Αφηρημένο

Ιστορικό

LIM και SH3 πρωτεΐνη 1 (LASP-1) είναι μια ειδική πρωτεΐνη εστιακής προσκόλλησης που είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε πολυάριθμες βιολογικές και παθολογικές διαδικασίες. LASP-1 υπερέκφραση έχει περιγραφεί σε διάφορους τύπους καρκίνων, αλλά η έκφραση και ο ρόλος του στην σαφή καρκινικών κυττάρων νεφρικών κυττάρων (ccRCC) παραμένει άγνωστη.

Μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, αναλύσαμε LASP- έκφραση 1 πρωτεΐνης σε 216 clinicopathologically χαρακτηριζόμενη περιπτώσεις ccRCC. Επίσης εξετάσαμε την έκφραση LASP-1 σε 20 ζεύγη ιστούς ccRCC και σε 2 κυτταρικές σειρές με πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδος Western. Χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA, μελετήσαμε τις συνέπειες της εξάντλησης LASP-1 στη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Οι στατιστικές αναλύσεις που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ LASP-1 επίπεδα, τα χαρακτηριστικά του όγκου και την έκβαση των ασθενών.

Αποτελέσματα

LASP-1 υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε ιστούς ccRCC (

P

& lt? 0,0001) σε σύγκριση με το ανοσοενισχυτικό nontumorous ιστούς, και τα επίπεδα έκφρασης του ήταν συσχετίζεται στενά με τη συνολική επιβίωση και την επιβίωση χωρίς υποτροπή (

P

= 0,044 και 0,006, αντίστοιχα) σε ασθενείς με ccRCC. RNA παρεμβολής μεσολάβηση αποσιώπηση του γονιδίου LASP-1 σε κύτταρα 786-0 ccRCC ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι LASP-1 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα προγνωστικό βιοδείκτη για τους ασθενείς ccRCC και μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο για τη θεραπεία της ccRCC

Παράθεση:. Yang F, Zhou Χ, Du S, Zhao Υ, Ren W, Ντενγκ Q, et al. (2014) ΕΑΥ και SH3 επικράτεια πρωτεΐνης 1 (LASP-1) Η υπερέκφραση συνδέθηκε με την επιθετική φαινότυπο και κακή πρόγνωση σε Clear κυττάρων καρκίνο νεφρού. PLoS ONE 9 (6): e100557. doi: 10.1371 /journal.pone.0100557

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 21 Μαρτίου του 2014? Αποδεκτές: 23, Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα αρχεία CEL είναι διαθέσιμα από GEO

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα Clear κυττάρων νεφρικών κυττάρων (ccRCC) είναι μια κοινή ουρολογική κακοήθεια σε όλο τον κόσμο [1]. Αν και τεράστια βελτίωση έχει σημειωθεί στην αντιμετώπιση της ccRCC κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, το ποσοστό θνησιμότητας των ccRCC παραμένει σε υψηλά επίπεδα, διότι το 40% των ασθενών που υποβάλλονται σε ccRCC νεφρεκτομή θα αναπτύξουν τοπική υποτροπή ή μετάσταση [2]. Ως εκ τούτου, αξιόπιστη προγνωστικούς βιοδείκτες απαιτούνται επειγόντως για να προβλέψει το αποτέλεσμα και τον εντοπισμό θεραπευτικοί στόχοι για την θεραπευτική αγωγή ασθενών ccRCC.

LIM και SH3 πρωτεΐνη 1 (LASP-1) έχει καταδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και εξέλιξης [3], [4]. LASP-1 ταυτοποιήθηκε αρχικά από μία βιβλιοθήκη cDNA των μεταστάσεων του καρκίνου του μαστού, και το γονίδιο χαρτογραφήθηκε σε ανθρώπινο χρωμόσωμα 17q21 [5], [6]. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη LASP-1 περιέχει 261 αμινοξέα με ένα Ν-τερματικό τομέα LIM, που ακολουθείται από δύο περιοχές πρόσδεσης ακτίνης στον πυρήνα της πρωτεΐνης LASP-1 που διαμεσολαβούν την αλληλεπίδραση μεταξύ LASP-1 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης στη θέση της επεκτάσεις κυτταρική μεμβράνη, αλλά όχι κατά μήκος της ακτίνης ίνες στρες [7] – [10]. Ο τομέας SH3 στο Ο-άκρο εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με σύνδεση προς πλούσια σε προλίνη αλληλουχίες, ειδικά zyxin, pallidin, λίπωμα προτιμώμενων εταίρος (LPP) και αγγειοδιασταλτικό διεγείρεται φωσφοπρωτεΐνη (VASP) [6], [11] . LASP-1 εντοπίζεται σε πολλαπλές τοποθεσίες του συνέρχεσθαι δυναμική της ακτίνης, όπως η εστιακή επαφές, εστιακές συμφύσεις, βολάν μεμβράνη ελασματοπόδια και ψευδοπόδια [12], [13], αλλά τα ακριβή καθήκοντα του LASP-1 δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή.

LASP-1 έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου και μεταστατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όπως είναι ο καρκίνος του μαστού [14], τον καρκίνο των ωοθηκών [4] και του παχέος εντέρου [15]. Επιπλέον, LASP-1 σίγηση σε μεταστατικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές είχε σαν αποτέλεσμα μια ισχυρή αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης, και οδήγησε σε μειώσεις zyxin στις εστιακές επαφές [4]. Είναι ενδιαφέρον,

in vitro

αποσιώπηση της LASP-1 γονιδίου μείωσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό εντοπισμού zyxin [3]. Επιπλέον, η γονιδιακή μεταμόλυνση μεσολαβούμενη LASP-1 υπερέκφραση σε κύτταρα SW480 CRC οδήγησε σε επιθετικά καρκινικά κύτταρα και να προωθούνται ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [15]. Ωστόσο, οι ρόλοι των LASP-1 σε ccRCC δεν έχουν περιγραφεί.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση της LASP-1 σε ccRCC χρησιμοποιώντας δείγματα ιστών ανθρώπινου ccRCC και κυτταρικές σειρές, και αξιολόγησε τη συσχέτιση μεταξύ LASP-1 έκφρασης και ccRCC αποτέλεσμα μετά την εκτομή. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε παρεμβολή RNA (RNAi) μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση του LASP-1 σε κύτταρα ccRCC να διερευνηθεί ο ρόλος του LASP-1 σε ccRCC εισβολή

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Δύο εκατόν δεκαέξι δείγματα νεφρική όγκου και των παρακείμενων nontumorous ιστούς τους ελήφθησαν από ασθενείς με ccRCC που υποβλήθηκαν σε ριζική ή μερική νεφρεκτομή στο Τμήμα Ουρολογίας Χειρουργικής, Xijing Νοσοκομείο, τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο από τον Αύγουστο του 2005 έως τον Σεπτέμβριο του 2010. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε από την μετεγχειρητική παθολογική ανάλυση. Οι ασθενείς με ιστορικό κακοήθειας και σε εκείνους που είχαν λάβει προηγουμένως εισαγωγική θεραπεία εξαιρέθηκαν από την παρούσα μελέτη. Κανένας ασθενής δεν είχε ανιχνεύσιμο μακρινή μετάσταση σε χειρουργική επέμβαση. Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελούνταν από 82 γυναίκες και 134 άνδρες (μέση ηλικία, 63 ετών? Εύρος ηλικίας, 18-82 ετών). Στην παρούσα μελέτη, οι κλινικές και παθολογικά χαρακτηριστικά καταγράφηκαν. Χρησιμοποιώντας το σύστημα σταδιοποίησης 2010 TNM και τον χαρακτηρισμό βαθμού Fuhrman, οι όγκοι ταξινομούνται στις ακόλουθες ομάδες για τις στατιστικές αναλύσεις: πρώιμο στάδιο (TNM1 και TNM2), προχωρημένο στάδιο (TNM3 και TNM4), χαμηλής ποιότητας (βαθμού 1 και 2) και υψηλής ποιότητας (βαθμού 3 και 4). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών που ανακτώνται από τα ιατρικά αρχεία συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα παρακολούθησης ελήφθησαν μέσω τηλεφώνου, e-mail, ή η κλινική βάση δεδομένων εξωτερικών ασθενών. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν από την ημερομηνία της αρχικής χειρουργικής επέμβασης είτε μέχρι το θάνατο ή την ημερομηνία λήξης της παρούσας μελέτης (30 Νοέμβρη, 2013). Υποτροπή ανιχνεύθηκε σε 127 ασθενείς (58,7%) κατά την τελευταία εξέταση παρακολούθησης, και 46 ασθενείς (31,0%) είχαν πεθάνει λόγω ccRCC που σχετίζονται με τη νόσο. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 49,3 μήνες (εύρος, 1-67 μήνες).

Η

Για τις αναλύσεις πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδας Western, με ένα σύνολο 20 ζεύγη καρκινικών ιστών και συμφωνημένα δίπλα nontumorous ιστοί συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία ccRCC χειρουργική επέμβαση στην Ουρολογική Κλινική Χειρουργικής, Xijing Νοσοκομείο, τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο μεταξύ Μαρτίου και Ιουνίου, 2013. Οι 20 ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν 12 άνδρες και 8 γυναίκες, με μέση ηλικία τα 61 έτη (εύρος, 21-79 έτη). Μετά την εκτομή, τα φρέσκα ιστοί καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Τόσο ο όγκος και nontumourous ιστοί επαληθεύεται από την ιστοπαθολογική εξέταση.

Η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμόλη και συνήθως σε επεξεργασία για εμβάπτιση σε παραφίνη. Τομές ιστού (πάχους 5-μm) βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και εξετάσθηκαν από δύο παθολόγους να καθορίσουν τα καρκινικά και τα αντίστοιχα notumorous ιστούς. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη σε τομές όγκων εγκλεισμένους σε παραφίνη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι LASP-1 (1:200, Abcam, Cambridge, UK) μετά από ανάκτηση αντιγόνου. Ένας αρνητικός έλεγχος χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα παρασκευάστηκε για όλα τα δείγματα. Ο μέσος ρυθμός έκφρασης LASP-1 αξιολογήθηκε με τον έλεγχο τουλάχιστον 5 μικροσκοπικά πεδία στα 400 × μεγέθυνση. LASP-1 έκφραση θεωρήθηκε αρνητική όταν & lt? 10% των καρκινικών κυττάρων στα μικροσκοπικά πεδία καταδειχθεί ανοσοχρώση, και τα πλακίδια εξετάστηκαν για δεύτερη φορά για να μειωθεί η ανάγνωση σφάλμα

Κυτταρικές σειρές

.

Η κυτταρική γραμμή 786-0 ανθρώπινη ccRCC λήφθηκε από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που είχε συμπληρωθεί με 10% FBS. Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ccRCC Α498 ελήφθη από Tiancheng Technology Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης για χρήση στα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω.

Real-time PCR

Ολικό RNA από όγκο και nontoumorous ιστούς των ασθενών 20 ccRCC εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε σε 20-μΙ σύστημα αντίδρασης με 2 μα του συνολικού RNA που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, Madison, Wisconsin, USA) για να συνθέσει πρώτου κλώνου cDNA σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή, που ακολουθείται από ενίσχυση του cDNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν για PCR πραγματικού χρόνου για LASP-1 ήταν: (F) 5′-ATGAACCCCAACTGCGCC-3 ‘και (R) 5′-TCAGATGGCCTCCACGTAGTT-3’

Western Blot

.

η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από όγκο και nontoumorous ιστούς έξι ασθενείς ccRCC χρησιμοποιώντας συνολικής πρωτεΐνης Extraction Kit (KeyGen, Nanjing, Κίνα). 30 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας 12% δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδίνιο. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι LASP-1 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) ή β-ακτίνης (1:5000, Abcam, Cambridge, UK) σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση τέσσερις φορές σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20, η μεμβράνη ανιχνεύτηκε με ένα υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (1:2000, Proteintech Group, Chicago, Illinois, USA).

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) μεσολάβηση LASP-1 γονίδιο αποσιώπηση

η έκφραση της ανθρώπινης LASP-1 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας siRNA διπόλων, όπως την παρακάτω ακολουθία: 5′-AAGGTGAACTGTCTGGATAAG-3 ‘, 5’-CUUAUCCAGACAGUUCACCdTdT-3 ‘. Αρνητικός έλεγχος siRNAs (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘και 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) στοχεύει άγνωστες αλληλουχίες mRNA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Όλα τα siRNAs συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Μια αναζήτηση BLAST του ανθρώπινου γονιδιώματος επαλήθευσε ότι οι επιλεγμένες αλληλουχίες ήταν ειδικά για τα γονίδια-στόχους. Τα κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξης απλώθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 0,5 × 10

5 κύτταρα /ml, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και επιμολύνθηκαν με 1 μα siRNA μόλις έφθασαν 30-50% συρροή σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Φλουορεσκεΐνη (FAM) -επισημασμένο αρνητικό siRNA ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει την αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης.

In vitro

μετανάστευσης ανάλυση

Τα κύτταρα σε μέσο ελεύθερο ορού (1 × 10

5 κύτταρα /200 μΙ) προστέθηκαν στην αρχή θαλάμους των θαλάμων μέγεθος πόρων Transwell 8-μm (Corning Star, Cambridge, Massachusetts, USA). Οι κάτω θάλαμοι παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας 10% FBS ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω των πορωδών μεμβρανών για 20 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει μέσω της μεμβράνης και να κολλήσει με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα διάλυμα στερέωση /χρώσης (0.1% κρυσταλλικό ιώδες, 1% φορμαλίνη και 20% αιθανόλη) για οπτικοποίηση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο σε πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία κάτω από ένα μικροσκόπιο Nikon ECLIPS 80i στο μεγέθυνση 400 ×. Τουλάχιστον πέντε θαλάμους από τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

Το 19,0 λογισμικό IBM SPSS Statistics χρησιμοποιήθηκε για να διεξάγει όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Διαφορές μεταξύ κατηγορηματικές μεταβλητές αναλύθηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας ένα τεστ chi-τετράγωνο, ενώ ποσοτικές μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Wilcoxon ζεύγη ή μη ζευγαρωμένα

t-τεστ

. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλογικών κινδύνων κατά Cox αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των επιπτώσεων των διαφόρων παραγόντων στην πρόγνωση. Μια ανάλυση Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η επιβίωση και η log-rank τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση της επιβίωσης των ασθενών μεταξύ των υποομάδων. Όλα

P

τιμές ήταν δύο όψεων, και

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

LASP-1 υπερέκφραση σε RCC ιστούς ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας IHC

Για να αποσαφηνιστεί η υποκείμενη ρόλο της LASP-1 στην εξέλιξη της RCC, εξετάσαμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του LASP-1 χρησιμοποιώντας IHC σε 216 καρκινικών ιστών και συμφωνημένα δίπλα nontumorous ιστούς. Βρήκαμε ότι LASP-1 έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά στους ιστούς του όγκου σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενων nontumorous ιστούς (

P

& lt? 0,0001? Σχήματα 1Α, Β και C).

LASP-1 έκφραση της πρωτεΐνης σε ιστούς παραφίνης ccRCC (Α) και των παρακείμενων ιστών nontumorous (Β) χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (μεγέθυνση, 100 Χ), στις οποίες θετικά LASP-1 ανοσοχρώση έδειξε καφέ χρώμα. Wilcoxon ανάλυση έδειξε ότι οι ιστοί του όγκου έδειξε σημαντικά υψηλότερες LASP-1 έκφραση από nontumorous ιστούς (C, η = 216). κηλίδας Western (D) και PCR πραγματικού χρόνου (Ε, n = 20) αναλύσεις επιβεβαίωσαν τα ευρήματα στην ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε επίσης διαφορική έκφραση LASP-1 σε ανθρώπινα embrynal νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ-293) και κυτταρικές σειρές ccRCC (F). Τ αναφέρεται σε ιστούς όγκων, ενώ P αναφέρεται σε peritumor (nontumorous) ιστούς στον πίνακα Δ

Η

Επαλήθευση των διαφορικών LASP-1 έκφρασης χρησιμοποιώντας Western blot και σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις σε ιστούς και κυτταρικές σειρές

Για να επαληθεύσετε τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την IHC, ανιχνεύσαμε την έκφραση LASP-1 σε 6 ιστούς ccRCC και συμφωνημένα δίπλα nontumorous ιστούς τους (σχήμα 1Δ). Τα αποτελέσματα επίσης αποκάλυψε αυξημένη έκφραση LASP-1 σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με nontumorous ιστούς. Real-time PCR στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε 20 ιστούς ccRCC και αντιστοιχισμένο nontumorous ιστούς, και τα επίπεδα LASP-1 mRNA βρέθηκαν επίσης να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ιστούς όγκων (Σχήμα 1 Ε). Επιπλέον, έχουμε διαπιστώσει ότι LASP-1 εκφράστηκε σε 2 ccRCC κυτταρικές σειρές και τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ-293) με χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται στα δείγματα των ιστών, τα υψηλότερα επίπεδα LASP-1 ανιχνεύθηκαν στο πιο επιθετική κυτταρική γραμμή (786-0) από ό, τι στην κυτταρική σειρά χαμηλής επιθετικά (Α498) ή κύτταρα ΗΕΚ-293 (Σχήμα 1 F).

Αυξημένη έκφραση LASP-1 συσχετίστηκε με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση σε ασθενείς ccRCC

οι συσχετίσεις μεταξύ LASP-1 έκφραση και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-τετράγωνο. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1, σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ LASP-1 έκφρασης και τέσσερις κλινικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους του όγκου (

P

= 0,002), το στάδιο TNM (

P

= 0,005), η επανεμφάνιση κατάσταση (

P

= 0,006) και το θάνατο κατάστασης (

P

= 0,026). Η σχέση μεταξύ Fuhrman βαθμού και LASP-1 έδειξε οριακής σημασίας (

P

= 0,081). Ωστόσο, δεν υπήρχαν στατιστικά συσχετίσεις μεταξύ LASP-1 έκφρασης και οι υπόλοιπες παράμετροι, όπως η ηλικία και το φύλο.

Στη συνέχεια χρησιμοποιείται μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική Cox παλινδρόμησης αναλύσεις για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ LASP 1-έκφραση και το αποτέλεσμα στην ασθενείς ccRCC. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση (Πίνακας 2), το μέγεθος του όγκου, Fuhrman βαθμού, στάδιο TNM και LASP-1 προς τα πάνω ρύθμιση συσχετίζονταν σημαντικά με κακή συνολική επιβίωση (

P

= 0.034, & lt? 0,0001, & lt? 0,0001 και = 0.003 , αντίστοιχα) και επιβίωσης χωρίς υποτροπή (

P

= 0,005, & lt? 0,0001, & lt? 0,0001 και & lt? 0,0001, αντίστοιχα) σε ασθενείς ccRCC. Στη συνέχεια, οι τέσσερις παράγοντες που συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με αποτέλεσμα (

P

& lt? 0,05) στην μονοπαραγοντική ανάλυση υποβλήθηκαν σε μία ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι Fuhrman βαθμό, το στάδιο TNM, και LASP-1 προς τα πάνω ρύθμιση ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για τη συνολική επιβίωση (

P

= 0,001, & lt? 0,0001 και 0,044, αντίστοιχα) και επιβίωσης χωρίς υποτροπή (

P

= 0.002, 0.010 και 0.006, αντίστοιχα) σε ασθενείς ccRCC (Πίνακας 3). Επιπλέον, η ανάλυση της καμπύλης Kaplan-Meier έδειξε επίσης ότι LASP-1 προς τα πάνω ρύθμιση ήταν σημαντικά σχετίζεται με φτωχότερη έκβαση σε ασθενείς ccRCC (Εικόνα 2Α και Β).

Η

Η

LASP-1 αποσιώπηση ανέστειλε τη μετανάστευση ccRCC κυττάρων

in vitro

η

siRNA επιμόλυνση χρησιμοποιήθηκε για την νοκ ντάουν έκφραση LASP-1 σε 786-0 κύτταρα, τα οποία εμφανίζονται υψηλά ενδογενή έκφραση LASP-1. Οι επιδράσεις του siRNA διαμόλυνση επί LASP-1 έκφραση επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Η ποσότητα της πρωτεΐνης LASP-1 προφανώς μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 3Α). Περαιτέρω, transwell δοκιμασία εισβολή αποκάλυψε ότι αποσιώπηση έκφραση LASP-1 μειώθηκε δραματικά την κινητικότητα των κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχήμα 3C). Μια μη ζευγαρωμένα

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ 786-0 και si786-0 κύτταρα στον αριθμό των εισέβαλαν κυττάρων ανά πεδίο (Σχ. 3Β), η οποία αποκάλυψε ότι ο αριθμός των εισέβαλαν κυττάρων ανά πεδίο μειώθηκε σημαντικά μετά την νοκ ντάουν της LASP-1 (

P

& lt? 0.0001).

κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση knock-down της LASP-1 έκφρασης σε 786-0 κύτταρα με siRNA διαμόλυνση (Α). Μη ζευγαρωμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν οι διαφορές στον αριθμό των κυττάρων ανά εισέβαλαν πεδίο μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 786-0 και si786-0 (Β). Τα αποτελέσματα φρεατίων για τις κυτταρικές γραμμές 786-0 και si786-0 εμφανίζονται (C).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση LASP-1 σε μια σειρά 216 ιστούς ccRCC και σύγκριση αυτών των δεδομένων με αυτά που ελήφθησαν σε κλινικά εγκατεστημένος ccRCC για πρώτη φορά. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του LASP-1 ήταν υψηλότερες σε ιστούς ccRCC ό, τι στα ζεύγη nontumorous ιστούς, όπως υποδεικνύεται από IHC και επικυρωθεί χρησιμοποιώντας στύπωμα western και σε πραγματικό χρόνο PCR. αναλύσεις Association αποκάλυψε ότι LASP-1 προς τα πάνω ρύθμιση συσχετίστηκε με μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου και χειρότερα στάδιο ΤΝΜ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LASP-1 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ccRCC. Περαιτέρω προγνωστικές αναλύσεις έδειξαν ότι LASP-1 υπερέκφραση μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας πρόγνωση σε ccRCC. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες με μεγάλα μεγέθη δείγματος που απαιτείται για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα και να καθορίσει το ρόλο του LASP-1 στην πρόβλεψη της πρόγνωσης των ασθενών με ccRCC.

Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ότι η υψηλή LASP-1 έκφρασης σε καρκίνους είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, στην εξέλιξη και τη μετάσταση [16]. Κύτταρα με υψηλή έκφραση LASP-1 εμφανίζεται ισχυρότερη ζωτικότητα και ήταν περισσότερο επιρρεπή σε σχηματισμό μεταστατικών αλλοιώσεων λόγω της ενισχυμένης ικανότητάς τους για να σχηματίσουν κλώνους [17]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι αποσιώπηση έκφραση LASP-1 σε μαστού, κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών και του παχέος οδηγεί σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση [4], [14], [15]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των μελετών αυτών, τα αποτελέσματα της παρούσας

in vitro

πειράματα σε κυτταρικές γραμμές ccRCC υποδεικνύουν ότι LASP-1 έκφραση είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των κυττάρων.

Ο μηχανισμός με τον οποίο LASP- 1 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και μετανάστευση παραμένει ασαφής. μετανάστευση των κυττάρων και η ελεγχόμενη συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση των συμφύσεων είναι εξαιρετικά ολοκληρωμένες διαδικασίες πολλαπλών σταδίων και των κεντρικών χαρακτηριστικών στη μοριακή παθολογία των καρκίνων [18]. Μέχρι σήμερα, έχουν πάνω από 50 διαφορετικές πρωτεΐνες προσκόλλησης που ρυθμίζουν το ρυθμό και την οργάνωση του πολυμερισμού της ακτίνης και το εστιακό του κύκλου εργασιών πρόσφυση σε προεξοχές έχουν εντοπιστεί [19], [20]. LASP-1 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με λίπωμα προτιμώμενο συνεργάτη (LPP) και zyxin, δύο από τα οποία μπορούν να επηρεάσουν τη δυναμική του νήματος ακτίνης [21]. Η πρόσδεση λαμβάνει χώρα μεταξύ του C-τερματικό πεδίο SH3 του LASP-1 και Ν-τερματικών πλούσια σε προλίνη πεδία των zyxin και LPP [4]. Zhao

et al

. Έχει αναφερθεί ότι η γονιδιακή μεταμόλυνση μεσολαβούμενη LASP-1 υπερέκφραση σε κύτταρα SW480 CRC οδήγησε σε επιθετικό φαινοτύπους σε καρκινικά κύτταρα και να προωθηθούν ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [15]. Αυτή η παρατήρηση υπογραμμίζει τη σημασία της LASP-1 σε καρκίνο.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι LASP-1 μεταγραφικά ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση της μορφογόνο Sonic Hedgehog [22]. Η διακοπή του καταρράκτη σηματοδότησης Hedgehog οδηγεί σε μια σειρά από αναπτυξιακές διαταραχές και παίζει βασικό ρόλο στο σχηματισμό μιας σειράς ανθρώπινων καρκίνων. Στο πλαίσιο αυτό, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι zyxin έχει επίσης ταυτοποιηθεί ως διαφορικά μεταγράφεται γονιδίου σε διάφορους τύπους καρκίνων χρησιμοποιώντας τεχνολογία μικροσυστοιχιών [15]. Grunewald

et al

. Έχει αναφερθεί ότι η LASP-1 υπερέκφραση μεσολαβεί ανθρώπινη μετανάστευση ωοθηκών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και επιρροές zyxin εντοπισμός [4]. Zyxin εντοπίζεται κυρίως στο εστιακό πλάκες πρόσφυση και παίζει κεντρικό ρόλο στον πολυμερισμό νήμα ακτίνης σε κύτταρα θηλαστικών. Zyxin φίμωση στα HeLa κύτταρα οδηγεί σε σημαντικά μείωση του σχηματισμού ακτίνης ινιδίων του στρες, ενώ σύμφωνα με κυκλική τέντωμα, zyxin διασπάται μόνο από εστιακές επαφές και συσσωρεύεται στον πυρήνα, χωρίς να επηρεάζει βινκουλίνης ή ακτίνη νημάτων [6]. Η μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων μετά LASP-1 σίγηση μπορεί να εξηγηθεί από την λειτουργική απώλεια του zyxin ως πρωτεΐνη σκαλωσιά που διευκολύνει τον σχηματισμό μοριακών συμπλοκών, προωθώντας έτσι site-specific ακτίνης [8]. Στην παρούσα μελέτη, γκρέμισε έκφραση LASP-1 στην κυτταρική γραμμή 786-0 και παρατηρήθηκε μικρή ικανότητα μετανάστευσης in vitro, η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών.

Συμπεράσματα

Συνοψίζοντας, παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ότι LASP-1 αυξορρυθμίζεται ccRCC, υπονοώντας ότι σημαντικός ρόλος της στην ανάπτυξη της ccRCC. LASP-1 υπερέκφραση συνδέθηκε με μεγαλύτερους όγκους και επιθετική φαινοτύπων σε ccRCC, και αποσιώπηση των LASP-1 ανέστειλε τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Ως εκ τούτου, LASP-1 μπορεί να είναι μία νέα προγνωστικός βιοδεικτών και ένα υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για ccRCC.