Αφηρημένο

Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ένα ρόλο για SHARP1, μια βασική έλικα-βρόχος-έλικα καταστολέας της μεταγραφής, στη ρύθμιση της κακοήθη συμπεριφορά των κυττάρων σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Εντούτοις, η έκφραση και ο ρόλος του SHARP1 κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του ενδομητρίου (ΕΚ) παραμένουν ασαφείς. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του SHARP1 καταστέλλεται αγγειογένεσης όγκου με μείωση υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α), ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου σε ΕΚ. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξαν ότι η έκφραση του SHARP1 σχετίστηκε αρνητικά με το στάδιο του όγκου, η ιστολογική ποιότητα, μυομητρίου εισβολή, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, διαπέραση των αιμοφόρων αγγείων στο μυομήτριο και έκφραση του HIF-1α. Μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι SHARP1 αλληλεπίδρασε με HIF-1α σωματικά, και το επίπεδο πρωτεΐνης του HIF-1α και το επίπεδο του mRNA των γονιδίων στόχων του (

VEGFA, ANGPTL4

και

CA9

) μειώθηκαν κατά SHARP1 υπό υποξία. Προς τα πάνω ρύθμιση SHARP1 σε ΕΚ εμποδίζεται υποξία προκαλούμενη αγγειογένεση μειώνοντας την έκκριση VEGF. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση επαληθεύεται μια συσχέτιση μεταξύ μειωμένη έκφραση SHARP1 και αυξημένη μικροαγγειακή πυκνότητα στους ιστούς ΕΚ. Επιπλέον, SHARP1 ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές ΕΚ. Η υπερέκφραση του SHARP1 in vivo ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση, και μειωμένη έκφραση του HIF-1α. Σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε SHARP1 ως νέου ογκοκατασταλτικό του ΕΚ και να ρίξει φως στους μηχανισμούς από το πόσο SHARP1 ανέστειλε την εξέλιξη της ΕΚ. Ως εκ τούτου, SHARP1 μπορεί να είναι ένα πολύτιμο προγνωστικό βιοδείκτη για την ΕΚ εξέλιξη και δείχνει υπόσχονται ως ένα νέο δυνητικό στόχο για την αντιαγγειογόνο φαρμάκων στην ΕΚ

Παράθεση:. Liao Υ, Lu W, Τσε Q, Yang Τ, Qiu Η, Zhang Η, et al. (2014) SHARP1 Καταστέλλει αγγειογένεση του καρκίνου του ενδομητρίου, μειώνοντας υποξία Factor-1α επίπεδο. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10.1371 /journal.pone.0099907

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17, Φεβ, 2014? Αποδεκτές: 19 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 11, Ιούν του 2014

Copyright: © 2014 Liao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81272885, 81172476, 81072139, 81072140), το έργο του Ιδρύματος της Σαγκάης Δημοτική Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής (Αρ 13JC1404500) και το Ph.D. Προγράμματα Ίδρυμα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (Αρ 20120073110090). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του ενδομητρίου (ΕΚ) είναι μια σημαντική αιτία νοσηρότητας σχετίζονται με τον καρκίνο και θνησιμότητα μεταξύ των γυναικών. Είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες, με κατ ‘εκτίμηση 49.500 νέες περιπτώσεις και 8200 θανάτους το 2013 [1]. Αν και σε πρώιμα στάδια ΕΚ συχνά θεραπευτεί επιτυχώς με χειρουργική επέμβαση, θεραπεία του προχωρημένου ΕΚ μπορεί να είναι δύσκολη και η πρόγνωση του είναι κακή [2], [3], ιδίως στο πλαίσιο της μεταστατικής ή υποτροπιάζουσας νόσου, με μία μέση επιβίωση μόνο 7 -12 μήνες [4]. Τρέχουσες επιλογές θεραπείας, όπως υστερεκτομή, ορμονική θεραπεία, και συνδυασμούς της ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας, είναι αποτελεσματικές για πρώιμου σταδίου ΕΚ? Ωστόσο, αποτελεσματικές θεραπείες στόχος για τους ασθενείς με μεταστατικό ή υποτροπιάζοντα ΕΚ δεν είναι διαθέσιμα [5], επειδή η αιτιολογία και βιολογικούς μηχανισμούς αυτής της ετερογενούς νόσου δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται εξέλιξη ΕΚ είναι επείγον.

Η αγγειογένεση, ο σχηματισμός νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχον αυτά, έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου, της προόδου και της μετάστασης [6], [7 ]. Αρχικά, αγγειογενετική δραστηριότητα είναι απούσα στις αρχές νεοπλάσματα. Ωστόσο, όπως οι όγκοι αναπτύσσονται πέρα ​​από τον υπάρχοντα ρυθμό τροφοδοσίας, το οξυγόνο εξαντλείται μέσα στον πυρήνα. Η προκύπτουσα κατάσταση υποξική (ΡΟ

2 & lt? 10 mmHg [-1.5% O

2]) αποτρέπει την αποδόμηση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1α (HIF-1α) μέσω καταστολέα VHL όγκων, επιτρέποντας trans-ενεργοποίηση των προ- αγγειογόνους παράγοντες, μεταξύ των οποίων το πιο αξιοσημείωτο είναι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [8] – [11]. Πρόσφατη έρευνα απέδειξε ότι η οδός σηματοδότησης HIF-1α /VEGF εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση, και αγγειακής διαπερατότητας [12]. Επιπλέον, η αναστολή της νεοαγγείωσης με καταστολή του /μονοπατιού σηματοδότησης VEGF HIF-1α μπορεί να καθυστερήσει την εξέλιξη του όγκου και ίσως ακόμη και λιμοκτονούν καρκινικά κύτταρα στο θάνατο [13] – [15]. Όπως και άλλοι στερεοί όγκοι, η ανάπτυξη και η μετάσταση των κυττάρων του ΕΚ εξαρτώνται από την αγγειογένεση [16]. Ο υποκείμενος μηχανισμός ρύθμισης αγγειογένεσης έχει περιγραφεί εκτενώς σε άλλους τύπους καρκίνου, αλλά μόνο ελάχιστα μελετηθεί σε ΕΚ [15].

SHARP1 (επίσης γνωστή ως bHLHE41 ή DEC2), μέλος του μεταγραφικού καταστολέα υποοικογένεια των βασικών έλικας η θηλειά-έλικα (bHLH) παράγοντες μεταγραφής [17], [18], εκφράζεται σε διάφορα εμβρυϊκά και ενήλικους ιστούς [19], [20]. Εκτενή στοιχεία δείχνουν ότι είναι ένας βασικός ρυθμιστής της εξέλιξης του όγκου σε προφορική και καρκίνου του μαστού, όπου έχουν ευρέως ερευνηθεί επιπτώσεις της στην καρκινικών κυττάρων απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [21] – [24]. Επιπλέον, SHARP1 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του VEGF [25], και μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι SHARP1 καταστέλλει την μετάσταση του καρκίνου του μαστού [23]. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο αν και, αν ναι, πώς SHARP1 συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη της ΕΚ, ιδίως όσον αφορά την αγγειογένεση, στην οποία συμμετέχει η οδός του HIF-1α /VEGF.

Στην παρούσα μελέτη , αποδείξαμε ότι μειωμένη έκφραση SHARP1 συσχετίστηκε σημαντικά με κακή κλινική έκβαση στην ΕΚ. Επιπλέον, για πρώτη φορά, δείξαμε ότι SHARP1 έχει ένα ρόλο κατασταλτική κατά τη διάρκεια ΕΚ εξέλιξης? ιδίως, SHARP1 ανέστειλε την αγγειογένεση σε HIF-1α-εξαρτώμενο τρόπο και μπορεί να είναι ένα πολύτιμο δείκτη για αντιαγγειογόνο επιλογή θεραπείας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ανθρώπου Διερεύνηση της Διεθνούς Ειρήνης μητρότητας & amp? Παιδιού Νοσοκομείο συνδεδεμένες με Shanghai Jiao Tong University. Τα δείγματα των ΕΚ και η κανονική του ενδομητρίου ιστοί συλλέχθηκαν μετά την παραλαβή γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς. Η έρευνα σε ζώα διεξήχθη σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις της κατευθυντήριας γραμμής για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου της Κίνας. Οι διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από το Υπουργείο Εργαστήριο Ζώων Επιστημών Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων.

Ασθενείς και δείγματα

δείγματα

ιστούς παραφίνης ελήφθησαν από 110 ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου και 52 ασθενείς με φυσιολογικό ενδομήτριο που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για τη θεραπεία άλλων ασθένειες όπως myoma ή αδενομύωση στη Διεθνή Ειρήνη μητρότητας & amp? Παιδιού Νοσοκομείο Υγεία συνδεδεμένες με Shanghai Jiao Tong University από το 2009 έως το 2013. Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών με ΕΚ ήταν 56,9 ± 8,8 χρόνια (μέση τιμή ± SD? Διάμεσο, 57 χρόνια? Εύρος, 33-78 ετών). Η μέση ηλικία των ασθενών με φυσιολογική ενδομήτριο ήταν 53,9 ± 8,6 χρόνια (μέση τιμή ± SD? Διάμεσο, 53 χρόνια? Εύρος, 34-70 ετών). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά όσον αφορά την ηλικία του ασθενούς, όταν ΕΚ και ελέγχου δείγματα σύγκριση (

P

= 0,054). Στην ομάδα ελέγχου, όλα τα δείγματα ήταν υστερεκτομή υπόδειγμα, μεταξύ των οποίων 16 περιπτώσεις ήταν από γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση, 17 περιπτώσεις ήταν από περιεμμηνοπαυσιακές γυναίκες και οι άλλοι ήταν από προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Τα στάδια (Ι-IV) και ιστολογική βαθμούς (G1-G3) των όγκων αυτών καθορίστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια της Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) χειρουργικό σύστημα σταδιοποίησης (2009) [26]. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αυξητική ορμόνη, ακτινοθεραπεία, ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση.

