Αφηρημένο

Η μικροκυκλοφορία του όγκου χαρακτηρίζεται από μια ανώμαλη αγγειακό δίκτυο με διεσταλμένες, βασανιστικό και saccular σκάφη. Ως εκ τούτου, η απεικόνιση της περιοχής αγγείωσης του όγκου και τον προσδιορισμό μορφομετρικών χαρακτηριστικών του αντιπροσωπεύουν μια κρίσιμη στόχο για τη βελτιστοποίηση της θεραπείας του καρκίνου που στοχεύει τα αιμοφόρα αγγεία (δηλ αντιαγγειογένεσης θεραπεία). Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει νέες παραμέτρους αγγειακή μορφομετρικές σε καρκίνο του παχέος εντέρου, δύσκολο να επιτευχθεί μέσω συμβατικών ανοσοϊστοχημεία, με χρήση της μεθόδου συνεστιακού λέιζερ endomicroscopy. Φρέσκο ​​βιοψίες από όγκο και φυσιολογικό ιστό συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της κολονοσκόπησης από πέντε ασθενείς με καρκίνωμα του παχέος Τ3 χωρίς μετάσταση και σημαδεύτηκαν με φθορισμό σημασμένα αντι-CD31 αντισώματα. Μια σειρά οπτικών φετών που εκτείνονται 250 μπι στο εσωτερικό του ιστού αμέσως συλλέγονται για κάθε δείγμα με χρήση συνεστιακού λέιζερ endomicroscope. Όλες οι μετρήσεις εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Η μέση διάμετρος των αγγείων του όγκου ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από τις φυσιολογικά αγγεία (9,46 ± 0,4 μm vs. 7.60 ± 0.3 μm, p = 0,0166). Η πυκνότητα σκάφος ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερα στον καρκίνο εναντίον δείγματα φυσιολογικού ιστού (5541,05 ± 262,81 έναντι 3.755,79 ± 194,96 σκάφη /mm

3, p = 0,0006). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, ο δείκτης ελίκωση και μήκη του πλοίου δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές (1,05 ± 0,016 και 28,30 ± 3,27 μm σε φυσιολογικό ιστό, έναντι 1,07 ± 0,008 και 26,49 ± 3,18 μm στον ιστό του όγκου, αντίστοιχα, ρ = 0.5357 και ρ = 0.7033). Η αναλογία κόρη /μητέρα (λόγος του αθροίσματος των τετραγώνων των ακτίνων σκάφους κόρη επί το τετράγωνο της ακτίνας μητέρα σκάφους) ήταν 1,15 ± 0,09 σε φυσιολογικό ιστό, και 1,21 ± 0,08 σε ιστό του όγκου (ρ = 0,6531). Η συνεστιακή endomicroscopy λέιζερ είναι εφικτό για τη μέτρηση των πιο αγγειακές παραμέτρους από φρέσκα βιοψίες όγκων από μόνα τους συμβατικούς ανοσοϊστοχημεία. Υπό την προϋπόθεση νέοι παράγοντες αντίθεσης θα είναι κλινικά διαθέσιμη, το μέλλον

in vivo

χρήση CLE θα μπορούσε να οδηγήσει σε ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών με βάση τα μορφομετρικών χαρακτηριστικών των αγγείων του όγκου

Παράθεση:. Ciocalteu Α, Σαφτόιου Α , Cârţână Τ, Gruionu LG, Pirici D, Georgescu CC, et al. (2014) Αξιολόγηση της Νέας μορφομετρικές παράμετροι της νεοαγγειογένεσης στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος Χρησιμοποιώντας Ομοεστιακή Laser Endomicroscopy (CLE) και Στοχευμένες Panendothelial Μαρκαδόροι. PLoS ONE 9 (3): e91084. doi: 10.1371 /journal.pone.0091084

Επιμέλεια: Domenico Ribatti, Πανεπιστήμιο του Μπάρι Ιατρική Σχολή, Ιταλία

Ελήφθη: 13, Νοεμβρίου του 2013? Δεκτές: 7 Φεβ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Μάρτη 2014

Copyright: © 2014 Ciocalteu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από δύο ερευνητικές επιχορηγήσεις που χρηματοδοτούνται από το Εθνικό Συμβούλιο έρευνας (CNCs), τη Ρουμανία, με τίτλο «Κλινική και Biomathematical Μοντελοποίηση των αγγειακών αλλοιώσεων Μετά αντι-αγγειογενετική θεραπεία in Advanced ορθοκολικό καρκίνωμα», αριθμός σύμβασης PN-ΙΙ-ID-PCE-2011- 3-0664, και το «πραγματικό χρόνο αξιολόγησης των Θεραπεία Effects in Advanced ορθοκολικό καρκίνωμα», αριθμός σύμβασης PN-ΙΙ-CT-ERC-2012-1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανισορροπία των προ- και αντι-αγγειογενετική σηματοδότησης εντός των όγκων δημιουργεί ένα μη φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο που χαρακτηρίζεται από διεσταλμένες, βασανιστική, και υπερδιαπερατού πλοία [1], [2]. Ως εκ τούτου, η αγγείωση του όγκου και ιδίως η ανάπτυξη νέων αιμοφόρων (αγγειογένεση) έχει προσελκύσει αυξημένη προσοχή κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες για πιθανές εφαρμογές για τη διάγνωση, την πρόγνωση διαστρωμάτωση και στοχευμένη θεραπεία [1].

Μεταξύ των μεθόδων για την εκτίμηση του όγκου αγγείωση, ο προσδιορισμός της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD) από ανοσοϊστοχημεία (IHC) δειγμάτων χρησιμοποιείται συνήθως σε προκλινικές και κλινικές μελέτες. MVD αντιπροσωπεύει τον μέσο αριθμό των σκαφών ανά mm

2 μέσα σε ένα δείγμα ιστού, αλλά ότι το μέτρο είναι η μόνη ανεπαρκής για την παρακολούθηση αγγειακές μεταβολές κατά τη διάρκεια μιας περιόδου θεραπείας [3]. Άλλες λειτουργικές και μορφολογικές παραμέτρους όπως τον όγκο του αίματος, διαπερατότητα, πυκνότητα μικροαγγείων, διάμετρος σκάφος, διακλάδωση μοτίβα, άλλα μέτρα του σχήματος αγγείου και του μεταβολισμού όγκου μπορεί να σχετίζονται με την αγγειογένεση του όγκου.

μηχανισμών που διέπουν τη βελτιωμένη αντικαρκινική δράση του οι συνδυασμένες θεραπείες μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των αντιαγγειογόνα μέσα, και δεν έχουν προσδιοριστεί με βεβαιότητα. έχουν αντι-αγγειογόνες ουσίες που διαταράσσουν τη αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα μονοπάτι έχει αποδειχθεί για την ομαλοποίηση αγγείωσης του όγκου. Μερικοί συγγραφείς θεωρούν ότι οι κανονικοποιημένες αγγειακά δίκτυα χαρακτηρίζονται από χαμηλότερα στρεβλότητα σκάφους και χαμηλότερη πυκνότητα σκάφος. [4], [5], [6].

Η κλινική παρακολούθηση των αποτελεσμάτων των αντί-αγγειογόνο θεραπεία απαιτεί μια μέθοδο απεικόνισης που ανιχνεύει τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των αγγείων του όγκου με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Επιπλέον, δεδομένου ότι η αντί-αγγειογόνο θεραπεία απαιτεί επαναλαμβανόμενες θεραπείες, μια μη επεμβατική τεχνική είναι ιδιαίτερα επιθυμητή [7]. Συμβατικά τρόπους απεικόνισης, όπως η αξονική τομογραφία, μαγνητική τομογραφία ή υπέρηχο δεν δίνουν μια λεπτομερή εικόνα των αγγείων του όγκου, με αποτέλεσμα την περιορισμένη χρήση για

in vivo

αξιολόγηση του καρκίνου [7]. Μη επεμβατική χαρακτηρισμό των αγγείων του όγκου οδηγεί σε καλύτερη κατανόηση των επιδράσεων της θεραπείας και βοηθά να βελτιστοποιήσετε και να προσαρμόσετε τις θεραπευτικές παρεμβάσεις. [8].

endomicroscopy συνεστιακή λέιζερ (CLE) επιτρέπει

in vivo

μικροσκοπική ανάλυση του γαστρεντερικού βλεννογόνου και microvascularization της κατά τη διάρκεια της ενδοσκόπησης, χρησιμοποιώντας τοπικά ή συστηματικά χορηγούμενων παραγόντων αντίθεσης [7], [9 ]. Στόχευση δείκτες της αγγειογένεσης, σε συνδυασμό με εξετάσεις μοριακό CLE (immunoendoscopy), προσθέτει τη λειτουργική ανάλυση για τη μορφολογική άποψη της νεοπλαστικής διαδικασίας [7]. Έτσι, σε αντίθεση με τις συμβατικές μεθόδους της αγγειακής αξιολόγησης, CLE προσφέρει μια μοναδική ευκαιρία για την ενίσχυση επιλεκτικά διαφορετικά επίπεδα της μικροκυκλοφορίας.

Σε προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι η μέθοδος CLE είναι εφικτή για την απεικόνιση διαφόρων πτυχών της η αγγείωση του όγκου από φρέσκα δείγματα βιοψίας παρόμοιες με τις επί του παρόντος αποδεκτές τεχνικές ιστοπαθολογία [9]. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε νέες παράμετροι αγγειακού δικτύου δύσκολο να εκτιμηθεί με συμβατικές ανοσοϊστοχημεία σε ασθενείς με κλινικά ανέβασε Τ3 πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνωμα, χωρίς μεταστατική εξάπλωση, χρησιμοποιώντας CLE συνδυασμό με φθορισμό σημασμένα αντι-CD31 αντισωμάτων για την επισήμανση των φυσιολογικών και καρκινικών αιμοφόρων αγγείων .

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Ιατρικής και Φαρμακευτικής του Craiova . Μια γραπτή συγκατάθεση δόθηκε σε κάθε προηγούμενη ασθενή εισαγωγή στη μελέτη.

Χαρακτηριστικά Ασθενών

Τα δείγματα βιοψίας ελήφθησαν από πέντε ασθενείς που προσλαμβάνονται στο Κέντρο Ερευνών της Γαστρεντερολογίας και ηπατολογίας Κραϊόβα, Ρουμανία πριν να υποστούν κάθε θεραπεία (Πίνακας S1). Οι ασθενείς είχαν προηγουμένως διαγνωστεί με πρωτοπαθή ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (G1-G2 βαθμού ιστολογική) κατά τη διάρκεια της ρουτίνας κολονοσκόπηση διαδικασίες. Ο ασθενής 1 υποβλήθηκε σε θεραπεία με bortezomib σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία και ακτινοβολία που ακολουθείται από χειρουργική επέμβαση. Ο ασθενής 2 είχε ένα ιστορικό χειρουργικής επέμβασης που ακολουθείται από χημειοθεραπεία για κακόηθες νεόπλασμα του κόμβου ορθοσιγμοειδικής τέσσερα χρόνια πριν και είχε διαγνωστεί με τοπική υποτροπή κατά την παρακολούθηση. Υποβλήθηκε σε αγωγή με χειρουργική επέμβαση και επικουρική χημειοθεραπεία με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU). Οι ασθενείς 3 και 5 υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία, με ακτινοβολία εισαγωγική για το ένα με το ορθό καρκίνωμα. Ασθενής 4 είχε μια ιστορία της βαλβιδική καρδιακή νόσος, η χρόνια λοίμωξη από ηπατίτιδα C και χαμηλός αριθμός αιμοπεταλίων και αρχικά αντιμετωπίζεται με αγωγή FUFOL, αλλά αρνήθηκε περαιτέρω θεραπεία συμπεριλαμβανομένης εκτομή. Κατά το χρόνο της ανάλυσης αυτής, οι πέντε ασθενείς ήταν ζωντανοί σε περισσότερο από ένα έτος μετά την πρώτη αξιολόγηση.

αξιολόγηση Ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε χειρουργικά δείγματα από τέσσερις ασθενείς, ενώ η ενδοσκοπική βιοψίες που συλλέγονται πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας χρησιμοποιήθηκαν για τον ασθενή που αρνήθηκε τη λειτουργία.

Οι ασθενείς ήταν προετοιμασμένοι για κολονοσκόπηση από την κατάποση ενός συνταγογραφούνται συχνά στοματικό διάλυμα ηλεκτρολυτών στομάχου. Ζεύγη βιοψίες συλλέχθηκαν με χρήση κολονοσκόπιο (CFQ160ZL, η Olympus, Tokyo, Japan) από την κανονική βλεννογόνο λαμβάνεται σε περίπου 10 cm από τον όγκο και από κάθε μακροσκοπικά ορατή βλάβη και αμέσως εμβαπτίστηκε σε φυσιολογικό ορό. Τα φρέσκα δείγματα βιοψίας επωάστηκαν στο σκοτάδι με ένα Alexa Fluor-488-επισημασμένο αντι-CD31 αντίσωμα (PECAM) (ποντικού αντι-ανθρώπινο IgG 1, αραιωμένο 1:10 σε PBS με 1% BSA, Exbio, Πράγα, Τσεχία) για 1 ώρα στους 37 ° C. Ο χρόνος επώασης και αραίωσης βελτιστοποιήθηκαν για να δώσουν την υψηλότερη διείσδυση μέσα στον ιστό και το ισχυρότερο σήμα φθορισμού για τα νωπά δείγματα βιοψίας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Αμέσως μετά την επώαση, τα δείγματα βιοψίας τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες που πρόκειται να απεικονιστεί με τη μέθοδο της CLE.

Ομοεστιακή Laser Endomicroscopy

απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ειδικό σύστημα endomicroscopy (Pentax ΕΚ-3870 CIFK, Tokyo, Japan), με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και με μέγιστη ισχύ εξόδου λέιζερ ≤1 mW στην επιφάνεια του ιστού που ελέγχεται από τον χρήστη κατά τη διάρκεια της εξέτασης για βέλτιστη αντίθεση απεικόνισης. Η διαδικασία CLE διεξήχθη ως εξής: το περιφερικό άκρο του ενδοσκοπίου τοποθετήθηκε στην αντίστοιχη βλεννογόνου περιοχή από τις γυάλινες ιστολογία slides, που ακολουθείται από συλλογή του σειριακού συνεστιακής εικόνων (7 μm πάχους, 0,7 μm πλευρική ανάλυση και το οπτικό πεδίο του 475 μm × 475 μm) μέχρι ένα μέγιστο βάθος 250 μm με το πάτημα ενός πεντάλ ποδοδιακόπτη.

Επεξεργασία CLE Εικόνα και Ανάλυση

η τοποθεσία με την καλύτερη κάλυψη αγγειακή σε όλη την ολόκληρο το βάθος του δείγμα βιοψίας επιλέχθηκε για τις μορφομετρικές μετρήσεις. Για κάθε ασθενή, 80-100 σειριακός εικόνων για κάθε δείγμα βιοψίας, του όγκου εναντίον φυσιολογικό ιστό συνενώθηκαν σε στοίβες εικόνα. Η προβολή Z κάθε στοίβας εικόνας λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ ΝΙΗ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, SUA) να αναλύσει ολόκληρο το αγγειακό δίκτυο σταματούν σε δείγμα βιοψίας (Σχ. 1 Α και Β). Όλες οι εικόνες βαθμονομήθηκαν και ένα χρώμα επικάλυψης χρησιμοποιήθηκε για μια καλύτερη διάκριση των αγγείων. Για να ληφθεί υπόψη χωρική ετερογένεια μέσα σε κάθε δείγμα, δύο 50 × 475 μm ορθογωνικό περιοχές ενδιαφέροντος (ROIs) επικεντρωμένη στη μέση της κάθε εικόνας στην οριζόντια και κάθετη κατεύθυνση σημαδεύτηκαν στην εικόνα (Σχήμα 1 C και D). Το πλάτος 50 μm του ROI επιλέχθηκε κατά την επιθεώρηση όλων των δειγμάτων που επιτρέπουν πολλές διακλαδώσεις και ολόκληρα τμήματα πλοίου σε κάθε δείγμα. Οι μορφομετρικές παράμετροι μετρήθηκαν σε κάθε ROI και, στη συνέχεια, κατά μέσο όρο για να ληφθεί μια τιμή για κάθε δείγμα.

Το Z προεξοχή της στοίβας εικόνας για την κανονική (Α) και όγκου (Β) μικροαγγείωση, προφανώς με περισσότερο στρεβλό διακλαδισμένη σκαφών. Το μήκος του σκάφους μετρήθηκε με τη χρήση κατά διαστήματα εργαλείο γραμμής και αναφέρονται σε μικρόμετρα. Ο δείκτης ελίκωση υπολογίστηκε ως η αναλογία του τμηματικού και ευθεία μήκη τόσο για την κανονική (C) και κακοήθεις (D) ανθρώπινο ορθοκολικό ιστό. * Η γραμμή της κλίμακας είναι 50 μm.

Η

Αγγειακή Παράμετρος Μετρήσεις

Η διαμέτρων αγγείων, την πυκνότητα του σκάφους, το μήκος του σκάφους, ο δείκτης στρεβλότητα και αναλογία κόρη /μητέρα μετρήθηκαν για κάθε σκάφος στο ROI. Οι τιμές για τα δύο ROI ανά ασθενή ήταν κατά μέσο όρο να αποκτήσει μια μέση τιμή ανά ασθενή. Τέλος, οι τιμές για κάθε ασθενή κατά μέσο όρο σε όλους τους ασθενείς και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (Πίνακας 1). Η πυκνότητα σκάφος υπολογίστηκε ως ο μέσος αριθμός των σκαφών ανά ROI διαιρείται με τον όγκο σαρώνεται (περιοχή ROI πολλαπλασιάζεται με ένα βάθος 250 μm στην κατεύθυνση Ζ) και, στη συνέχεια, κανονικοποιημένο σε 1 mm

3 ‘όγκο.

Χρησιμοποιώντας τη λειτουργία ευθεία γραμμή του ImageJ του, η διάμετρος του κάθε αγγειακών τμημάτων που έπεσε εξ ολοκλήρου ή εν μέρει στην μετρήθηκε η απόδοση της επένδυσης μεταξύ δύο γειτονικών σημείων διακλάδωσης.

το μήκος του σκάφους, τόσο για κανονικές και του παχέος όγκου του καρκίνου δείγματα μετρήθηκε με τον εντοπισμό της κεντρικής γραμμής του κάθε τμήματος σκάφους που χρησιμοποιεί το εργαλείο κατακερματισμένη γραμμή. Ο δείκτης στρεβλότητα του κάθε τμήματος αγγείου υπολογίστηκε ως ο λόγος του τμηματικού και ευθέα μήκη γραμμή. Η αναλογία κόρη /μητέρα (DMR) υπολογίστηκε ως ο λόγος του αθροίσματος των τετραγώνων των ακτίνων σκάφους κόρη επί το τετράγωνο της ακτίνας μητέρα σκάφος, λαμβάνοντας υπόψη την μητέρα ως η μεγαλύτερη σκάφος σε ένα σημείο διακλάδωσης. Αυτή η μέτρηση είναι μια ένδειξη της αναχώρησης από την τοπολογία δομή δέντρου στην οποία περίπτωση το DMR είναι περίπου το ένα.

Η ιστοπαθολογική εκτίμηση των

Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε χειρουργικά δείγματα (αντί για το φρέσκο ​​βιοψία δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για CLE), με μία εξαίρεση, όταν ένα ενδοσκοπικό βιοψία χρησιμοποιήθηκε από έναν ασθενή ο οποίος αρνήθηκε χειρουργική επέμβαση. Τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν σε 4% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για τη συνήθη παραφίνη ενσωμάτωση και τομής ως 4 μm πάχους τομές. (Στήριξη Πληροφορίες S1).

Από κάθε μπλοκ, μια διαφάνεια χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη ηωσίνη για παθολογική διάγνωση, και οι επόμενες διαδοχικές τομές χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία για να απεικονίσει το αντιγόνο CD31. Εν συντομία, μετά σε φούρνο μικροκυμάτων σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ = 6), ως μέθοδος ανάκτησης αντιγόνου, οι τομές ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 1% για να εξουδετερωθεί το ενδογενούς υπεροξειδάσης. Για να εμποδίσει τις μη ειδική αντιγονικές θέσεις, τα δείγματα αποκλείστηκαν για 30 λεπτά σε 2% αποβουτυρωμένο γάλα (Bio-Rad, München, Germany) και το πρώτο αντίσωμα επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C (αντι-CD31, αντι-ποντικού -ανθρώπινη, IgG1, κλωνοποιήσει JC70A, Dako, Glostrup, Denmark, αραιωμένο όπως 1:100 σε PBS με 1% BSA). Την επόμενη ημέρα, τα πλακίδια πλύθηκαν, το σήμα από το πρώτο αντίσωμα ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση πολυμερικό σύστημα (EnVision Dako, Redox, Βουκουρέστι, Ρουμανία), και στη συνέχεια να ανιχνεύεται με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη – DAB (Dako) . Όλα τα στάδια έκπλυσης έγιναν σε 1χ ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Μετά από χρώση με αιματοξυλίνη, τα πλακίδια coversliped και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse 55I μικροσκόπιο (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) σε συνδυασμό με ένα MP κάμερα 5 χρώμα CCD (Nikon) και ένα σταθμό ανάλυσης εικόνας (Image λογισμικού ProPlus AMS, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA).

Τέσσερις εικόνες από τις υψηλότερες περιοχές πυκνότητα αγγειακή συνελήφθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες φωτισμού και με στόχο 40x για κάθε περίπτωση, και αρχειοθετούνται ως εικόνες ασυμπίεστου TIFF. Μια γραφίδα σχεδιασμού χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιάσετε τα περιγράμματα των πλοίων (όπως απεικονίζονται από την χρώση DAB) στην Εικόνα πακέτο λογισμικού ProPlus. Όλες αυτές οι περιοχές ενδιαφέροντος (ROI που) ήταν ψευδο-χρωματισμένα σε μαύρο και μετράται αυτόματα ως το σύνολο των αγγειακών περιοχών και συνολική αγγειακή αριθμοί ανά 40x περιοχή, μετά την οποία τα αποτελέσματα ήταν κανονικοποιούνται για 1 mm

2 περιοχές. Όλες οι τελικές μετρήσεις χρησιμοποιούνται οι μέσες τιμές για όλες τις εικόνες που συλλαμβάνονται από την κάθε περίπτωση και ιστοπαθολογικά προφίλ.

Στατιστική Ανάλυση

Οι μετρήσεις μορφομετρικών ελήφθη στο ImageJ εξήχθησαν για την ανάλυση δεδομένων στο Microsoft Office Excel (Microsoft , Redmond, Washington, USA). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Όλες οι μετρούμενες παράμετροι σκάφος θεωρήθηκαν ότι προέρχονται από μια κανονική κατανομή όπως προηγουμένως [9], [10], και ως εκ τούτου στατιστικές διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών αγγείων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student, και ρ-τιμές ≤0.05 θεωρήθηκαν να είναι στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Ομοεστιακή Laser Endomicroscopy

Η διαδικασία CLE έδωσε μια λεπτομερή παρατήρηση των παρακείμενων όγκων και τομές φυσιολογικού βλεννογόνου με ορατό σήμα φθορισμού (Εικ. 1). Τόσο τα φυσιολογικά και καρκινικά αιμοφόρα φαίνεται βασανιστική συνολικά αλλά δεν ήταν σαφές από την οπτική ανάλυση των εικόνων κατά πόσον υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών αγγείων ή αν η ελίκωση διατηρείται στο επίπεδο των μεμονωμένων αγγειακών θραυσμάτων.

Η μέση διάμετρος των σκαφών στα δείγματα όγκου (9.46 ± 0.4 μm) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι στο φυσιολογικό δείγμα (7.60 ± 0.3 μm, p = 0,0166) (Πίνακας 1). Παρομοίως, η πυκνότητα σκάφος ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ορθοκολικό καρκίνο (5541,05 ± 262,81 δοχεία /mm

3) από την κανονική του παχέος βλεννογόνο (3755,79 ± 194,96 δοχεία /mm

3, ρ = 0.0006).

σε αντίθεση με την οπτική αξιολόγηση, ο δείκτης στρεβλότητα και το μήκος του σκάφους δεν ήταν στατιστικά διαφορετικά μεταξύ της κανονικής (δείκτης στρεβλότητα ήταν 1,05 ± 0,016 και σκάφος μήκους ήταν 28.30 ± 3.27 μm) και καρκινικού ιστού (δείκτης στρεβλότητα ήταν 1.07 ± 0.008 και σκάφος μήκους 26,49 ± 3,18 μm) (Πίνακας 1). Η μέση αναλογία κόρη /μητέρα ήταν 1,15 ± 0,09 στην κανονική δείγμα και 1.21 ± 0.08 στα δείγματα του όγκου (ρ = 0,6531). Τα δεδομένα για κάθε ασθενή που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Αν και το μικρό μέγεθος του δείγματος, δεν υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ των ασθενών. Ως πιθανή εξαίρεση, σε ασθενή 2, οι τιμές για τις αναλογίες κόρη /μητέρα ήταν μεγαλύτερα από 1 τόσο ο όγκος και φυσιολογικά δείγματα και (1.53 και 1.46 αντίστοιχα), οι οποίες θα μπορούσαν να αντανακλούν μια ιδιαίτερα αγγειοποιημένου και ετερογενή αγγείωση αλλά κατά μέσο όρο πάνω από όλους τους ασθενείς, οι τιμές ήταν κοντά στο 1.

η

η ανοσοϊστοχημεία

για να δούμε αν τα σήματα σκάφος CLE συσχετίστηκαν με ιστολογικά δεδομένα, η διάμετρος των πλοίων και η πυκνότητα σκάφος ανιχνεύεται από CLE ήταν ποιοτικά σε σύγκριση με τα CD31-βάφονται τα σκάφη σε μια ιστολογική τομή από τον ίδιο ασθενή. Το αγγειακό περιοχή ήταν 8,19 ± 1,35% σε καρκίνο του παχέος εντέρου, σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στην κανονική βλεννογόνο, 3,17 ± 0,48% (p = 0,0084). Η MVD για τον ορθοκολικό φυσιολογικό βλεννογόνο και καρκινικών ιστών ήταν επίσης σημαντικά διαφορετικές (185.73 ± 33.21 /mm

2 και 309,28 ± 32,26 /mm

2 αντίστοιχα, p = 0,0280, Πίνακας 3).

Η

συζητήσεις και συμπεράσματα

Συνήθως, σε όγκο αγγειακές μελέτες η μικροαγγειακού περιγράφεται μόνο από τα σημεία διάμετρο του αγγείου και την πυκνότητα του άποψη, διότι αυτά τα χαρακτηριστικά μπορεί να μετρηθεί από την ιστολογική φέτες. Επίσης, έχουμε διενεργήσει ανοσοϊστοχημική μελέτη σε δείγματα μας, και λαμβάνονται παρόμοια αποτελέσματα με τη βιβλιογραφία (μεγαλύτερα MVD και αγγειακή περιοχή σε όγκους έναντι κανονικού ιστού) [9], [11], [12], [13]. Επιπλέον, αξιολογήσαμε περισσότερες παραμέτρους αγγείωσης από ογκομετρικής δείγματα, όπως το μήκος του πλοίου, ο δείκτης ελίκωση και ο λόγος κόρη /μητέρα, που μπορεί εύκολα να ποσοτικοποιηθεί με CLE λόγω μεγαλύτερο βάθος διείσδυσης του εντός του ιστού (έως 250 μm). Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση των κόρης /αναλογίες της μητέρας και του δείκτη στρεβλότητα σε ορθοκολικό καρκίνο αγγειακό σύστημα.

Ανατομικά, μικροαγγείων του όγκου είναι γενικά πιο διεσταλμένες, βασανιστική, και saccular με ακανόνιστα σχήματα της διασύνδεσης και της διακλάδωσης [ ,,,0],14]. Η υπερέκφραση κάποιων προ-αγγειογόνοι παράγοντες, όπως ο VEGF, οδηγεί σε σχηματισμό νέας αγγείωσης που είναι δομικά ανώμαλα σε μακροσκοπικές και μικροσκοπικές επίπεδα και γενικά θεωρείται ότι αυτές οι ανωμαλίες επιδεινώνονται καθώς ο όγκος συνεχίζει να αναπτύσσεται [15]. Κατά συνέπεια, η πυκνότητα μικροαγγείων αυξάνει βαθμιαία από χαμηλού βαθμού σε υψηλού βαθμού νεοπλασία με τον καρκίνο [16]. Ομοίως, στην παρούσα μελέτη έχουμε βρει μια σημαντικά υψηλότερη πυκνότητα των αγγείων και τη διάμετρο των αγγείων του όγκου.

Το μεγαλύτερο μέρος της βιβλιογραφίας δίνει μόνο μια ποιοτική ανάλυση για το μήκος του σκάφους και στρεβλότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Yuan et al. (1996) υπό τον όρο πρώιμες ενδείξεις ότι η εξουδετέρωση του όγκου των κυττάρων που προέρχονται από VEGF θα μπορούσε να αντιστρέψει μερικές από τις ανωμαλίες του μικροαγγειακού όγκου, όπως αγγειακή διάμετρο και στρεβλότητα [17]. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι ένας στρατηγική για την επιτυχή θεραπεία με αντι-αγγειογόνοι παράγοντες είναι να μειωθεί η ελίκωση των παθολογικών αιμοφόρων [18], η ποσοτική εκτίμηση είναι απαραίτητη. Σε γενικές γραμμές, αγγειακή στρεβλότητα αξιολογήθηκε από 2D εικόνες [19]. Προηγούμενη έρευνα ορίζεται διαφορετικά είδη ελίκωση πλοίων, ανάλογα με το μήκος του σκάφους και έδειξε ότι στρεβλότητα πλοίο και το μήκος είναι μεταβλητές σε όγκους [20]. Σε ομοεστιακό οπτικό τμήματα μας, τα κακοήθη αιμοφόρα αγγεία εμφανίστηκε πιο διεσταλμένες και περισσότερο βασανιστικό σε σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα. Είναι ενδιαφέρον, παρά την οπτική εξέταση, λάβαμε καμία στατιστική σημασία όταν υπολογίσαμε τους δείκτη του ελίκωση. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά το γεγονός ότι η βασανιστική εμφάνιση θα μπορούσε να δοθεί από τη μηχανική παραμόρφωση και το σύνολο καρκινικός ιστός μεγαλώνει και όχι μεμονωμένα θραύσματα αγγείων είναι βασανιστική. Μια πρόσφατη μελέτη τρισδιάστατη ποσοτικοποίηση δεν έδειξαν διαφορές σχετικά με ελίκωση και σκάφος μήκος μεταξύ τριχοειδών σε υγιείς και καρκινικούς ιστούς [21], ενώ ποσοτικές μελέτες σε τρισδιάστατο όγκους σε μετέπειτα στάδια της ανάπτυξης έδειξαν μείωση του μήκος του σκάφους [20], [ ,,,0],22], [23].

δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην αναλογία κόρη /μητέρας μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δίκτυο υποκαταστημάτων και οι τιμές είναι κοντά στο 1 (1,15 ± 0,09 έναντι 1,21 ± 0,08). Αυτή η παράμετρος προέρχεται από το δίκαιο του Murray για τη σύνδεση μεγάλων σκαφών στα μικρά σκάφη που εφαρμόζονται σε ορθοκολικό καρκίνο αγγειογένεση. νόμος του Murray, διαθέσιμο για ασύμμετρη καθώς και συμμετρικά συστήματα διακλάδωση, αναφέρει ότι ο κύβος της ακτίνας ενός γονέα σκάφους ισούται με το άθροισμα των κύβων των ακτίνων από τις κόρες και αναφέρεται στη βελτιστοποίηση της διαμέτρου των αιμοφόρων αγγείων και του όγκου του αίματος σύμφωνα με τις μεταβολικές απαιτήσεις [24]. Ένας περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι η κατεύθυνση της ροής του αίματος δεν είναι γνωστή, ως εκ τούτου, δεν μπορεί να καθοριστεί η ακριβής ονομασία της μητέρας σκάφους. Αυτό το κενό θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με το

in vivo

παρατήρηση της ροής του αίματος σε όγκους, χρησιμοποιώντας κλινικά ελεγμένα παραγόντων αντίθεσης.

Η χρησιμότητα χρησιμοποιώντας παραμέτρους μορφομετρικών ως βιοδείκτες θα μπορούσε να εξαρτηθεί από το στάδιο της ανάπτυξης του όγκου . Υπολογίσαμε τις μορφομετρικών παραμέτρων που μετρούν διαφορετικές πτυχές του παχέος μικροκυκλοφορίας του όγκου λαμβάνεται υπόψη μόνον Τ3 οργάνωσαν, και έως μετρίως διαφοροποιημένο καρκίνωμα (βαθμός G1-G2), χωρίς μετάσταση. Το 1997, ο Robert D. Κάρντιφ et al. υπολόγισε το δείκτη ελίκωση σε μια μελέτη βασίζεται σε ένα σύστημα μοντέλου όγκου μαστού ποντικού, χρησιμοποιώντας ιστολογία σε συνδυασμό με τη βοήθεια υπολογιστή έμβια μικροσκοπία και ποντικούς που έχουν εγχυθεί με FITC [25]. Θεώρησε αυτή η παράμετρος ένας προγνωστικός παράγοντας και απέδειξε ότι δεν ήταν στατιστικά σημαντική όταν συσχετίζονται με υψηλότερο μεταστατικό ρυθμό. Ομοίως, περαιτέρω μακροπρόθεσμες μελέτες σε μεγαλύτερες ομάδες ασθενών είναι απαραίτητη για να δούμε αν όλα μορφομετρικών παραμέτρων δείχνουν ισχυρή συσχέτιση με ορθοκολικό ταξινόμησης αδενοκαρκίνωμα και αν θα μπορούσαν να συσχετίζονται με το αποτέλεσμα της θεραπείας και την πρόγνωση.

Άλλα μεθοδολογία θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε μελέτες που ελέγχουν την επίδραση των αντι-αγγειογένεσης θεραπεία (π.χ. bevacizumab) σε αγγειακά διακλάδωση, ελίκωση και όγκο του δοχείου σε όγκους [8], [26].

Καθώς η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας εξαρτάται από την παρουσία ενός κατάλληλου όγκου παροχή αίματος για να εξασφαλιστεί χορήγησης φαρμάκων, «ομαλοποίηση» του δικτύου αγγειακού όγκου είναι επιθυμητή. Έτσι, αξιολογώντας τις διαφορές μεταξύ του μήκους του σκάφους, στρεβλότητα και διακλάδωση μοτίβα με CLE απεικόνισης και χρώση φρέσκια βιοψία θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό της cathegory των ασθενών που θα μπορούσαν να επωφεληθούν από την εισαγωγική αγγειογενετική θεραπεία. . [27]

Σήμερα, τρισδιάστατη ανακατασκευή συνεστιακή endomicroscopy λέιζερ αποτελεί πρόκληση [28] – [30]. Χρησιμοποιώντας CD 31 αντισώματα σημασμένα με φθορισμό με ένα φθορόχρωμα (Alexa Fluor 488) και CLE για την ταυτοποίηση των σκαφών από φρέσκα δείγματα βιοψίας, θα μπορούσαμε να εκτιμήσουμε το σχήμα τους, διακλάδωση χαρακτηριστικά και πυκνότητα. Δύο σημαντικά πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι ο μικρότερος χρόνος επεξεργασίας (μία ώρα έναντι αρκετές ώρες έως ημέρες) και δεν αντικείμενα από μονιμοποίηση του ιστού και την επεξεργασία για IHC. Μελλοντικές παρόμοιες μελέτες θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν πιο συγκεκριμένες δείκτες για νεοαγγειογένεσης όγκου σε σύγκριση με το panendothelial δείκτη που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη.

Μια άμεση σύγκριση των μορφομετρικών παραμέτρων μεταξύ CLE και IHC είναι δύσκολο και περιορισμένης σημασίας. Κάποιος θα πρέπει να συγκριθούν τα αποτελέσματα από το ένα τμήμα του ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη που χρησιμοποιούνται σε συμβατικές IHC για την κλινική διάγνωση, με τις πληροφορίες από το 3D στοίβα ολοκλήρου σε μία μόνο σάρωση CLE που αναλύθηκε στην παρούσα μελέτη. Ένα 2D slice δεν επιτρέπει την ακριβή μέτρηση του μήκους του σκάφους, ελικοειδές ή αναλογίες μητέρα /κόρη. Μια άλλη δυσκολία είναι ότι το αντίσωμα CD31 και τα στάδια επεξεργασίας του ιστού (φρέσκο ​​έναντι της σταθερής και εγκλεισμένα σε παραφίνη) είναι διαφορετικά μεταξύ των δύο χρώση τεχνικές, και είναι πιθανό να παραγάγουν διαφορετικές τιμές για την ίδια παράμετρο που οφείλονται σε διαφορές στις τεχνικές επεξεργασίας.

εν περιλήψει, κατά την τρέχουσα χειρόγραφο αποδείξαμε ότι η συνεστιακή endomicroscopy λέιζερ είναι εφικτό για τη μέτρηση περισσότερο αγγειακές παραμέτρους από φρέσκο ​​βιοψίες όγκων από μόνα τους συμβατικούς ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, έχουμε παρουσιάσει ένα πλαίσιο που συλλαμβάνει μερικά από τα βασικά χαρακτηριστικά του παχέος microvascularization καρκίνου, χρησιμοποιώντας μια αναπαραγόμενη μη επεμβατική τεχνική και στοχευμένες panendothelial δείκτες στα φρέσκα βιοψίες. Η επαλήθευση θα πρέπει να γίνει σε μελλοντικά πειράματα χρησιμοποιώντας endomicroscopy συνεστιακό λέιζερ

in vivo

με χειρισμό μορφολογία του όγκου μέσω διακυμάνσεις στην αγγείωση του όγκου. Υπό την προϋπόθεση νέοι παράγοντες αντίθεσης θα είναι κλινικά διαθέσιμη, το μέλλον

in vivo

χρήση CLE θα μπορούσε να οδηγήσει σε ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών με βάση τα μορφομετρικών χαρακτηριστικών των αγγείων του όγκου.

Τα αποτελέσματα είναι χρήσιμα για την περαιτέρω κατανόηση του παχέος ανάπτυξης του καρκίνου και τα κριτήρια επιλογής των ασθενών. Επιπλέον, όπως ορίζεται από Ehling J et al (2013), μη επεμβατική χαρακτηρισμό των αγγείων του όγκου οδηγεί σε καλύτερη κατανόηση των επιδράσεων της θεραπείας, βοηθά στη βελτιστοποίηση και να διαμορφώσετε τις θεραπευτικές παρεμβάσεις [8]. Τα αποτελέσματα εκτείνονται προηγούμενα ευρήματα σκοπιμότητας μας στην αξιολόγηση των νέων αγγειακών παραμέτρων, οι οποίες είναι σημαντικές στην αντιμετώπιση του καρκίνου, αλλά τα οποία είναι δύσκολο να μετρηθούν από ανοσοϊστοχημικές τμήματα (η σκάφη /mm

3, το μήκος του πλοίου, ο δείκτης του στρεβλότητα και ο λόγος μητέρα /κόρη). Έχουμε δείξει την αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου με τη σύγκριση των δύο κοινές χρησιμοποιούμενες παραμέτρους (διάμετρος σκάφος, πυκνότητα αγγείων) προς την παραδοσιακή ανοσοϊστοχημεία. Χρησιμοποιώντας την τεχνική απεικόνισης CLE για την ανάλυση της μικροαγγειακή αρχιτεκτονική 3D όγκων είναι κατάλληλο τόσο για ποσοτικές και ποιοτικές μετρήσεις αγγειογένεση in vivo και σε συνδυασμό με στοχευμένες αντισώματα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

ασθενούς χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημεία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091084.s001

(DOC)