Αφηρημένο

έχουν Ατομική βακτήρια και αλλαγές στη σύνθεση του microbiome έχουν συσχετιστεί με ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Για να διερευνηθεί αλλαγές στην microbiome σχετίζεται με από του στόματος μορφές καρκίνου, εμείς προφίλ καρκίνους και ανατομικά συμφωνημένα αντίπλευρο κανονικό ιστό από τον ίδιο ασθενή με αλληλούχιση 16S rDNA αμπλικόνια υπερμεταβλητής περιοχής. Σε δείγματα καρκίνου τόσο από την ανακάλυψη και την επόμενη ομάδα επιβεβαίωση, την αφθονία των

Firmicutes

(ιδιαίτερα

Streptococcus

) και

Ακτινοβακτηρίων

(ιδιαίτερα

Rothia

) μειώθηκε σημαντικά σε σχέση με ετερόπλευρη φυσιολογικά δείγματα από τον ίδιο ασθενή. Σημαντικές μειώσεις στην αφθονία αυτών φύλα παρατηρήθηκαν για την προ-καρκίνους, αλλά όχι κατά τη σύγκριση δειγμάτων από αντίπλευρο τόπων (γλώσσα και το δάπεδο του στόματος) από υγιή άτομα. Σταθμισμένο UniFrac κύριες συντεταγμένες ανάλυση βασίζεται σε 12 taxa διαχωρίζονται οι περισσότεροι καρκίνοι από άλλα δείγματα με μεγαλύτερο διαχωρισμό του κόμβου θετικών περιπτώσεων. Αυτές οι μελέτες αρχίζουν να αναπτύξει ένα πλαίσιο για την αξιοποίηση του στόματος microbiome για την παρακολούθηση του στόματος την ανάπτυξη του καρκίνου, την εξέλιξη και την επανάληψη

Παράθεση:. Schmidt, BL, Kuczynski J, Bhattacharya Α, Huey Β, Corby μμ, Queiroz ELS, κ.ά. . Muy-Teck Teh (2014) Αλλαγές στην Αφθονία του Στόματος μικροχλωρίδας συνδεδεμένων με τον καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10.1371 /journal.pone.0098741

Ελήφθη: 21 του Αυγ 2013? Δεκτές: 7 Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης, Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Schmidt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με την επιδίκαση ενός GS Τζούνιορ 454 αλληλουχίας τρέχει από τη Roche, το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων, το Εθνικό Κέντρο για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών, και το Γραφείο του διευθυντή, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, μέσω του πανεπιστημίου του Σαν Φρανσίσκο ( UCSF) – CTSI αριθμό επιχορήγηση UL1 RR024129, και μεμονωμένες ερευνητής από την επιχορήγηση του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (R01 CA131286, R21 CA 941 186 215) και το Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας (R01 DE019796). Το περιεχόμενό του είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του ΝΙΗ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η παραλαβή του βραβείο για αλληλούχιση από τη Roche, ένα εμπορικό χρηματοδότη, δεν μεταβάλλει τήρηση των συντακτών σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Ο Δρ Justin Kuczynski είναι υπάλληλος της δεύτερης Γονιδιώματος, Inc. απασχόληση του δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, ~ 22.000 Αμερικανοί έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του στόματος των οποίων το 90% είναι καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC). Η πενταετής επιβίωση, σε 40% δεν έχει βελτιωθεί τα τελευταία 40 χρόνια, και είναι ένα από τα χαμηλότερα από τα μεγάλα sites του καρκίνου, με αποτέλεσμα περισσότεροι άνθρωποι πεθαίνουν από καρκίνο του στόματος από το μελάνωμα, του τραχήλου της μήτρας ή των ωοθηκών καρκίνο στις ΗΠΑ. Παγκοσμίως υπάρχουν 350,000-400,000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο. Σε αντίθεση με τις περισσότερες άλλες ανατομικές περιοχές, οι οποίες έχουν μειωθεί σε συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στόματος αυξάνεται, ιδιαίτερα μεταξύ των νέων και των γυναικών [1], [2]. Οι κυριότεροι παράγοντες κινδύνου, ο καπνός και το αλκοόλ χρήση, δεν μπορεί να εξηγήσει τις αλλαγές στη συχνότητα, επειδή ο καρκίνος του στόματος και εμφανίζεται συνήθως σε ασθενείς χωρίς ιστορικό καπνού ή αλκοόλ έκθεσης [3]. Πρόσφατα, ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) έχει ταυτοποιηθεί ως αιτιολογικός παράγοντας για τον καρκίνο στοματοφαρυγγική, αλλά η μόλυνση HPV δεν είναι μια σημαντική συμβολή στο καρκίνο του στόματος, καθώς ο ιός βρίσκεται σπάνια σε αυτούς τους καρκίνους (2-4% των περιπτώσεων) [4] . Έτσι, οι συνεισφορές από άλλους, ενδεχομένως περιβαλλοντικούς παράγοντες μένει να βρεθεί.

Ένας ρόλος για βακτηριακή λοίμωξη στην πρόκληση ή την προώθηση του καρκίνου είναι γνωστό σε σχέση με τη σύνδεση των

