασης του AURKA, AURKB και FLJ10540 σε κύτταρα HepG2 και Huh7 κατεστάλησαν από τους 30% DMSO GP εκχυλίσματα, αλλά όχι από τα κλάσματα παρασκευάζονται σε νερό ή βουτανόλη. (D) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 75 ng /ml του νοκοδαζόλη παράγοντα συγχρονισμού (NOC) για 18 ώρες? τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 750 μg /ml του 30% DMSO GP εξάγει ή ελέγχου του οχήματος (30% DMSO) για ακόμη 3 ώρες. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-FLJ10540, αντι-AURKA και αντισώματα αντι-AURKB. (Ε) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30% DMSO GP εκχυλίσματα και τα κλάσματα του (ΗΗ-F1, HH-F2, HH-F3 και ΗΗ-F4) για 3 ώρες. επίπεδα έκφρασης AURKA και AURKB σε κύτταρα HepG2 κατεστάλησαν από το κλάσμα HH-F3 αλλά όχι από τους άλλους κλάσματα. (F) Huh7, Mahlavu και PLC5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις HH-F3 για 48 ώρες. Η έκφραση των πρωτεϊνών AURKA και FLJ10540 αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοστυπώματος. HH-F3 μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης AURKA και FLJ10540 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο.

Η

GP μειώνει AURKA, AURKB και FLJ10540 επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια τόσο μεσόφαση και τη μίτωση σε ενεργοποιημένα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα και κυτταρικές σειρές HCC

AURKA, AURKB και FLJ10540 είναι ογκογονίδια που συνήθως υπερεκφράζεται σε HCC [22-24]. Τυχαία, βρήκαμε ότι τα 30% DMSO GP εκχυλίσματα ανέστειλαν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης FLJ10540, AURKA και AURKB σε κυτταρικές σειρές HCC (HepG2 και Huh7) σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 C, S1 Σχ). Σε αντίθεση, τα GP εκχυλίσματα που παρασκευάζονται είτε σε νερό ή βουτανόλη δεν αναστέλλει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του AURKA ή AURKB στα κύτταρα HepG2 μετά από 72 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 1 C). Είναι γνωστό ότι τα επίπεδα έκφρασης του AURKA, AURKB και FLJ10540 είναι υψηλότερη κατά τη διάρκεια της μετάφασης ό, τι κατά τη μεσόφαση [25-27]. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε κατά πόσον οι 30% DMSO GP εκχυλίσματα θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της μίτωσης στα κύτταρα HCC. κύτταρα HepG2 επεξεργάστηκαν πρώτα με 75 ng /ml του νοκοδαζόλη για 18 ώρες? Αυτά τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30% DMSO GP εκχυλισμάτων για 3 ώρες (χωρίς έκπλυση της νοκοδαζόλη). επίπεδα έκφρασης AURKA, AURKB και FLJ10540 ήταν υψηλή κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 30% DMSO GP εκχυλίσματα, τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του AURKA, AURKB και FLJ10540 μειώθηκαν κατά τη μεσόφαση και μετάφαση (Σχήμα 1D)? Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των άλλων μιτωτικών πρωτεϊνών (PIN1, hurp και PLK) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

HH-F3 καταστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης AURKA σε κυτταρικές σειρές HCC

Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα Sephadex στήλης LH-20, λάβαμε τέσσερα κλάσματα από τις 30% DMSO GP εκχυλίσματα (S2A Εικ). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη 3 ώρες μετά την θεραπεία έδειξε ότι μόνο το τρίτο κλάσμα (ΗΗ-F3) κατέστειλε την έκφραση του AURKA και AURKB σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 1 Ε). Στη συνέχεια, Huh7, Mahlavu και PLC5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με 25, 50 και 75 μg /ml του κλάσματος HH-F3 για 48 ώρες. Η έκφραση του AURKA και FLJ10540 σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές HCC ήταν σημαντικά καταστάλθηκε από ΗΗ-F3 (Σχήμα 1 F). Για να διερευνηθεί κατά πόσο οι ανασταλτικές επιδράσεις της HH-F3 συνέβη στο μεταγραφικό επίπεδο, εξετάσαμε την διακύμανση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του

FLJ10540

και

AURKA

,

AURKB

και

AURKC

(μέλη της οικογένειας της κινάσης Aurora γονιδίων). Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 μg /ml του κλάσματος HH-F3 για 6 ώρες, και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και της πρωτεΐνης μετρήθηκαν με μικροσυστοιχιών (τσιπ U133A, Affymetrix) και στύπωμα Western, αντιστοίχως. Δεν υπήρξε σχεδόν καμία μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου οποιουδήποτε από τα προαναφερθέντα γονίδια μετά από θεραπεία με HH-F3? Ωστόσο, οι μειώσεις στα επίπεδα πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ποσοστό HH-F3 ρυθμίζεται η έκφραση των FLJ10540 και της οικογένειας της κινάσης Aurora μόρια σε επίπεδο μεταφραστικό παρά στο μεταγραφικό επίπεδο.

Προσδιορισμός των δραστικών συστατικών σε GP

Για την απλοποίηση των πρωτοκόλλων της προετοιμασίας, χρησιμοποιήθηκε μια άλλη μέθοδος (μέθοδος II) με άμεση κάθαρση των 30% DMSO GP αποσπάσματα από το νερό. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ενώσεων που ελήφθησαν με χρήση της μεθόδου II που απαριθμούνται στο S1 πίνακα, και τα δεδομένα αυτά έδειξαν ότι τα κλάσματα που λαμβάνονται με τη μέθοδο Ι (η μέθοδος που χρησιμοποιείται αρχικά για την παρασκευή HH-F3) και Μέθοδος II ήταν ταυτόσημα. Μετά από λυοφιλίωση, χαρακτηριστικό χρώμα ροζ και μερική ασημί μεταλλικό-όπως λάμψη του κλάσματος HH-F3 παρατηρήθηκε. Σύμφωνα με τους διευρύνθηκε αρωματικά σήματα σε

1 και

13C NMR φάσματα, τα κύρια συστατικά του κλάσματος HH-F3 ταυτοποιήθηκαν ως πολυφαινολικές ενώσεις? Πιο συγκεκριμένα, τανίνες. Μια χρωματομετρική δοκιμασία (OD

500) για την ποσοτικοποίηση του συμπυκνωμένου ταννίνη χρησιμοποιώντας κατεχίνη όπως η τυπική έδειξε ότι η συνολική περιεκτικότητα σε τανίνη του κλάσματος HH-F3 ήταν περίπου 68% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το δακτυλικό αποτύπωμα HPLC του κλάσματος HH-F3 (S2 Σχήμα 2Β) αποκάλυψε ότι αυτό το κλάσμα περιείχε δύο ομάδες των ενώσεων (Ομάδες Α και Β) με χωριστές σειρές μοριακά βάρη? Ομάδα Β περιείχε ένα μείζον και ένα δευτερεύον συστατικό. Αυτά τα ευρήματα αποκάλυψαν το κλάσμα το HH-F3 ήταν πλούσια σε συμπυκνωμένες ταννίνες και περιείχε ενώσεις με υψηλά μοριακά βάρη.

(Α) Ανθρώπινη ηπατοκυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του 30% εκχυλισμάτων DMSO GP /HH-F3 για 72 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Huh7, Mahlavu και PLC5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5, 25, 50 και 75 μg /ml του κλάσματος HH-F3 σε 24, 48 και 72 ώρες στη συνέχεια υποβάλλεται σε δοκιμασία ΜΤΤ (Β) και κυανού δοκιμασίας (C). Το IC

50 συγκεντρώσεις HH-F3 για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Huh7, Mahlavu και PLC5 ήταν περίπου 50, 37,5 και 75 μg /ml, αντίστοιχα, μετά από 72 ώρες της θεραπείας.

Η

Επειδή δεν πολυμερείς ενώσεις έχουν ακόμη απομονωθεί από GP, οι ενώσεις πολυφαινολικές από

Rhodiola rosea

(χρυσή ρίζα), ένα άλλο βότανο της οικογένειας Crassulaceae, χρησιμοποιήθηκαν ως ενώσεις αναφοράς για τη δομική ταυτοποίηση των ενώσεων στο HH- F3 κλάσμα.

R

.

rosea

έχει αναφερθεί ότι περιέχουν συμπυκνωμένες ταννίνες (CTS). Οι χημικές ιδιότητες των κύριων ενώσεων στην HH-F3a υπο-κλάσμα, τόσο από Μέθοδοι Ι και ΙΙ, ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα της CTs σε

R

.

rosea

(χρυσή ρίζα). Επιπλέον, επειδή οι CT ενώσεις που βρίσκονται συχνά σε πολλά είδη κοινά σταφύλι,

Vitis vinifera

CTs χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως ενώσεις αναφοράς. S1 Πίνακας περιλήψεις τις φυσικοχημικές ιδιότητες του πολυμερούς προανθοκυανιδίνης από

R

.

rosea

και

Vitis vinifera

. υψηλή αναλογία του σε 3, 4, 5-τριϋδροξυ βενζυλικό υποκαταστάτες του HH-F3a (προσδιορίζεται από τα

χημικές μετατοπίσεις 13C σε 105 ppm και 109 ppm για το C-2 ‘/6’ και C-2 «/6» του η μονάδα EGCG, αντίστοιχα? φάσματα δεν φαίνεται) ήταν πολύ παρόμοια με εκείνη της ένωσης που βρέθηκαν σε

R

.

rosea

, αλλά πολύ μεγαλύτερη από την ένωση που βρίσκεται στη φλούδα των σταφυλιών και σπόρων (βλ S1 πίνακα). Κατά συνέπεια, η CT παρουσιάζεται στην HH-F3a προτάθηκε ως ένα πολυμερικό proanthocyanidin με τον κυριαρχικό prodelphinidin επαναλαμβανόμενη μονάδα και (4 → 8) -συνδέσεις (βλέπε S2C σχήμα). Χημικός χαρακτηρισμός HH-F3a και διαλεύκανση της δομής της επαναλαμβανόμενης μονάδας μετά από χημική αποικοδόμηση από θειόλυση θα δημοσιευθεί χωριστά.

Το κλάσμα HH-F3 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων HCC

Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις