PLoS One: μικροπεριβάλλον Διαμόρφωση του Decorin και Lumican του Temozolomide-Resistant γλοιοβλάστωμα και καρκίνος Νευροβλάστωμα Stem-όπως τα κύτταρα


Αφηρημένο

Η παρουσία των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) ή καρκινικά κύτταρα-κίνηση μπορεί να οδηγήσει σε υποτροπή του καρκίνου σε ένα ανεκτικό κύτταρο-μικροπεριβάλλον αλληλεπίδραση, την προώθηση της εισβολής στο γλοιοβλάστωμα (GBM) και νευροβλάστωμα (ΝΒ). Εξωκυττάριας ουσίας (ECM) μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRPs) παίζουν πολλαπλούς ρόλους στην ομοιόσταση των ιστών από την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) εξαρτήματα και διαμόρφωση ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης. Λόγω της παν-ανασταλτικές ιδιότητες τους έναντι υποδοχέων κινασών τυροσίνης (RTK), οι SLRPs αναφερθεί ότι ασκούν αντικαρκινική επιπτώσεις

in vitro

και

in vivo

. Ωστόσο, οι ρόλοι τους φαίνεται να είναι ιστο-ειδικά και εμπλέκονται επίσης στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και της αντίστασης στα φάρμακα, ανοίγοντας το δρόμο σε σύνθετα διαφορετικά σενάρια. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί αν η ντεκορίνη SLRPs (DCN) και λουμικάνη (LUM) προσλαμβάνονται στο κελί πλαστικότητα και την προσαρμογή στο μικροπεριβάλλον των διαφοροποιημένων κυττάρων καρκίνου που προκαλείται προς φαινότυπο στελέχους-όπως. Πλωτή νευροσφαίρες που δημιουργούνται από την εφαρμογή μέσου CSC εμπλουτισμού (νευρικών βλαστικών κυττάρων μέσο χωρίς ορό, NSC SFM) με την καθιερωμένη καρκινικές κυτταρικές σειρές SK-N-SH SF-268 και, κυτταρικά μοντέλα GBM και ΝΒ, αντίστοιχα. Και στα δύο μοντέλα, παρατηρήθηκε η χρονο-εξαρτώμενη συνεργική ενεργοποίηση του DCN και LUM. Η υψηλότερη έκφραση /πρωτεΐνης DCN και LUM mRNA ανιχνεύθηκε μετά από έκθεση των κυττάρων σε NSC SFM για 8/12 ημέρες, θεωρώντας αυτά τα κύτταρα ως SLRP εκφράζουν (SLRP

+) CSC-όπως. Υπερδομική απεικόνισης έδειξε την κυτταρική ετερογένεια τόσο της GBM και νευροσφαιρίδια NB και προσδιόρισε τα εσωτερικά κύτταρα διαβίωσης. Γονική κυτταρικές σειρές τόσο GBM και NB αυξήθηκαν μόνο σε μαλακό άγαρ + NSC SFM, ενώ οι δευτερεύουσες νευροσφαιρίδια (προέρχεται από SLRP

+ t

8 CSC-όπως) έδειξε χαμηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού από την πρωτοβάθμια νευρόσφαιρες. Είναι ενδιαφέρον ότι η SLRP

+ CSC-όπως από το GBM και νευροσφαιρίδια NB ήταν ανθεκτικά στην τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) σε συγκεντρώσεις & gt? 750 μΜ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η GBM και ΝΒ CSC-όπως προάγουν την ενεργοποίηση των τεράστιων ποσοτήτων SLRP σε απόκριση CSC εμπλουτισμό, συγχρόνως αποκτώντας αντίσταση ΤΜΖ, κυτταρική ετερογένεια, και ηρεμίας φαινότυπο, προτείνοντας μία νέα κεντρικό ρόλο για SLRP σε αντίσταση στο φάρμακο και κυτταρική πλαστικότητα της CSC-όπως, επιτρέποντας την κυτταρική επιβίωση και τις δυνατότητες διαμόρφωσης ECM /εξειδικευμένες

Παράθεση:. Farace C, Oliver JA, Melguizo C, Alvarez P, Bandiera P, Ράμα AR, et al. (2015) μικροπεριβάλλον Διαμόρφωση του Decorin και Lumican του Temozolomide-Resistant γλοιοβλάστωμα και καρκίνος Νευροβλάστωμα Stem-όπως τα κύτταρα. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10.1371 /journal.pone.0134111

Επιμέλεια: Ντραγκάνα Nikitovic-Τζανακάκη, Πανεπιστήμιο Κρήτης, ΕΛΛΆΔΑ

Ελήφθη: 28, Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 6 Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Farace et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από Fundació la Marató TV3, Έργο n ° 111431.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Ιστορικό

γλοιοβλάστωμα (GBM) και νευροβλάστωμα (ΝΒ) είναι οι πιο κοινές και θανατηφόρο νευρικό σύστημα κακοήθεις καρκίνοι σε ενήλικες και παιδιατρικούς ασθενείς, αντίστοιχα. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας εκτιμά GBM την πιο επιθετική αστροκύτωμα, και μπορεί να εξελιχθεί σε δευτερεύουσα GBM από χαμηλού βαθμού γλοιώματα, ή

de novo

με ταχεία εξέλιξη σε θάνατο [1]. Σε αντίθεση, η ΝΒ προκύπτει κυρίως από κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας ως καρκίνος νευροενδοκρινή του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, και το 60% των παιδιατρικών ασθενών εμφανίζουν μεταστατική νόσο κατά τη διάγνωση [2]. Αν και τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) -ένα μέσο αλκυλίωσης που επάγει κυτταρικό θάνατο από ολόκληρο αλκυλίωση του DNA /μεθυλίωση σε γουανίνη υπολείμματα-σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα ή ακτινοθεραπεία αντιπροσωπεύουν μια θεραπεία πρώτης γραμμής αυξάνοντας την συνολική επιβίωση (OS) των ασθενών με GBM ή NB [ ,,,0],3, 4], αντοχή φαρμάκου και εξέλιξη του καρκίνου είναι κοινά. Επειδή GBM είναι ιδιαίτερα επεμβατική στον εγκέφαλο και NB τείνει να εισβάλουν σε άλλα όργανα, OS ασθενής παραμένει φτωχή (& lt? 1,5 χρόνια σε ασθενείς GBM και 4 χρόνια σε ασθενείς με ΝΒ). [5, 6]