Helicobacter pylori

με καρκίνο του στομάχου [5], και άλλων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της χοληδόχου κύστης, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και του προστάτη, έχουν συσχετιστεί με συγκεκριμένα βακτηριακές λοιμώξεις [6], [7], [8]. Είναι λογικό να ρωτήσει, ως εκ τούτου, εάν αλλαγές στη σύνθεση της κανονικής στοματικής κοιλότητας microbiome, που αποτελείται από περισσότερα από 600 διαφορετικά είδη βακτηρίων [9] και /ή χρόνια βακτηριακή μόλυνση θα μπορούσε να είναι προαγωγείς ή αίτια του καρκίνου του στόματος. Πράγματι, οι μεταβολές στην μικροβιακή κοινότητα συνήθως συνδέονται με οδοντικές ασθένειες όπως η περιοδοντική νόσος, η οποία είναι πιθανότατα ένα πολυμικροβιακή ασθένεια που χαρακτηρίζεται από έκφυση ορισμένων παθολογικών οργανισμών [10], και η χρόνια περιοδοντίτιδα έχει αναφερθεί ότι είναι ένας παράγοντας κινδύνου για στοματική προκακοήθη αλλοιώσεις και καρκίνους [11]. Αυξημένα επίπεδα και οι αλλαγές στη σύνθεση των βακτηρίων και μυκήτων μικροχλωρίδας της στοματικής κοιλότητας έχουν αναφερθεί σε συνδυασμό με από του στόματος προ-καρκίνους και καρκίνους [12]. Υπάρχει, ωστόσο, δεν υπάρχει συναίνεση μεταξύ εκθέσεις σχετικά με τον καρκίνο που σχετίζεται με αλλαγές στη στοματική microbiome. Αυτή η σύγχυση μπορεί να προκύψει επειδή οι πρώτες μελέτες περιορίστηκαν σε ανάλυση των σχετικά μικρό αριθμό γνωστών και καλλιεργήσιμων προφορική βακτηριακών ειδών [13], [14], και αργότερα μελέτες με τη χρήση μοριακών μεθόδων επικεντρώνεται σε συγκεκριμένα φύλα [15] ή κλωνοποιηθεί και η αλληλουχία μικρών αριθμοί των κλώνων ανά δείγμα [16], [17].

ανεξάρτητες μεθόδους Πολιτισμού, ιδιαίτερα εκείνες που απασχολούν την επόμενη γενιά αλληλουχίας της υπερμεταβλητής περιοχής του 16S υπομονάδας του ριβοσώματος, παρέχει ένα μέσο για πιο περιεκτικά και με ακρίβεια το προφίλ της microbiome στην υγεία και την ασθένεια [18]. Τέτοιες μελέτες του στόματος microbiome [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] αποκαλύψει , αφενός, ότι η υγιεινή του στόματος microbiome χαρακτηρίζεται από ένα σχετικά μικρό αριθμό των βακτηριακών φύλα (9-13), η πιο συχνά αναφερόμενη άφθονα φύλα είναι

Firmicutes

,

Πρωτεοβακτηρίων

,

Bacteroidetes

,

ακτινοβακτηρίων

, και

Fusobacteria

[16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. Από την άλλη πλευρά, η πλειοψηφία των ενδο-ατομική διακύμανση έχει αποδοθεί σε διαφορές σε είδος ή επίπεδο στελέχους [24].

Streptococcus

είναι πιο συχνά παρατηρείται να είναι το κυρίαρχο γένος στην υγιεινή του στόματος microbiome, και λιγότερο συχνά

Prevotella

,

Veillonella

,

Neisseria

, και

Haemophilus

κυριαρχούν προφορική microbiome ενός ατόμου [19], [24]. Διακύμανση παρατηρείται επίσης στην κοινότητα σύνθεση μικροβιακών βιοφίλμ σε κάθε ενδοστοματική ενδιαιτημάτων (

π.χ.

., Επιφάνεια του δοντιού, πλευρική και ραχιαία γλώσσας, κ.λπ.), πιθανότατα αντανακλώντας τις διαφορετικές ιδιότητες της επιφάνειας και μικροπεριβάλλοντα [21], [24].

για να διερευνήσουν σωστά πιθανές αλλαγές στη σύνθεση του στόματος microbiome στον καρκίνο του στόματος, ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο για τον έλεγχο διαφορών μεταξύ της στοματικής δευτερεύουσες τοποθεσίες και ενδο-ατομική διακύμανση. Επιπλέον, τα υψηλά ποσοστά υποτροπής και την επικράτηση του δεύτερου πρωτογενούς μορφές καρκίνου του στόματος υποστηρίξει την πρόταση που αναπτύσσουν αυτοί οι καρκίνοι από ένα πεδίο των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων, η έννοια της «σχηματισμός καρκίνου τομέα» [29]. Τέτοια πεδία έχουν αναφερθεί να επεκταθεί όσο 7 cm από έναν όγκο και να εμφανιστούν τα κλινικά φυσιολογικά [30]. Για τους λόγους αυτούς, ερευνήσαμε την προφορική καρκίνο που σχετίζεται με microbiome μη επεμβατικά δειγματοληψία της βλάβης του καρκίνου και ένα ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο περιοχή του φυσιολογικού ιστού από κάθε άτομο. Υποβάλλαμε DNA που απομονώθηκε από αυτά τα δείγματα σε ενίσχυση υπομονάδας ριβοσωμικού 16S και αλληλούχιση. Ο σκοπός αυτών των μελετών ήταν να αρχίσουν να τεθούν οι βάσεις που θα επιτρέψουν την εκμετάλλευση του στόματος microbiome για τη θεραπεία και την παρακολούθηση της έναρξης του καρκίνου του στόματος, της εξέλιξης και της επανάληψης.

Αποτελέσματα

Για να διερευνήσουν τις αλλαγές στην η στοματική microbiome σχετίζεται με καρκίνο του στόματος, εμείς προοπτικά συλλέγονται καρκίνου και ανατομικά συμφωνημένα ασθενής κλινικά φυσιολογικά δείγματα από πέντε ασθενείς (Πίνακας 1, Μελέτη 1 Discovery κοόρτης, Πίνακας S1). Για να επιβεβαιώσετε και να επεκτείνουν τις αρχικές μας παρατηρήσεις, πραγματοποιήσαμε μια δεύτερη μελέτη (Μελέτη 2, πίνακες S2 – S6, ο συνολικός αριθμός των δειγμάτων = 83), στην οποία προοπτικά συλλέγονται ένα ανεξάρτητο σύνολο του αλλοιωμένου και ανατομικά συμφωνημένα κλινικά φυσιολογικά δείγματα από καρκίνο του στόματος (Πίνακας 2, Μελέτη 2 κοόρτης Επιβεβαίωση, Πίνακας S2), καρκίνωμα