ανοσοϊστοχημεία (IHC) και εκτιμήσεων

Τομές ιστού (πάχους 4 μm) παρασκευάστηκαν από δείγματα ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη. Οι τομές αποκηρώθηκαν με ξυλόλιο ακολουθούμενη από επανυδάτωση σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA? ΡΗ 9.0) για 20 λεπτά με θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων. Στη συνέχεια, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση των τομών με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά, και η μη ειδική χρώση μπλοκαρίστηκε με επώαση με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι SHARP1 (λόγο αραίωσης 1:100 έως 10 μg /ml? Novus, Littleton, CO), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι HIF-1α (αναλογία αραίωσης 1:50 έως 5 μg /ml ? BD Biosciences, Bedford, μΑ), μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι CD34 (αναλογία αραίωσης 1:100 έως 5 μg /ml? Abcam, Cambridge, UK), και πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι Κί67 (αναλογία αραίωσης 1:100 να 5 μg /ml? Epitomics, Burlingame, CA) σε υγροποιημένο θάλαμο στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα (λόγο αραίωσης 1:1000 σε 1 μg /ml? Beyotime, Nanjing, Κίνα) για 30 min, ακολουθούμενο από στρεπταβιδίνη υπεροξειδάσης για 15 λεπτά. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) χρησιμοποιήθηκε για την αραίωση αντισώματα. δραστικότητα υπεροξειδάσης ανιχνεύθηκε με την εφαρμογή τετραχλωριούχο 3,3′-διαμινοβενζιδίνη. Κάθε στάδιο επώασης εκτελέστηκε στους 37 ° C και ακολουθήθηκε από τρεις διαδοχικές εκπλύσεις με PBS για 5 λεπτά η κάθε μία. Τέλος, τα τμήματα ήταν αφυδατωμένο στο αλκοόλ και εκκαθαρίζονται σε ξυλόλιο.

Η βαθμολόγηση έγινε από δύο ανεξάρτητους παθολογοανατόμους που δεν γνώριζαν τα κλινικά και παθολογικά δεδομένα. χρώση SHARP1 αξιολογήθηκε με υπόψη τόσο τον αριθμό των κυττάρων με θετικά πυρηνικά και κυτταροπλασματική χρώση και την ένταση της χρώσης σε κάθε θετικό πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Ο αριθμός των θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (& lt? 5%)? 1 (5-25%)? 2 (26-50%)? 3 (51-75%)? 4 (& gt? 75%). Η ένταση βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (αρνητική)? 1 (ασθενής)? 2 (μέτρια)? 3 (ισχυρή). Η τελική βαθμολογία υπολογίζεται πολλαπλασιάζοντας τις δύο βαθμολογίες παραπάνω. Δεκάδες 0-2 ορίστηκαν ως » αρνητική έκφραση »? βαθμολογίες 3-8 ως » ασθενώς θετική έκφραση », και τα σκορ των 9-12 ως » έντονα θετική έκφραση » [27]. Για χρώση HIF-1α, μόνο αξιολογήθηκε το ποσοστό της σκοτεινής, ομογενώς χρωματισμένο πυρήνες, και αγνοήθηκε κυτταροπλασματική χρώση. Θεωρήθηκε θετική όταν & gt? 1% των πυρήνων κηλιδώθηκαν [28]. Η μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD) εκτιμήθηκε με χρώση IHC για CD34, η οποία αναδεικνύει την αγγείωση του όγκου /ιστού. Τα μικροαγγεία μετρήθηκαν σε τρία διαφορετικά πεδία ανά τμήμα ως εξής: πλακίδια πρώτα σαρώνεται υπό χαμηλής ισχύος (Χ 100) για να προσδιοριστεί τρεις «καυτά σημεία » ‘ή σε περιοχές με τον μέγιστο αριθμό των μικροαγγείων, τότε τα θετικά χρωματισμένων αιμοφόρων αγγείων στον επιλεγμένες περιοχές αναλύθηκαν σε μεγέθυνση × 400 [29].

Cell Culture, συνθήκες υποξίας, και αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ΕΚ (Ishikawa και RL95-2) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ανθρώπινα ομφάλιου αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) ελήφθησαν από Key-GEN Biotech (Nanjing, Κίνα). Ishikawa και RL95-2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM /F12 (Gibco, Auckland, NZ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Carlsbad, CA). HUVECs καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. Για πειράματα υποξίας, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια in vitro υποξικό (& lt? 0,1% O

2) Σύστημα δοχείο (BD Diagnostics, Sparks, MD). Προσαρμοσμένο μέσο (CM), πρωτεϊνών και RNA συλλέχθηκαν αμέσως όταν τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από υποξική δοχείο.

