Αφηρημένο

Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις προβλέψει την ανταπόκριση στη θεραπεία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη σχέση μεταξύ αυτών των δύο κοινές γενετικές αλλοιώσεις. Μικρο-RNAs (miRNAs), μια κατηγορία των μη κωδικεύουσας RNA που εμπλέκονται σε κυτταρικές διαδικασίες, έχουν όλο και περισσότερο συνδέεται με

KRAS

και

TP53

. Υποθέσαμε ότι η θανατηφόρα-7α (ας-7α) miRNA ρυθμίζει

KRAS

μέσω

TP53

. Για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ

KRAS, TP53

, και αφήστε-7α, χρησιμοποιήσαμε HCT116

KRAS

mut

ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα με τέσσερα διαφορετικά γονοτυπική τροποποιήσεις στο

TP53

(

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

και

TP53

mut /-

). Χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα παρατηρήσαμε ότι η δραστικότητα K-Ras ήταν υψηλότερη σε κύτταρα με μεταλλαγμένες ή νοκ άουτ

ΤΡ53

αλληλόμορφα, γεγονός που υποδηλώνει ότι άγριου-τύπου

ΤΡ53

μπορεί να καταστείλει δραστικότητα K-Ras. Ας-7α ήταν παρούσα σε HCT116

KRAS

mut

κύτταρα, αν και δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου ας-7α και

TP53

κατάσταση γονότυπο. Για να διερευνήσουν πώς ας-7 μπορούν να ρυθμίζουν K-Ras στα διάφορα

TP53

της γονότυπο κύτταρα χρησιμοποιήσαμε αναστολέα ας-7α και κατέδειξε αυξημένη δραστηριότητα K-Ras σε όλες τις

TP53

, επιβεβαιώνοντας έτσι προηγούμενες εκθέσεις ότι ας-7α ρυθμίζει K-Ras. Για να εκτιμηθεί το δυναμικό κλινικές επιπτώσεις αυτού του ρυθμιστικού δικτύου, εξετάσαμε την επίδραση του

TP53

γονότυπο και αφήστε-7α αναστολή για την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από θεραπεία chemoradiation (CRT). Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα με πλήρη απώλεια της άγριου τύπου

ΤΡ53

αλληλόμορφα (

– /- ή

– /Mut) ήταν ανθεκτικά σε CRT μετά την αγωγή με 5-φθοριοουρακίλη και ακτινοβολία. Περαιτέρω αύξηση της δραστηριότητας K-Ras με αναστολή let-7α δεν είχε επίδραση επιβίωσης σε αυτά τα κύτταρα. Σε αντίθεση, τα κύτταρα με μονά ή διπλά άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα ήταν μέτρια ανταποκρίνεται στις CRT και παρουσίασαν αντίσταση όταν αφήνω-7α ανεστάλη. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ένα σύνθετο ρυθμιστικό σύστημα που περιλαμβάνει

TP53

,

KRAS

, και αφήστε-7α. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να παρέχει ενδείξεις για να κατανοήσουν και στόχευση αυτών των αλληλεπιδράσεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Luu C, Heinrich EL, Duldulao Μ, Arrington AK, Fakih Μ, Garcia-Aguilar J, et al. (2013)

TP53

και Ας-7α μικρο-RNA Ρυθμίζουν K-Ras στα κύτταρα HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (8): e70604. doi: 10.1371 /journal.pone.0070604

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 4 του Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 21 Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Luu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η 4

th πιο κοινή μορφή καρκίνου και η 2

ου πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στις ΗΠΑ [1]. Οι πρόσφατες εξελίξεις που έχουν βελτιωμένα αποτελέσματα στο CRC έχουν συμπεριλάβει τον προσδιορισμό της ακριβούς προγνωστικά και προγνωστικά μοριακοί βιοδείκτες [2] – [4]. Σε αυτές περιλαμβάνονται οι γενετικές τροποποιήσεις στο

KRAS

και

TP53

, που συχνά ανιχνεύονται σε ασθενείς με CRC.

KRAS

μεταλλάξεις είναι παρούσα σε περίπου 30-50% του ΚΕΣ, αλλά και σε 17-25% όλων των ανθρώπινων όγκων [2], [5] – [7]. Ομοίως,

TP53

αλλοιώσεις είναι συνήθεις σε ασθενείς με CRC (σχεδόν 50%) [8]. Και οι δύο προγνωστική και προβλεπτική ρόλοι έχουν ταυτοποιηθεί και για τις δύο γονίδια [9]. Η δική μας ομάδα και τους άλλους έχει δείξει πρόσφατα ότι η ανίχνευση των ταυτόχρονων

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις, με συχνότητα 5% έως 20% σε ασθενείς με CRC, συσχετίζεται με την αντίσταση στην εισαγωγική θεραπεία chemoradiation ( CRT) σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού [10] – [12]. Παρά τη συχνότητα αυτών των μεταλλάξεων στο CRC, λίγα είναι γνωστά για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο γονιδίων.

Ο σύνδεσμος μεταξύ των δύο αυτών μεταβάλλονται συχνά γονίδια σε CRC μπορεί να βρίσκεται σε μικρο-RNA (miRNA), μία κατηγορία μη κωδικοποίησης RNA το οποίο λειτουργεί σε μεταγραφική ρύθμιση και πιο συγκεκριμένα μπορούν να επηρεάσουν την ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης [13], [14]. Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι η δραστηριότητα καταστολέα όγκου του miRNA θανατηφόρου 7α (ας-7a) μπορεί να οφείλεται στην σύνδεσή του με το

KRAS

και ότι η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μπορεί να συμβεί από την καταστολή της έκφρασης K-Ras με γράμ- 7α [15], [16]. Αναδυόμενες κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση ενδο-όγκου ας-7α συσχετίζεται με ανταπόκριση του όγκου και τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο που λαμβάνουν επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) με στόχο μέσα σε δύο

KRAS

άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων πληθυσμών [17 ]. Πρόσθετες μελέτες έχουν σκεφτεί ότι ο ρόλος του

TP53

στην επιδιόρθωση του DNA και την απόπτωση μπορεί εν μέρει να ρυθμίζεται από miRNAs, συμπεριλαμβανομένων ας-7α [18], [19]. Ως εκ τούτου, ένα πολύπλοκο κανονιστικό δίκτυο για

TP53

και

KRAS

μπορεί να συνδέεται με αφήσει-7α.

Για να διερευνήσουν πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των

TP53

,

KRAS

, και αφήστε-7α, αναλύσαμε μια μοναδική οικογενειακή του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο

KRAS

και τροποποιήσεις στο

TP53

γονότυπο. Αυτά τα κύτταρα μας επέτρεψε να εξετάσει τις αλλαγές στην έκφραση και δραστηριότητα K-Ras που αντιστοιχούσε με παραλλαγές στο

TP53

γονότυπο. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να ανακρίνουν καλύτερα το ρόλο της αφήνω-7α στη ρύθμιση των μεταλλαγμένων

KRAS

και διάφορα

TP53

γονότυπους. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν νέες αυξήσεις της δραστηριότητας της K-Ras με διαφορετικές

TP53

γονότυπους. Ωστόσο, δεν βρήκαμε μια σαφή σχέση μεταξύ του επιπέδου ας-7α και

TP53

γονότυπο. Παρ ‘όλα αυτά, οι αλλαγές στη δραστηριότητα K-Ras ρυθμίζονταν από let-7. Αυτή η πρώτη έκθεση του

TP53

και αφήστε-7α ρύθμιση της δραστηριότητας K-Ras παρέχει ενδείξεις για να κατανοήσουν καλύτερα την περίπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ

TP53

και

KRAS

.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο CRC γραμμή κυττάρων HCT116, που φιλοξενούν ένα μόνο μεταλλαγμένο

KRAS

αλληλόμορφο και το διπλό άγριου τύπου

TP53

(

TP53

+ /+

) αλληλόμορφα, τροποποιήθηκε σε τέσσερις σταθερές κυτταρικές σειρές με διαφορετικές

TP53

γονότυπους (

TP53

– /-, TP53

+/-, TP53

mut /+,

και

TP53

mut /-

). Το τροποποιημένο γονικές κυτταρικές σειρές και έγιναν ευγενώς από τον Dr. Bert Vogelstein (Πανεπιστήμιο Johns Hopkins? Baltimore, MD) [20]. Μεταλλαγμένα και knockout αλληλόμορφα και οι δύο χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των πιθανών διαφορών μεταξύ των δύο αλληλόμορφα, όπως προτείνεται στην προηγούμενη εκθέσεις [21]. Όλες οι κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν με εκχύλιση του DNA, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), και αλληλούχιση για

KRAS

και

ΤΡ53

μεταλλάξεις γονιδίων για την επαλήθευση γονότυπους. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Irvine Scientific? Santa Ana, CA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Omega Scientific? Tarzana, CA) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη-γλουταμίνη (Invitrogen? Carlsbad, CA) σε 5% CO

2 στους 37 ° C

ανοσοαποτύπωσης

τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA. (Invitrogen? Carlsbad, CA) συν αναστολείς πρωτεάσης (Thermo Scientific? Rockford, IL). Είκοσι μικρογραμμάρια πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 12% γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore? Bedford, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα και ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες σημάνθηκαν με υπεροξειδάση κρένου (HRP) δευτερεύοντα αντισώματα (BioRad? Hercules, CA). Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia? Piscataway, NJ) και απεικονίζεται. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-K-Ras (Millipore) και αντι-GAPDH (Cell Signaling? Danvers, ΜΑ)

K-Ras Δραστηριότητα

δραστηριότητα

K-Ras μετρήθηκε με τη χρήση των Ras. Η ενεργοποίηση ELISA Assay Kit (Millipore). Εν συντομία, κυτταρολύματα επωάστηκαν με Raf-1 Ras Τομέα Δέσμευσης (RBD) -αγαρόζης. Raf-1-RBD χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει την ενεργή ΟΤΡ-δεσμευμένη K-Ras πρωτεΐνη, η οποία στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με την προσθήκη ενός αντι-K-Ras-αντίσωμα (Millipore). Στη συνέχεια προστέθηκε ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Ένα φωτόμετρο χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των σημάτων μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου χημειοφωταύγειας (Perkin-Elmer? Shelton, CT). Από προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να εκτιμηθούν οι σχετικές μεταβολές στη δραστικότητα K-Ras μεταξύ των διαφόρων

ΤΡ53

γονότυπους, δραστικότητα K-Ras από το γονικό

ΤΡ53

+ /+ γραμμή ορίστηκε ως 1. Για τις δοκιμασίες με αναστολέα let-7, κάθε γονότυπο ενήργησε ως μάρτυρας του εαυτού του. Τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες διεξήχθησαν για κάθε κυτταρική σειρά, και η απορρόφηση ± την τυπική απόκλιση (SD) σημαίνουν παραστάθηκε γραφικά για κάθε γραμμή.

Αντίστροφη Μεταγραφή

RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Taqman ® δοκιμασία miRNA (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των παρεχόμενων μάστερ μιξ συν κυτταρολύματα Αντιδραστήριο Multiscribe RT ™ και τους ειδικούς εκκινητές ας-7α (Invitrogen). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα θερμικό ανακυκλωτή στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, και 85 ° C για 5 λεπτά.

Real Time-PCR

RT-PCR ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις Cells TaqMan® miRNA να Kit CT ™ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το προϊόν RT προστέθηκε στο PCR κοκτέιλ (αντιδραστήριο ποσοτικού προσδιορισμού TaqMan® miRNA συν παρέχονται κύριο μείγμα TaqMan®) και τα RT-PCR αντιδράσεις έτρεξαν σε 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 15 sec στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C στο 7500 γρήγορο σύστημα RT-PCR της Applied Biosystems (Foster City, CA). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν

Let-7a Αναστολέας

Ας-7a αναστάλθηκε από αναστολείς miRIDIAN miRNA (Dharmacon? Lafeyette, CO). Ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα HCT116 (3 χ 10

5) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Αυτά στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ αναστολέα miRIDIAN miRNA για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες πριν να χρησιμοποιηθούν σε προσδιορισμούς.

Chemoradiation Therapy

HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CRT σύμφωνα με ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο [22]. Μετά από συνολικά 72 ώρες επώασης με τον αναστολέα let-7α, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4 ηΜ 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (Sigma Aldrich? St. Louis, ΜΟ) για 16 ώρες μετά από την οποία είχαν εκτεθεί σε 4 Gy ακτινοβολίας. έκθεση στο φάρμακο διακόπηκε 6 ώρες μετά τη θεραπεία ακτινοβολίας από μέσο ανταλλαγής. Κύτταρα που δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αναστολέα ας-7α παρομοίως σε επεξεργασία με CRT

Προσδιορισμός Βιωσιμότητας Κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία που βασίζεται ΑΤΡ (Cell Titer-Glo?. Promega ? Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα HCT116 (5 × 10

3) απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. αντιδραστήριο κυττάρων Ο τίτλος-Glo προστέθηκε και κυτταρική λύση που προκαλείται. Φωταύγεια καταγράφηκε με ένα φωτόμετρο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο της βιωσιμότητας, ως ποσοστό της βιωσιμότητας των μη επεξεργασμένων κυττάρων

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με το λογισμικό Microsoft Excel. (Microsoft? Redmond, WA). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. συνθήκες ελέγχου και θεραπείας συγκρίθηκαν με t-test του Student και οι διαφορές μεταξύ των κυτταρικών γραμμών συγκρίθηκαν με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). P τιμή & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

K-Ras πρωτεΐνη επιπέδου δεν εξαρτάται από το

TP53

Μετάλλαξη Κατάσταση

Για να προσδιοριστεί η επίδραση των διαφορετικών

ΤΡ53

γονότυπους στην έκφραση K-Ras, δοκιμασία κηλίδος Western εκτελέστηκε για σύγκριση επίπεδα πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης K-Ras δεν επηρεάστηκαν από τη διαφορετική

TP53

γονότυπους (Εικόνα 1Α) γεγονός που υποδηλώνει ότι

TP53

δεν ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης K-Ras.

Α) HCT116 κύτταρα με τις Σημειώνεται διακυμάνσεις

TP53

κατάσταση μετάλλαξης συλλέχθηκαν και λύθηκαν για western αποτύπωση για την έκφραση K-Ras. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) δραστηριότητα K-Ras μετρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα pull-down δοκιμασία ELISA Raf. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο 3 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε σχέση με το

ΤΡ53

+ /+ κυττάρων, ρ & lt? 0.05. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση (SD).

Η

Επίδραση του

TP53

Μετάλλαξη Κατάσταση στο K-Ras Δραστηριότητα

Η επίδραση του

TP53

γονότυπο για δραστικότητα K-Ras μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία pull-down Raf. Ανακαλύψαμε ότι η δραστηριότητα K-Ras ήταν χαμηλότερη σε

TP53

+ /+

κύτταρα. Αυξημένη δραστηριότητα K-Ras ήταν πιο έντονη σε

TP53

mut /-, ακολουθούμενο από

TP53

– /-,

TP53

+ /mut, και TP53

– /+ (44%, 32%, 20%, και 10% αυξήσεις, αντίστοιχα, ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δραστηριότητα K-Ras ήταν χαμηλότερη σε κύτταρα με άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα? και τα υψηλότερα επίπεδα εντοπίστηκαν σε κύτταρα με ομόζυγη απώλεια του άγριου τύπου TP53 αλληλόμορφα.

Ας-7a εκφράζεται σε όλες τις γραμμές HCT116

Ας-7α έκφραση σε κυτταρικές σειρές HCT116 μετρήθηκε με qPCR. έκφραση Ας-7α ανιχνεύτηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α). Δεν υπήρχε σχέδιο των αλλαγών στα επίπεδα let-7 τα οποία αντιστοιχούσαν σε αλλαγές στο

TP53

γονότυπο.

Α) έκφραση Ας-7α μετρήθηκε μέσω qRT-PCR. Τα δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν ένα μόνο qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 100 ηΜ αναστολέα ας-7α για 24 ώρες. Πρωτεΐνης για τον έλεγχο και για ανέστειλε κύτταρα ας-7α συλλέχθηκαν για ανοσοαποτύπωση για την έκφραση K-Ras. GAPDH χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης

Η

Ας-7α δεν ρυθμίζει K-Ras πρωτεΐνη Επίπεδα

Ας-7α ανεστάλη γονιδιακής έκφρασης & gt?. 90% από qPCR. επίπεδα πρωτεΐνης K-Ras αξιολογήθηκαν σε όλη την

ΤΡ53

γονότυπους στην παρουσία ή απουσία αναστολής ας-7. τα επίπεδα της πρωτεΐνης K-Ras δεν μεταβλήθηκαν από ας-7α αναστολής (Εικόνα 2Β).

Ας-7α ρυθμίζει αρνητικά K-Ras Δραστηριότητα

Η επίδραση της αναστολής ας-7α στο K-Ras δραστικότητα προσδιορίστηκε επίσης. Με αναστολή let-7, Κ-Ras αυξήθηκαν σε όλες τις

TP53

γονότυπους (Σχήμα 3). Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα K-Ras αυξήθηκαν κατά 50% έως 112% σε σύγκριση με το αφήνω-7α κύτταρα που εκφράζουν (p & lt? 0,05). Η επί τοις εκατό αύξηση σε δραστικότητα K-Ras σε όλες τις κυτταρικές σειρές δεν ήταν σαφώς σχετίζεται με

ΤΡ53

γονότυπου και είτε νοκ-άουτ ή μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ήταν παρόντα.

Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν ακόλουθες 72 ώρες επώασης και υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία Raf-pull down που μετρά δραστηριότητα K-Ras. Τα δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα γίνονται εις τριπλούν. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD. * P & lt?. 0.05

Η

Τα κύτταρα με άγρια-τύπου

TP53

αλληλόμορφα είναι ευαίσθητα σε CRT και αφήστε-7α Αναστολή Μειώνει απάντηση σε CRT

Τα κύτταρα που φέρουν διαφορετική

ΤΡ53

γονότυπους υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CRT και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε (Σχήμα 4). Κύτταρα που στερούνται κάθε TP53 άγριου τύπου

αλληλόμορφο ήταν ανθεκτικά σε CRT, ενώ τα κύτταρα που φιλοξενούν ένα ενιαίο άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφο εμφάνισαν περίπου 50% κυτταρικό θάνατο. θεραπεία CRT διεξήχθη πάλι με ας-7α αναστολής, η οποία μειώθηκε CRT-κυτταρικό θάνατο που επάγεται κατά περίπου 20% σε κύτταρα που φιλοξενούν τουλάχιστον ένα άγριου τύπου

ΤΡ53

αλληλόμορφο (ρ & lt? 0,05). Τα κύτταρα με ομόζυγο απώλεια του άγριου τύπου

ΤΡ53

αλληλόμορφα (

– /- και

mut /-), η οποία συσχετίζεται με την υψηλότερη δραστικότητα K-Ras (βλέπε Σχήμα 1Β), παρουσίασαν καμία αλλαγή στο κυτταρικής βιωσιμότητας ανεξάρτητα από αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης let-7.

τα κύτταρα με διαφορετικό

αναστολέας TP53

κατάσταση +/- ας-7α έλαβαν θεραπεία με 5-FU που ακολουθείται από την ακτινοβολία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τη μέση βιωσιμότητα ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. * P & lt? 0,05, ** p & gt?. 0.05

Η

Συζήτηση

KRAS

και

TP53

είναι κοινές σωματικές μεταλλάξεις με προβλεπτική και προγνωστική αξία σε ασθενείς με CRC. Η ανίχνευση επιλέξτε

KRAS

μεταλλάξεις έχει συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής της νόσου και του θανάτου [23] και έχει προβλέψει αντίσταση σε αντι-EGFR θεραπείες στο CRC [9]. Ομοίως, επιλέξτε

TP53

αλλαγές έχουν συσχετιστεί με κακή έκβαση σε CRC [8]. Έχουμε, επίσης, ανέφερε ότι η ταυτόχρονη ανίχνευση των

TP53

και

KRAS

μεταλλάξεις σε ασθενείς που λαμβάνουν εισαγωγική CRT για τον καρκίνο του ορθού προβλέψει την αποτυχία των παθολογικών πλήρους ανταπόκρισης [10]. Στην παρούσα έρευνα, επιδιώξαμε να κατανοήσουμε καλύτερα μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο γονιδίων. Εντοπίσαμε ας-7α ως μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της

TP53

και

KRAS

. Πριν από τον χαρακτηρισμό του let-7α αποκάλυψε ρόλου της στον έλεγχο της προόδου του κυτταρικού κύκλου και διαίρεση σε ανθρώπινο πνεύμονα και του κόλου [24], [25]. Επιπλέον, Johnson et al. [15] ανακάλυψαν ότι αρνητικά ελέγχεται

KRAS

έκφραση ας-7 στον καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, Ruzzo et al. [17] ανέφεραν βελτιωμένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με αυξημένα ας-7α μέσα σε ένα

KRAS

μεταλλαγμένο πληθυσμό καρκίνο του παχέος εντέρου θεραπεία με αντι-EGFR θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ένα ανασταλτικό ρόλο όγκου για αφήνω-7α στο

KRAS

ενεργοποιημένα όγκους.

ΤΡ53

έχει γίνει γνωστό για μεταγραφικά ρυθμίζουν την έκφραση των miRNAs [26], [27]. Ως εκ τούτου, έχουμε υποθέσει την ύπαρξη μιας σειράς κανονιστικών βήματα από

TP53

να αφήσει-7α έως

KRAS

. Ανακαλύψαμε ότι ογκογόνο δράση K-Ras ρυθμιζόταν από

TP53

γονότυπο και αφήστε-7α? και οι αλλαγές τόσο επηρεασμένη απάντηση στις CRT.

Στη μελέτη μας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα CRC που φιλοξενούν διάφορες

TP53

γονότυπους. Αυτά τα κύτταρα προέρχονται από ένα γονική κυτταρική γραμμή που φέρει το κέρδος της λειτουργίας

KRAS

μετάλλαξη βρίσκεται στην κωδικόνιο 13 [28], [29]. Υπάρχει σκεπτικό για τη χρήση κυττάρων με νοκ-άουτ και μεταλλαγμένα

TP53

αλληλόμορφα στη μελέτη μας. Παρά την κοινή απώλεια του άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα, το νοκ-άουτ και μεταλλαγμένο

TP53

αλληλόμορφα δεν είναι ομοειδή. Πλήρης απώλεια του

TP53

αλληλόμορφα αποτελέσματα στην αντίστοιχη απώλεια της δραστηριότητας ογκοκατασταλτικών ενώ μεταλλαγμένο

TP53

αλληλόμορφα μπορούν να εκφράσουν πρωτεΐνες p53 που χάνουν την δραστικότητα καταστολέα όγκων, αλλά και να αποκτήσουν ογκογόνο ιδιότητες [21]. Ωστόσο, στην παρούσα έρευνα δεν μπορέσαμε να βρούμε σταθερές διαφορές μεταξύ ΚΟ και των μεταλλαγμένων

TP53

αλληλόμορφα σε σχέση με K-Ras δραστηριότητα κατά την έναρξη και σε απάντηση ας-7α αναστολή, ούτε ως απάντηση σε CRT.

Όπως σημειώθηκε προηγουμένως, παρατηρήσαμε αλλαγές στη δραστηριότητα K-Ras με αναστολή της έκφρασης ας-7α. Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε αντίστοιχες αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης K-Ras, η οποία έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενες αναφορές που αποδεικνύουν ας-7 ρύθμισης miRNA της έκφρασης K-Ras [30], [31]. Παρ ‘όλα αυτά, τα ευρήματά μας συνάδουν με τις καθιερωμένες ρυθμιστικών μηχανισμών του miRNA. Πράγματι, μπορεί να ρυθμίσει miRNA γονιδίων μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών από τη μετάφραση του mRNA για τη σταθερότητα στο κυτταρόπλασμα με τη δραστηριότητα κυτταρικού κύκλου [14], [24]. Οι διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων μας και εκείνες των προηγούμενων εκθέσεων θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε διαφορές μεταξύ των ειδών ή κυτταρικών γραμμών που χρησιμοποιούνται. Έτσι, ενώ η έκφραση K-Ras παρέμεινε αμετάβλητη από την αναστολή let-7, τα πειράματά μας έδειξαν ότι η δραστηριότητα K-Ras επηρεάστηκε από αφήνω-7α. Επιπλέον, τα κύτταρα που φιλοξενούν ομόζυγο άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα εξέφρασε τη χαμηλότερη δραστηριότητα K-Ras, γεγονός που υποδηλώνει ότι η άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα μπορούν να καταστέλλουν τη δράση K-Ras. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με μια έκθεση για τον καρκίνο του παγκρέατος, παρουσιάζοντας αύξηση της δραστηριότητας K-Ras, όταν μεταλλαγμένο

KRAS

συνδυάστηκε με μεταλλαγμένο

TP53

[32]. Τέλος, η δραστηριότητα K-Ras αυξήθηκε σαφώς όταν αφήνω-7α ανεστάλη ανεξάρτητα από το

TP53

γονότυπο, υποδηλώνοντας περαιτέρω ρύθμιση ας-7α δραστηριότητας K-Ras.

Η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία είναι σημαντικά συστατικά του η πολυτροπική διαχείριση των χειρουργικών ασθενών με καρκίνο του ορθού? και εισαγωγική CRT έχει συσχετιστεί με downstaging της νόσου και μειωμένη τοπική υποτροπή [33], [34]. Στην έρευνά μας, ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα στερούνται άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα ήταν ανθεκτικά στην CRT και δεν παρουσίασαν καμία κυτταρικό θάνατο κατά τη θεραπεία με CRT. Σε αντίθεση, τα κύτταρα με τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο άγριου τύπου (

TP53

+ /+, TP53

mut /+

, και

TP53

– /+) είχε περίπου 50% κυτταρικό θάνατο κατά τη θεραπεία με CRT. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα από προηγούμενες κλινικές δοκιμές μας, όπου οι ασθενείς με διπλή μεταλλάξεις (

KRAS

και

TP53

) απέτυχε να παρουσιάσει μια παθολογική πλήρης απόκριση μετά από θεραπεία με εισαγωγική CRT [10]. Όταν αφήνετε-7α έκφραση ανεστάλη (που οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα K-Ras), κύτταρα που στερούνται άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφα (

TP53

– /-

και

TP53

mut /-

) είχε επιβίωση% των κυττάρων 100. Ωστόσο, σε κύτταρα που φέρουν τουλάχιστον ένα άγριου τύπου

TP53

αλληλόμορφο (στο παρελθόν δείχνει κάποιο κυτταρικό θάνατο), κυτταρική επιβίωση αυξήθηκε σε απάντηση ας-7α αναστολή. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν δύο σημαντικές επιπτώσεις: (1)

TP53

γονότυπο επηρεάζει δραστηριότητα K-Ras και μπορεί να προβλέψουν την ανταπόκριση στην CRT και (2) αφήστε-7α επίπεδα έκφρασης επηρεάσουν τη δραστηριότητα της K-Ras και μπορεί να αλλάξει απάντηση σε CRT.

Εν κατακλείδι, παρέχουμε διορατικότητα πιθανούς μηχανισμούς που συνδέουν

KRAS

,

TP53

, και αφήστε-7α. Αν και διπλά μεταλλάγματα είναι σχετικά σπάνια, η κατάσταση φαίνεται να έχουν μια κακή φαινότυπο με αντίσταση στην CRT. Τα αποτελέσματά μας συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της σύνδεσης μεταξύ των

KRAS

και

TP53

. Η γνώση των μονοπατιών που συνδέουν

KRAS

,

TP53

, και αφήστε-7α μπορεί να παρέχει καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν τους φτωχούς φαινότυπο που παρατηρείται σε ορισμένες μεταλλάξεις στο CRC. Ενώ αναγνωρίζουμε ότι οι περιορισμοί της μελέτης μας περιλαμβάνουν την έλλειψη

στο

vivo

μοντελοποίηση και οι περιορισμοί μία κυτταρική σειρά, η εστίασή μας ήταν σχετικά με τη διερεύνηση των δυνατοτήτων cross-talk μεταξύ let 7α και p53, η οποία θα αποδεικνύουν σαφώς στο μοντέλο μας. Είναι εφικτό ότι αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να είναι κυτταρική γραμμή ειδική ή μπορεί να εξαρτάται από άλλα ανώμαλα μονοπάτια σε HCT-116 (MSI-Η,

PIK3

μεταλλαγμένο). Μελλοντικές εργασίες θα επικεντρωθούν στη διερεύνηση των πιθανών μηχανισμών αλληλεπίδρασης μεταξύ ας-7α και p53 σε διάφορες παχέος κυτταρικές σειρές και με διαφορετικά μοριακά προφίλ.