in situ

(CIS, Πίνακας S3) και ασθενείς προ-καρκίνου (Πίνακας S4), καθώς και από τις αριστερή και δεξιά πλευρά της πλευρικής γλώσσας και όροφο του στόματος υγιών φυσιολογικά άτομα (Πίνακας S5). Στη Μελέτη 2, συμπεριλάβαμε επίσης μια ανεξάρτητη ανάλυση των αρχικών πέντε ασθενείς με καρκίνο από την Μελέτη 1 και έξι ζευγάρια όμοια δείγματα (τρία τον καρκίνο και τρεις ασθενείς προ-καρκίνου, Πίνακας S6). Οι τελευταίοι είχαν συμπεριληφθεί στην αξιολόγηση επαναληψιμότητα της συλλογής και επεξεργασίας δείγματος και δεν είχαν συμπεριληφθεί σε καμία από τις αναλύσεις (βλέπε περαιτέρω συζήτηση στο Μέθοδοι).

Η

Μελέτη 1. Discovery ομάδα

επαλειφθεί το καρκίνο του στόματος αλλοίωσης και ένα αντίστοιχο ανατομικά συμφωνημένα κλινικά φυσιολογικά περιοχή ιστού από την ανακάλυψη κοόρτης από πέντε ασθενείς (Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας το όργανο Roche GS Τζούνιορ να εκτελέσει Pyrosequencing, πετύχαμε, σε ένα ενιαίο τρέξιμο, συνολικά 104.380 αλληλουχίες από αμπλικόνια που κράτησε την υπερμεταβλητή περιοχή V4 του βακτηριακού 16S μικρό υπομονάδας του ριβοσώματος (Πίνακας S7). Ο αριθμός των πρώτων ακολουθίας διαβάζει ποικίλη από & gt? 10 φορές σε όλη δείγματα, που κυμαίνονται από 1231 έως ένα μέγιστο 17.682 ακατέργαστου διαβάζει. Ποιότητα φιλτράρεται ακολουθίες αναζητήθηκαν με τη βάση δεδομένων αναφοράς Greengenes του 16S αλληλουχιών, συγκεντρωμένα σε 97%, και Επιχειρησιακή Ταξινομική Μονάδων (Otus) έχουν εκχωρηθεί ταξινομική χρήση Bayesian ταξινομητή mothur του. Από τις 92.987 αλληλουχίες που πέρασαν ποιότητα φιλτραρίσματος, 81.308 ήταν παρόμοια με τα γνωστά βακτήρια και οι περισσότεροι θα μπορούσε να χαρακτηριστεί στο επίπεδο γένος (65037) με λιγότερες ταξινομούνται σε επίπεδο είδους (17115). κάλυψη ακολουθία ήταν μεταβλητή σε όλη δείγματα? ο αριθμός των διαβάζει ανά δείγμα ανατεθεί Otus (εξαιρουμένων εκείνων που φιλτράρονται λόγω κακής ποιότητας ή έλλειψη που σχετίζονται ακολουθία στη βάση δεδομένων αναφοράς Greengenes) κυμαινόταν από 1.038 έως ένα μέγιστο των 14.359, και περιελάμβανε 76-85% των πρώτων σειρών (Πίνακας S7 ). Εντοπίστηκαν συνολικά 276 Otus (ανά εύρος δείγματος, 37-161, (Πίνακας S8). Ανάλυση Αραίωση πραγματοποιείται σε επίπεδο οικογένειας έδειξε ένα αρκετά ευρύ φάσμα α διαφορετικότητας με τον αριθμό των διαπιστωμένων οικογένειες που κυμαίνονται από ~15-28 (Σχήμα .. S1a) Τρεις δείγματα ασθενών, η κανονική και καρκίνου από τον ασθενή 117 και το φυσιολογικό δείγμα από 142 ασθενών, σταθεροποιήθηκε σε λιγότερες οικογένειες από τα άλλα δείγματα, υποδεικνύοντας κάπως μειωμένη ποικιλομορφία σε αυτά τα δείγματα Όλα τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε κάποιο βαθμό, αν και όχι εντελώς? περαιτέρω αλληλουχίας θα ήταν πιθανόν να αποκαλύπτουν επιπλέον οικογένειες. από την άλλη πλευρά, Pyrosequencing θόρυβος και τα σφάλματα PCR θα μπορούσε λανθασμένα να αυξήσει τους αριθμούς OTU [31]. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε επίπεδο γένους (Σχήμα S1b).

η ποικιλομορφία των microbiomes σχετίζεται με ανατομικά συμφωνημένα τον καρκίνο του στόματος και φυσιολογικά δείγματα

Η Otus των καρκινικών και κλινικά φυσιολογικά δείγματα στην ομάδα Discovery ταξινομήθηκαν σε 12 φύλα (Πίνακας S7). Η πλειοψηφία ανήκε σε μία από τις πέντε φύλα (99,2%, η κανονική , 98,0% των καρκίνων) με την πιο άφθονη φύλα είναι

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Πρωτεοβακτηρίων

,

Fusobacteria

, και

ακτινοβακτηρίων

(Πίνακας 7, Σχήμα 1). Αν και η διανομή σε καρκίνο και κλινικώς φυσιολογικά δείγματα αυτών των πέντε κοινών φύλα ποικίλλει μεταξύ των ατόμων (Σχήμα 1), σε όλους τους ασθενείς, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της αφθονίας των

Firmicutes

και

Ακτινοβακτηρίων

στον καρκίνο σε σύγκριση με το ανατομικά συμφωνημένα αντίπλευρο κλινικά φυσιολογικό δείγμα ασθενούς, (ρ = 0.004, FDR ρυθμίστηκε ρ = 0,02 και ρ = 0,028, FDR ρυθμίστηκε ρ = 0,07, αντίστοιχα). Παρατηρήσαμε επίσης ότι το ποσοστό του

Fusobacteria

αυξήθηκε σε όλους τους ασθενείς, αλλά η αλλαγή στην αφθονία δεν έφθασε στατιστική σημασία (ρ = 0,074, Σχήμα 2). Σημειώνουμε, ωστόσο, ότι για να παρατηρήσει συνεπής αλλαγές στην αφθονία των τριών φύλα σε αυτή τη μικρή ομάδα είναι εξαιρετικά σημαντική. Αγνοώντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των σχετικές αφθονίες των διαφόρων φύλα, ένα διωνυμικό αποδόσεις δοκιμή p = 0,0022 ως η πιθανότητα (κάτω από την μηδενική υπόθεση) έχουν τρία ή περισσότερα φύλα, όπου (και οι πέντε ασθενείς μοιράζονται αύξηση) ή (όλα τα πέντε μερίδιο μείωση).

Η σχετική κατανομή των φύλα (τοις εκατό των αλληλουχιών) δείχνεται για κάθε δείγμα ασθενούς με κλινικά φυσιολογικά δείγματα εμφανίζονται μαζί στην κορυφή και τον καρκίνο δείγματα στον πυθμένα

Η

(α – ε. ) σχετική αφθονία του κάθε ένα από τα πέντε πιο άφθονα φύλα σε καρκίνους σε σύγκριση με κλινικώς φυσιολογικά δείγματα από καθένα από πέντε ασθενείς. Σημειώστε, ότι τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε διαφορετικές κλίμακες, γεγονός που αντικατοπτρίζει την αφθονία των φύλα. Τα μεγέθη των μεταβολών σε αφθονία είναι σαφώς μεγαλύτερο από το θόρυβο στατιστική καταμέτρηση, όπως υποδεικνύεται από τις εκτιμήσεις μπαρ σφάλμα, οι οποίες βασίζονται στην τετραγωνική ρίζα του πραγματικού αριθμού των διαβάζει. (Στ) Μεταβολή σχετική αφθονία φαίνεται ως η διαφορά σε αφθονία από φύλα σχετίζονται με καρκίνους σε σύγκριση με ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο κλινικά φυσιολογικά δείγματα. Σε καρκίνους, μειώνεται στη σχετική αφθονία των

Firmicutes

και

Ακτινοβακτηρίων

παρατηρήθηκαν σε όλους τους ασθενείς, ενώ η σχετική αφθονία των

Fusobacteria

ήταν αυξημένα σε καρκίνους από όλους τους ασθενείς.

η

Μελέτη 2. επιβεβαίωση ομάδα

Για να επιβεβαιώσει αυτές τις αρχικές παρατηρήσεις, πραγματοποιήσαμε Μελέτη 2. Όπως και πριν, θα απολυμαίνεται τόσο η βλάβη (καρκίνος ή προ-καρκίνου) και ετερόπλευρη ανατομικά κλινικά φυσιολογικά συμφωνημένα ιστοσελίδα. Εμείς απολυμαίνεται τα αριστερή και δεξιά πλευρά της πλευρικής γλώσσας και του εδάφους του στόματος των υγιών ατόμων. Χρησιμοποιώντας το όργανο Illumina MiSeq, εμείς αλληλουχία αναδιπλασιασμού που καλύπτει την υπερμεταβλητή περιοχή 16S rDNA V4. Έχουμε λάβει 4.486.196 πρώτες ακολουθία διαβάζει με μια σειρά από 31.109 έως 125.847 διαβάζει ανά δείγμα μετά την αφαίρεση των δύο δείγματα που απέτυχαν στη αλληλουχίας (Πίνακες S9 – S13). Εμείς ανατεθεί ταξινομική στο Otus όπως και πριν. Από τις αλληλουχίες που πέρασαν ποιότητα φιλτραρίσματος, 4.444.432 ήταν παρόμοια με τα γνωστά βακτήρια και οι περισσότεροι θα μπορούσε να χαρακτηριστεί στο επίπεδο γένος (4.148.785) με λιγότερες ταξινομούνται σε επίπεδο είδους (1.650.037). Εμείς εντόπισε συνολικά 2.107 Otus (ανά εύρος δείγματος, 90-482, πίνακες S9 – S13). ανάλυση αραίωση έδειξε ένα αρκετά ευρύ φάσμα α ποικιλομορφία με όλα σχεδόν τα δείγματα πλατό σε κάποιο βαθμό (Εικόνα S2). Όπως συζητήθηκε παραπάνω, ο θόρυβος αλληλουχίας και PCR σφάλματα μπορεί να αυξήσει τους αριθμούς OTU [32].

πολυμορφίας της microbiomes σχετίζονται με ανατομικά αντίστοιχα δείγματα από καρκίνο του στόματος, προ-καρκίνου και υγιή φυσιολογικά άτομα στη Μελέτη 2

Θα καθοριστεί, πρώτον, ότι τα δεδομένα που συλλέγονται σε εννέα από τα δείγματα 10 Discovery Cohort που είχαν επιτυχία προφίλ στη Μελέτη 2 (Πίνακας S9) έχουν υψηλή συσχέτιση με τα αρχικά δεδομένα που λαμβάνονται από 454 Pyrosequencing (Σχήμα S3). Στη συνέχεια εξέτασε το Cohort Επιβεβαίωση αποτελούνται μόνο από δείγματα από ασθενείς με καρκίνο που δεν περιλαμβάνονται στο Discovery Cohort,

δηλαδή

., Αποκλείσαμε τα δείγματα ομάδα εννέα Discovery (Πίνακας 2, Πίνακας S9). Εμείς πάλι διαπίστωσε ότι η πλειοψηφία των Otus (61-100%) ανήκε σε ένα από τα πέντε πιο άφθονη φύλα (

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Πρωτεοβακτηρίων

,

Fusobacteria

, και

ακτινοβακτηρίων

) (Σχήμα 3α, Πίνακας S14). Στη συνέχεια ρώτησε αν υπήρχαν σημαντικές μειώσεις στην αφθονία του

Firmicutes

και

Ακτινοβακτηρίων

στον καρκίνο σε σύγκριση με το ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρη κλινικά φυσιολογικό δείγμα ασθενούς. Πράγματι, όπως είχαμε παρατηρήθηκε στην ομάδα Discovery (Μελέτη 1), υπήρξε μια σημαντική μείωση σε αφθονία από αυτά τα δύο φύλα σε καρκίνους σε σύγκριση με τα ανατομικά συμφωνημένα αντίπλευρου κλινικά φυσιολογικά δείγματα ασθενών (ρ = 0,042 και ρ = 0,004, αντίστοιχα), επιβεβαιώνοντας την αρχική μας παρατηρήσεις (Σχήμα 3b, Εικόνα S4).

(α) Παρίσταται η σχετική κατανομή των φύλα (τοις εκατό των αλληλουχιών). Για καρκίνους, συμπεριλάβαμε μόνο ασθενείς για τους οποίους τόσο ο καρκίνος και αντίπλευρο κλινικά φυσιολογικά δείγματα ήταν διαθέσιμα. (Β) Μεταβολή σχετική αφθονία των φύλα παρουσιάζεται ως η διαφορά στην αφθονία των φύλα που σχετίζονται με καρκίνους ή προ-καρκίνους σε σύγκριση με ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρη κλινικά φυσιολογικά δείγματα. Για υγιή φυσιολογικά δείγματα, συγκρίναμε αριστερά και δεξιά πλευρά του πλευρικού γλώσσας ή δάπεδο του στόματος.

Η

Στη Μελέτη 2, παρατηρήσαμε επίσης ότι η πλειοψηφία των Otus σε δείγματα από ασθενείς προ-καρκίνου και υγιής φυσιολογικά (Σχήμα 3α) ανήκε σε ένα από τα πέντε φύλα

Firmicutes

,

Bacteroidetes

,

Πρωτεοβακτηρίων

,

Fusobacteria

, και

Ακτινοβακτηρίων

(προ-καρκίνοι = 99-100%, υγιή φυσιολογικό = 87-100%). Εμείς πάλι ρώτησε αν σημαντικές μειώσεις στην αφθονία των

Firmicutes

και

Ακτινοβακτηρίων

θα μπορούσε επίσης να είναι παρόντες κατά τη σύγκριση προ-καρκίνου και ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο κλινικά φυσιολογικά δείγματα ασθενών. Κάναμε βρείτε ότι η αφθονία του

Firmicutes

και

Ακτινοβακτηρίων

μειώθηκε (p = 0,048 και p = 0,037, αντίστοιχα), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να συμβεί νωρίς τις αλλαγές στην αφθονία αυτών των δύο φύλα (Σχήμα 3β ). Αντιθέτως, δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην αφθονία των δύο αυτών φύλα ή οποιοδήποτε από τα πέντε πιο άφθονη φύλα κατά τη σύγκριση των αριστερή και δεξιά πλευρά της πλευρικής γλώσσας και του εδάφους του στόματος υγιών κανονικών ατόμων (σχήμα 3β).

για να διερευνήσουν τις αλλαγές σε αφθονία σε επίπεδο γένους για τα πέντε πιο άφθονη φύλα, θεωρήσαμε ασθενών αντίστοιχα δείγματα από το Επιβεβαίωση Colson και περιλαμβάνονται επίσης τέσσερις από τις περιπτώσεις πέντε Discovery Cohort που είχαν επιτυχία αναλύονται στη Μελέτη 2 (14 καρκίνους από 13 ασθενείς, Πίνακας S9). Εμείς κανονικοποιήθηκαν τον αριθμό των Otus ένα εκατομμύριο απαριθμήσεις, (Πίνακας S15) και για κάθε φύλο, προσδιορίσαμε μεταβολές στην αφθονία των γενών που αντιπροσώπευε & gt? 10% Otus σε περισσότερες από 20% των δειγμάτων (Σχήμα S5 και S6). Σημαντική μείωση σε αφθονία παρατηρήθηκε για

Streptococcus

(p = 0,003) και

Rothia

(p = 0,021) σε καρκίνους σε σχέση με ανατομικά συμφωνημένα κλινικά φυσιολογικά δείγματα (Πίνακας S16). Αντιθέτως, παρατηρήσαμε αυξημένη αφθονία του

Fusobacterium

(p = 0.044) σε σχέση με συμφωνημένα κλινικά φυσιολογικά δείγματα από τους ασθενείς με καρκίνο. Στην προ-καρκίνους, παρατηρήσαμε σημαντικά μειωμένη αφθονία

Streptococcus

(p = 0,042) (Πίνακας S16). Εμείς δεν βρήκε σημαντικές διαφορές σε αφθονία από αυτά τα πιο κοινά γένη κατά τη σύγκριση αφθονία σε δείγματα που λαμβάνονται από την αριστερή και δεξιά πλευρά της πλευρικής γλώσσας και του εδάφους του στόματος των υγιών ατόμων (Πίνακας S16).

Σημειώνεται, επίσης, ότι αν και δεν βρήκε συνεπής αλλαγές στην αφθονία του

Bacteroidetes

όταν συγκρίνονται μέσα σε ιδιώτες (σχήμα 3β), τα δείγματα από καρκίνο και προ-καρκίνο ασθενείς (και οι δύο βλάβη και ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο κλινικά φυσιολογικό ιστό) σχετίστηκαν με αυξημένη αφθονία του

Bacteroidetes

σε σύγκριση με δείγματα από υγιείς φυσιολογικά άτομα (Σχήμα 3α).

Prevotella

είδη, ιδίως, διέφεραν και περιλαμβάνονται, για παράδειγμα, Otus που αντιστοιχεί στο

P. intermedia

,

P. melaninogenica

,

P. nanceiensis

,

P. Oris

,

P. tannerae

και αταξινόμητη είδη (Σχήμα S5, Πίνακας S15). Αυξημένα επίπεδα του

P. melaninogenica

έχουν αναφερθεί προηγουμένως ως πιθανή σιελογόνων βιοδείκτη του καρκίνου του στόματος [33] και

P. ενδιάμεση

είναι μια περιοδοντική παθογόνο [34]. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να κατανοήσουν τις εισφορές των γενικών (

Bacteroidetes

) και αλλοίωση-συγκεκριμένες αλλαγές (

Ακτινοβακτηρίων

,

Firmicutes

) στην microbiome του καρκίνου του στόματος και προ -cancer ασθενείς.

Otus διακριτικό καρκίνου από ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρη δείγματα ασθενή κανονική

για να αντιμετωπιστεί η ανάγκη για βιοδείκτες για την πρόβλεψη της συμπεριφοράς των στοματικών καρκίνων που θα μπορούσε να προσδιοριστεί με μη επεμβατικές εξετάσεις, ζητήσαμε αν τα δείγματα καρκίνου θα μπορούσε να διακριθεί με βακτηριακή σύνθεση. Λαμβάνοντας υπόψη τον καρκίνο /κανονική ζεύγη δειγμάτων, εντοπίσαμε 11 Otus από το φύλα

Ακτινοβακτηρίων

(

Actinomyces

και

Rothia

, 2 Otus από κάθε γένος) και

Firmicutes

(

Streptococcus

, 7 Otus) τα οποία μειώθηκαν σημαντικά σε καρκίνους και μία OTU από την συνομοταξία

Fusobacteria

(

Fusobacterium

) που αυξήθηκε σε καρκίνους σε σύγκριση με ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο φυσιολογικά δείγματα ασθενών (Πίνακας S17). Σταθμισμένο UniFrac κύριες συντεταγμένες ανάλυση (PCoA) με βάση αυτό το σύνολο των Otus διαχωρίζονται οι περισσότεροι καρκίνοι από την κανονική και προ-καρκίνου δείγματα με πέντε από τα επτά λεμφαδένων θετικές περιπτώσεις που σχηματίζουν μια σφιχτή συστάδα στην κάτω δεξιά γωνία του οικοπέδου (Σχήμα 4). Μετάσταση στους τραχήλου (αυχένα) λεμφαδένες είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας του καρκίνου του στόματος επιβίωσης των ασθενών [35]. Η σημερινή έλλειψη αξιόπιστων μεθόδων για την αξιολόγηση του κινδύνου των αποτελεσμάτων μεταστάσεων σε ασθενείς που συνήθως υποβάλλονται σε πρόσθετη χειρουργική επέμβαση για την αφαίρεση των λεμφαδένων, έστω και αν η πλειοψηφία δεν θα επωφεληθούν από τη διαδικασία. Η σφιχτή ομαδοποίηση των δειγμάτων από τον κόμβο θετικούς ασθενείς στο Σχήμα 4 δείχνει ότι αλλαγές στη σύνθεση του στόματος microbiome καρκίνου μπορεί επίσης να κρατήσει την υπόσχεση ως σχετιζόμενα με όγκο βιοδείκτη του κινδύνου μετάστασης.

PCoA βασίζεται σε σταθμισμένη απόσταση UniFrac μεταξύ δείγματα δεδομένη την αφθονία των 12 Otus. Άξονας 1 (PCoA1): 54% της διακύμανσης εξήγησε. Άξονας 2 (PCoA2): 24% της διακύμανσης εξήγησε. N0 και N + δείχνουν την κομβική κατάσταση του ασθενή με καρκίνο, N0 = node αρνητικό, N + = node θετική. ελέγχου του καρκίνου και τον έλεγχο προ-καρκίνου είναι ετερόπλευρη κλινικά φυσιολογικά δείγματα ασθενών. Άλλα δείγματα προσδιορίζει από υγιή φυσιολογικά άτομα

Η

Όλη micrbiome -. Β ποικιλομορφία

Για να διερευνήσουν δείγμα προς δείγμα ανομοιότητας, εμείς subsampled τα δεδομένα από τυχαία επιλογή 31.109 αλληλουχίες από κάθε κοινότητα να προσαρμόσει τις αποκλίσεις σε βάθος αλληλουχίας (Πίνακας S18). Κατά την εξέταση των τριών δειγμάτων ομάδες (καρκίνοι, Υγιεινή Φυσιολογικά, και προ-καρκίνου), παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές microbiome για την ταυτότητα του ασθενούς βασίζεται σε δύο σταθμισμένο UniFrac (αφθονία) και αστάθμιστος UniFrac (παρουσία /απουσία) μετρήσεις (Πίνακας S19, Σχήματα S7 και S8). Κανένα άλλο συγκρίσεις, όπως αριστερά εναντίον δεξιά, τον αριθμό των ακολουθιών ή βλάβης (καρκίνος ή προ-καρκινική) έναντι του ελέγχου κανονικές θέσεις αποκάλυψε σημαντικές διαφορές. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με άλλες μελέτες που έχουν καταδείξει τις διαφορές μεταξύ των ατόμων στην προφορική microbiome [24]. Περαιτέρω, υποστηρίζουν το σχεδιασμό της μελέτης μας, η οποία μετρά τις αλλαγές στην microbiome μέσα σε ιδιώτες,

δηλαδή

., Χρησιμοποιώντας κάθε ασθενή ως δικό του έλεγχο.