Η αποτυχία της θεραπείας στην ασθενείς με καρκίνο έχει προηγουμένως σχετίζονται με τον καρκίνο των βλαστικών κυττάρων (CSC) υποπληθυσμών, η οποία εξασφαλίζει τη διατήρηση της ετερογένειας του καρκίνου, και αυτές οι υποπληθυσμοί CSC είναι πιο ανθεκτικά στην επιλεκτικών φαρμάκων μέσω πολλαπλών συντονισμένη βήματα της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [7-9]. Μετάσταση και υποτροπή του καρκίνου συνδέονται επίσης με τη συμπεριφορά των ΚΕΠ, συμπεριλαμβανομένης της ηρεμίας φαινότυπο τους, τη μεταναστευτική ικανότητα, και της φοροαποφυγής του ανοσοποιητικού συστήματος [10]. Άφθονη έρευνα δείχνει ότι βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τα κύτταρα εξοπλισμένα με έμφυτη μηχανήματα που τους προστατεύει από το ραδιόφωνο /χημειοθεραπεία [11, 12]. Αυτό περιλαμβάνει τους μηχανισμούς που σχετίζονται με τα βλαστικά, όπως προστατευτικά κόγχες των κυττάρων και μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, ο μεταβολισμός του φαρμάκου, και εκροής φαρμάκου [13]. Η ανθεκτικότητα στα φάρμακα και το δυναμικό κυτταρική εισβολή των ΚΕΠ αυξηθεί επίσης στο αναστρέψιμη επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση φαινοτυπική (EMT) [14, 15], το οποίο ανακεφαλαιώνει την EMT στην κανονική οργανογένεση και την ανάπτυξη [16, 17].

Αρκετές μικροπεριβάλλοντος σήματα, συμπεριλαμβανομένης της αναδιοργάνωσης της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), υποξία, και αυτοκρινείς /παρακρινείς παράγοντες, μπορεί να καθορίσει τις τύχες βλαστικών κυττάρων και τον καρκίνο [18-25], και σκανδάλη ή να αναστέλλουν τις διαδικασίες ΕΜΤ [26, 27]. Ως εκ τούτου, γλυκοπρωτεΐνες ECM και πρωτεογλυκάνες που είναι ικανά να τροποποιούν τόσο το περιβάλλον όσο ECM και ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, είναι υψίστης σημασίας στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου [28-30]. Τα μικρά πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRPs), που μοιράζονται στρατηγικά συντηρημένες περιοχές, αποτελούν ένα σαφές παράδειγμα της ανωτέρω έννοια. Ο πυρήνας πρωτεΐνη πλούσιες σε λευκίνη (40-50 kDa) συνδέονται σε έναν αριθμό παραγόντων ανάπτυξης (GF) και υποδοχείς μεμβρανών, ενώ διακλάδωση του glycosaminoglycanic πλευρικών αλυσίδων εμπλέκονται στη συναρμολόγηση ECM-κολλαγόνο και επίσης σε υποδοχέα μεμβράνης δεσμευτική. Είναι ενδιαφέρον, παρά παν-ανασταλτικών ιδιοτήτων τους έναντι των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) και οδοί την ανάπτυξη του καρκίνου, του «κηδεμόνα από τη μήτρα» ντεκορίνη (DCN) και λουμικάνη (LUM) SLRPs θα μπορούσε να ασκήσει αντικαρκινικές επιδράσεις

in vivo

και

in vitro

[31-33]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν ρίξει φως για τους πρόσφατα εντοπιζόμενους ιστού-ειδικές ιδιότητες και των δύο DCN και LUM σε φυσιολογικούς ιστούς και στην κακοήθη μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Όπως αναφέρθηκε από άλλους συγγραφείς, η μερική αναστολή γλοίωμα από DCN σε πειράματα γονιδιακής θεραπείας σε αρουραίους φέρνει μαζί της μια σημαντική μείωση των μικρογλοιακών κυττάρων διείσδυσης [34], η οποία θα μπορούσε να επηρεάζει την αναστολή του καρκίνου

in vivo

. DCN ενισχύει επίσης την διαφυγή του ανοσοποιητικού συστήματος και των μυών εισβολή στον καρκίνο του προστάτη

in vivo

[35], και ασκεί απρόσμενη προστασίας και αντιαποπτωτικά αποτελέσματα σε κυτταρικές σειρές γλοιώματος υπό υποξικές συνθήκες [36]. Σε κακοήθη κύτταρα του στόματος πλακώδες καρκίνωμα, το πυρηνικό εντοπισμό της DCN φαίνεται να ενισχύουν την κυτταρική εισβολή

μέσω

του υποδοχέα του επιδερμικού πυρηνικό αυξητικού παράγοντα (EGFR) οδού [37, 38], ενώ σε κύτταρα οστεοσαρκώματος, DCN-μεσολάβηση ανάπτυξης σύλληψη αποφεύγεται

μέσω

την παρατεταμένη ενεργοποίηση της μεμβράνης EGFR [39]. Κλινικά, DCN έχει προταθεί ως ρυθμιστής του χημειοθεραπεία μηχανισμού στον καρκίνο του στόματος [40] και που σχετίζονται με την αντίσταση στο φάρμακο και μειωμένη επιβίωση σε ασθενείς GBM [41]. Ομοίως με DCN, LUM έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί καταστολή όγκου. Ωστόσο, LUM εκφράζεται σε υψηλής ποιότητας παγκρέατος με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης [42] και σε ασθενείς GBM, καθώς και. LUM επίσης αναστέλλει την κυτταρική προσκόλληση και προάγει τη μετανάστευση των κυττάρων οστεοσαρκώματος με ρύθμιση της β2 αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF-β2) /SMAD2 μονοπατιού [43], και μια πρωτεογλυκάνη 70-kDa LUM φαίνεται να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και αναστέλλει την μετανάστευση των παγκρεατικών τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, μαζί για DCN, LUM ρυθμίζεται αυξητικά σε σισπλατίνη ανθεκτικά καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα [44].

Είναι αξιοσημείωτο ότι SLRPs εκφράζονται σε αρχέγονα κύτταρα κόγχες στο έμβρυο νεοσσού [45], στην εγκεφαλική ενδοθηλιακή κυττάρων [46], σε προγονικά κύτταρα διαφόρων κυτταρικών τύπων [47], και σε υποπληθυσμό κυττάρων ΝΒ αδιάφορη για την ανάπτυξη νευρίτη νεύρο-αυξητικού παράγοντα μεσολάβηση [48]. DCN προέρχονται από αστροκύτταρα επίσης αναστέλλει νευρικών βλαστικών κυτταρική διαφοροποίηση κυττάρου /προγονικών προς μια κυτταρική δομή νευρώνα-όπως [49]. Η αλλοίωση των μηχανικών χαρακτηριστικών των τρισδιάστατων (3D) μήτρες κολλαγόνου, SLRPs προσλαμβάνονται κατά την διάρκεια της οντογενικό (αναπτυξιακή) ΕΜΤ [50], πρόδρομο κύτταρο μετανάστευση και διαφοροποίηση [51], και την επούλωση τραυμάτων /επισκευής ιστού σε απόκριση στον τραυματισμό του κεντρικού νευρικού συστήματος και φλεγμονής [52]. Στο πλαίσιο αυτό, είναι κατανοητό ότι οι μικρές DCN και LUM πρωτεογλυκανών παίζουν ρόλο στη βιολογία των ΚΕΠ προέλευσης νευρικού συστήματος. Για το σκοπό αυτό, διερευνήσαμε τη συμμετοχή της DCN και LUM στην GBM και NB CSC-όπως τα μοντέλα, προσομοίωση των φαινομένων της απώλειας αγκυροβόλιο και την απόσπαση των διαφοροποιημένων καρκινικών κυττάρων που διέπουν τη διαδικασία EMT, και τη σχέση τους με CSC-όπως και τη συμπεριφορά και την κυτταρική απόκριση σε TMZ. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε για πρώτη φορά τη μαζική συνεργιστική έκφραση της DCN και LUM SLRPs στην GBM και κυτταρικές σειρές NB υποβάλλονται σε κυμαινόμενο CSC-όπως εμπλουτισμό 3D νευρόσφαιρα-based. Νευρόσφαιρα μικρογραφίες επισημάνετε το στέλεχος-όπως η ετερογένεια και η κυτταρική πόλωση των μοντέλων 3D NB και GBM. Επιπλέον, SLRP

+ NB και GBM CSC-όπως απομονώνονται από τις σφαίρες νευρικών παρουσίασαν χαμηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού, λιγότερο απόπτωση, και μεγαλύτερη αντοχή στα φάρμακα από τις γονικές κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει κεντρικοί και συνεργιστική ρόλους για DCN και LUM στην αντίσταση ΤΜΖ, η επιβίωση και τη συντήρηση των ηρεμίας, αργή ποδηλασία, CSC-όπως υποπληθυσμών.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και CSC εμπλουτισμό

Σε αυτή τη μελέτη, δύο ιδρύθηκε GBM και κυτταρικές σειρές NB εντάχθηκαν. Η κυτταρική γραμμή SK-N-SH είναι ένα εμπορικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που αρχικά προέρχεται από μετάσταση μυελό των οστών ενός 4-ετών καυκάσιος θηλυκό υποφέρουν με NB, και ήταν προηγουμένως εμπλουτισμένο σε CSC-όπως. Σε αντίθεση, SF-268 είναι ένα μη επιθηλιακά κυτταρική γραμμή που προέρχεται από ένα υψηλής ποιότητας αναπλαστικό αστροκύτωμα, το οποίο δεν έχει ποτέ χρησιμοποιηθεί για CSC-όπως εμπλουτισμού. Η καθιερωμένη SK-N-SH (από τα Type Culture Collection American) καρκινικές κυτταρικές γραμμές και SF-268 (ευγενώς από την Instrumentation Κέντρο Επιστημονικών, Γρανάδα Πανεπιστήμιο) διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο ως προσκολλημένες καλλιέργειες (μονοστρώματα) σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, σε υγρή ατμόσφαιρα στους 37 ° C με 5% CO

2. Συρρέοντα κύτταρα αποκολλήθηκαν σε 5 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) -ethylenediaminetetraacetic οξύ (EDTA) στους 37 ° C για 10 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και υποκαλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες. CSC εμπλουτισμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πραγματοποιήθηκε με τη δημιουργία νευρόσφαιρες σε νευρικών βλαστικών κυττάρων μέσου χωρίς ορό (NSC SFM) [53, 54], που περιέχει νοκ-άουτ DMEM /F12 συν 20 μg /ml βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF), 20 μg /ml επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, 1 × StemPro Neural συμπλήρωμα (Invitrogen, Paisley, UK), 1% Ε-γλουταμίνη και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. NSC SFM αντικαταστάθηκε κάθε 2 ημέρες μετά από ήπια φυγοκέντρηση των νευροσφαιρών.

εκχύλιση RNA και ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής (qRT) -PCR

Η έκφραση της DCN και LUM mRNAs αξιολογήθηκε σε t

0 κύτταρα και νευρόσφαιρες μετά από 4 (t

4), 8 (t

8), και 12 ημέρες (t

12) του εμπλουτισμού CSC. Οι γονικές κυτταρικές σειρές σε ϋΜΕΜ χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (t

0). RNA εκχυλίστηκε με το RNeasy Mini Kit (Qiagen, MD, USA) και ποσοτικοποιούνται με Nanodrop φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific, DE, USA). Το RNA (1 μα) από κάθε δείγμα αναστράφηκε μεταγράφηκε με M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Sigma, Ιταλία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και SYBR Green-based ενίσχυση (Applied Biosystems, Foster City, CA) έγινε με τη CFX96 Πραγματικό -Time Σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad, Ιταλία), όπως έχει ήδη αναφερθεί [55]. Το πρόγραμμα κύκλων PCR ήταν: 50 ° C (2 λεπτά), 95 ° C (2 λεπτά), 42 κύκλους: μετουσίωση στους 95 ° C (30 s), ανασύνδεση στους 56 ° C (30 s), και επέκταση στους 72 ° C (40 δευτερόλεπτα), που ακολουθήθηκε από μια ανάλυση της καμπύλης τήξης (εύρος 56-95 ° C) με προσαυξήσεις του 0,5 ° C /5 s για την αξιολόγηση της εκκινητή εξειδίκευση. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν: προς τα εμπρός 5′-GGA CCG ΤΤΤ CAA CAG AGA GG-3 ‘, αντίστροφη 5′-GAC CAC TCG AAG ATG GCA ΤΤ-3′ (DCN)? προς τα εμπρός 5’-ΤΟΟ ΑΓΓ TCA ATC AAC TTG AGA A-3 ‘, αντίστροφη 5′-CAA ACG CAA ATG CTT GAT CTT-3′ (LUM)? προς τα εμπρός 5’-CAA GGA GTA AGA CCC CTG GAC-3 ‘, αντίστροφη 5′-TCT ACA ΤΟΟ ΥΠΑ CTG TGA GGA G-3′ (αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης, GAPDH)? προς τα εμπρός 5’-GGC ATC CTC ACC CTG ΑΑΤ GA-3 ‘, αντίστροφη 5′-ΑΟΟ TGT GGT GCC AGA ΤΤΤ TC-3’ (β-ακτίνη, ACTB). Οι μεταγραφές στόχοι ήταν ανεξάρτητα κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH και ACTB (γονίδια housekeeping), και το RNA του Τ

0 κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος βαθμονόμησης. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε λογαριθμική κλίμακα ως φορές αλλαγές (FCS), με το 2

-ΔΔCt μέθοδο.

κηλίδωση Western

Ολόκληρα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ελήφθησαν με την παλμική επεξεργασία με υπερήχους της κυτταρικής σφαιριδίων σε 200 μΐ ρυθμιστικού εκχύλισης που περιέχει 50 mM Trizma βάσης, 0,25 mM σακχαρόζη, 5 mM EDTA (ρΗ 7.4), 0.5% Triton-X 100 και 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Bradford. Οι πρωτεΐνες (50 μg) αναμείχθηκαν 1: 1 με 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli, θερμαίνεται στους 95 ° C για 5 λεπτά, και φορτώθηκε σε μια 12% μετουσίωσης γέλη SDS-PAGE με το Kaleidoscope προχρωματισμένων προτύπων. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε σταθερή τάση (90 V) για 90 λεπτά και στυπώθηκαν σε μεμβράνη 0,45 μm νιτροκυτταρίνη υπό semidry συνθήκες με την Trans-Blot SD Semi-Dry ηλεκτροφορητική μεταφορά κυττάρων (Bio-Rad, Ισπανία) για 25 λεπτά σε 200 mA. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS, επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με αντι-LUM πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (αραιωμένο 1: 100? SC-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή ποντικού μονοκλωνικό αντι-DCN αντίσωμα (1:50? SC-73896, Santa Cruz Biotechnology) σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως, πλένεται 4 φορές σε διάλυμα πλύσης (0,1% Tween σε PBS), επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με το κατάλληλο μονοκλωνικό αρμορακίας-συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενές αντίσωμα (1: 5000? Sigma Aldrich), και πλύθηκε πάλι σε διάλυμα πλύσης. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ECL Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης (Amersham? UK). Το σύστημα Μοριακής Imager Versadoc MP 4000 (Bio-Rad, Hercules, CA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση χημειοφωταύγειας. Οι κηλίδες απογυμνώνεται και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης αντισώματος. (1: 30.000? Sigma Aldrich) ως έλεγχος φόρτωσης

μαλακό άγαρ καλλιέργειες

Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ να αξιολογήσει τους αποικία ή νευρόσφαιρα σχηματισμό κάτω αγκύρωση-ανεξάρτητο συνθήκες, σε DMEM ή NSC SFM. Για να εξερευνήσετε τον πολλαπλασιασμό του SLRP

+ CSC-όπως μετά την CSC εμπλουτισμού για 8 ημέρες (t

8 CSC-όπως), δευτεροβάθμια νευροσφαίρες που δημιουργούνται από τ

8 CSC-όπως. Εν συντομία, Αντιδραστήριο Διαχωρισμού StemPro Accutase κυττάρων (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να διαχωρίσει τα t

8 νευροσφαίρες. Μια δοκιμή αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης έγινε και 5 × 10

3 /ml κύτταρα συλλέχθηκαν σε 2 × DMEM ή NSC SFM. Τα κύτταρα αναμίχθηκαν 1: 1 με ένα προθερμανθέν διάλυμα που περιέχει 0,6% αγαρόζη υπερκαθαρό σε PBS (τελική συγκέντρωση άγαρ 0,3%), σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκες έξι φρεατίων σε 2 ml στερεοποιήθηκε άγαρ πυθμένα 0,6%, και επωάστηκαν σε μια υγρή ατμόσφαιρα στους 37 ° C με 5% CO

2. Οι καλλιέργειες μαλακού άγαρ φωτογραφήθηκαν καθημερινά κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon Eclipse TE 2000-S).

Μεταφοράς και ηλεκτρονικής σάρωσης μικροσκοπικής απεικόνισης

Οκτώ ημερών (t

8 ) νευρόσφαιρες συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε PBS, και μονιμοποιήθηκαν σε 2.5% γλουταραλδεΰδη σε 0,1 Μ PBS (ρΗ 7.4) για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σταθερά νευροσφαίρες πλύθηκαν προσεκτικά τέσσερις φορές σε PBS, σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% τετροξείδιο του οσμίου (ΟΣΟ

4) σε 0.1 Μ PBS για 1 ώρα στους 4 ° C, και αποθηκεύεται σε PBS στους 4 ° C μέχρι την ενσωμάτωση. Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) αφυδατώθηκαν σε σειρά αυξανόμενων συγκεντρώσεων ακετόνης και ενσωματωμένα σε εποξική ρητίνη για τεμαχισμό υπέρλεπτων στους 60 ° C όλη τη νύκτα. Οι φέτες υπέρλεπτων κοπεί με ένα 8800 Ultratome (LKB, Bromma, Σουηδία) βάφτηκαν με 4% οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και παρατηρήθηκαν σε ένα Zeiss ΕΜ 109-902 μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Zeiss, Oberchochen Γερμανία). Για ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM), τα μετασταθεροποιήθηκε νευροσφαίρες επωάστηκαν σε καθαρή εξαμεθυλδισιλαζάνης για 1 ώρα στους 4 ° C, ξηραίνεται σε ένα κρίσιμο σημείο στεγνωτήριο (Polaron, Watford, UK), και επιμεταλλωμένο σε S150A επιμετάλλωσης (Edwards, Crawley, UK) για σάρωση σε Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Ολλανδία) ή DSM 962 SEM μέσων (Zeiss, Oberchochen, Γερμανία).

θεραπεία TMZ και ΜΤΤ δοκιμασία

Ενιαία κύτταρα από τις μονοστιβάδες και t

8 νευροσφαίρες από δύο κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε με εξαίρεση κυανούν Τρυπανίου και 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων, σε ϋΜΕΜ ή NSC SFM. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο χωρίς ή με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ΤΜΖ (25-1500 μg /ml? Sigma, Μαδρίτη, Ισπανία). DMSO συμπεριλήφθηκε ως μάρτυρας οχήματος. Κάθε συνθήκη εξετάστηκε σε έξι φρεάτια. Τρεις ημέρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο για τη διατήρηση δραστηριότητα ΤΜΖ. Το τελικό σημείο της αγωγής ΤΜΖ ιδρύθηκε την ημέρα 6. Τέλος, μία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) χρωματομετρική δοκιμασία διεξήχθη (Sigma). Εν συντομία, 20 μΐ ΜΤΤ /φρεάτιο προστέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C. Μετά από 4 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε προσεκτικά και DMSO προστέθηκε για να διαλυθούν τα άλατα φορμαζάνης. Οι αντιδράσεις μετρήθηκαν με ένα Multiskan ΕΧ μικροπλάκας φωτόμετρο (Thermo Scientific, Μαδρίτη, Ισπανία) στα 570 nm. Η ΤΜΖ δόσης-απόκρισης εκφράζονται ως ποσοστό αναστολής (%) του κυττάρου μεταβολικής δραστηριότητας σε σχέση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων και ρυθμίζεται με τον έλεγχο του οχήματος. Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης με ΤΜΖ αξιολογήθηκε σε πειράματα τετραπλούν.

Στατιστική ανάλυση

του Student δύο ουρών

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε τα αποτελέσματα της θεραπείας για την ΤΜΖ SLRP

+ CSC-όπως και οι γονικές κυτταρικές σειρές. Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων qPCR αξιολογήθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

DCN και LUM έκφραση κατά τη διάρκεια νευρόσφαιρα με βάση CSC εμπλουτισμό

Νευροσφαίρες τόσο SF-268 και SK-N-SH κυτταρικές σειρές αποκτήθηκαν τακτική 3D διαμορφώσεις που προκύπτουν από την παρατεταμένη ακτινική πολλαπλασιασμό των περισσοτέρων κυττάρων, φθάνοντας & gt? 50 μm μετά από 4 ημέρες (Σχήμα 1Α). Μια ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι η έκφραση DCN και LUM mRNA, με την εξαίρεση των LUM σε SF-268 t

12, η ​​αυξημένη υπό συνθήκες εμπλουτισμού CSC στις δύο κυτταρικές σειρές, που δείχνει τις υψηλότερες τιμές έκφρασης DCN και LUM mRNA μετά από 8 ημέρες (t

8). Σε σύγκριση με τις γονικές κυτταρικές σειρές (t

0), και λαμβάνοντας υπόψη ACTB η γονιδιακή καθαριότητας, GBM CSC-όπως ήταν πιο εμπλουτισμένη σε LUM mRNA (FC

Lum

= t

0: 1? t

4: 11.00? t

8: 21.70? t

12: 9,51) σε σχέση με το DCN mRNA (FC

DCN

= t

0: 1 ? t

4: 6,32? t

8: 17.87? t

12: 11.08) (p & lt? 0,01). Ομοίως, η ΝΒ CSC-όπως έδειξαν υψηλότερα επίπεδα LUM mRNA (FC

Lum

= t

0: 1? T

4: 29.04? T

8: 105,78? T

12: 60.12) από τα επίπεδα DCN mRNA (FC

DCN

= t

0: 1? t

4: 23.02? t

8: 80.44? t

12: 40.22) (p & lt? 0,01? Σχήμα 1Β)

(Α) γενιά Νευροσφαιρών από κυτταρικές σειρές SK-N-SH SF-268 και.. Μπαρ, 50 μm. (Β) Έκφραση της DCN και LUM mRNAs σε καλλιέργειες εμπλουτισμού CSC. Αποτελέσματα qRT-PCR κανονικοποιήθηκαν προς ACTB και γραφικά ως σχετικές μεταβολές φορές (FCS) μεταξύ νευρόσφαιρες σε διαφορετικά χρονικά σημεία (t4, t8, και Τ12) και προσκολλημένα t

0 κυττάρων με το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Όλες οι τιμές DCN και LUM FC για τις νευροσφαιρίδια ήταν στατιστικά σημαντικές (* p & lt? 0,01). (C) κηλίδωση Western ανάλυση της DCN και LUM. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα συνολικά επίπεδα DCN και LUM ήταν υψηλότερα στα νευροσφαιρών ό, τι στα προσκολλημένα κύτταρα και των δύο κυτταρικών σειρών. Μια ισομορφή 70-kDa LUM ρυθμίζεται αυξητικά στις σφαίρες νευρικών και των δύο κυτταρικών σειρών, με την υψηλότερη έκφραση στα νευροσφαίρες t8. Προσκολλημένα κύτταρα SF-268 έδειξε βασική έκφραση της πρωτεΐνης πυρήνα 37-kDa LUM.

Η

Η ανάλυση της πρωτεΐνης έδειξε μια σαφή αύξηση σε πρωτεΐνες LUM (70-kDa) κατά τη διάρκεια του εμπλουτισμού CSC. Η υψηλότερη έκφραση LUM ανιχνεύθηκε σε αμφότερα SF-268 και SK-N-SH t

8 νευροσφαιρίων (Σχήμα 1 C). Αντίθετα, το 40-kDa LUM πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με πολύ λιγότερη έκφραση ότι το 70-kDa LUM τόσο SF-268 και SK-N-SH, και ιδιαίτερα σε t

12 (Σχήμα 1 C). Από την άλλη πλευρά, εντοπίσαμε μια σημαντική αύξηση DCN (& gt? 150-kDa) πρωτεϊνική έκφραση τόσο SF-268 και SK-N-SH t

12 νευρόσφαιρες ενώ το 40-kDa DCN πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε πολύ ασθενώς, με μια δύσκολη την αξιολόγηση της έκφρασης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του mRNA, 8 ημέρες SLRP

+ CSC-όπως (Τ8 CSC-όπως) που προέρχονται από τόσο GBM και κυτταρικές σειρές NB φοιτούσαν σε περαιτέρω ανάλυση.

μαλακό άγαρ καλλιέργειες SLRP

+ CSC-όπως και η γονική κυτταρικές σειρές

Για να αξιολογηθούν οι διαφορές στην ανάπτυξη των κυττάρων μεταξύ των CSC-όπως και τη γονική κυτταρικές σειρές, οι δευτερεύουσες νευροσφαίρες από SLRP

+ t

8 CSC-όπως παρήχθησαν σε μαλακό άγαρ και σε σύγκριση με τα πατρικά-κυττάρων που προέρχονται από πρωτογενή νευροσφαίρες. Οι καλλιέργειες μαλακού άγαρ αγκύρωση-ανεξάρτητο έδειξε νευρόσφαιρα αποικίες στην NSC SFM, ενώ δεν ή χαμηλή αποικίες των γονικών κυττάρων είχε αυξηθεί στο μαλακό δοκιμασία άγαρ DMEM-based μετά από 22 ημέρες (Σχήμα 2Α). Τα πρωτογενή νευροσφαίρες SK-N-SH ήταν μεγαλύτερα από τα SF-268 νευροσφαιρών, φθάνοντας & gt? 200 μm μετά από 3 εβδομάδες, και είχε δείξει ευδιάκριτη σκούρο πυρήνα εντός της δομής 3D. Οι καλλιέργειες μαλακού άγαρ του t

8 GBM και NB CSC-όπως (SLRP

+) αυξήθηκαν τόσο μικρό δευτερεύοντα νευροσφαιρίδια στο NSC SFM, και περιέργως, επίσης, ως μικρές αποικίες σε DMEM μετά από 30 ημέρες (Σχήμα 2Β). Τα δευτερεύοντα νευροσφαίρες ήταν μικρότερες από τις πρωτογενείς νευροσφαίρες και intrasphere τόνισε κύτταρα (σκούρο πυρήνες) ήταν ανιχνεύσιμα μόνο στις δευτερεύουσες SF-268 νευρόσφαιρες μετά από 2 εβδομάδες, ενώ οι δευτερογενείς νευρόσφαιρες SK-N-SH διατήρησε μια ημιδιαφανή εμφάνιση.

(Α) Πρωτοβάθμια μαλακό νευροσφαιρίδια άγαρ από τις γονικές κυτταρικές σειρές. Απουσία του σχηματισμού αποικιών σε ημιστερεά DMEM (22 ημέρες) και το σχηματισμό νευρόσφαιρα σε ημιστερεά NSC SFM (14 και 22 ημέρες). (Β) Δευτερεύουσα μαλακό νευροσφαιρίδια άγαρ από SLRP

+ CSC-όπως απομονώνονται από τ

8 νευρόσφαιρες. Νευροσφαίρες που δημιουργούνται τόσο σε ημιστερεά ϋΜΕΜ και ημιστερεά NSC SFM (14 και 22 ημέρες), γεγονός που υποδηλώνει την αργή συμπεριφορά του ποδηλάτου της CSC-όπως και υπολειμματική δράση θάνατο φοροδιαφυγής στα DMEM που καλλιεργούνται δευτεροβάθμιας νευρόσφαιρες. Μπαρ, 50 μm.

Η

ετερογενή υπερδομές της GBM και απεικόνισης Σημείωση νευροσφαιρίδια

Υπερδομική με ΤΕΜ και SEM έδειξε ευρεία κυτταρική ετερογένεια στα t

8 νευροσφαιρίδια των δύο κυτταρικές σειρές. SEM απεικόνιση των επιφανειών νευροσφαιρών έδειξαν περισσότερο συσκευασμένα κύτταρα στις σφαίρες νευρικών ΝΒ ό, τι στις σφαίρες νευρικών GBM, ενώ τα περιφερειακά κύτταρα των νευροσφαιρών GBM είχαν extroflections μεμβράνη πιο λεπτές από τις νευρόσφαιρες SK-N-SH (Σχήματα 3Α, 3Β, 4Α και 4Β ). Δίπλα πυκνά σε ηλεκτρόνια και ηλεκτρονιο-φωτεινών κύτταρα και σποραδικές αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν στην περιφέρειά νευροσφαιρών GBM (Σχήμα 3C-3E). Τα περιφερικά κύτταρα των νευροσφαιρών ΝΒ πολωμένη, με περισσότερο ΟΣΟ

4 χρώση στο κυτταρόπλασμα από τα εσωτερικά κύτταρα, και περιείχε πυκνό κόκκοι, ενδοκυτταρικά κυστίδια, και λίγοι extroflections μεμβράνη (Σχήμα 4C-4Ε). Ευρείες περιοχές του κυτταρικού θανάτου, που χαρακτηρίζεται από διόγκωση της μεμβράνης, κυτταρική ρυτίδωση, αποπτωτικά σώματα, και ευρεία πυρηνική συμπιέζεται ετεροχρωματίνη, παρατηρήθηκαν στη μέση των νευροσφαιρών του αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ 3G, 3Η, 4G και 4Η). Ωστόσο, ενεργή μίτωση και ζωντανά κύτταρα κοντά στα εσωτερικά τόνισε περιοχές παρατηρήθηκαν επίσης, τόσο στην GBM και NB νευρόσφαιρες (Εικόνες 3G, 3I, 3J, 4F και 4J). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτές οι μικροπεριβάλλον ανθεκτικά κύτταρα στον υποξικό πυρήνα νευρόσφαιρας έδειξε εσοχή πυρήνες, μεγάλες ποσότητες ευχρωματίνη και ευδιάκριτο μιτοχονδριακή συσκευή.

(Α) SEM εικόνα ενός ολόκληρου SF-268 νευροσφαιρών (1000 Χ). (Β) εικόνα SEM της επιφάνειας νευροσφαιρών (2200 ×). (C-J), ΤΕΜ εικόνες του εσωτερικού και περιφερειακού νευροσφαιρών. Λεπτομέρειες extroflection λεπτή μεμβράνη (C-D), οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ηλεκτρονίων πυκνή και ηλεκτρονιο-φωτεινών κύτταρα (Ε), τα στοιχεία του προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (F), που πάσχουν θέσεις στις εσωτερικές σφαίρες, με νεκρωτικές (G) και αποπτωτικά ( H) κύτταρα, ζωντανά κύτταρα, και τα στοιχεία του μιτοχονδριακού συσκευής στις εσωτερικές σφαίρες (I, J). Σημειώστε τα αποπτωτικά κύτταρα στην περιφέρεια ενός νευροσφαιρών (D) και των ζωντανών κυττάρων κοντά στους χώρους που υποφέρει (Ι). Bar: (Ο-Ε) και (Ζ-Ι), 5 μm? (F και J) 1 μm.

Η

(Α) SEM εικόνα του ολόκληρο νευροσφαιρών SK-N-SH (950 Χ). (Β) SEM απεικόνισης επιφάνειας νευροσφαιρών (3000 ×). (C-J) εικόνες ΤΕΜ του εσωτερικού και περιφερειακού νευροσφαιρών. Λεπτομέρειες των κυτταρικών κυστιδίων, πόλωση κυττάρων και απόσπαση (Ο-Ε), τα ζώντα κύτταρα στα εσωτερικά νευροσφαίρες και λεπτομέρειες της μιτοχονδριακής συσκευής (F), που πάσχουν θέσεις στις εσωτερικές σφαίρες, με νεκρωτικές (G) και τα αποπτωτικά κύτταρα (H και Ι), και ένα γεγονός intrasphere μιτωτικής (J). Bar: (C-J), 5 μm

Η

θεραπεία TMZ και ΜΤΤ δοκιμασία της SRLP

+ κυτταρικές σειρές CSC-όπως και η γονική

Low-φάσμα συγκεντρώσεων ΤΜΖ (. 0-500 μΜ) δεν προκάλεσε σημαντικές διαφορές στις μεταβολικές δραστηριότητες των SF-268 γονικών κυττάρων και SRLP

+ t

8 CSC-όπως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η μεταβολική δραστηριότητα των γονικών κυττάρων κυμάνθηκε από 76,14% έως 100% (94,63% ± 7,10%), ενώ μεταβολική δραστηριότητα του SRLP

+ t

8 CSC-σαν κυμαίνονταν από 80.71% έως 100% (88,22% ± 5,43%). Υψηλότερες συγκεντρώσεις της ΤΜΖ (750-1500 μΜ) προκάλεσε σημαντικές διαφορές μεταξύ των SLRP

+ t

8 CSC-όπως και η γονική κυτταρική σειρά. Σε αυτές τις συγκεντρώσεις, η μεταβολική δραστηριότητα της μητρικής κυτταρικής γραμμής SF-268 κυμαινόταν από 38,99% έως 58,86% (51,80% ± 7,59%), ενώ εκείνη του SF-268 SRLP

+ t

8 CSC-όπως κυμαινόταν από 79,09% έως 79,64% (78,94% ± 0,45%) (ρ & lt? 0,05). Η SF-268 γονική IC

50 ήταν περίπου 1250 μΜ, και δεν έφθασε το IC

50 του SF-268 SRLP

+ t

8 CSC-όπως.

(Α) SF-268 προσκολλημένα κύτταρα

έναντι

SF-268 SLRP

+ t

8 CSC-όπως. (Β) κύτταρα προσκολλημένα SK-N-SH

έναντι

SK-N-SH SLRP

+ t

8 CSC-όπως. αναστολή της ανάπτυξης κυττάρου με χαμηλές δόσεις της ΤΜΖ (0-500 μΜ) ήταν μεγαλύτερη στην t

8 ΚΕΠ-όπως σε σχέση με τις γονικές κυτταρικές σειρές, με σημαντικότητα σε κύτταρα SK-N-SH (* ρ & lt? 0,05, σχ 5Β). Σε αντίθεση, η κυτταρική ανάπτυξη αναστολή από υψηλές δόσεις της ΤΜΖ σε, που αντιστοιχεί σε φαρμακολογικές δόσεις (& gt? 750 μΜ), ήταν μεγαλύτερη στα γονικά κύτταρα από ό, τι ο t

8 ΚΕΠ κύτταρα που μοιάζουν στα εμπλουτισμοί CSC και των δύο κυτταρικών σειρών (* ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5Α και 5Β). φόντο DMSO αφαιρέθηκε από τα δείγματα και τιμές ελέγχου, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος (SD) του [(Α

δείγματα-Α

DMSO) /(Α

έλεγχος-Α

DMSO)] * 100 από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

η

στις χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις, το TMZ προκάλεσε σημαντικές διαφορές στις μεταβολικές δραστηριότητες των SK-N-SH γονικών κυττάρων και την SRLP

+ t

8 CSC -αρέσει. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, η μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 0-500 μΜ ΤΜΖ κυμαίνονταν από 75.08% έως 100% (88,41% ± 6,70%) για τα γονικά κύτταρα και από 66,86% έως 100% (74,70% ± 10,84%) για SRLP

+ t

8 CSC-όπως (p & lt? 0,05). Ωστόσο, σε κύτταρα κατεργασμένα με 750-1500 μΜ ΤΜΖ, η μεταβολική δραστηριότητα μεταγωγής και κυμάνθηκε από 42,91% έως 68,56% (54,96% ± 9,61%) για τα γονικά κύτταρα και από 63,92% έως 70,61% (66,64% ± 2,50%) για SRLP

+ t

8 CSC-όπως (p & lt? 0,05). Το IC

50 σε SK-N-SH γονικών κυττάρων ήταν περίπου 1250 μΜ, και δεν έφθασε το IC

50 του SK-N-SH t

8 SRLP

+ CSC-όπως.

Συζήτηση

Η θεωρία των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου είναι μια νέα κατανόηση της ανάπτυξης του καρκίνου που θεωρεί ογκογένεση είναι παρεκκλίνουσα οργανογένεση [56]. Επειδή CSC-όπως υπάρχουν σε καρκίνο, όπως τα καρκινικά κύτταρα, την έναρξη και κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με και να αντιδρούν με την εξειδικευμένη CSC, η οποία μπορεί να ρυθμίζει τις κυτταρικές μοίρα, συμβάλλοντας στην ετερογένεια του καρκίνου των ιστών και την αντίσταση των ναρκωτικών [57]. Αυτή η πλαστικότητα διευκολύνει την απώλεια αγκυροβόλιο και κυτταρική κινητικότητα, παραγωγής κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων

μέσω

την EMT σε μια διδακτική μικροπεριβάλλον. Διαφορετικές υποπληθυσμών CSC βρεθεί εντός του ίδιου όγκου [58], διαλύοντας κάθε αμφιβολία σχετικά με τους ρόλους των ΚΕΠ στην ετερογένεια του καρκίνου και διαμόρφωση μικροπεριβάλλον, και, κατά συνέπεια, στην ανθεκτικότητα στα φάρμακα [59, 60]. Αρκετές προηγούμενες μελέτες ανέφεραν πρωτεΐνες SLRP στο μητρικό [61], παγκρεατικό [62], του παχέος εντέρου [63], της μήτρας του τραχήλου της μήτρας [64], του προστάτη [30], και καρκίνων του πνεύμονα [65], μεταξύ άλλων, τονίζοντας τα αμφιλεγόμενα ρόλους των DCN και LUM στη βιολογία του καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν την πρώτη απόδειξη της σημασίας της DCN και αποδόσεως στο CSC βιολογία, επιδεικνύοντας σημαντικά αυξημένα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης και των δύο SLRPs στην GBM και NB CSC-όπως. Ωστόσο, ενώ LUM mRNA και πρωτεΐνης αυξήθηκε το t

8 νευροσφαιρίδια, DCN mRNA αυξήθηκε σε t

8 και πρωτεΐνης DCN σε t

12. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από τις διαφορές μεταξύ DCN και LUM στην intrasphere παγίδευση και ίσως από CSC συγκεκριμένες μετα-μεταγραφική μηχανισμούς ρύθμισης που είναι ακόμη άγνωστες. Επιπλέον, η επίδραση των αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, όπως εκείνες του EGF και ΤΟΡ-β1, με DCN διαμόρφωσης και διακίνησης έχει έδειξε σε ενήλικα κύτταρα [66, 67], υποδηλώνοντας υποθετική στιχομυθία του DCN και αυξητικών παραγόντων περιόδων CSC, που χρήζουν περαιτέρω μηχανιστικών έρευνες.

Το 3D tumorsphere πολιτισμούς σε ρυθμισμένα μέσα ελεύθερα ορού, τα οποία αποτελούν μια μεθοδολογική εξέλιξη των πολιτισμών νευρόσφαιρα χρησιμοποιούνται σε νευρικά βλαστικά και την έρευνα προγονικών κυττάρων [68-70], θεωρούνται αντιπροσωπευτικά

in vitro

μοντέλα καρκίνου χρήσιμοι στην CSC-όπως εμπλουτισμός των πρωτογενών [71-75] και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου [76, 77]. Εδώ, αυτό το μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί νευροσφαιρών με βάση ελεύθερο ορού CSC εμπλουτισμός της ανθρώπινης GBM και καρκινικές κυτταρικές σειρές ΝΒ, ενισχύοντας κύτταρο πλαστικότητα μέσω των κυτταρικών αποδιαφοροποίηση προς ένα φαινότυπο στέλεχος-όπως.

You must be logged into post a comment.