Παροδική και σταθερές επιμολύνσεις για SHARP1-υπερέκφραση

Η έκφραση SHARP1 πλασμίδιο Pez-M02-SHARP1 και κενό πλασμίδιο pReceiver-M02-ΝΕΟ αγοράστηκαν από GeneCopoeia (Guangzhou, Κίνα). Παροδική διαμόλυνση διεξήχθη σε 70% κύτταρα Ishikawa συρρέοντα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για σταθερή έκφραση σε κύτταρα Ishikawa, το ανθρώπινο γονίδιο SHARP1 κλωνοποιήθηκε σε φορείς λεντοϊών με Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP χρησιμοποιώντας τεχνολογία πύλης (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο λειτουργίας (http: //products.invitrogen. com /ivgn /προϊόν /12538120).

μικρά RNA παρεμβολής (siRNA)

siRNAs συντέθηκαν από GenePharma Biotech (Σαγκάη, Κίνα). Οι αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Το siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Η

Απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

Ολικό RNA εκχυλίζεται από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Πρώτου κλώνου cDNA μεταγράφηκε αντίστροφα από 1 μg του ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου Prime Script RT (Takara, Dalian, Κίνα), και το cDNA αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara). Για τα πειράματα qPCR, οι τιμές για το

άξονα y

αντιπροσωπεύουν 2

(- ΔΔCt), όπου ΔCt είναι η διαφορά μεταξύ της Ct για το γονίδιο του ενδιαφέροντος και ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί β-ακτίνη και ΔΔCt είναι η διαφορά μεταξύ της ΔCt της πειραματικής ομάδας και την ομάδα ελέγχου ή την πρώτη λωρίδα [30]. Οι Primer σύνολα φαίνονται στον Πίνακα 2. Τα δεδομένα ελήφθησαν εις τριπλούν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Western Blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Beyotime, Nanjing, Κίνα) με πρωτεάσης φθοριούχο αναστολέα φαινυλυεθανοσουλφονύλ (PMSF? Beyotime). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίζεται με κιτ BCA Protein Assay (Beyotime). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα μιας SDS-PAGE γέλης για διαχωρισμό πρωτεϊνών και μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι SHARP1 (λόγο αραίωσης 1:500 έως 2 μg /ml? Novus), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι HIF-1α (λόγο αραίωσης 1:200 έως 5 μg /ml? Abcam) και κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (ένα λόγο αραίωσης 1:5000 σε 0,2 μg /ml? Epitomics) ξεχωριστά στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια με υπεροξειδάση συνδεδεμένη δευτερογενή αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού αντισώματα (αναλογία αραίωσης 1:5000 σε 0,2 μg /ml? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ). Χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των δεσμευμένων πρωτογενή αντισώματα

συνανοσοκαθίζησης (Co-IP) Δοκιμασία

για να μελετήσουμε τη σύνδεση ενδογενούς SHARP1 /HIF-1α, τα κύτταρα Ishikawa επωάστηκαν υπό υποξία για 24 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Στη συνέχεια, δύο συρρέον πιάτα 10 cm από τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. Πριν από την ανοσοκαθίζηση, συνολικά κυτταρολύματα επωάστηκαν με 1 μα IgG ποντικού και 20 μΙ πρωτεΐνης A + G-αγαρόζης πολτού σφαιριδίων (Beyotime) στους 4 ° C για 2 ώρες για να εξαλείψει μη ειδική σύνδεση. Φυγοκέντρηση στη συνέχεια πραγματοποιείται και το υπερκείμενο συλλέχθηκε και επωάστηκε με αντι-ανθρώπινο HIF-1α ποντικού (τελική συγκέντρωση: 10 μg /ml? Abcam) ή IgG ποντικού ελέγχου (τελική συγκέντρωση: 10 μg /ml? Beyotime) όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, 40 μΙ πρωτεΐνης A + G-αγαρόζης πολτού σφαιριδίων προστέθηκε στα μίγματα αντίδρασης και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή. Co-ανοσοκαταβυθίστηκε πρωτεΐνες αναλύθηκαν με western αποτύπωση όπως περιγράφεται παραπάνω

Δοκιμασία ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές (ELISA)

Quantikine kit ανθρώπινου VEGF αγοράσθηκε από την R &?. Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM /F12, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό υποξία ή νορμοξία για άλλες 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και εξωκυτταρική VEGF στο μέσο προσδιορίστηκε ποσοτικά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ενδοθηλιακών Κυττάρων Σχηματισμού δοκιμαστικό σωλήνα

Μια πλάκα 96 φρεατίων επικαλύφθηκε με 100 μΙ Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA) ανά φρεάτιο και διατηρήθηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 2 × 10

4 HUVECs αιωρήθηκαν σε 1 ml αραιωμένου ρυθμισμένο μέσο (CM? 1:10) και εφαρμόστηκε σε προ-επικαλυμμένη πλάκα 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2000 κύτταρα /φρεάτιο. CM συλλέχθηκε από το υπερκείμενο κυττάρων Ishikawa καλλιεργηθεί υπό υποξία ή νορμοξία για 24 ώρες. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 14 ώρες, το συνολικό μήκος των σωλήνων τύπου τριχοειδούς που είχε σχηματιστεί μετρήθηκαν και κατά μέσο όρο σε τρία τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. Μορφολογικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο, και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 100 × μεγέθυνση.

όγκου Nude Mouse ξενομοσχεύματος Δοκιμασία

Δεκαεννέα 6 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών BALB /c ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Life Science (Slac Laboratory Animal Co., Ltd, Κίνα). Για τη δημιουργία μιας γυμνό μοντέλο ποντικού που φέρει ΕΚ, κύτταρα Ishikawa επιμολυσμένα με λεντοϊού φορέα που φέρει το ανθρώπινο γονίδιο SHARP1 (Lenti-SHARP1) ή με κενό φορέα μόνο (Lenti-Control) χρησιμοποιήθηκαν. Όλα τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες των πέντε ποντικών (τα άλλα εννέα ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία βύσμα Matrigel? Βλέπε παρακάτω). Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του κάθε ποντικού (1 × 10

7 κύτταρα ανά ένεση). σχηματισμός υποδόριου όγκου παρακολουθήθηκε σε όλα τα γυμνά ποντίκια κάθε 7 ημέρες από 14 ημέρες μετά την ένεση. Οι βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και του όγκου του όγκου (cm

3) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο πρότυπο τύπο: όγκος του όγκου (cm

3) = (η μεγαλύτερη διάμετρος) × (τα συντομότερη διάμετρος)

2 × 0.5. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 6 εβδομάδες μετά την έγχυση, μετά την οποία οι όγκοι αφαιρέθηκαν προσεκτικά, και τα βάρη και οι όγκοι τους μετρήθηκαν πριν από την περαιτέρω ιστολογική εκτίμηση.

Δοκιμασία Plug Mouse Matrigel

Εννέα nude BALB /c ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες των τριών ποντικών. Αυξητικού παράγοντα-ελαττωμένη Matrigel (BD Biosciences) (300 μΙ) αναμίχθηκε με κύτταρα Ishikawa επιμολυσμένα με κενό πλασμίδιο υπό φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία ή SHARP1 πλήρους μήκους πλασμίδιο υπό υποξία, ή να αναμιχθεί με τα αντίστοιχα cm (100 μΙ) από τα ίδια τα κύτταρα που αναφέρθηκαν πάνω από. Κύτταρα ή αντίστοιχα ΕΛΟΤ συλλέχθηκαν συγχρόνως μετά καλλιεργήθηκαν κάτω από συνθήκες που αναφέρονται για 24 ώρες. Τα μίγματα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του κάθε ποντικού (δεξιά πλευρά, μίγμα με κύτταρα? Αριστερή πλευρά, μίγμα με τα αντίστοιχα CM). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα βύσματα απομακρύνθηκαν 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό και φωτογραφήθηκαν. βύσματα Matrigel βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) για ιστολογική εξέταση και αναλύθηκε με IHC όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι CD34 ποντικού (1:100, Abcam)

Trans-well Μετανάστευση Δοκιμασίες

.

για HUVEC προσδιορισμούς μετανάστευσης trans-φρεατίων, 1 × 10

4 κύτταρα αιωρούνται σε 200 μΐ RPMI1640 σπάρθηκαν στην κορυφή του θαλάμου και ρυθμισμένο μέσο (CM) από διαφορετικές πηγές, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι προστέθηκε σε ο θάλαμος κάτω μέρος, όπου τα κύτταρα Ishikawa καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 24 ώρες πριν από την συλλέχθηκε CM. Κάθε δείγμα τοποθετήθηκε εις τριπλούν. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα στην άνω πλευρά του άνω θαλάμου απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Τα μεταναστευτικά κύτταρα (στην κάτω πλευρά του φίλτρου) στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες, και τότε ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν μετρήθηκε. Ένα σύνολο έξι πεδία μετρήθηκαν για κάθε φίλτρο trans-καλά. Κάθε πεδίο μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν σε 200 × μεγέθυνση.

Methyl θειαζολυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) Δοκιμασίες

Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 1 έως 4 ημέρες. Κατά το τελευταίο 4 ώρες καλλιέργειας, το μεθύλιο θειαζολυλ τετραζολίου (ΜΤΤ? 5 mg /ml) αντιδραστηρίου (Sigma, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 490 nm με αναγνώστη μικροπλακός (μοντέλο 680? Bio-Rad, Hercules, CA). Για την ανίχνευση της βιωσιμότητας HUVEC, 2 × 10

4 HUVECs ανεστάλησαν με 1 ml αραιωμένου CM (αραίωση αναλογία 1:10) και σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 2000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες επώασης, HUVEC βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε παραπάνω. Σε κάθε πείραμα και σε κάθε κατάσταση, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε εις τριπλούν, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS έκδοση 17.0 (Chicago, IL ). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με unpaired Student του

t-test

ή με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για πολλαπλές συγκρίσεις. Το χ

2 τεστ για τους πίνακες για να συγκριθούν τα κατηγορικά δεδομένα. δοκιμή συντελεστή συσχέτισης του Spearman χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση συσχέτισης. Ένα

P

-τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

SHARP1 ρυθμίζεται προς τα κάτω στο ΕΚ και συσχετίζεται με κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της έκφρασης SHARP1 για την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ΕΚ, επιλέξαμε 52 περιπτώσεις κανονικής ενδομητρίου ιστού, 97 περιπτώσεις ενδομητριοειδές καρκίνου του ενδομητρίου (ΕΟΚ) ιστού και 13 περιπτώσεις θηλώδους ορώδες ΕΚ ή σαφή κυττάρων των ιστών ΕΚ και με εκπροσώπους των τύπου Ι και τύπου II ΕΚ, αντίστοιχα. Τύπου Ι ΕΚ, που εμφανίζεται σε περίπου 85% των ασθενών, συχνά εμφανίζει θετικούς οιστρογονικούς υποδοχείς. Όγκους με αυτού του τύπου τείνουν να είναι καλά διαφοροποιημένο, της χαμηλής ποιότητας και καλή πρόγνωση. Σε αντίθεση, ο τύπος II, που αποτελείται ως επί το πλείστον από ορώδες και σαφή καρκίνωμα, τυπικά προκύπτει σε ατροφικό ενδομήτριο μέσω ενός μηχανισμού που δεν σχετίζονται με έκθεση σε οιστρογόνα. Αυτός ο τύπος είναι συνήθως ER αρνητικά, και κακώς διαφοροποιημένο, υψηλής ποιότητας και κακή πρόγνωση. Αν και τύπου ΙΙ ECs αντιπροσωπεύουν περίπου το 15% των περιπτώσεων, είναι υπεύθυνη για περίπου το 50% όλων των υποτροπών [31]. Ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι SHARP1 έντονα εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των περισσότερων κυττάρων σε φυσιολογικό ενδομήτριο αλλά έδειξε σημαντικά μειωμένη έκφραση σε ΕΚ (

P

= 0,00046, πίνακας 3? Σχήμα 1Α-C).

Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες SHARP1 και χρώση HIF-1α σε ενδομήτριο ιστούς (αρχική μεγέθυνση: 400 × για τα ένθετα, 200 × για όλους τους άλλους? κλίμακα bar, 100 μm). Πίνακες Α-Γ δείχνουν ανοσοϊστοχημική χρώση για SHARP1 σε φυσιολογικά ενδομήτριο (Α), ενδομητριοειδές καρκίνο του ενδομητρίου (ΕΟΚ) (Β), και θηλώδες ορώδες ΕΚ (C). Πίνακες D-F δείχνουν ανοσοϊστοχημική χρώση για SHARP1 στην ιστολογική βαθμού 2 (G2) ΕΟΚ (D), G3 ΕΟΚ του Συμβουλίου (Ε), καθώς και σαφείς κυττάρων ΕΚ (F). Πάνελ G-Ι δείχνουν ανοσοϊστοχημική χρώση για HIF-1α σε G2 ΕΟΚ (G), G3 ΕΟΚ (H), και σαφή κυττάρων ΕΚ (Ι) στις αντίστοιχες ίδιες περιοχές του ίδιου περιπτώσεις χρώση SHARP1.

Η

τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των 110 ασθενών ΕΚ συνοψίζονται στον πίνακα 4. σε σύγκριση με ΕΟΚ, η έκφραση SHARP1 ήταν σημαντικά μειωμένη ή χάνεται στο θηλώδες ορώδες ΕΚ ή σαφή κυττάρων ΕΚ (

P

= 0,017), η οποία αντιπροσωπεύει τις πιο επιθετικές μορφές της ΕΚ. Επιπλέον, η έκφραση SHARP1 μειώθηκε σημαντικά στο τελευταίο στάδιο (στάδιο ΙΙΙ ή IV) ή υψηλής ποιότητας (G3) ΕΚ, σε σύγκριση με πρώιμου σταδίου (στάδιο Ι ή ΙΙ) ή χαμηλής ποιότητας (G1, G2) ΕΚ (

P

= 0.017 και

P

= 0,001, αντίστοιχα). Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης SHARP1 και μυομητρίου εισβολή (

P

= 0,002), λεμφαδένα μετάσταση (

P

= 0.005), και διαπέραση των αιμοφόρων αγγείων στο μυομήτριο (

P

= 0,021). Δεν είχαμε, όμως, να βρούμε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ SHARP1 και άλλα κλινικοπαθολογική μεταβλητές, όπως η ηλικία και η έκφραση του υποδοχέα οιστρογόνου, υποδοχέας προγεστερόνης, και p53.

Η

Η έκφραση της SHARP1 είναι αντιστρόφως ανάλογη με HIF-1α στο ΕΚ

Για να καθοριστεί αν η μειωμένη έκφραση SHARP1 συσχετίζεται με HIF-1α έκφρασης σε καρκινικούς ιστούς, ανοσοϊστοχημική χρώση του HIF-1α πραγματοποιήθηκε σε 104 από τα δείγματα ιστού 110 ΕΚ (τα υπόλοιπα έξι δείγματα λείπουν ή είναι κατεστραμμένα ). Μεταξύ αυτών, 31 ήταν ισχυρώς θετικά για SHARP1 (29,8%), και 77 από 104 δείγματα ήταν θετικά για HIF-1α (74,0%). Μόνο 16 περιπτώσεις ήταν έντονα θετικά για SHARP1 και θετική για HIF-1α (15,4%). κλινικά δεδομένα μας παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι υπάρχει μια ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ SHARP1 και την έκφραση του HIF-1α σε ΕΚ (

P

= 0,003, Πίνακας 5? Σχήμα 1D-Ι).

Η

SHARP1 εξασθενεί την έκφραση του HIF-1α πρωτεΐνη και κατάντη γονίδια της στις γραμμές κυττάρων ΕΚ

βάσει των κλινικών ευρημάτων μας, προτείναμε μια πιθανή σχέση μεταξύ SHARP1 και HIF-1α. Χρησιμοποιώντας qPCR και κηλίδωση Western, διαπιστώσαμε ότι το

SHARP1

επίπεδο ανυψώθηκε διττή στην ΕΚ κυτταρική γραμμή RL95-2 σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά Ishikawa, δύο εκ των οποίων προήλθε από αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου (Εικόνα 2Α) . Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη λειτουργία SHARP1 και συσχέτιση με HIF-1α, που υπερεκφράζεται SHARP1 χρησιμοποιώντας πλασμίδια έκφρασης SHARP1 στα κύτταρα Ishikawa και γκρέμισε SHARP1 χρήση siRNA στα κύτταρα RL95-2. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης επιβεβαιώθηκε στις 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση για mRNA και η πρωτεΐνη επίπεδα, αντίστοιχα (Σχήμα S1).

(Α) Εκφραση του SHARP1 σε Ishikawa και RL95-2 κύτταρα όπως προσδιορίζεται με qPCR (αριστερά ) και κηλίδωση Western (δεξιά). (Β) ανάλυση κηλίδας Western ελέγχου και SHARP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ishikawa καλλιεργήθηκαν στις υποδεικνυόμενες επίπεδα οξυγόνου για 24 h. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των αποτελεσμάτων της εξάντλησης SHARP1 σε κύτταρα RL95-2 μετά από 24 ώρες στις υποδεικνυόμενες επίπεδα οξυγόνου. (D) qPCR ανάλυση του

HIF-1α

mRNA σε έλεγχο και SHARP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ishikawa (αριστερά), και σε κύτταρα RL95-2 που είχαν επιμολυνθεί με τον έλεγχο ή SHARP1 siRNAs (δεξιά) επωάστηκαν στο υποδεικνυόμενο τα επίπεδα οξυγόνου για 24 h. (Ε) συνανοσοκαθίζησης (Co-IP) των ενδογενών HIF-1α με ενδογενή SHARP1 από εκχυλίσματα κυττάρων Ishikawa. Ο αστερίσκος υποδεικνύει μια ταινία υπόβαθρο που προκύπτει από τη διασταυρούμενη αντίδραση των ανοσοσφαιρινών (IgGs). (F) qPCR (αριστερά) και κηλίδωση Western (δεξιά) ανάλυση του

SHARP1

σε κύτταρα Ishikawa επωάζονται στις υποδεικνυόμενες επίπεδα οξυγόνου για 24 h. (G) qPCR ανάλυση του

VEGFA

,

ANGPTL4

, και

CA9

στον έλεγχο και SHARP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ishikawa επωάζονται στις υποδεικνυόμενες επίπεδα οξυγόνου για 24 h. (H) qPCR αναλύσεις

VEGFA

,

ANGPTL4

, και

CA9

σε κύτταρα RL95-2 που είχαν επιμολυνθεί με τον έλεγχο ή SHARP1 siRNAs και επωάζεται στην υποδεικνυόμενη οξυγόνο επίπεδα για 24 ώρες. Για παροδικές επιμολύνσεις, χρησιμοποιήθηκαν το πλασμίδιο (1,6 μg /ml) και siRNA (40 pmol /ml). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001? NS, μη σημαντικό). Για όλες τις αναλύσεις qPCR, τα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με την β-ακτίνη, και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση που φαίνεται στην πρώτη στήλη.

Η

SHARP1 υπερέκφραση μειώθηκε σημαντικά επίπεδα πρωτεΐνης HIF-1α σε κύτταρα Ishikawa υπό υποξία (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον η ενδογενής SHARP1 ήταν μια σχετική αναστολέας του HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης. εξάντληση SHARP1 χρησιμοποιώντας siRNA αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1α σε κύτταρα RL95-2 υπό υποξία (Σχήμα 2C). Ωστόσο, πρωτεΐνη HIF-1α ήταν σχεδόν ανιχνεύθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν κάτω από νορμοξία. Εν τω μεταξύ, καμία σημαντική αλλαγή στο

HIF-1α

mRNA επίπεδο παρατηρήθηκε στα κύτταρα Ishikawa υπερεκφράζεται SHARP1 ή RL95-2 κυττάρων με εξάντληση της SHARP1 (Σχήμα 2D). Διαπιστώσαμε επίσης μια φυσική διασύνδεση μεταξύ της HIF-1α και SHARP1 σε ενδογενή επίπεδα σε κύτταρα Ishikawa υπό υποξία χρησιμοποιώντας δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθιση (Σχήμα 2Ε). Περιέργως,

SHARP1

έκφραση ανυψώθηκε σε κύτταρα Ishikawa μετά καλλιεργήθηκαν υπό υποξία για 24 h (Σχήμα 2F). Επιπλέον, ο HIF-1α knockdown χρησιμοποιώντας siRNA μειωμένη έκφραση SHARP1 υπό υποξία (Σχήμα S2A).

Για να ελεγχθεί αν SHARP1 επηρεάζει λειτουργικώς HIF-1α δραστηριότητα, qPCR χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει διαφορές στα επίπεδα του επιλεγμένου στόχου HIF-1α γονίδιο μεταγραφές. Αξιολογήσαμε τα γονίδια που κωδικοποιούν αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα Α (

VEGFA

, μια ισομορφή του VEGF που είναι ζωτικής σημασίας για την αγγειογένεση όγκων και παίζει βασικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, την επιβίωση και τη διαπερατότητα [7], [10 ], [12], [16], [32]), αγγειοποιητίνη-όπως 4 (

ANGPTL4

), και καρβονικής ανυδράσης 9 (

CA9

). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτά τα γονίδια μεταγραφικά υπερεκφράζεται κάτω από υποξία στα κύτταρα Ishikawa, ενώ SHARP1 έκφραση βρεγμένο αυτές τις επαγωγές (Σχήμα 2G). Αντιστρόφως, SHARP1 knockdown τόνωσε την μεταγραφή αυτών των γονιδίων σε κύτταρα υπό RL95-2 υποξία (Σχήμα 2Η). Η έκφραση αυτών των γονιδίων, ωστόσο, δεν επηρεάζονται σημαντικά από SHARP1 προς τα πάνω ρύθμιση ή αρνητική ρύθμιση υπό φυσιολογική οξυγόνωση. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση του HIF-1α χρήση siRNA εξασθενημένο την έκφραση του mRNA της

VEGFA

,

ANGPTL4

και

CA9

στα κύτταρα Ishikawa κάτω από υποξία (Σχήμα S2B).

SHARP1 αναστέλλει την αγγειογένεση

HIF-1α είναι ένας κύριος ρυθμιστής της αγγειογένεσης του όγκου [33], και SHARP1 ανέστειλε

VEGFA

έκφραση του mRNA στη μελέτη μας (Σχήμα 2G, αριστερό πάνελ). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ELISA για την ανίχνευση της έκκρισης VEGF σε ρυθμισμένο μέσο (CM) των κυττάρων Ishikawa. SHARP1 υπερέκφραση μείωσε μερικώς την έκκριση του VEGF που επάγεται από υποξία σε Ishikawa κύτταρα (Σχήμα 3Α). Έτσι, εξέτασε αν η πρόσκρουση των SHARP1 στην έκφραση /VEGF HIF-1α επηρεάζει υποξία προκάλεσε αγγειογένεση στο ΕΚ. Χρησιμοποιήσαμε αρκετές προσεγγίσεις για τη διερεύνηση εάν και πώς θα μπορούσε να ρυθμίσει SHARP1 τη συμπεριφορά των ενδοθηλιακών κυττάρων. CM συλλέχθηκε από κύτταρα Ishikawa επιμολυσμένα με κενό πλασμίδιο ή SHARP1 πλήρους μήκους πλασμίδιο υπό φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 24 ώρες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η βιωσιμότητα και η μετανάστευση ικανότητα του HUVECs διεγέρθηκαν με CM από υποξικά κύτταρα Ishikawa, ενώ CM από υποξικά κύτταρα Ishikawa που υπερεκφράζονται SHARP1 ανέστειλε αυτές τις επιδράσεις (Σχήμα 3Β και C). Καθώς δεν έχουν προφανείς επιπτώσεις της SHARP1 στην έκκριση VEGF, HUVEC βιωσιμότητα και τη μετανάστευση παρατηρήθηκαν κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση, χρησιμοποιήσαμε CM από κύτταρα Ishikawa επιμολυσμένα με SHARP1 ή άδειο πλασμίδια υπό υποξία για ακόλουθα πειράματα, και CM από Ishikawa κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο πλασμίδια καλλιεργήθηκαν κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση ως ένα αρνητικό έλεγχο. Για να καθοριστεί εάν SHARP1 μεταβληθεί η λειτουργική συμπεριφορά των ενδοθηλιακών κυττάρων, HUVECs τοποθετήθηκαν σε μία μήτρα βασικής μεμβράνης για να προκληθεί σχηματισμός τριχοειδούς σωλήνα που μοιάζει με την παρουσία του ΣΔΥ που αναφέρθηκε παραπάνω. Ο σχηματισμός σωλήνα ποσοτικοποιήθηκε με μέσο όρο το συνολικό μήκος των σωλήνων σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία. Παρομοίως, CM από SHARP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ishikawa ανέστειλε σημαντικά την υποξία-διεγερμένα σχηματισμός σωλήνα και διακλάδωσης (Σχήμα 3D).