Συζήτηση

Για να μελετήσει στόματος κακοήθεια που σχετίζεται με αλλαγές microbiome, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη Discovery καρκίνους (Μελέτη 1), στην οποία εμείς μη επεμβατικά δειγματοληψία και ετερόπλευρο κλινικά δείγματα φυσιολογικού ιστού από κάθε άτομο. Σύγκριση της σύνθεσης των μικροβιακών κοινοτήτων στο πλαίσιο των ασθενών εντοπίζονται αλλαγές στην αφθονία των

Ακτινοβακτηρίων

και

Firmicutes

. Εμείς επιβεβαίωσε αυτές τις παρατηρήσεις σε ένα δεύτερο Επιβεβαίωση Cohort (Μελέτη 2) και περαιτέρω διαπίστωσε σημαντικές αλλαγές στην αφθονία του

Ακτινοβακτηρίων

γένους

Rothia

και το

Firmicutes

γένους

Streptococcus

κατά την εξέταση όλων των καρκίνων στη Μελέτη 2 (Πίνακας S16). Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε δει μια σημαντική αλλαγή στην αφθονία της συνομοταξία

Fusobacteria

είτε στο Discovery ή Κοόρτεις Επιβεβαίωση, είχαμε βρει μια σημαντική αύξηση σε αφθονία του

Fusobacteria

γένους,

Fusobacterium

κατά την εξέταση όλων των ασθενών με καρκίνο στη Μελέτη 2. Σημειώνουμε ότι, ενώ οι ομάδες των ασθενών που μελετήθηκαν εδώ είναι μικρές και ετερογενείς, τα ευρήματά μας σχετικά με την αφθονία των φύλα είναι παρόμοια με δημοσιευμένες μελέτες, οι οποίες επικεντρώθηκαν στην ολοκληρωμένη ανάλυση της στοματικής microbiome. Επιπλέον, η χρήση διαφορετικών τεχνολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας για τη μέτρηση της αφθονίας των 16S rDNA αμπλικονίων στις μελέτες 1 και 2 υποστηρίζει την ευρωστία των παρατηρήσεών μας. Παρ ‘όλα αυτά, ακόμη μεγαλύτερες μελέτες θα πρέπει να βοηθήσει να προσδιορίσει καλύτερα τις προφορικές καρκίνου που συνδέονται αλλαγές σε αφθονία αυτών των φύλα και γένη. Επιπλέον, παρατηρήσαμε αλλαγές στην αφθονία των

Firmicutes

(

Streptococcus

) σε συνδυασμό με από του στόματος προ-καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στοματική βλάβη που σχετίζεται αλλαγές στη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας μπορεί να συμβεί στις αρχές του στόματος την ανάπτυξη του καρκίνου και /ή την εξέλιξη του καρκίνου του κήρυκα.

το κάπνισμα αποτελεί παράγοντα κινδύνου για ασθένειες του στόματος, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και της περιοδοντίτιδας. Μελέτες απέδειξαν ότι οι επιπτώσεις του καπνίσματος η σύνθεση των βακτηριακών κοινοτήτων στην στοματική κοιλότητα, συμπεριλαμβανομένων, για παράδειγμα, το σιελογόνο microbiome των υγιών καπνιστών και μη καπνιστών [36] και τις υποουλικής microbiomes των ασθενών με περιοδοντική νόσο [37], καθώς και ως το σχηματισμό πλάκας βιοφίλμ [38]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε κανένα στοιχείο της συνολικής διαφορές στις microbiomes που θα μπορούσαν να αποδοθούν στο κάπνισμα, αλλά με μόνο τρεις τρέχοντες καπνιστές και τέσσερα μη-καπνιστές στον καρκίνο ομάδες ασθενών μας, για παράδειγμα, δεν μπορούμε να βγάλουμε συμπεράσματα σε αυτό το διάστημα. Από τη μία πλευρά, επειδή χρησιμοποιείται κάθε ασθενή ως δικό του /ελέγχου της, εμείς δεν θα περιμένουμε να δούμε το κάπνισμα σχετίζεται διαφορές στην αφθονία της μικροχλωρίδας που σχετίζεται με τον καρκίνο, δεδομένου ότι το κάπνισμα θα επηρεάσει τόσο το χώρο ελέγχου και τον καρκίνο. Από την άλλη πλευρά, σε καπνιστές, τα κύτταρα στις κλινικώς φυσιολογικά θέσεις και οι καρκίνοι ανταποκρίνονται μου διαφορετικά στο κάπνισμα μεταβολές που προκαλούνται στο σχηματισμό βιομεμβράνης, για παράδειγμα, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι, ενώ ο καρκίνος σχετίζεται μεταβολές στην αφθονία της μικροχλωρίδας σε καπνιστές και μη-καπνιστές φαίνονται παρόμοια, ο σχηματισμός και λειτουργικές συνέπειες των αλλοιωμένων microbiomes μπορεί να διαφέρουν σε αυτές τις ομάδες ασθενών. Παρόμοιες σκέψεις θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα.

Η παρουσία των βακτηρίων σε μορφές καρκίνου του στόματος ή /και διαφορές στις βακτηριακές κοινότητες που σχετίζονται με τον καρκίνο του στόματος, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν με τη χρήση είτε εξαρτάται από τον πολιτισμό [13], [14] ή μοριακή μεθόδους [15], [16], [17], δεν υπάρχουν ακόμη συνεπής παρατηρήσεις έχουν αναφερθεί σε αυτές τις μελέτες. Είναι, ωστόσο, δύσκολο να γίνουν συγκρίσεις ακόμα και μεταξύ δύο πρόσφατες μελέτες αναφέρουν την αφθονία των βακτηρίων [16], [17] και τη μελέτη αυτή, λόγω των διαφορών στην (α) τον τύπο του δείγματος (επίχρισμα, αυτή η μελέτη εναντίον δείγμα ιστού [16] [17]), (β) θέση στοματικής κοιλότητας, (γ) πηγή ασθενούς συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα ελέγχου (ανατομικά συμφωνημένα ετερόπλευρο κλινικά φυσιολογικά, η παρούσα μελέτη, ανώτερης αναπνευστικής οδού βλεννογόνου [16], παρακείμενο φυσιολογικό [17]), (d ) ενισχυμένης περιοχής του γονιδίου 16S ριβοσωμικού (V4, η παρούσα μελέτη, V4-V5 [16] ή V1-V4 [17]), (ε) μεθοδολογία (Sanger [16], [17] έναντι Pyrosequencing ή MiSeq, αυτή η μελέτη ), και (στ) τον αριθμό των κλώνων ή αλληλουχία διαβάζει εκχωρηθεί σε Otus ανά δείγμα (μέσος όρος 8.000 και 55.000 διαβάζει ανά δείγμα, Μελέτη 1 και 2, αντίστοιχα, σε σύγκριση με -90 ή -250 κλώνους ανά δείγμα [16], [17] ). Για παράδειγμα, Pushalkar και οι συνεργάτες του [16] αναφορά σε 10 ασθενείς, διαπίστωσε ότι το 75 και το 80% των κλώνων (κανονικό και τον καρκίνο, αντίστοιχα) διατέθηκαν για τη συνομοταξία

Firmicutes

. Το ποσοστό αυτό είναι όχι μόνο υψηλότερο από το 40-0% αναφέρθηκαν σε άλλες μελέτες της στοματικής κοιλότητας των υγιών ή καρκίνο ασθενείς, αλλά δεδομένου ότι μόνο -90 κλώνοι αλληλουχήθηκαν ανά δείγμα, υπάρχουν πολύ λίγοι κλώνοι να προσδιορίσει αξιόπιστα σχετική αφθονία άλλων φύλα για συγκρίσεις. Μια ανάλυση επίπεδο συνομοταξία μόνο το 16 γλώσσα, το δάπεδο του στόματος και της στοματικής κοιλότητας καρκίνων που αναφέρθηκαν από Bebek και οι συνεργάτες του [17], ωστόσο, αποκάλυψε ο καρκίνος σχετίζεται αύξηση της αφθονίας του συνομοταξία

Fusobacteria

, σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας, αλλά μειώθηκε αφθονία

Streptococcus

δεν μπορούσε να δει, όπως λίγοι κλώνοι εκχωρηθεί σε αυτό το γένος.

δεν μπορούμε να διακρίνουμε αν οι παρατηρούμενες μεταβολές στην μικροβιακή κοινότητα αντανακλά το γεγονός ότι ορισμένα βακτήρια είναι πιο κατάλληλο να τηρούν και να αναπτυχθούν στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου ή αν έχουν καρκίνο προώθηση. Επιπλέον, δεν είναι σαφές πώς να σταθμίσει τις πιθανές συνεισφορές από τις αλλαγές στην αφθονία γένη όπως

Streptococcus

σε σύγκριση με το λιγότερο άφθονο

Ακτινοβακτηρίων

γένη. Πιθανοί ρόλους για τα βακτήρια και τους μύκητες σε προαγωγή καρκίνου περιλαμβάνουν παραγωγή των καρκινογόνων ουσιών, όπως νιτροζαμίνη ή άλλων προ-καρκινογόνες χημικές ουσίες, χρόνια φλεγμονή και άμεσες επιδράσεις στην σηματοδότηση σε επιθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα ενισχυμένο πολλαπλασιασμό ή καταστολή της απόπτωσης [6], [7] [12], [39]. Μόνο μια μειοψηφία του στόματος μικροβιακή κοινότητα μπορεί να προσκολληθεί σε σκληρά και μαλακά ιστών του στόματος, και συναρμολόγηση του συγκροτήματος του στόματος βιοφίλμ επιτυγχάνεται με την επακόλουθη προσκόλληση της δευτεροβάθμιας αποικιοκράτες.

Streptococcus

είναι ένα πρώιμο οικιστή και

Fusobacterium

(

π.χ.

.,

F. Nucleatum

) έχει μια τάση για συν-συσσωμάτωσης με πολλά γένη, σχηματίζοντας μια γέφυρα ανάμεσα στις αρχές και τα τέλη αποικιοκράτες στη στοματική βιοφίλμ [40]. Έτσι, από τη μία πλευρά, η παρατηρούμενη μείωση στην επικράτηση του

Streptococcus

και αυξημένη αφθονία του

Fusobacterium

γένη σε προ-καρκίνους θα μπορούσε να αντανακλά τις αλλαγμένες ιδιότητες της επιφάνειας των καρκινικών κυττάρων και στρώμα, το οποίο θα μπορούσε πλέον να υποστηρίξει την πρόσφυση του

στρεπτόκοκκοι

. Από την άλλη πλευρά, μπορούμε να υποθέσουμε ότι μετατοπίσεις σε αφθονία αυτών των δύο γενών θα μπορούσε να οδηγήσει σε βελτιωμένη προ-φλεγμονωδών περιβάλλον, δεδομένου ότι

Streptococcus

είδη έχουν αναφερθεί ότι εξασθενεί

Fusobacterium nucleatum

Induced pro -inflammatory αποκρίσεις των επιθηλιακών κυττάρων του στόματος [41], [42]. Σημειώνουμε επίσης ότι

Fusobacterium nucleatum

καλλιεργείται ως βιοφίλμ είναι σε θέση να εισβάλλουν οργανοτυπικές καλλιέργειες [43], και, δεύτερον, ότι ο οργανισμός έχει πρόσφατα αναφερθεί σε καρκίνους του παχέος εντέρου [44], [45], υποστηρίζοντας περαιτέρω ένα δυνητικό ρόλο στον καρκίνο του στόματος.

Η στοματική κοιλότητα προσφέρει μια σχετικά μοναδική ευκαιρία για τη διαλογή σε άτομα κινδύνου για (από το στόμα) του καρκίνου, διότι οι βλάβες μπορεί να δει κανείς, και όπως αναφέρουμε εδώ, η μετατόπιση στην microbiome του τα καρκινικά και προκαρκινικών βλαβών σε σύγκριση με ανατομικά συμφωνημένα κλινικά φυσιολογικό ιστό από το ίδιο άτομο μπορεί να ανιχνευθεί σε μη επεμβατικά συλλέγονται δείγματα μάκτρο. Το σάλιο είναι ένα άλλο μη επεμβατικά συλλέγονται από το στόμα δείγμα αποτελείται κυρίως από βακτηριακά κύτταρα, αλλά επίσης να ρίξει τα επιθηλιακά και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού.